專利名稱：依賴細胞周期蛋白的激酶的n－[5－[[[5－烷基－2－噁唑基]甲基]硫基]－2－噻唑基 ...的制作方法
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本發明概述本發明涉及式I的化合物及其對映異構體、非對映異構體和藥學上可接受的鹽 其中R是烷基；R1和R2各獨立是氫或烷基；R3是氫或烷基，和R4是氫或由一個或兩個羥基或一個NR5R6基團取代的烷基，或R3和R4與它們所連接的氮原子一起形成4-到7-元雜環，其中R3R4由-(CH2)n-代表，其中n是3、4、5或6的整數；R5和R6各獨立是氫、烷基、取代的烷基、環烷基或取代的環烷基，或R5和R6與它們所連接的氮原子一起形成4-到7-元雜環，其中R5R6由-(CH2)m-代表，其中m是3、4、5或6的整數；和X是CH或N。
式I的化合物特別用作有效的蛋白激酶抑制劑并用于治療增生性疾病例如癌癥、炎癥和關節炎。它們也可用于治療早老性癡呆、化療引起的脫發和心血管疾病。
本發明詳述本發明提供式I的化合物、含有這些化合物的藥用組合物以及使用這些化合物的方法。
以下列出了許多用于描述本發明化合物術語的定義。這些定義適用于整個說明書中所使用的、單獨或作為大基團一部分的術語(除非它們在特殊情況下有其它限制)。
術語“烷基”或“alk”表示一價烷(烴)衍生的基團，除了另外定義外，該基團含有1-12個、優選1-6個和更優選1-4個碳原子。烷基是任選取代的直鏈、支鏈或環狀的飽和烴基團。當取代時，烷基可以在任何合適的連接點上由最多可達4個取代基(如所定義的R7)取代。當所述烷基被說成由烷基取代時，這種說法與“支鏈烷基”互換使用。典型的未取代的這類基團包括甲基、乙基、丙基、異丙基、正-丁基、叔-丁基、異丁基、戊基、己基、異己基、庚基、4，4-二甲基戊基、辛基、2，2，4-三甲基戊基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基等。典型的取代基包括、但不限于一個或更多個以下的基團鹵代基(如F、Cl、Br或I)鹵代烷基(如CCl3或CF3)、烷氧基、烷基硫基、羥基、羧基、烷基羰基、烷氧基羰基、烷基羰基氧基、氨基、氨基甲酰基、脲基、脒基(amidinyl)或硫羥基。
環烷基是含有3-15個碳原子、在碳原子之間沒有更迭或共振雙鍵的烷基。它可以包括1-4個環。典型的未取代的這類基團包括環丙基、環丁基、環戊基、環己基等。典型的取代基包括一個或更多個以下基團鹵素、烷基、烷氧基、烷基羥基、氨基、硝基、氰基、硫羥基和/或烷基硫基。
本文使用的術語“烷氧基”或“烷基硫基”指如上所述的、分別通過氧鍵(-O-)或硫鍵(-S-)連接的烷基。
本文使用的術語“烷氧基羰基”指通過羰基連接的烷氧基。烷氧基羰基由下式代表-C(O)OR8，其中R8是直鏈或支鏈C1-6烷基。
術語“烷基羰基”指通過羰基連接的烷基。
本文使用的術語“烷基羰基氧基”指通過氧鍵連接的烷基羰基。
適用于本發明所述方法和組合物中的式I化合物的藥學上可接受的鹽包括、但不限于與多種有機和無機酸形成的鹽，所述酸例如是鹽酸、羥基甲磺酸、氫溴酸、甲磺酸、硫酸、乙酸、三氟乙酸、馬來酸、苯磺酸、甲苯磺酸，以及許多其它的鹽如硝酸鹽、磷酸鹽、硼酸鹽、酒石酸鹽、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽、苯甲酸鹽、抗壞血酸鹽、水楊酸鹽等。另外，式I化合物的藥學上可接受的鹽可以由堿金屬如鈉、鉀和鋰；堿土金屬如鈣和鎂；有機堿如二環己基胺、三丁基胺和吡啶等；及氨基酸如精氨酸、賴氨酸等形成。
打算包括所有本發明化合物的立體異構體，無論是混合物還是純的或基本純的形式。根據本發明化合物的定義包括所有可能的立體異構體和它們的混合物。尤其包括外消旋形式和具有特殊活性的離析的旋光異構體。這些外消旋形式可以通過物理的方法拆分，例如非對映異構體衍生物的分級結晶、分離或結晶，或通過手性柱層析分離。單一的光學異構體可以通過常規方法如與旋光性的酸形成鹽，隨后結晶由外消旋物得到。
打算包括本發明化合物的所有構型異構體，無論是混合物還是純的或基本純的形式。本發明化合物的定義特別包括環烷基環的順式和反式異構體。
