專利名稱：來源于酵母的新型細胞壁錨定蛋白及其基因和使用其的細胞表面表達系統的制作方法
技術領域：
本發明涉及來源于酵母的新型細胞壁錨定蛋白及其基因和使用其的表面表達系統。更具體地說，本發明涉及使用四種來源于多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)的GPI(糖基磷脂酰肌醇)-錨定蛋白，HpSed1p，HpGas1p，HpTip1p和HpCwp1p，及來源于多形漢遜酵母的細胞壁蛋白HpPir2p在多形漢遜酵母和其他酵母的細胞表面表達外源蛋白的表面表達系統。另外，本發明涉及使用來源于多形漢遜酵母的HpWSC1和來源于Saccharomyces diastaticus的STA1編碼的蛋白在多形漢遜酵母和其他酵母的細胞壁表面表達外源蛋白的表面表達系統。
發明的
背景技術：
由于在細胞表面表達蛋白具有多種用途，如包括生產新型疫苗、篩選各種抗原和抗體、在細胞表面固定化有用的酶類等。因此，近年來，對在單細胞生物，如噬菌體、細菌和酵母表面表達期望得到的蛋白進行了活躍的研究。
首先，在細胞表面表達外源蛋白應用于篩選抗原決定簇和抗原性決定多肽片段，并以疫苗的穩定生產為目的。在此之前，是通過從隨機突變病原體庫中篩選具有穩定連續滴度的突變體來生產疫苗的。但是以這種傳統方式生產的疫苗在對人或動物口腔途徑給藥時可能會丟失抗原性。已進行了很多努力來克服這些問題，如使用細胞表面展示的活性口腔疫苗。
在細胞表面表達抗原蛋白的策略中，內源性細胞表面蛋白是用來指導這些蛋白表達在細胞表面的。例如，將編碼細胞表面蛋白的基因與編碼抗原蛋白的基因融合，然后將得到的重組基因導入革蘭氏陰性細菌中，從而在細胞表面表達融合蛋白。這種以融合蛋白作為介體的抗原蛋白可作為有效抗原引發免疫反應。特別是由于存在于革蘭氏陰性細菌細胞膜上的脂多糖(LPS)可以增強這種表達在細胞表面的融合蛋白的抗原性，所以革蘭氏陰性細菌非常適于實現上述目的。
通常分泌或表達在細胞表面的蛋白在其一級序列上帶有分泌信號，以使新生蛋白穿過細胞質膜。為了在革蘭氏陰性細菌細胞表面表達，蛋白需跨過細胞質膜和周質空間，然后插入外膜中以穿過外膜。在細菌中，有幾種酶和毒素具有分泌信號和(或)指導蛋白定位的定位信號。因此，利用這些分泌信號或定位信號，并帶有合適的啟動子，可以成功地實現外源蛋白在細胞表面的定位。
迄今為止，已對利用革蘭氏陰性細菌的表面蛋白在細胞表面表達外源蛋白進行了廣泛嘗試。用于外源蛋白定位的表面蛋白主要分為外膜蛋白、脂蛋白、分泌蛋白和細胞表面器官蛋白。
革蘭氏陰性細菌中已知的外膜蛋白LamB，PhoE和OmpA已用于在細胞表面生產外源蛋白。當使用外膜蛋白時，由于外源蛋白必須嵌入伸出細胞表面的環中，因此外源蛋白的大小會受到限制。而且由于嵌入的外源蛋白C和N末端需要在三維結構上彼此緊鄰，因此如果二末端的距離相距很大時，需用連接肽將其拉在一起。
實際上，在使用LamB或PhoE時，當嵌入的外源多肽大于等于50-60個氨基酸，則由于位阻效應很難構建成穩定的膜蛋白。(Charbit等，J.Immunol.，1997，139，1658-1664；Agterberg等，Vaccine，1990，8，85-91)。為了解決這個問題，嘗試使用了正確定位所必須的最小的定位信號OmpA片段。例如，成功地在細胞表面表達了連接在OmpA C末端的β-內酰氨酶。蛋白從細胞質到外膜的轉移由融合在OmpA N末端大腸桿菌脂蛋白Lpp的信號序列來完成。(Francisco等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1992，489，2713-2717)。
如上所述，用細菌外膜蛋白在細胞表面展示外源蛋白需要在基因水平上將外源蛋白與合適的外膜蛋白連接起來，從而形成可穿過細胞質膜的融合蛋白，并能夠穩定地插入到外膜中。合適的表面錨定基序是滿足以下要求的外膜蛋白1)具有一個分泌信號，允許融合蛋白穿過細胞質膜；2)具有一個定位信號，允許融合蛋白錨定在外膜里；3)在外膜大量表達；和4)與蛋白大小無關，可穩定表達。迄今為止，還沒有找到滿足以上所有要求的表面定位基序。
與此同時，脂蛋白也已用作表面定位基序。特別是來源于大腸桿菌的脂蛋白非常有用，因為它可通過N末端分泌信號穿過內膜，并通過其末端的L-半胱氨酸以共價鍵直接與外膜或內膜的脂類連接。來源于大腸桿菌的脂蛋白Lpp，其N末端與外膜相連，而C末端與細胞壁肽聚糖相連，因此它與外膜蛋白A融合后可用于在大腸桿菌表面分泌和轉運外源蛋白。(OmpA，Francisco等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1992，489，2713-2717)。另一個用于外源蛋白表面表達的脂蛋白是TraT。據報道，TraT已用于在大腸桿菌表面表達多肽，如脊髓灰質炎病毒C3抗原決定簇(Felici等，J.Mol.Biol.，1991，222，301-310)。另外，雖然與肽聚糖連接的脂蛋白(PAL)其功能還沒有闡述清楚，但已用于重組抗體的表面表達(Fuchs等，Bio/Technology，1991，9，1369-1372)。在這種情況下，PAL的C末端與肽聚糖相連，而N末端與暴露在細胞表面的重組抗體融合。
能夠穿過外膜的分泌蛋白也可用作表面錨定基序，但在革蘭氏陰性細菌中沒有得到很好的發展。只有一些蛋白在輔助蛋白的幫助下具有分泌機制。例如，Klebsiella oxytoca分泌的脂蛋白--普魯蘭酶通過脂類與其N末端連接錨定在外膜上，而且在生長穩定期完全分泌到培養基中。Komacker等試圖利用普魯蘭酶N末端片段在細胞表面表達β-內酰氨酶，但表達的普魯蘭酶-β-內酰氨酶融合蛋白在短期的錨定后又釋放到細胞培養基中。當使用周質空間蛋白--堿性磷酸酶作為定位蛋白時，則不能實現表面表達。因為堿性磷酸酶的分泌至少需要14個蛋白才能夠實現，所以它的功能表達是很困難的。(Komacker等，Mol.Microl.，1990，4，1101-1109)。
Neisseria是一種具有一個非常有趣的分泌系統的病原微生物，來源于該菌的IgA蛋白酶C末端的β-結構域具有分泌信號，該信號指導N末端蛋白酶結構域分泌到細胞表面。該蛋白酶在錨定到外膜上后又通過自身的催化水解分泌到培養基中。12kDa的霍亂毒素B亞基已利用IgA蛋白酶的β-亞基進行了表面表達。(Klauser等，EMBO J.，1990，9，1991-1999)。但由于在轉移過程中發生蛋白折疊，從而阻止了融合蛋白的分泌。
來源于革蘭氏陰性細菌細胞表面器官的蛋白，如鞭毛、菌毛和纖毛蛋白，也可用作表面錨定基序。例如，鞭毛絲的亞基蛋白--鞭毛蛋白已用于進行霍亂毒素B亞基和B型肝炎病毒多肽的穩定表面表達，這些表達的蛋白可與其相應抗體進行強烈反應(Newton等，Science，1989，244，70-72)。當使用纖毛亞基蛋白--纖毛蛋白時，只能對小分子肽進行成功表達(Hedegaard等，Gene，1980，85，115-124)。
已嘗試用革蘭氏陽性和陰性細菌的表面蛋白作為表面錨定基序，在革蘭氏陽性細菌中進行表面表達(Samuelson等，J.Bacterial.，1995，177，1470-1476)。包含80個氨基酸殘基的瘧疾紅內期抗原和來源于Streptococcus并與白蛋白相連的蛋白G在革蘭氏陽性細菌細胞表面得到有效表達，所使用的表面表達系統包括由來源于Staphylococcus aureus的蛋白A作為表面錨定基序，及來源于Staphylococcus hyicus的脂肪酶分泌信號。
由于對革蘭氏陽性和陰性細菌中表面表達的廣泛研究，各種表面表達系統已在美國、歐洲和日本得到發展并申請了專利。在過去的三年里，已發布了8個關于表面表達系統的專利，其中使用革蘭氏陰性細菌外膜蛋白的案例有5個(WO9504069，WO9324636，WO9310214，EP603672和US5356797)，使用細胞表面器官菌毛的案例有1個(WO9410330)，使用細胞表面脂蛋白的案例有1個(WO9504079)。
由于大腸桿菌易培養，而且其基因結構了解得很清楚，因此它是最普遍應用于外源蛋白生產的細菌宿主。但在通常條件下，外源蛋白并不能很好地分泌到培養基中。另外，當外源蛋白過量表達時會在細胞中聚集為包含體。因此它們的純化需要一個再折疊過程來溶解包含體，從而導致產量的重大損失。而且，由于大腸桿菌會產生對人體有害的內毒素，因此在純化時重組蛋白有可能被毒素污染。
相比較而言，由于酵母在自身細胞內分泌系統的調控下能夠很容易地將蛋白以活性形式分泌到培養基中，而且其調控方式與高等真核生物相同，因此它已被用作宿主通過基因工程技術來生產有用的外源蛋白。
自從1981年干擾素的生產后(Hitzeman等，1981，nature，293；717-722)，酵母已被廣泛用于生產外源蛋白。另外，不僅酵母的重組蛋白已被美國FDA批準為對人體是安全的，而且酵母中大部分基因表達的調控機制也已經了解清楚(Strathern等，酵母的分子生物學，代謝和基因表達(TheMolecular Biology of the Yeast Saccharomyces，Metabolism and GeneExpression)，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y，1982)。因此，酵母系統具有幾個重要的優勢來生產外源蛋白。例如，在酵母中表達的蛋白對人體是安全的，細胞外分泌使其與在動物或人細胞中表達的蛋白一樣具有高特異活性。另外，與大腸桿菌相比，在酵母中產生的蛋白其純化過程比較簡單，不需要通過再折疊過程以獲得活性形式，因此產量高。特別是目前對釀酒酵母的表面表達進行了廣泛研究。幾年前，外源蛋白在酵母中的表面表達主要集中在以一種典型的細胞壁蛋白--α-凝集素作為表面錨定基序(Schreuder等，Yeast，1993，9，399)上。近年來，關于表面錨定基序的研究已延伸到各種細胞壁蛋白。首先，隨著釀酒酵母基因組計劃的完成，已廣泛進行了通過保守序列分析來篩選表面錨定蛋白的研究(Hamada等，Mol.Gen.Genet.，1998，258，53)。用這些表面蛋白作為表面錨定基序，已將包括α-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、脂肪酶和角質酶在內的各種酶在釀酒酵母細胞表面進行了穩定表達。另外，對各種酶進行的細胞表面表達可以發展許多有用的工業生物催化劑(Murai等，Appl.Microbiol.Biotechnol.，1999，51，65)。以α-凝集素作為錨定基序的表面表達系統已由Invitrogen公司開發并商品化。另外，酵母是一種真核微生物，通常對人體無害，已作為宿主廣泛應用于生產食品或藥品原料。例如，對B型肝炎病毒抗原(HbsAg)進行酵母細胞表面表達用于生產活性疫苗(Schreuder等，Vaccine，1996，14，383)。