應該理解，式I化合物的溶劑合物(如水合物)也包括在本發明范圍內。溶劑化方法通常為本領域已知的。因此，本發明的化合物可以是游離的或水合物的形式，可以通過以下方案所列舉的方法得到。
如在方案1中所示，式I的化合物可通常通過式II的胺與式III的羧酸在偶合劑如1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽或1，3-二環己基碳二亞胺存在下，任選在堿存在下反應制備。方案1 如在方案2中所示，式I的化合物也可以通過式II的胺與式IV的羧酸在偶合劑如1，3-二環己基碳二亞胺或1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽存在下反應，形成式V的中間體化合物，并使所述中間體化合物與式VI的胺反應制備。方案2 如在方案3中所示，式I的化合物，其中R2是氫，可以通過式VII的羧酸與草酰氯反應形成酰氯中間體，使所述酰氯中間體與式II的胺反應形成式VIII的醛中間體，再使所述醛中間體與式VI的胺在還原劑如三乙酰氧基硼氫化鈉存在下反應來制備。方案3 如在方案4中所示，式I的化合物，其中R2是烷基，可以通過式VIII的醛與式IX的溴化烷基鎂反應形成式X的醇，使所述式X的醇與亞硫酰氯反應形成式XI的氯化物，再使所述氯化物與式VI的胺反應來制備。方案4 另外，在本文所提供的實施例中敘述了用于制備本發明式I化合物的其它方法。
可以如在方案5中所示制備式II的原料胺。式XII的α-溴酮可以與疊氮化鈉在溶劑如二甲基甲酰胺中反應，得到疊氮酮衍生物XIII，將其用還原劑如氫在披鈀碳催化劑或三苯膦存在下還原，得到氨基酮XIV。或者，化合物XIV可以通過式XII的α-溴酮與六亞甲基四胺在溶劑如丙酮中反應，得到式XV的化合物，將該化合物用酸性介質如鹽酸的乙醇溶液水解來制備。式XIV的化合物可以用試劑如2-氯代乙酰氯酰化，得到式XVI的酰胺。用脫水劑如三氯氧化磷在甲苯中或Burgess’試劑在四氫呋喃中將式XVI的酰胺環化為式XVII的2-氯代甲基噁唑。式XVII的氯代甲基噁唑與硫脲在溶劑如乙醇中反應，得到硫脲衍生物XVIII，它可以與5-溴代-2-氨基噻唑在堿如氫氧化鉀的醇溶液存在下反應，得到式II的胺。或者，式XVII的氯代甲基噁唑衍生物與5-氰硫基-2-氨基噻唑在還原劑如硼氫化鈉存在下反應，得到式II的化合物。方案5 方案5(續) 優選的式I化合物是這樣一些化合物，其中R是叔-丁基；R1和R2各獨立是氫或甲基；R3是氫和R4是氫、-CH2C(CH3)2CH2OH、-CH2CH2OH、-C(CH3)2CH2OH、-CH(CH2OH)2、-CH2CH(OH)CH2OH、-CH(CH3)CH2OH或 或R3和R4與它們所連接的氮原子一起形成5-元雜環，其中R3R4由-(CH2)4-代表；和X是CH或N。
第一組更優選的本發明的化合物是這樣一些式Ia的化合物及其對映異構體、非對映異構體和藥學上可接受的鹽 其中R1和R2各獨立是氫或甲基；和R3是氫，和R4是氫、-CH2C(CH3)2CH2OH、-CH2CH2OH、-C(CH3)2CH2OH、-CH(CH2OH)2、-CH2CH(OH)CH2OH、-CH(CH3)CH2OH或 或R3和R4與它們所連接的氮原子一起形成5-元雜環，其中R3R4由-(CH2)4-代表。
第二組更優選的本發明的化合物是這樣一些式Ib的化合物及其對映異構體、非對映異構體和藥學上可接受的鹽 其中R1和R2各獨立是氫或甲基；和R3是氫，和R4是氫、-CH2C(CH3)2CH2OH、-CH2CH2OH、-C(CH3)2CH2OH、-CH(CH2OH)2、-CH2CH(OH)CH2OH、-CH(CH3)CH2OH或 或R3和R4與它們所連接的氮原子一起形成5-元雜環，其中R3R4由-(CH2)4-代表。
第三組更優選的本發明的化合物是這樣一些式Ic的化合物及其對映異構體、非對映異構體和藥學上可接受的鹽 其中R1和R2各獨立是氫或甲基；和R3是氫，和R4是氫、-CH2C(CH3)2CH2OH、-CH2CH2OH、-C(CH3)2CH2OH、-CH(CH2OH)2、-CH2CH(OH)CH2OH、-CH(CH3)CH2OH或 或R3和R4與它們所連接的氮原子一起形成5-元雜環，其中R3R4由-(CH2)4-代表。
一組最優選的本發明化合物是這樣一些式Ia、Ib和Ic的化合物，其中R4不是氫。
特別用于本發明方法中的式I化合物包括N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[[2-羥基-1-(羥基甲基)乙基]氨基]甲基]苯乙酰胺；4-[[(2，3-二羥基丙基)氨基]甲基]-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺；(R)-4-[[(2，3-二羥基丙基)氨基]甲基]-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺；(S)-4-[[(2，3-二羥基丙基)氨基]甲基]-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺；4-(氨基甲基)-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺；N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[(3-羥基-2，2-二甲基丙基)氨基]甲基]苯乙酰胺；N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-(1-吡咯烷基甲基)苯乙酰胺；N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[(2-羥基乙基)氨基]甲基]苯乙酰胺；N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[[2-(1-吡咯烷基)乙基]氨基]甲基]苯乙酰胺；N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[(2-羥基-1，1-二甲基乙基)氨基]甲基]苯乙酰胺；N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-3-[[(2-羥基乙基)氨基]甲基]苯乙酰胺；N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-3-[[(3-羥基-2，2-二甲基丙基)氨基]甲基]苯乙酰胺；3-(氨基甲基)-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺；N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[(2-羥基-1-甲基乙基)氨基]甲基]苯乙酰胺；N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[1-[(2-羥基乙基)氨基]乙基]苯乙酰胺；N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[1-[(2-羥基-1-甲基乙基)氨基]乙基]苯乙酰胺；(αS)-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[(2-羥基乙基)氨基]甲基]-α-甲基苯乙酰胺；N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-6-[[(2-羥基乙基)氨基]甲基]-3-吡啶乙酰胺；和N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[(2-羥基乙基)氨基]甲基]-α-甲基苯乙酰胺；及其藥學上可接受的鹽。
本發明的化合物具有藥理學特性，特別是式I的化合物是蛋白激酶如依賴細胞周期蛋白的激酶(cdks)，例如cdc2(cdk1)、cdk2、cdk3、cdk4、cdk5、cdk6、cdk7和cdk8的抑制劑。預期新的式I化合物用于增生性疾病如癌癥、炎癥、關節炎、早老性癡呆和心血管疾病的療法中。這些化合物也可以用于治療局部和系統性真菌感染。