如上所述，已在世界范圍內進行細胞壁蛋白的活躍的研究，但僅限于對釀酒酵母的研究。目前，對其他酵母，如白色念珠菌(Candida albican)的研究剛剛起步。因此，迫切需要研究在產業上有用的酵母中的表面蛋白及其表面表達。由于迄今已進行研究的介導蛋白是利用糖基磷脂酰肌醇-錨進行表面錨定，因此感興趣的蛋白必須與錨定蛋白在其羧基末端相連。然而，有些蛋白在這種條件下不能表現出完全活性，這是酵母表面表達系統的一個缺點。
發明概要導致本發明的原因是本發明人關于外源蛋白細胞外轉運的深入全面研究，發現衍生自一種工業上有用的甲醇-同化型酵母多形漢遜酵母的表面蛋白在構建表面表達系統和開發生物催化劑應用系統方面十分有效。本發明所建立的表面表達系統能夠在細胞表面穩定地表達感興趣的蛋白，因此在各個領域具有多種用途，包括生物催化劑的固定化和酶、抗原、抗體等蛋白的大規模生產等。
因此，本發明的一個目的是解決前述或其他的現有技術中所面臨的問題，并提供將在宿主中表達的外源多肽輸出到宿主的分離區的系統及其應用。
本發明的另一個目的是提供一種來源于多形漢遜酵母的新型表面錨定蛋白及其基因。
本發明的進一步目的是提供一個由完全或部分的表面蛋白作為外源多肽或蛋白表面表達的介體的表面表達系統。
本發明更進一步目的是提供從多形漢遜酵母分離的表達介體蛋白及其編碼基因，該蛋白可與要在細胞表面表達的蛋白的氨基末端融合。
本發明的再一個目的是提供一個表面表達系統，該系統使用的是可與要表達的蛋白的氨基末端融合的完全或部分表達介體蛋白。
本發明的再一個目的是提供一個表面表達系統，該系統使用的是已知的來源于Saccharomyces diastaticus和多形漢遜酵母的完全或部分的表面蛋白。
根據本發明的一個方面，提供了分離的DNA序列，包括SEQ.ID.NO1所代表的堿基序列HpSED1，SEQ.ID.NO4所代表的堿基序列HpRIR2，SEQ.ID.NO5所代表的堿基序列HpGAS1，SEQ.ID.NO6所代表的堿基序列HpTIP1，及SEQ.ID.NO7所代表的堿基序列HpCWP1，它們都編碼多形漢遜酵母的細胞壁蛋白，及其DNA同系物(homologues)。
根據本發明的另一個方面，提供了新型的具有重組載體的大腸桿菌菌株，這些載體包含堿基序列HpSED1的4kb EcoRI片段，堿基序列HpPIR2的5.5kb SalI片段，堿基序列HpGAS1的3kb PstI片段，堿基序列HpTIP1的3.5kb XbaI片段及堿基序列HpCWP1的6kb SalI片段。
根據本發明的進一步的方面，提供了表面表達系統，其中用來源于Saccharomyces diastaticus的堿基序列HpSED1，HpPIR2，HpGAS1，HpTIP1，HpCWP1，STA1，來源于多形漢遜酵母的堿基序列HpWSC1和來源于釀酒酵母的堿基序列WSC1或它們的部分片段來表達介體蛋白，其將外源蛋白定位在細胞表面。此處，對本發明有用的是真核細胞，可從酵母屬種及霉菌屬種中選擇，酵母包括念珠菌屬種，殺德氏酵母屬種(Debaryomycesspp.)，漢遜酵母屬種，克魯維酵母菌屬種，畢赤氏酵母屬種(Pichia spp.)，裂殖酵母屬種，Yarrowia spp.，Saccharomyces spp.；霉菌包括曲霉屬種，青霉屬種，和根霉屬種(Rhizopus spp.)。
附圖的簡要描述本發明以上及其他目的、特征和其他優點將會通過以下結合附圖的詳細描述而更被清楚地理解，其中
圖1所示的是Southern blot分析結果的照片，用BamHI(泳道3)，EcoRI(泳道4)，PstI(泳道5)，XbaI(泳道6)處理的多形漢遜酵母得到的各DNA片段和釀酒酵母基因組的EcoRI酶切片段(泳道1)和分子量標準(泳道2)，在該各DNA片段與探針SED1基因雜交后的結果。
圖2a所示的是Southern blot分析的照片，多形漢遜酵母基因組被ClaI(泳道1)，EcoRI(泳道2)，HindIII(泳道3)，SalI(泳道4)，XhoI(泳道6)處理后得到的DNA片段，以及分子量標準(泳道6)和釀酒酵母基因組的EcoRI酶切片段(泳道7)與探針CWP2基因雜交后的結果。
圖2b所示的是Southern blot分析的照片，多形漢遜酵母基因組被以下各種酶處理，得到的DNA片段與探針TIR1基因雜交的結果如下BamHI(泳道1)，ClaI(泳道2)，EcoRI(泳道3)，HindIII(泳道4)，PstI(泳道5)，XbaI(泳道6)，XhoI(泳道7)，泳道8為分子量標準，和釀酒酵母基因組的EcoRI酶切片段。
圖3所示的是Southern blot分析的照片，多形漢遜酵母基因組被各種酶處理后，得到的DNA片段與探針GAS1基因雜交的結果如下ClaI(泳道1)，HindIII(泳道2)，SalI(泳道3)，XhoI(泳道4)，BamHI(泳道7)，EcoRI(泳道8)，PstI(泳道9)，和XbaI(泳道10)，泳道5和6為分子量標準。
圖4所示的是Southern blot分析的照片，多形漢遜酵母基因組被各種酶處理后，得到的DNA片段與探針TIP1基因雜交的結果如下BamHI(泳道1)，EcoRI(泳道2)，ClaI(泳道3)，PstI(泳道4)，XbaI(泳道5)，XhoI(泳道6)，EcoRI(泳道9)，XbaI(泳道10)，XhoI(泳道11)，泳道7和12為分子量標準，泳道8為釀酒酵母基因組的EcoRI酶切片段。
圖5所示的是Southern blot分析的照片，多形漢遜酵母基因組被各種酶處理后，得到的DNA片段與探針CWP1基因雜交的結果如下ClaI(泳道1)，HindIII(泳道2)，PstI(泳道3)，SalI(泳道4)，和XhoI(泳道5)。
圖6所示的是在多形漢遜酵母細胞表面表達CMCase的表面表達載體示意圖，包括GAPDH啟動子(pGAPDH)，殺傷毒素的信號序列(KTsig)及帶有終止密碼子的CMCase基因(Term)。
圖7所示的柱狀圖是根據表面表達介體在多形漢遜酵母細胞表面檢測到的CMCase活性。
圖8所示的圖表是在具有表面表達介體的多形漢遜酵母菌株細胞表面檢測到的CMCase活性，并對培養時間作圖。
圖9所示的是在多形漢遜酵母細胞表面表達HpPir2p蛋白的表面表達載體示意圖，包括GAPDH啟動子(pGAPDH)，殺傷毒素的信號序列(KTsig)，帶有終止密碼子的CMCase基因(Term)及與殺傷毒素信號序列(KTsig)氨基末端融合的全長PIR2(Pir-N)或與CMCase基因羧基末端融合的PIR2部分片段(Pir-C)。
圖10a所示的是Wsc1p蛋白的結構域及其細胞定位位點的示意圖。
圖10b所示的是在多形漢遜酵母細胞表面表達外源蛋白的表面表達載體示意圖，其中插入的是幾個截短的HpWSC1基因片段，缺失半胱氨酸基序或跨膜結構域或二者均缺失，及編碼全長HpWsc1p的完整HpWSC1基因。
圖11所示的照片是在使用表達介體(Tip40，GasF，CwpF和Wsc-ct)和不使用表達介體(GOD*)的多形漢遜酵母菌株中根據平板活性測定法檢測的葡萄糖氧化酶活性。
圖12所示的是FACS分析結果，多形漢遜酵母菌株(白色)通過使用表面表達介體如CwpF(圖片A)，Tip40(圖片B)，GasF(圖片C)，和Wsc-ct(圖片D)葡萄糖氧化酶在其上表達，和野生型(灰色)。
圖13所示的是用STA1基因在釀酒酵母細胞表面表達外源蛋白的表面表達系統示意圖，構建其的載體包括僅僅信號序列(STASS)，信號序列和八肽序列(STASS-8)兩者，信號序列、八肽序列和蘇氨酸/絲氨酸-富集區(STASS-8-TS)，信號序列和蘇氨酸/絲氨酸-富集區(STASS-TS)，信號序列和α-凝集素(STASS-CMC-Agalc)，和信號序列、八肽和α-凝集素(STASS-8-CMC-Agalc)，以及CMCase基因作為報告基因。
圖14所示的圖表是根據平板活性測定法自釀酒酵母菌株檢測到的CMCase活性，這些菌株僅含信號序列(SS)，含信號序列和八肽序列(SS-8)，含信號序列、八肽序列和蘇氨酸/絲氨酸-富集區(SS-8-TS)，和含信號序列和蘇氨酸/絲氨酸-富集區(SS-TS)。
圖15所示的是釀酒酵母菌株FACS分析結果，在該菌株上CMCase通過使用表面表達載體得到表達(灰色)，和野生型(白色)。
發明的詳細描述本發明所建立的系統可將外源多肽從其在其中表達的酵母細胞輸出到該酵母細胞的分離的區域，可應用于可再生的整細胞生物催化劑。
為了繞過與工業生產中已應用于重組蛋白生產的釀酒酵母有關的問題，用一種與Pichia pastoris一樣的甲醇營養性酵母多形漢遜酵母進行重組蛋白表達的研究。由于多形漢遜酵母的細胞壁結構仍是未知的，因此在本發明中對介導外源蛋白輸出到細胞表面的蛋白編碼基因進行了篩選和克隆。而且將克隆的基因與編碼感興趣的蛋白的基因融合，構建新型的能夠在酵母細胞表面表達外源蛋白的表面表達系統。
因此，本發明涉及編碼多形漢遜酵母細胞壁蛋白的基因。
經鑒定，多形漢遜酵母的細胞壁蛋白與釀酒酵母的細胞壁蛋白具有非常相同的特征。編碼已知為細胞壁蛋白的Cwp1p(GenBank D37975，van derVaart等，J.Bacteriol.，1995，177，3104)，Cwp2p(GenBank Z28096，Van derVaart等，J.Bacteriol.，1995，177，3104)，Sed1p(GenBank X66838，Seidel，J.andW.Tanner，Yeast，1997，13，3104)，Tir1p(GenBank X12775)，和Tip1p(GenBankM71216，Van der Vaart等，J.Bacteriol.，1995，177，3104)，及已知為細胞質膜蛋白的Gas1p(GenBank X53424，Benghezal等，J.Cell Biol.，1995，130，1333)的基因被用于從多形漢遜酵母基因組中尋找相應的基因。
(1)分離多形漢遜酵母的HpSED1基因由長1,017bp的SED1基因編碼的Sed1p是一個包含338個氨基酸殘基的蛋白質，它是釀酒酵母在穩定期時細胞壁中的主要蛋白。
用釀酒酵母的SED1基因片段作為探針，從多形漢遜酵母基因組中獲得一個4kb EcoRI片段(如圖1)，并將其插入載體中。將多形漢遜酵母的SED1同源基因片段命名為HpSED1，鑒定其堿基序列為SEQ.ID.NO1，其編碼的開放閱讀框包含131個氨基酸殘基，序列為SEQ.ID.NO11。多形漢遜酵母的HpSED1基因片段比釀酒酵母的SED1短很多。但多形漢遜酵母的HpSED1編碼的HpSed1p與釀酒酵母有相同的氨基酸重復序列，表現出相似的蘇氨酸/絲氨酸-富積結構，并有58.4％的氨基酸同源性。另外，多形漢遜酵母的HpSed1p似乎具有一個17個氨基酸的信號序列，以及一個推測的GPI錨定信號在其羧基末端。一個新型的大腸桿菌轉化體于2000年7月11日保藏在韓國生物科學與生物技術研究所(KRIBB)的韓國典型微生物保藏中心，該菌株帶有包含HpSED1基因的4kbEcoRI片段的重組載體，其保藏號為KCTC 0825BP。
(2)分離多形漢遜酵母的HpPIR2基因由長765bp的TIR1基因編碼的Tir1p是一個在釀酒酵母細胞壁發現的包含254個氨基酸殘基的蛋白質。該蛋白具有高度的N-糖基化，富含絲氨酸/丙氨酸，在厭氧條件下良好地表達。
用釀酒酵母的TIR1基因片段作為探針，從多形漢遜酵母基因組中獲得一個5kb ClaI片段(如圖2b)，并將其插入載體中。DNA序列分析表明ClaI片段的ORF與釀酒酵母的PIR2基因(GenBank D13741，Toh-e等，Yeast，1993，9，481)有51.2％的同源性。
在釀酒酵母蛋白中，除α-凝集素外，包含92個氨基酸的Cwp2p是最有效的表面錨(anchor)(van der Vaart等，Appl.Environ.Microbiol.，1997，63，615)。在本發明中，用釀酒酵母CWP2基因作為探針從多形漢遜酵母基因組得到一個5.5kb SalI片段(如圖2a)，通過DNA測序鑒定，該片段與通過TIR1克隆的ClaI片段是相同的片段。已報道蛋白Cwp2p和Tir1p均包含序列為SEQ.ID.NO2的重復氨基酸序列，命名為PIR1/2/3重復，與Pir2p蛋白有很高同源性。
已知PIR2編碼的釀酒酵母的Pir2p可通過堿處理從細胞壁中釋放出來，通常具有一個Kex2切點，并此蛋白通過與GPI(糖基磷酸肌醇)錨定蛋白不同的方式錨定在細胞壁上，不能通過葡聚糖酶處理釋放出來(Toh-e等，Yeast，1993，9，481)。對堿處理后從多形漢遜酵母細胞壁釋放出來的主要細胞壁蛋白N末端氨基酸分析表明，該蛋白與HpPir2p多肽在kex2p切點之后具有相同的氨基酸序列，序列為SEQ.ID.NO3。因此認為從多形漢遜酵母獲得的HpPIR2基因是編碼定位于細胞壁上的HpPir2p的基因。多形漢遜酵母的HpPir2p由長1,014bp，序列為SEQ.ID.NO4的基因編碼，包含337個氨基酸，并具有PIR1/2/3重復。該蛋白具有一個18個氨基酸的信號序列，并在68位氨基酸處具有Kex2p切點。一個新型的具有包含多形漢遜酵母HpPIR2基因的5.5kb SalI片段的重組載體的大腸桿菌轉化體于2000年7月11日保藏在韓國生物科學和生物技術研究所(KRIBB)的韓國典型微生物保藏中心保藏號為KCTC 0827BP。
(3)分離多形漢遜酵母的HpGAS1基因由長1,680bp的GAS1基因編碼的Gas1p包含254個氨基酸，并與釀酒酵母的細胞膜相連。但是它的氨基末端暴露在外部，并穿過細胞壁。
在本發明中，用釀酒酵母的GAS1基因片段作為探針，從多形漢遜酵母基因組中獲得一個3kb PstI片段(如圖3)，并將其插入載體中。DNA序列分析表明其ORF與釀酒酵母的Gas1p有70.7％的同源性，并被命名為HpGas1p。多形漢遜酵母的HpGas1p包含537個氨基酸，序列為SEQ.ID.NO14，由序列為SEQ.ID.NO5的長1,614bp的基因編碼。多形漢遜酵母的Gas1p也具有一個18個氨基酸的信號序列，但GPI錨定信號與釀酒酵母不同。一個新型的具有包含多形漢遜酵母HpGAS1基因3kb PstI片段的重組載體的大腸桿菌轉化體于2000年7月11日保藏在韓國生物科學和生物技術研究所(KRIBB)的韓國典型微生物保藏中心保藏號為KCTC0828BP。
(4)分離多形漢遜酵母的HpTIP1基因由長633bp的釀酒酵母TIP1基因編碼的Tip1p是一個包含210個氨基酸的GPI錨定蛋白，與Tir1p具有高同源性，Tip1p由冷休克誘導表達。
在本發明中，用釀酒酵母TIP1基因片段作為探針，從多形漢遜酵母基因組中獲得一個3.5kb XbaI片段(如圖4)，并將其插入載體中。DNA序列分析表明其ORF包含序列為SEQ.ID.NO6的長852bp的基因，編碼283個氨基酸，序列為SEQ.ID.NO13，。一個新型的具有包含多形漢遜酵母HpTIP1基因3.5kb XbaI片段的重組載體的大腸桿菌轉化體于2000年7月11日保藏在韓國生物科學和生物技術研究所(KRIBB)的韓國典型微生物保藏中心保藏號為KCTC 0824BP。
(5)分離多形漢遜酵母的HpCWP1基因Cwp1p是一個典型的GPI錨定蛋白，由長720bp的釀酒酵母CWP1基因編碼，包含239個氨基酸。
在本發明中，用釀酒酵母的CWP1基因片段作為探針，從多形漢遜酵母基因組中獲得一個6kbSalI片段(如圖5)，并將其插入載體中。DNA序列分析表明其推測的ORF有序列為SEQ.ID.NO7的246bp序列，將其命名為HpCWP1，即使該蛋白與釀酒酵母的CWP1同源性低。另外，推測序列為SEQ.ID.NO15的HpCwp1p具有一個15個氨基酸的分泌信號及一個GPI錨定信號。一個新型的具有包含編碼多形漢遜酵母HpCwp1p的6kb SalI基因片段的重組載體的大腸桿菌轉化體于2000年7月11日保藏在韓國生物科學和生物技術研究所(KRIBB)的韓國典型微生物保藏中心保藏號為KCTC 0826BP。
(6)分離多形漢遜酵母的HpWSC1基因Wsc1p是負責應力反應的蛋白，它錨定在釀酒酵母細胞膜上。據報道該應力反應蛋白具有一個羧基末端跨膜結構域，一個可穿過細胞壁的絲氨酸/蘇氨酸富集區，及一個暴露在外部，以檢測外部信號的氨基末端半胱氨酸基序(Verna等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1997，94，13804)。
根據以下事實，即當綠色熒光蛋白(GFP)作為Wsc1p的融合伴侶表達時，可在細胞表面觀察到熒光，推測Wsc1p的氨基末端可作為表面表達介體。在分離多形漢遜酵母LEU2基因的過程中，HpWSC1基因由Agaphonov等獲得(Agaphonov等，Yeast，1994，10，509，GenBank U00889)。DNA測序分析表明多形漢遜酵母的HpWSC1基因包含序列為SEQ.ID.NO8的長1,110bp的序列，并編碼373個氨基酸序列。推測由多形漢遜酵母中分離的HpWSC1基因所編碼的蛋白是一種錨定機制不同于GPI錨定蛋白的細胞表面蛋白，可通過與外源蛋白氨基末端區域融合而應用于開發表面表達系統。
按照本發明的實施方案，提供了來源于多形漢遜酵母的細胞壁蛋白基因，HpSED1，HpPIR2，HpGAS1，HpTIP1，和HpCWP1，及一個膜蛋白基因HpWSC1基因，包含這些基因的載體，及用這些載體轉化的細胞。
而且本發明涉及利用從多形漢遜酵母中分離的新型細胞壁蛋白作為外源蛋白的表面表達的介體的表面表達系統。
按照本發明的另一個實施方案，提供了利用從多形漢遜酵母中分離的GPI錨定蛋白作為外源蛋白的表面表達的介體的表面表達系統。
認為可作為介體基因用于表面表達系統，將4個推測的GPI錨定蛋白基因從多形漢遜酵母中克隆出來。根據本發明，對每個介體所構建的表面表達系統，均由來源于Bacillus subtilis(Park等，Agric.Biol.Chem.，1991，55，441)的羧甲基纖維素酶(以下稱為“CMCase”)作為報告蛋白。
此處，GAPDH啟動子(Sohn等，Appl.Microbiol.Biotechnol.，1999，51，800)和殺傷毒素信號序列(Sor，F.and Fukuhara，Curr.Genet.，1985，9，147)均插入到表達載體中。然后將CMCase基因符合讀框地融合以便構建CMCase表面表達載體，其能夠在GAPDH啟動子的控制下表達CMCase。將4個推測的GPI錨定蛋白基因，HpCWP1，HpGAS1，HpTIP1和HpSED1基因片段，分別插入到表面表達載體CMCase的羧基末端，從而構建成CMCase表面表達載體。根據GPI錨定基序位于羧基末端40個氨基酸中的事實(van der Vaart等，Appl.Environ.Microbiol.，1997，63，615)，也用編碼每個介體羧基末端40個氨基酸的核酸節段構建了CMCase表面表達載體。將所有這些表面表達載體導入多形漢遜酵母(Hill等，Nucl.Acids Res.，1991，19，5791)后，培養獲得的轉化體，并在其上清和整個細胞級分中測定CMCase活性。