尤其是，式I的化合物用于治療多種癌癥，包括(但不限于)以下癌癥-癌，包括膀胱癌、乳腺癌、結腸癌、腎癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、宮頸癌、甲狀腺癌、前列腺癌和皮膚癌；-淋巴系的造血腫瘤，包括急性淋巴白血病、B-細胞淋巴瘤和伯基特淋巴瘤；-骨髓系的造血腫瘤，包括急性和慢性髓細胞白血病和前髓細胞白血病；-間充質源的腫瘤，包括纖維肉瘤和橫紋肌肉瘤；和-其它腫瘤，包括黑素瘤、精原細胞瘤、畸胎瘤、骨肉瘤、成神經細胞瘤和神經膠質瘤。
由于cdks在全身性細胞增殖的調節中的關鍵作用，所以作為可逆的細胞生長抑制劑的抑制劑可以用于治療任何以細胞增殖異常為特征的疾病過程例如神經纖維瘤病、動脈粥樣硬化、肺纖維化、關節炎、銀屑病、腎小球腎炎、血管成形術或血管術后的再狹窄、肥大性疤痕形成、炎性腸道疾病、移植術排斥反應、血管生成和內毒素性休克。
式I的化合物也可以用于治療早老性癡呆，正如近期發現cdk5涉及Tau蛋白的磷酸化作用(J.Biochem，117，741-749(1995))所提示的。
式I的化合物也可以作為其它蛋白激酶如蛋白激酶C、her2、raf1、MEK1、MAP激酶、EGF受體、PDGF受體、IGF受體、PI3激酶、wee1激酶、Src、Ab1、VEGF和1ck的抑制劑，并因此在治療與其它蛋白激酶有關的疾病中有效。
式I的化合物也誘導或抑制細胞凋亡，一種對于正常發育和體內穩態至關重要的生理細胞死亡過程。細胞凋亡途徑的改變成為許多人類疾病的致病原因。式I的化合物，作為細胞凋亡的調節劑將用于治療許多與細胞凋亡失常有關的人類疾病，包括癌癥(特別是，但不限于濾泡性淋巴瘤、伴有p53突變的癌、乳腺、前列腺和卵巢的激素依賴性腫瘤和癌變前的損害如家族性腺瘤樣息肉病)、病毒性感染(包括但不限于皰疹病毒、痘病毒、EB病毒、Sindbis病毒和腺病毒)、自身免疫性疾病(包括但不限于系統性紅斑狼瘡、免疫調節性腎小球腎炎、類風濕性關節炎、銀屑病、炎性腸疾病和自身免疫性糖尿病)、神經變性的疾病(包括但不限于早老性癡呆、AIDS-相關的癡呆、帕金森病、肌萎縮性側索硬化、色素性視網膜炎、脊柱性肌肉萎縮和小腦變性)、AIDS、脊髓發育不良綜合征、再生障礙性貧血、伴有心肌梗死的局部缺血性損傷、中風和再灌注損傷、心律失常、動脈粥樣硬化、毒素-誘發的或酒精誘發的肝疾病、血液疾病(包括但不限于慢性貧血和再生障礙性貧血)、肌肉骨骼系統的變性疾病(包括但不限于骨質疏松和關節炎)、阿斯匹林-敏感性鼻竇炎、胰囊性纖維變性、多發性硬化、腎病和癌性痛。
另外，式I的化合物可以用于治療化療引起的脫發、化療引起的血小板減少癥、化療引起的白細胞減少癥或mucocitis。在治療化療引起的脫發方面，優選以藥劑如凝膠、溶液劑、分散劑或糊劑的形式局部使用式I的化合物。
本發明的化合物可以與已知的抗癌療法如放療或與細胞生長抑制劑和毒害細胞藥聯合使用，所述藥物包括但不限于微管-穩定劑、微管-破壞劑、烷化劑、抗-代謝藥物、表葉毒素、抗腫瘤酶、拓撲異構酶抑制劑、丙卡巴肼、米托蒽醌、鉑配位絡合物、生物應答調節劑、生長抑制劑、激素/抗激素治療劑、造血生長因子等。
可以與本發明的式I化合物聯合使用的抗癌藥物的種類包括但不限于蒽環類抗生素藥物、長春花藥物、絲裂霉素、平陽霉素、細胞毒核苷、紫杉烷、epothilones、discodermolide、蝶啶類藥物、diynenes、芳香酶抑制劑和鬼臼毒素。這些類型的具體成員包括例如紫杉醇、docetaxel、7-O-甲硫基甲基紫杉醇(在US 5,646,176中公開)、3’-叔-丁基-3’-N-叔-丁氧基羰基-4-脫乙酰基-3’-脫苯基-3’-N-脫苯甲酰基-4-O-甲氧基羰基-紫杉醇(在USSN 60/179,965中公開，于2000年2月3日提交，其作為參考結合在本文中)、C-4甲基甲酸酯紫杉醇(在WO94/14787中公開)、epothilone A、epothilone B、epothilone C、epothiloneD、脫氧epothilone A、脫氧epothilone B、[1S-[1]R*，3R*(E)，7R*，10S*，11R*，12R*，16S*]]-7，11-二羥基-8，8，10，12，16-五甲基-3-[1-甲基-2-(2-甲基-4-噻唑基)乙烯基]-4-氮雜-17-氧雜雙環[14.1.0]十七烷-5，9-二酮(在WO 99/02514中公開)、[1S-[1R*，3R*(E)，7R*，10S*，11R*，12R*，16S*]]-3-[2-[2-(氨基甲基)-4-噻唑基]-1-甲基乙烯基]-7，11-二羥基-8，8，10，12，16-五甲基-4，17-二氧雜雙環[14.1.0]十七烷-5，9-二酮(在USSN09/506,481中公開，于2000年2月17日提交，其作為參考結合在本文中)、多柔比星、去甲柔紅霉素、柔紅霉素、氨蝶呤、甲氨蝶呤、甲基葉酸、二氯代-甲氨蝶呤、絲裂霉素C、泊非霉素、5-氟尿嘧啶、6-巰基嘌呤、吉西他濱、阿糖胞苷、鬼臼毒素或鬼臼毒素衍生物如依托泊苷、磷酸依托泊苷或替尼泊苷、美法侖、長春堿、長春新堿、長春西定、長春堿酰胺、環氧長春堿等。其它與本發明化合物聯合使用的有效的抗癌藥物包括但不限于雌莫司汀、順鉑、卡鉑、環磷酰胺、平陽霉素、他莫昔芬、異環磷酰胺、美法侖、六甲三聚氰胺、塞替派、阿糖胞苷、idatrexate、三甲曲沙、達卡巴嗪、L-門冬酰胺酶、喜樹堿、CPT-11、托泊替堪、阿糖胞苷、比卡魯胺、氟他胺、亮丙瑞林、吡啶并苯并吲哚衍生物、干擾素、白細胞介素等。另外，本發明的化合物可以與那些在U.S.6,011,029中所公開的法尼基蛋白轉移酶抑制劑、抗血管生成劑如制管張素和endostatin、激酶抑制劑如her2特異抗體和p53反式激活的調節劑聯合使用。
如果以固定劑量配制，這些組合的產物在以下敘述的劑量范圍內使用本發明的化合物及在已批準的劑量范圍內使用其它的藥用活性劑。當組合制劑不合適時，式I的化合物可以以任何順序與已知的抗癌藥或毒害細胞藥序貫使用。
本發明也提供含有本發明化合物和藥學上可接受的載體的藥用組合物。本發明的藥用組合物還可以含有一種或更多種藥學上可接受的附加成分如明礬、穩定劑、抗菌劑、緩沖劑、著色劑、調味劑等。本發明的化合物和組合物可以口服或胃腸外給予，包括靜脈內、肌內、腹膜內、皮下、直腸和局部途徑給予。
對于口服使用而言，本發明的化合物和組合物可以例如以片劑或者膠囊或以溶液或懸浮液的形式給藥。在口服使用的片劑的情況下，通常使用的載體包括乳糖和玉米淀粉，并且通常加入潤滑劑如硬脂酸鎂。對于以膠囊形式口服給藥而言，所使用的載體包括乳糖和玉米淀粉。當口服給藥使用含水懸浮液時，通常加入乳化劑和/或懸浮劑。另外，對于口服的組合物可以加入甜味劑和/或調味劑。作為肌內、腹膜內、皮下和靜脈內使用，通常使用活性成分的無菌溶液，并且將所述溶液的pH值適當地調節和緩沖。對于靜脈內使用而言，應該控制所述溶質的總濃度，以便使所述制劑等滲。
對于給予人的本發明化合物的日劑量通常由具有處方權的醫師根據病人的年齡、體重、給藥途徑和病人的個體反應以及病人癥狀的嚴重性來決定。優選給予人的本發明的式I化合物的量從每天大約0.001mg/kg體重到大約100mg/kg體重，更優選從每天大約0.01mg/kg體重到大約50mg/kg體重，最優選從每天大約0.1mg/kg體重到大約20mg/kg體重。
cdc2/細胞周期蛋白B1激酶測定通過監測將32P摻入到組蛋白HI中的過程確定cdc2/細胞周期蛋白B1激酶的活性。所述反應物質由溶于激酶緩沖液(50mM Tris，pH8.0，10mM MgCl2，1mM EGTA，0.5mM DTT)中的50ng表達GST-cdc2的桿狀病毒、75ng表達GST-細胞周期蛋白B1的桿狀病毒、1μg組蛋白HI(Boehringer Mannheim)、0.2μCi的32Pγ-ATP和25μM ATP組成。將該反應物質在30℃下孵育30分鐘，然后通過加入冷的三氯乙酸(TCA)至終濃度為15％終止反應，并且在冰上孵育20分鐘。用PackardFiltermate Universal收集器將反應物質收獲到GF/C unifilter板(Packard)上，并將該濾器在Packard TopCount 96-孔液體閃爍計數器上計數(Marshak，D.R.，Vanderberg，M.T.，Bae，Y.S.，Yu，I.J.，J.of CellularBiochemistry，45，391-400(1991)，作為參考結合在本文中)。