與其中無信號序列或無介體基因融合的對照載體相比較，其中插入各介體基因的表達載體在整個細胞級分(fractions)中的CMCase活性顯著提高，這說明CMCase被各個介體輸送到細胞表面(如表1)。特別是，發現HpTip1p，HpGas1p和HpCwp1p比其他介體將CMCase轉運到細胞表面的效率更高(如圖7)。
盡管大多數細胞在達到穩定期時CMCase活性下降，但發現用HpCwp1p作為表面錨的細胞的CMCase活性，雖然在穩定期有所降低，但在整個培養期其活性都保持很高。因此表明HpCwp1p在所檢測的蛋白中是最穩定的介體(如圖8)。
按照本發明進一步的實施方案，提供了使用從多形漢遜酵母中分離的非GPI錨定蛋白作為介體，對外源蛋白進行表面表達的表面表達系統。
在該實施方案的一個版本中，編碼不同于GPI錨定蛋白的細胞壁蛋白的HpPIR2基因用于構建表面表達系統。
與GPI錨定蛋白相比較，Pir2p蛋白通過其絲氨酸/蘇氨酸富集區的高度O-糖基化與存在于細胞壁上的聚糖從而錨定在細胞壁中。因此，Pir2p蛋白在僅水解多聚糖的酶作用下并不從細胞壁釋放，但當用可切斷所有糖基化的堿處理時，能夠從細胞壁上釋放。在本發明中，構建了利用HpPir2p蛋白羧基-和氨基-末端區的表面表達系統。測定作為報告蛋白的CMCase的活性，以估計來源于HpPir2p的介體的錨定能力。(如圖9)。
當HpPir2蛋白的羧基-末端區作為介體時，獲得的CMCase活性與無介體的CMCase基因表達時的活性幾乎相同。相反，當用HpPir2蛋白氨基末端區作為錨定介體時，不僅在上清中檢測到CMCase活性，而且在整個細胞級分中也檢測到活性(如表2)。據報道Pir2p蛋白通過體內的過量表達而分泌到培養基中(Russo等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1992，89，3671)。因此，在整個細胞級分中檢測到的CMCase活性是由于酶錨定在細胞壁上造成的。
因此，HpPir2p蛋白可錨定在細胞壁中，因而可用作表面表達介體。Pir2p蛋白好于傳統GPI錨定蛋白的優勢在于連接到目的蛋白的氨基末端到其羧基末端。
在實施方案的另一個版本中，編碼不同于GPI錨定蛋白的跨膜蛋白的WSC1基因用于構建表面表達系統。
如圖10a所示，Wsc1p蛋白包括將蛋白錨定在細胞膜中的跨膜結構域、貫穿細胞壁的絲氨酸/蘇氨酸富集區及存在于胞外空間的氨基末端半胱氨酸基序(Verna et al.，Proc.Natl.Sci.USA，1997，13804)。
為了用HpWsc1p建立表面表達系統，幾個截短的HpWSC1基因片段，缺失半胱氨酸基序或跨膜結構域，或二者均缺失，插入到CMCase表達載體中(如圖10b)，并分析了CMCase活性。
只有當融合蛋白中存在跨膜結構域時，CMCase才不會進行分泌，而是附著在細胞上。但是，盡管跨膜結構域存在，如果不存在半胱氨酸基序，也不能在整個細胞級分中檢測到CMCase活性。該結果可能來自以下事實即CMCase不能充分暴露在細胞表面。對照而言，當跨膜結構域缺失時，大部分CMCase活性在上清中檢測到。另外，半胱氨酸基序在CMCase分泌中起到附加作用(如表3)。
因此，來源于HpWsc1p的介體必須具有半胱氨酸基序和跨膜結構域二者，為了錨定效率。在本發明中，建議將HpWsc1p作為一種新型的介體用于蛋白的表面表達。
依據本發明的再一個實施方案，提供了使用HpTip1p，HpGas1p和HpCwp1p，及HpWsc1p將葡萄糖氧化酶輸出到細胞表面的表面表達系統。
葡萄糖氧化酶是一種來源于Aspergillus niger的黃素酶，包含兩個相同的多肽鏈亞基。在多形漢遜酵母中表達時，已知該酶會進行高度(hyper)糖基化。
當葡萄糖氧化酶在錨定介體如HpTip1p、HpGas1p、HpCwp1p和HpWsc1p存在下表達時，發現該酶在平板上的活性圈(Hodgkins等，Yeast，1993，9，625)比分泌的酶小(如圖11)。
在使用錨定介體的所有情況中，均通過FACS(熒光激活細胞分選儀)分析對熒光細胞進行了觀察，結果表明葡萄糖氧化酶得到表達并錨定在細胞表面。另外，在所有菌株中，整個細胞級分比上清檢測到更高的葡萄糖氧化酶活性。當使用HpCwp1p時，對大量細胞的熒光進行檢測，結果表明HpCwp1p具有卓越的細胞壁錨定活性。而且發現HpTip1p的40個氨基酸的片段可在細胞表面有效表達蛋白(如圖12)。在HpGas1p和HpWsc1p介導下，可檢測到能證明細胞壁錨定活性的熒光，但是低水平。但即使在這種情況下，如果將底物滲入細胞壁，似乎在酶的活性的檢測中毫無問題。
因此，根據本發明，不僅發現HpCwp1p在GPI錨定蛋白中是最有效的表面表達介體，而且表明HpPir2p和HpWsc1p蛋白可作為新型的表達介體。
在此處，針對本發明所用的是真核細胞，選自酵母屬種及霉菌屬種，酵母屬種包括念珠菌屬種，殺德氏酵母屬種(Debaryomyces spp.)，漢遜酵母屬種，克魯維酵母菌屬種，畢赤氏酵母屬種(Pichia spp.)，裂殖酵母屬種，Yarrowia spp.，Saccharomyces spp.；霉菌包括曲霉屬種，青霉屬種，和根霉屬種(Rhizopus spp.)。
根據本發明的另一個實施方案，提供了由來源于Saccharomycesdiastaticus的葡糖淀粉酶基因STA1構建的表面表達系統。
來源于Saccharomyces diastaticus的葡糖淀粉酶長2,337bp，序列為SEQ.ID.No9，該酶分泌到胞外空間，對胞外淀粉進行水解。該酶的氨基酸序列分析表明在氨基末端區具有一個信號序列(SS)，并具有一個蘇氨酸/絲氨酸富集(TS-富集)區，該區包含占總的氨基酸殘基的55％的量的蘇氨酸和絲氨酸殘基。信號序列和蘇氨酸/絲氨酸富集區通過序列為SEQ.ID.NO10的八肽相互連接。盡管該八肽在定向蛋白到外部的過程中起作用，蘇氨酸/絲氨酸富集區負責支持蛋白穿過細胞壁，因此其作用就像錨定介體一樣(Venturini等，Mol.Microbiol.，1997，23，997；Yamashita，I.，Agric.Biol.Chem.，1989，53，483；Yamashita等，Agric.Biol.Chem.，1984，48，1611)。
圖13所示的是利用STA1基因所構建的表面表達系統的載體示意圖，如圖所示，表面表達系統是用僅含信號序列，含信號序列和八肽序列，含信號序列、八肽序列和蘇氨酸/絲氨酸富集區，含信號序列和α-凝集素，含信號序列、八肽和α-凝集素，并以CMCase基因作為報告基因的載體進行構建的。
通過pNPC(p-硝基苯基β-D-cellobiocide)法(Deshpande等，Anal.Biochem.，1984，138，481)的測定，當僅使用信號序列時，大部分CMCase分泌到胞外，而不錨定在細胞壁上。相反，當使用經八肽與信號序列相連的蘇氨酸/絲氨酸富集區時，在上清中CMCase活性很低，而在整個細胞級分中活性很高。平板活性測定法驗證了相同的結果。當僅含信號序列時，在菌落周圍出現大環，這說明CMCase大部分分泌到細胞外。蘇氨酸/絲氨酸富集區的存在阻礙了酶的分泌，這可被其菌落周圍形成小環所證明(如表4及圖14)。
另外，通過FACS分析檢測了具有蘇氨酸/絲氨酸富集區的細胞的熒光，結果表明CMCase存在于細胞表面(如圖15)。
用葡糖淀粉酶基因構建表面表達系統時，葡糖淀粉酶或其結構域可與目的蛋白的氨基末端融合。這樣，該系統解決了由于介體與羧基末端融合，從而使目的蛋白羧基末端活性結構域受到防礙的問題。
因此，根據靶蛋白的性質，此處描述的介體可以開發能夠表達各種類型的靶蛋白的表面表達系統。
實施例通過下面實施例對本發明實際和目前優選實施方案進行舉例說明。
但是，要理解的是，基于本發明的公開內容，本領域的普通技術人員在本發明所限定的宗旨和范圍內可對本發明進行改進和修改。實施例1從多形漢遜酵母中分離編碼細胞壁表達蛋白的基因來源于多形漢遜酵母DL1(ATCC 26012)并用于克隆的菌株DL1-L(Δleu2)從NPO Biotechnologia(莫斯科，俄羅斯)獲得。用不能穿過細胞壁的生物素標記對細胞壁蛋白分布(profile)分析，結果表明該菌株具有與釀酒酵母非常類似的表面蛋白的分布。用編碼釀酒酵母葡聚糖酶可提取的細胞壁蛋白的基因，對來自多形漢遜酵母的細胞壁蛋白進行克隆。
為了從多形漢遜酵母中分離細胞壁蛋白基因，首先從釀酒酵母中獲得了已知編碼細胞壁表達蛋白Cwp1p(GenBank D37975，van der Vaart等，J.Bacteriol.，1995，177，3104)，Cwp2p(GenBank Z28096，van der Vaart等，J.Bacteriol.，1995，177，3104)，Sed1p(GenBank X66838，Seidel，J.and W.Tanner，Yeast，1997，13，3104)，Tir1p(GenBank X12775)，和Tip1p(GenBank M71216，van der Vaart等，J.Bacteriol.，1995，177，3104)，及已知作為細胞質膜蛋白Gas1p(GenBank X53424，Benghezal等，J.Cell Biol.，1995，130，1333)的基因。據報道，由于這些蛋白的羧基末端經過GPI錨與β-1，6-糖苷相連，從而可通過葡聚糖酶處理將這些蛋白從細胞壁上分離出來(Kapteyn等，Biochim.Biophys.Act.，1999，1426，373；Kolla等，J.Biol.Chem.，1997，272，17762)。用這些基因作為探針，對多形漢遜酵母基因組進行southern blot分析。當用釀酒酵母Cwp1p基因作為探針時，沒有從多形漢遜酵母基因組DNA中得到清晰的信號。推斷這可能是因為該基因在二菌株間同源性較低。而其他4個基因均觀察到清晰的信號。相應的DNA片段從基因庫中進行了克隆。<1-1>分離多形漢遜酵母的HpSED1基因為了從多形漢遜酵母中分離SED1同系物，根據Klenow片段方法，對釀酒酵母SED1基因的開放閱讀框通過DIG標記系統(BoehringerMannheim)進行標記，并用作Southernblot分析的探針。在42℃及30％甲酰氨溶液中雜交，并對獲得的信號進行檢測。
Southern blot分析結果如圖1所示。可在4kb EcoRI片段中檢測到信號。從膠中對4kb附近的DNA進行洗脫，然后將DNA片段從EcoRI位點插入到pBluescript II SK(+)中構建基因庫。在同樣的條件下，對基因庫進行southern blot分析，以獲得可與探針雜交并插入DNA片段的重組載體。對命名為HpSED1的DNA序列分析表明4kb DNA片段具有序列為SEQ.ID.NO1的堿基序列，并具有一個包含131個氨基酸序列為SEQ.ID.NO11的開放閱讀框。已知多形漢遜酵母HpSED1基因比釀酒酵母相應基因更短，但具有相同的氨基酸重復序列及蘇氨酸/絲氨酸富集區，而且二者同源性為58.4％。另外，PSORT II預測系統分析表明，多形漢遜酵母HpSed1p具有一個17個氨基酸的信號序列，羧基末端具有一個GPI錨定信號。一個新型的具有其中插入了包含多形漢遜酵母HpSED1基因的4kb EcoR1片段的重組載體的大腸桿菌轉化體于2000年7月11日保藏在韓國生物科學和生物技術研究所(KRIBB)的韓國典型微生物保藏中心保藏號為KCTC 0825BP。<1-2>分離多形漢遜酵母的HpPIR2基因為了從多形漢遜酵母中分離TIR1同系物，根據Klenow片段方法對釀酒酵母TIR1基因的開放閱讀框通過DIG標記系統(Boehringer Mannheim)進行標記，并用作Southern blot分析的探針。在42℃及30％甲酰氨溶液中雜交，并對獲得的信號進行檢測。
Southern blot分析結果如圖2b所示。可在5kb ClaI片段中檢測到信號(泳道9)。從膠中對4kb附近的DNA進行洗脫，然后將DNA片段從ClaI位點插入到pBluescript II SK(+)中構建基因庫。使用<1-1>中同樣的方法，獲得與探針雜交的包含5kb ClaI DNA片段的重組載體。對該5kb ClaI DNA序列分析表明其ORF與釀酒酵母的Pir2p具有51.2％同源性。
為了從多形漢遜酵母a中克隆CWP2同系物，根據Klenow片段方法對釀酒酵母CWP2基因的開放閱讀框通過DIG標記系統進行標記，作為雜交探針。Southern雜交在42℃及30％甲酰氨溶液中進行，檢測信號。Southern blot分析結果如圖2a所示。可在5.5kb SalI片段中檢測到信號。通過對DNA測序分析，該5.5kbSalI片段與ClaI片段的序列相同。在Cwp2p和Tir1p兩種蛋白中，都發現含有序列為SEQ.ID.NO2的重復氨基酸序列，稱為PIR1/2/3重復序列。據推斷，這些重復序列與多形漢遜酵母的HpPIR2基因有很高的同源性，因此當探針與HpPIR2雜交時可能有信號產生。為了排除這種可能性，使用缺失重復序列的基因作為探針進行southern blot分析，但并沒有獲得清晰的信號。
對于從釀酒酵母中分離獲得的PIR2基因編碼的蛋白——Pir2p蛋白，有報道指出它可以通過堿處理方式從細胞壁中釋放出來，但不能通過葡聚糖酶處理來釋放，這意味著該蛋白以一種不同于GPI(糖基磷脂酰肌醇)錨定蛋白的形式錨定到細胞壁上，而且該蛋白含有一個Kex2切點(Toh-e等，Yeast，1993，9，481)。使用30mM氫氧化鈉處理多形漢遜酵母細胞壁后，對所獲得的主要細胞壁蛋白進行N末端氨基酸分析(Mrsa等，Yeast，13，1145-1154，1997)，結果表明具有序列為SEQ.ID.NO3，并與HpPir2p kex2切點后多肽相同的氨基酸序列。因此推斷從多形漢遜酵母獲得的HpPIR2基因所編碼的HpPir2p蛋白可轉移到細胞壁上。
多形漢遜酵母的Pir2p蛋白由一個長1,014bp，序列為SEQ.ID.NO4的基因編碼，該蛋白包含337個氨基酸，并具有PIR1/2/3重復，其序列為SEQ.ID.NO12。該蛋白具有一個18個氨基酸的信號序列，并在68位殘基處有一個Kex2切點。一個新型的用其中插入了多形漢遜酵母HpPIR2基因的5.5kb SalI片段的重組載體轉化的大腸桿菌轉化體于2000年7月11日保藏在韓國生物科學和生物技術研究所(KRIBB)的韓國典型微生物保藏中心保藏號為KCTC 0827BP。<1-3>分離多形漢遜酵母的HpGAS1基因根據Klenow片段方法對釀酒酵母GAS1基因通過DIG標記系統(Boehringer Mannheim)進行標記，并用作Southern blot分析的探針。在42℃及30％甲酰氨溶液中雜交，并對獲得的信號進行檢測。
在1.6kb SalI片段中檢測到信號。為了鑒定基因的全長，用其他限制性內切酶處理基因組，并在42℃及30％甲酰氨溶液中與同樣的探針進行雜交。如圖3所示，在3kb PstI片段檢測到信號。將命名為HpGAS1PstI片段克隆并從PstI位點插入到pBluescript II SK(+)中構建重組載體。重組載體的DNA序列分析表明多形漢遜酵母的HpGas1p由一個長1614bp，序列為SEQ.ID.NO5的基因編碼，包含序列為SEQ.ID.NO14的537個氨基酸，并與釀酒酵母Gas1p的同源性高達70.7％。另外，也發現多形漢遜酵母的HpGas1p具有一個18個氨基酸的分泌信號序列，但GPI錨定信號與釀酒酵母不同。
一個新型的具有包含多形漢遜酵母HpGAS1基因的3kb PstI片段的重組載體的大腸桿菌轉化體于2000年7月11日保藏在韓國生物科學和生物技術研究所(KRIBB)的韓國典型微生物保藏中心保藏號為KCTC0828BP。<1-4>分離多形漢遜酵母的HpTIP1基因根據Klenow片段方法對釀酒酵母TIP1基因的開放閱讀框通過DIG標記系統(Boehringer Mannheim)進行標記，并用作Southern blot分析的探針來篩選多形漢遜酵母TIP1同系物。在42℃及30％甲酰氨溶液中雜交，并對獲得的信號進行檢測。
Southern blot分析結果如圖4所示。可在3.5kb XbaI片段中檢測到一個明顯的信號。將命名為HpTIP1的3.5kb片段在XbaI位點插入到pBluescript II SK(+)構建重組載體。重組載體DNA序列分析表明克隆的基因長852bp，序列為SEQ.ID.NO6，編碼一個序列為SEQ.ID.NO13的具有283氨基酸的蛋白。一個新型的具有包含多形漢遜酵母HpTIP1基因的3.5kb XbaI片段的重組載體的大腸桿菌轉化體于2000年7月11日保藏在韓國生物科學和生物技術研究所(KRIBB)的韓國典型微生物保藏中心保藏號為KCTC 0824BP。<1-5>分離多形漢遜酵母的HpCWP1基因根據Klenow片段方法對釀酒酵母CWP1基因的開放閱讀框通過DIG標記系統(Boehringer Mannheim)進行標記，并用作Southern blot分析的探針來篩選多形漢遜酵母CWP1同系物。在42℃及30％甲酰氨溶液中雜交，并對信號進行檢測。
如圖5所示，可檢測到幾個較弱的信號，在各信號中，命名為HpCWP1的6kb SalI片段信號最強，將其在SalI位點插入到pBluescript II SK(+)構建重組載體。DNA序列分析表明重組載體中的克隆基因長246bp，其序列為SEQ.ID.NO7的開放閱讀框與釀酒酵母Cwp1p同源性很低。另外，根據POSRT II預測程序表明，其序列為SEQ.ID.NO15的氨基酸序列具有一個15個氨基酸的分泌信號序列及GPI錨定信號。一個新型的具有包含編碼多形漢遜酵母HpCwp1p的6kb SalI片段的重組載體的大腸桿菌轉化體于2000年7月11日保藏在韓國生物科學和生物技術研究所(KRIBB)的韓國典型微生物保藏中心保藏號為KCTC 0826BP。<1-6>分離多形漢遜酵母的HpWSC1基因根據以下事實當綠色熒光蛋白(GFP)作為Wsc1p融合部分表達時，可在細胞表面觀察到熒光，從而推測出Wsc1p的氨基末端結構域可作為表面表達介體。
在分離多形漢遜酵母的LEU2基因的過程中，HpWSC1基因由Agaphonov等獲得(Agaphonov等，Yeast，1994，10，509，GenBank U00889)。DNA序列分析表明多形漢遜酵母HpWSC1基因由1,110bp，序列為SEQ.ID.NO8的序列構成，編碼一個373個氨基酸的序列。由分離自多形漢遜酵母的HpWSC1基因編碼的蛋白是一個在錨定機理上不同于GPI-錨定蛋白的細胞表面蛋白，并且可通過其氨基末端結構域用于開發表面表達系統。實施例2使用自多形漢遜酵母中分離的細胞壁蛋白的表面表達系統<2-1>構建表面表達系統構建其中實施例1自多形漢遜酵母中分離的4個GPI錨定蛋白基因和HpWSC1基因用作為外源蛋白的表面表達的介體基因的表面表達系統。來源于Bacillus subtilis的CMCase基因(Park等，Agric.Biol.Chem.，1991，55，441)作為報告基因，與每個介體基因一起用于表面表達系統。
此處，GAPDH啟動子(Sohn等，Appl.Microbiol.Biotechnol.，1999，51，800)和殺傷毒素信號序列(Sor，F.and Fukuhara，Curr.Genet.，1985，9，147)插入到AMIpL1載體(Agaphonov等，Yeast，1999，15，541)中。然后將CMCase基因符合讀框地融合，從而得到CMCase表面表達載體，并被命名為pGKCMCF，它可以在GAPDH啟動子控制下表達CMCase，如圖6所示。通過PCR獲得對應于從31位甘氨酸到355位天冬氨酸的氨基酸序列的CMCase基因序列，并將其連接到表達載體中的殺傷毒素信號序列的下游。如圖6所示，介體基因插入到在限制性內切酶BamHI/HindIII識別位點之間的CMCase基因羧基區。另外，設計表達載體具有一個ARS，HARS36，它可以指導載體整合到宿主細胞染色體的端粒區，從而能夠比較表面錨定蛋白的轉移效率(Sohn等，J.Bacteriol.，1996，178，4420)。
4個推測的GPI錨定蛋白基因，HpCWP1，HpGAS1，HpTIP1和HpSED1基因片段用合適的引物對從重組載體上通過PCR擴增得到，所用的引物對被設計為對PCR產物提供BamHI和HindIII位點。擴增的推測GPI錨定蛋白基因在CMCase基因的羧基末端區中的BamHI/HindIII位點插入到表達載體pGK CMCF中，從構建HpCWP1，HpGAS1，HpTIP1和HpSED1的CMCase表面表達載體，并分別命名為CwpF，GasF，TipF和SedF。
用包含BamHI/HindIII位點的引物對，通過PCR擴增得到4個各自編碼每種蛋白40個羧基末端氨基酸的核酸片段，將其分別插入到表達載體中，構建CMCase表面表達載體，并分別命名為Cwp40，Gas40，Tip40和Sed40。
已知來自釀酒酵母的GPI-錨定蛋白Cwp2p具有卓越的錨定效率，為了對表面錨定效率進行比較，通過PCR合成編碼Cwp2p的羧基末端92個氨基酸序列的DNA片段，并將其插入到相同的載體中，以便構建Cwp2p的CMCase表面表達載體，命名為ScCwp2，作為對照。
包含該介體蛋白基因的CMCase表面表達載體轉化到多形漢遜酵母DL1-L(Hill等，Nucl.Acids Res.，1991，19，5791)中，并在不含亮氨酸的基本合成培養基(2％葡萄糖，0.67％無氨基酸的酵母氮堿(base)，各種合適濃度的氨基酸)上篩選轉化子。<2-2>測定表面錨定的CMCase活性將每個篩選的克隆接種到YPD培養基(2％葡萄糖，2％蛋白胨，1％酵母膏)中，在37℃培養18小時，然后根據DNS(二硝基水楊酸)法(G.L.Miller，Anal，Biochem.，1959，31，426)測定上清和整個細胞級分的CMCase活性。
為了檢測CMCase活性，通過離心將培養液分為上清和整個細胞級分。整個細胞級分用醋酸緩沖液(10mM醋酸緩沖液，pH5.0)洗2次后，再溶于相同的緩沖液中。所得的懸浮液加入1％CMC(羧甲基纖維素)溶液中，55℃溫育30分鐘。然后在DNS溶液中煮沸5分鐘終止反應。550nm測定吸收值。結果如下表1所示。CMCase酶活性單位定義為U，1U表示的是在1分鐘內從CMC釋放1μmole葡萄糖的酶活性的量。
表1根據錨定介體的CMCase的表面表達活性上清中的活性整個細胞級分中的活性錨定介體(U/ml) (U/ml)Sed40 0.40 0.059SedF0.41 0.030Tip40 0.92 0.090TipF0.45 0.024Gas40 0.19 0.010GasF0.61 0.080Cwp40 1.10 0.150CwpF0.65 0.110MCMC0.14 0.003CMC*1.92 0.000ScCwp2 0.15 0.020DL1 0.00 0.000MCMC帶有無分泌信號序列的CMCase表達載體的轉化體。CMC*帶有具有分泌信號序列、CMCase基因，并由終止密碼子代替錨定介體的CMCase表達載體的轉化體。DL1沒有表達載體的野生型細胞。
在上清級分中，可觀察到高的CMCase活性。據信這是因為CMCase在GAPDH啟動子調控下表達的太多而不能正確錨定到細胞表面的事實而造成的。而且，由于用作為CMCase活性測定的底物的CMC分子量較大，所以錨定到細胞中的酶不能有效接近CMC。與那些用對照載體(缺失分泌信號序列的MCMC，及無介體基因的CMC)轉化的菌株相比，用包含介體基因的載體轉化的菌株在整個細胞級分中表現出明顯改進的CMCase活性，因此表明CMCase被每個介體輸出到細胞表面。另外發現，在包含Tip40，GasF，Cwp40p和CwpF的轉化體中，CMCase轉移到細胞表面的效率比包含其他介體的菌株高，如圖7所示。
根據培養時間對CMCase活性進行監測，結果如圖8所示。當到達穩定期時，大多數細胞的CMCase活性趨向于降低。但發現帶有含有HpCWP1基因的表面表達載體的細胞在整個細胞級分中的CMCase活性在整個培養期均保持很高，雖然在穩定期也有所降低。因此推斷HpCwp1p是所有檢測蛋白中最穩定的介體，如圖8所示。
從上面所得的數據可知，在從多形漢遜酵母中分離的4種新型GPI-錨定蛋白中，鑒定出HpCwp1p具有更高的表面表達效率和穩定性。實施例3使用HpPir2p的表面表達系統<3-1>構建表面表達系統構建其中用HpPIR2基因作為外源蛋白的表面表達的介體并以CMCase作為報告蛋白的表面表達載體，該HpPIR2基因編碼的細胞壁表達蛋白不同于GPI錨定蛋白。如圖9所示，將CMCase融合在HpPir2p的二末端之任一，以確定HpPir2p蛋白的哪一部分對在細胞壁上表達靶蛋白是有用的。
為了利用HpPir2p羧基末端與目的蛋白融合，通過PCR合成了一個基因片段，該片段編碼從HpPir2p蛋白的Kex2切點到其終止密碼子的序列，并將該片段在限制酶切位點(BamHI/HindIII)處插入到實施例2所構建的表達載體pGK CMCF中，得到的重組表達載體，命名為Pir-C。對HpPir2p的氨基末端而言，將殺傷毒素信號序列從表達載體pGK CMCF中刪除，并用編碼HpPir2p的自起始密碼子蛋氨酸到終止密碼子的全長開放閱讀框的基因片段代替，以使HpPIR2基因直接與CMCase的氨基末端融合。得到的表面表達載體命名為Pir-N。表達載體轉化多形漢遜酵母，隨后以上述相同的方式篩選轉化子。<3-2>表面錨定的CMCase的活性測定將實施例3-1所篩選的轉化子在YPD培養基中培養后，測定其CMCase活性。結果如下表2所示。
表2使用HpPir2p作為表面表達介體的多形漢遜酵母的CMCase活性介體上清中的活性(U/ml) 整個細胞級分中的活性(U/ml)Pir-C#13.33 0.010Pir-C#22.80 0.009Pir-N#11.83 0.080Pir-N#21.86 0.084CMC*2.53 0.000如表2所示，當用HpPir2p蛋白的羧基末端區作為介體(Pir-C)時，測定的CMCase活性與用具有終止密碼子的CMCase基因時幾乎相同，這說明HpPir2p蛋白的羧基末端區完全沒有表面錨定能力。并且，CMCase活性不受插入HpPir2p蛋白的影響。相反，當用HpPir2p蛋白氨基末端區作為介體時(Pir-N)，不僅在上清檢測到CMCase活性，而且也在整個細胞級分中檢測到CMCase活性，這說明CMCase在細胞壁上表達。
因此，HpPir2p蛋白錨定在細胞壁上，并且因此可用作表面表達介體。與傳統GPI錨定蛋白相比，HpPir2p蛋白的優勢在于將靶蛋白的氨基末端與其羧基末端進行連接。該錨定蛋白可用于避免當目的蛋白在其羧基末端區具有活性位點時發生的活性損失的問題。實施例4使用HpWsc1p的表面表達系統<4-1>構建表面表達系統如圖10a所示，HpWsc1p蛋白由一個將該蛋白錨定在細胞膜上的跨膜結構域，一個穿過細胞壁的絲氨酸/蘇氨酸富集區，及一個存在于胞外空間起檢測外部信號作用的氨基末端半胱氨酸基序構成(Verna等，Proc.Natl.Sci.USA，1997，13804)。
在該實施例中，HpWSC1基因用來構建表面表達系統。此處，CMCase融合到HpWsc1p氨基末端并且作為暴露在細胞表面的報告蛋白。
為了鑒定哪個結構域負責在細胞壁上的錨定，用設計有BamHI/HindIII位點的引物對通過PCR合成截短的HpWSC1基因片段。將4個截短的HpWSC1基因片段，缺失半胱氨酸基序(wsc-t)或跨膜結構域(Wsc-c)，和二者均缺失(Wsc-o)，及完整的編碼全長HpWSC1的WSC1基因(Wsc-ct)，在BamHI/HindIII位點插入到質粒載體中(如圖10b)。將重組載體轉化入多形漢遜酵母DL1-L，隨后以上述相同的方式篩選轉化子。<4-2>測定表面錨定的CMCase活性篩選的轉化子在YPD肉湯中培養18小時后，根據DNS法測定其CMCase活性，結果如下表3所示。
表3使用HpWsc1p作為表達介體的多形漢遜酵母菌株的CMCase活性表達介體 上清中的活性整個細胞級分中的活性(U/ml) (U/ml)Wsc-c 0.90 0.002Wsc-ct 0.35 0.069Wsc-o 2.40 0.003Wsc-t 0.04 0.006CMC*2.54 0.000DL1 0.00 0.000
如表3所示，只有當跨膜結構域存在于融合蛋白中時(Wsc-ct，Wsc-t)，CMCase不進行分泌，而保持附著在細胞上。但如果缺失半胱氨酸基序(Wsc-o，Wsc-t)，即使存在跨膜結構域，在全細胞級分中也沒有檢測到CMCase活性。該結果被認為是由于CMCase沒有充分地暴露在細胞表面的事實造成的。相反，當跨膜結構域缺失時(Wsc-o，Wsc-c)，大部分CMCase活性存在于上清中。另外發現，半胱氨酸基序對CMCase分泌的做附加的貢獻。
因此，來源于HpWsc1p的介體必須同時具有半胱氨酸基序和跨膜結構域才能進行有效錨定。由于在整個細胞級分中檢測到的活性與GPI錨定蛋白幾乎相同，這說明HpWsc1p可作為一個新型介體，用于在細胞表面表達蛋白。實施例5葡萄糖氧化酶的表面表達系統<5-1>構建表面表達系統在檢測的介體蛋白中，對3個GPI錨定蛋白，HpTip1p(Tip40)，HpGas1p(GasF)和HpCwp1p(CwpF)，及HpWsc1p(Wsc-ct)進行了葡萄糖氧化酶的表面表達的檢測。對葡萄糖氧化酶的表面表達而言，通過PCR合成葡糖淀粉酶信號序列及葡萄糖氧化酶基因，并將其彼此融合后克隆到pBluescript II SK(+)中。包含表達介體基因的pGK CMCF載體用EcoRI和BamHI進行處理，以除去殺傷毒素信號序列和CMCase基因，然后插入葡萄糖氧化酶表達盒，從而得到表面表達載體pGA GOD。用該載體轉化入多形漢遜酵母DL1-L，然后用與上述CMCase相同的方式篩選轉化子。<5-2>表面錨定的葡萄糖氧化酶的活性測定將實施例5-1中篩選的轉化子轉移到YPD平板培養基上，用過氧化物酶和O-聯茴香胺根據平板活性測定法(Hodgkins等，Yeast，1993，9，625)測定葡萄糖氧化酶活性。如圖11所示，用錨定介體(Tip40，GasF，CwpF和Wsc-ct)表達的葡萄糖氧化酶比不含它們(GOD*)的產生一個更小的葡萄糖氧化酶活性圈。
在YPD培養基上培養后，對通過平板活性檢測法檢出的在細胞表面具有葡萄糖氧化酶活性的轉化子進行FACS分析，并以野生型作為對照。FACS結果如圖12。此處，培養后的細胞用磷酸鹽緩沖液(PBS，pH6.5)洗2次，然后懸浮在含有1％BSA(小牛血清白蛋白)的PBS中。懸浮液中加入葡萄糖氧化酶抗體(Accurate Chemicals)，冰上放置1小時，然后細胞用同樣的緩沖液洗滌3次并重懸。向懸浮液中加入二抗(FITC-標記的抗兔抗體，Sigma)，并在冰上溫育30分鐘，然后用同樣的緩沖液洗滌細胞3次。
在所有使用錨定介體的情況下，均可通過FACS分析(熒光活化細胞分選儀)觀察到熒光細胞，表明葡萄糖氧化酶得到表達并錨定在細胞表面。而且，所有菌株在整個細胞級分中檢測到的葡萄糖氧化酶活性均高于上清中的活性。總之，發現表面錨定的葡萄糖氧化酶活性與CMCase得到的結果是一致的。當使用CwpF時，可在大量細胞中檢測到熒光，表明CwpF具有卓越的細胞壁錨定活性。而且通過FACS分析還發現，Tip40可在細胞表面有效表達蛋白(Fig.12)。在GasF和Wsc-tc介導下，可檢測到作為細胞壁錨定證據的熒光，但水平低，就我們所知，其原因是GasF和Wsc-tc均為細胞質膜膜蛋白，從而與其他介體相比較，它們在細胞表面的暴露較弱。但即使在這種情況下，如果將底物滲入到細胞壁中，則該酶的活性檢測似乎毫無問題。
綜合考慮使用各種介體將兩種酶錨定在細胞壁上的測定結果，證明HpCwp1p在GPI錨定蛋白中是最有效的表面錨定介體，而提示HpPir2p和HpWsc1p蛋白可作為新型的表面錨定介體。實施例6使用葡糖淀粉酶基因的表面表達系統<6-1>構建表面表達系統對一種已知細胞壁蛋白作為表達介體的有效性進行了調查。獲得來源于Saccharomyces diastaticus的葡糖淀粉酶基因STA1，并研究其構建在釀酒酵母中的表面表達系統的有效性。
用合適的引物通過PCR合成各種截短的STA1基因片段，并在EcoRI和SmaI位點插入到pBluescript II SK(+)中。通過DNA測序鑒定克隆。重組載體用EcoRI和HindIII消化，以插入釀酒酵母GAPDH啟動子。插入后得到的重組載體用KpnI和EheI消化，以得到各種STA1基因與GAPDH融合的片段，并將它們在KpnI/PstI位點插入到表達載體YEp352(Hill等，Yeast，1986，2，163)中，從而得到CMCase表面表達載體。
參照圖13所示的是使用STA1基因構建的表面表達系統示意圖。如圖所示，表面表達系統是由各種載體構建的，這些載體僅含有信號序列(STASS)，含有信號序列和八肽序列(STASS-8)，含有信號序列、八肽序列和蘇氨酸/絲氨酸富集區(STASS-8-TS)，含有信號序列和蘇氨酸/絲氨酸富集區(STASS-TS)，含有信號序列和α-凝集素(STASS-CMC-Agalc)，含有信號序列、八肽序列和α-凝集素(STASS-8-CMC-Agalc)，并以CMCase基因作為報告基因。通過PCR合成CMCase基因，用SmaI/PstI酶切并插入到表達載體中。得到的表達載體轉化釀酒酵母L3262，然后在不含尿嘧啶的基礎平板培養基上篩選具有表達載體的轉化子。<6-2>表面錨定的CMCase的活性測定將實施例6-1中篩選的轉化子在YPD培養基中30℃培養48小時，測定CMCase活性。通過pNPC(p-苯硝基β-D-cellobiocide)法(Deschpande等，Anal.Biochem.，1984，138，481)測定CMCase活性。每個轉化子的培養液通過離心分為上清和整個細胞級分。細胞用PBS洗滌3次并重懸在PBS中。懸浮液與2.5mM pNPC溶液混合，在37℃溫育1小時，然后加入等體積2％碳酸鈉(Na2CO3)終止反應。在410nm測定吸收值，結果如下表4所示。在表4中，CMCase酶活性定義為U，1U定義為在1分鐘釋放1μmole pNP的酶活性量。
表4釀酒酵母中的CMCase活性ss-ss8- ssts- ss8ts-CMCCMCCMC CMC上清中的活性(U/l) 339389189 145整個細胞級分中的活件(U/l) 13.6 14.5 12 128整個細胞級分中的活性3.93.637 47上清中的活性(％)如表4所示，當僅使用信號序列時(SS-CMC)，大部分CMCase分泌到胞外，不錨定在細胞壁上。相反，當使用直接與信號序列相連的蘇氨酸/絲氨酸富集區(SS-TS-CMC)或通過八肽序列與信號序列相連的蘇氨酸/絲氨酸富集區(SS-8-TS-CMC)時，在上清中檢測到的酶活性低，而在整個細胞級分中高。
平板活性測定證實了同樣的結果，如圖14。僅有信號序列時(SS)，由于大部分表達的酶分泌到胞外，從而在菌落周圍形成很大的圈。相反，當蘇氨酸/絲氨酸富集區存在時，在菌落周圍形成小的圈，這證明蘇氨酸/絲氨酸富集區阻礙了酶的分泌。
為了確定CMCase轉移到細胞表面，通過與多形漢遜酵母中同樣的方式對CMCase進行了FACS分析。結果如圖15。如FACS圖表所觀察到的，在含有蘇氨酸/絲氨酸富集區的細胞中可檢測到熒光，表明CMCase存在于細胞表面。同時，在CMCase與α-凝集素羧基末端融合后，通過測定CMCase活性來檢測表面錨定能力。但在這種情況下，不比僅使用蘇氨酸/絲氨酸富集區時檢測到的CMCase活性高。因此，鑒定出STA1基因中單獨的蘇氨酸/絲氨酸富集區可作為良好的表面錨定介體。
因此，當用于構建表面表達系統時，葡糖淀粉酶或它的結構域可融合在靶蛋白的氨基末端。從而，這些系統可克服由于介體融合在羧基末端而造成靶蛋白的羧基末端活性結構域受到防礙時引起的各種問題。因此，此處描述的介體可根據靶蛋白的性質開發各種能夠表達各種類型的靶蛋白的表面表達系統，。
工業適用性如上所述，來源于工業上有用的甲醇營養性酵母多形漢遜酵母的表面表達蛋白可用于高效構建表面表達系統及開發生物催化劑應用系統。因為本發明所建立的表面表達系統可生產工業上有用的生物材料，如酶、抗原、抗體等，而且可提供工業生產工具如固定化生物催化劑，因此它們在各種工業，包括醫藥工業、食品工業和化學和生化工業等具有無數的應用價值。
本發明已用舉例說明的方式進行了描述，應理解所用的術語在本質上是描述性的而不是限制性的。根據上述技術，可對本發明進行許多改進和變化。因此，應理解，在所附的權利要求范圍中，本發明可以以除了具體描述的方式外的其它方式實施。
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序 列 表Pc0300-1序列表<110>韓國生命工學研究院<120>來源于酵母的新型細胞壁錨定蛋白及其基因和細胞表面表達系統<130>0FPO-07-20<160>15<170>KopatentIn 1.55<210>1<211>396<212>DNA<213>多形漢遜酵母<400>1atgcaattca gaactttggc tccacttgct ttggcttccg ctgctttcgc tgcttactct 60aacggcaccg tctccaccat tacttacgag accaccgttt ctgaggtcgt tactgctttg120actacctact gcccagaagc cacctctatc gtcaccaacg gaaagaccta cactgtcact180ggtgccacca ccttgaccat caccgactgc ccatgcacta agaagaaggt catcaccacc240accactgtca ccaccatccc agctaaatct tccactgctg cttcctctgt tgctgcttcc300tctgctccag tcatctccac tgccgagaac gctggtgcta aggttggtgc tgctggtttg360gctgcccttg ccggtgctgc tgctttcttg ctctaa 396<210>2<211>9<212>PRT<213>多形漢遜酵母<400>2Ser Gln Ile Gly Asp Gly Gln Ile Gln1 5<210>3<211>13<212>PRT<213>多形漢遜酵母<400>3
Pc0300-1Gly Val Val Xaa Gln Ile Gly Asp Gly Gln Ile Gln Ala1 5 10<210>4<211>1014<212>DNA<213>多形漢遜酵母<400>4atgaagttca catcctcgct cgctgccatc agtttggcct ccaacgcatt cgctgcctat 60gttggctcta cctactggac taccatgacc ccatcctaca ccctggatgg tgctctgact 120agctactcgg ctactttcgg tattgctgtt gaaccactag agaccagttc ctcggtttcc 180gcctctctca acgttgagaa aagacaggtt gtttctcaaa ttggtgatgg tcaaattcag 240gctaccacga acaccgagaa agaaacctcc aaatcctcta cttctactgc cgcagctgtt 300gtgtcgcaaa tcacggacgg tcaaatccaa gccaccactg ccaccaccac ctcttcttca 360tcgagctcca agaagactgc cgcagctgtt gtcactcaaa ttggsgacgg tcaaatccaa 420gctaccacct ccacttcttc caagagcact gctgctgacg ttgttaccca aatcggcgat 480ggtcagatcc aagccaccag caagtcgtca tccacttcca ctgctgctga cgttgtgtct 540cagatcactg acggccagat ccaagctacc accagcacca aggcctcttc tgccaccacc 600agcggtgtga tctcccagat ctccgacggt caaatccagg catcttccac cgcttcttcg 660aagacctcca ccgcttcctc atccactgca actggagact acgtcacctc tgtgtcctgt 720aagaaggagg gtgctctggc catgactttg aaggacggta tcctgtatga ctcggaggga 780agaattggct ctatcgttgc taacagacaa ttccaattcg acggtcctcc accacaagct 840ggtgccatct atgctgacgg atggtccatt tccccagacg gatacctggc cattggtaac 900gacaccatat tctaccagtg tctgtcgggc accttctaca acttgtacga ccagtcgatt 960ggaggccaat gtaataaggt ccacttgaag gctgtcgagt tggtcgactg ttag 1014<210>5<211>1614<212>DNA<213>多形漢遜酵母
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權利要求書(按照條約第19條的修改)1.來源于多形漢遜酵母的由SEQ.ID.NO1表示的新型細胞壁蛋白基因HpSED1及其同系物。
2.一種新型的由權利要求1的HpSED1基因編碼的由SEQ.ID.NO11代表的細胞壁蛋白HpSed1p及其同源體。
3.由包含權利要求1的HpSED1基因的4kb EcoRI片段的重組載體轉化的大腸桿菌轉化體(保藏號KCTC 0825BP)。
4.來源于多形漢遜酵母的由SEQ.ID.NO4代表的新型細胞壁蛋白基因HpPIR2及其同系物。
5.一種新型的由權利要求4的HpPIR2基因編碼的由SEQ.ID.NO12表示的細胞壁蛋白HpPir2p及其同源體。
6.由包含權利要求4的HpPIR2基因的5.5kb SalI片段的重組載體轉化的大腸桿菌轉化體(保藏號KCTC 0827BP)。
7.來源于多形漢遜酵母的由SEQ.ID.NO5代表的新型細胞壁蛋白基因HpGAS1及其同系物。
8.一種新型的由權利要求7的HpGAS1基因編碼的由SEQ.ID.NO14代表的細胞壁蛋白HpGas1p及其同源體。
9.由包含權利要求7的HpGAS1基因的3kb PstI片段的重組載體轉化的大腸桿菌轉化體(保藏號KCTC 0828BP)。
10.來源于多形漢遜酵母的由SEQ.ID.NO6表示的新型細胞壁蛋白基因HpTIP1及其同系物。
11.一種新型的由權利要求10的HpTIP1基因編碼的由SEQ.ID.NO13表示的細胞壁蛋白HpTip1p及其同源體。
12.由包含權利要求10的HpTIP1基因的3.5kb XbaI片段的重組載體轉化的大腸桿菌轉化體(保藏號KCTC 0824BP)。
13.來源于多形漢遜酵母的由SEQ.ID.NO7代表的新型細胞壁蛋白基因HpCWP1及其同系物。
14.一種新型的由權利要求13的HpCWP1基因編碼的由SEQ.ID.NO15代表的細胞壁蛋白HpCwp1p及其同源體。
15.由包含權利要求13的HpCWP1基因的6kb SalI片段的重組載體轉化的大腸桿菌轉化體(保藏號KCTC 0826BP)。
16.在細胞表面表達外源多肽或蛋白的表面表達系統，其中由權利要求1、4、7、10和13的DNA序列，其同系物或部分的片段所編碼的多肽或其部分的片段被用作表達介體，將外源多肽或蛋白定位在細胞表面。
17.在細胞表面表達外源多肽或蛋白的表面表達系統，其中由來源于Saccharomyces diastaticus的含有由SEQ.ID.NO9代表的堿基序列STA1或其部分片段的分離的DNA所編碼的多肽或其部分片段被用作表達介體，將外源多肽或蛋白定位在細胞表面。
18.在細胞表面表達外源多肽或蛋白的表面表達系統，其中由來源于多形漢遜酵母的含有SEQ.ID.NO8所代表的堿基序列的HpWSC1所編碼的多肽或其部分的片段，或由來源于釀酒酵母的堿基序列WSC1所編碼的多肽或其部分的片段被用作表達介體，將外源多肽或蛋白定位在細胞表面。
19.權利要求16到18中的任何一項的表面表達系統，其中的細胞是選自酵母種和霉菌種的種，酵母種包括念珠菌屬種，殺德氏酵母屬種，漢遜酵母屬種，克魯維酵母菌屬種，畢赤氏酵母屬種，裂殖酵母屬種，Yarrowia spp.，Saccharomyces spp.；霉菌種包括曲霉屬種，青霉屬種，和根霉屬種。
權利要求
1.來源于多形漢遜酵母的由SEQ.ID.NO1表示的新型細胞壁蛋白基因HpSED1及其同系物。
2.由包含權利要求1的HpSED1基因的4 kb EcoRI片段的重組載體轉化的大腸桿菌轉化體(保藏號KCTC 0825BP)。
3.來源于多形漢遜酵母的由SEQ.ID.NO4代表的新型細胞壁蛋白基因HpPIR2及其同系物。
4.由包含權利要求3中HpPIR2基因的5.5 kb SalI片段的重組載體轉化的大腸桿菌轉化體(保藏號KCTC 0827BP)。
5.來源于多形漢遜酵母的由SEQ.ID.NO5代表的新型細胞壁蛋白基因HpGAS1及其同系物。
6.由包含權利要求5的HpGAS1基因的3 kb PstI片段的重組載體轉化的大腸桿菌轉化體(保藏號KCTC 0828BP)。
7.來源于多形漢遜酵母的由SEQ.ID.NO6表示的新型細胞壁蛋白基因HpTIP1及其同系物。
8.由包含權利要求7的HpTIP1基因的3.5 kb XbaI片段的重組載體轉化的大腸桿菌轉化體(保藏號KCTC 0824BP)。
9.來源于多形漢遜酵母的由SEQ.ID.NO7代表的新型細胞壁蛋白基因HpCWP1及其同系物。
10.由包含權利要求9的HpCWP1基因的6 kb SalI片段的重組載體轉化的大腸桿菌轉化體(保藏號KCTC 0826BP)。
11.在細胞表面表達外源多肽或蛋白的表面表達系統，其中由權利要求1、3、5、7和9的DNA序列，其同系物或部分的片段所編碼的多肽或其部分的片段被用作表達介體，將外源多肽或蛋白定位在細胞表面。
12.在細胞表面表達外源多肽或蛋白的表面表達系統，其中由來源于Saccharomyces diastaticus的含有由SEQ.ID.NO9代表的堿基序列STA1或其部分片段的分離的DNA所編碼的多肽或其部分片段被用作表達介體，將外源多肽或蛋白定位在細胞表面。
13.在細胞表面表達外源多肽或蛋白的表面表達系統，其中由來源于多形漢遜酵母的含有SEQ.ID.NO8所代表的堿基序列的HpWSC1所編碼的多肽或其部分的片段，或由來源于釀酒酵母的堿基序列WSC1所編碼的多肽或其部分的片段被用作表達介體，將外源多肽或蛋白定位在細胞表面。
14.權利要求11到13中的任何一項的表面表達系統，其中的細胞是選自酵母種和霉菌種的種，酵母種包括念珠菌屬種，殺德氏酵母屬種，漢遜酵母屬種，克魯維酵母菌屬種，畢赤氏酵母屬種，裂殖酵母屬種，Yarrowiaspp.，Saccharomyces spp.；霉菌包括曲霉屬種，青霉屬種，和根霉屬種。
全文摘要
本發明提供了衍生自酵母的新的細胞壁錨定蛋白，其基因以及使用其粘連多肽到酵母細胞壁的遺傳方法。尤其是，本發明提供了新型的GPI(糖基磷脂酰肌醇)－錨定蛋白基因，SED1，GAS1，TIP1，和CWP1，及其蛋白質，PIR2細胞壁蛋白基因及其蛋白質，其衍生于多形漢遜酵母，以及使用它們將外源的酶或者多肽固定到微生物細胞的細胞壁的細胞表面表達系統。此外，本發明提供了細胞表面表達系統，其使用衍生自包括多形漢遜酵母和釀酒酵母的酵母WSC1基因及其蛋白，和衍生自Saccharomyces diastaticus的STA1基因及其蛋白。本發明的細胞表面表達系統可以通過粘連所需的蛋白到該細胞表面起到生物催化劑的固定作用，并且提供一種通過文庫篩選改變靶蛋白特征如結合親和性和穩定性的手段。
文檔編號C07K14/39GK1454258SQ00819780
公開日2003年11月5日 申請日期2000年7月27日 優先權日2000年7月26日
發明者崔毅星, 孫廷薰, 金素影 申請人:韓國生命工學研究院