cdk2/細胞周期蛋白E激酶測定通過監測將32P摻入到成視網膜細胞瘤蛋白中的過程確定cdk2/細胞周期蛋白E激酶的活性。所述反應物質由溶于激酶緩沖液(50mMHepes，pH8.0，10mM MgCl2，5mM EGTA，2mM DTT)中的2.5ng表達GST-cdk2/細胞周期蛋白E的桿狀病毒、500ng細菌產生的GST-成視網膜細胞瘤蛋白(aa 776-928)、0.2μCi32Pγ-ATP和25μM ATP組成。將該反應物質在30℃下孵育30分鐘，然后通過加入冷的三氯乙酸(TCA)至終濃度為15％終止反應，并且在冰上孵育20分鐘。用PackardFiltermate Universal收集器將反應物質收獲到GF/C unifilter板(Packard)上，并將該濾器在Packard TopCount 96-孔液體閃爍計數器上計數。
cdk4/細胞周期蛋白D1激酶活性通過監測將32P摻入到成視網膜細胞瘤蛋白中的過程確定cdk4/細胞周期蛋白D1激酶的活性。所述反應物質由溶于激酶緩沖液(50mM Hepes，pH8.0，10mM MgCl2，5mM EGTA，2mM DTT)中的165ng表達為GST-cdk4的桿狀病毒、282ng細菌表達為S-tag的細胞周期蛋白D1、500ng細菌產生的GST-成視網膜細胞瘤蛋白(aa 776-928)、0.2μCi32Pγ-ATP和25μM ATP組成。將該反應物質在30℃下孵育1小時，然后通過加入冷的三氯乙酸(TCA)至終濃度為15％終止反應，并且在冰上孵育20分鐘。用Packard Filtermate Universal收集器將反應物質收獲到GF/C unifilter板(Packard)上，并將該濾器在PackardTopCount 96-孔液體閃爍計數器上計數(Coleman，K.G.，Wautlet，B.S.，Morissey，D.，Mulheron，J.G.，Sedman，S.，Brinkley，P.，Price，S.，Webster，K.R.(1997)Identification of CDK4 Sequences involved in cyclin D，andp16 binding.J.Biol.Chem.272，3018869-18874，作為參考結合在本文中)。
為了便于進一步理解本發明，提供主要為了說明其細節的下列實施例。不應該認為本發明的范圍受限于這些實施例，而本發明的范圍包括全部在權利要求書中所定義的主題內容。
實施例14-(氨基甲基)-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺的制備 A.1-疊氮基-3，3-二甲基-2-丁酮 將1-溴代-3，3-二甲基-2-丁酮(199.07g，1.115mol，1當量)與疊氮化鈉(93.9g，1.444mol，1.3當量)在1.785L丙酮中混合。將該反應混合物在室溫下攪拌27.5小時。過濾得到的淤漿并用丙酮(3×150mL)洗滌。在真空下濃縮濾液，得到154.3g(98.4％)1-疊氮基-3，3-二甲基-2-丁酮。HPLC 83.85％在2.57min(Phenomenex 5m C18柱4.6×50mm，含有0.2％磷酸的10-90％含水甲醇，用4分鐘，4mL/min，在220nm處檢測)。B.1-氨基-3，3-二甲基-2-丁酮鹽酸鹽 將1-疊氮基-3，3-二甲基-2-丁酮(400g，1.254mol，1當量)與12NHCl水溶液(439mL，5.26mol，4.2當量)在2L乙醇中混合。將該反應混合物在75℃下攪拌1小時，然后冷卻至室溫。將得到的淤漿過濾。將濾液在真空下濃縮并加入異丙醇。將該溶液再過濾。加入1.2L乙醚使所需物質從溶液中沉淀。將該物質濾出，用乙醚(2×300mL)洗滌并在真空中、50℃下干燥過夜，得到1-氨基-3，3-二甲基-2-丁酮鹽酸鹽184.1g(97％)。C.N-氯代乙酰基-1-氨基-3，3-二甲基-2-丁酮 在N2、-5℃下，將1-氨基-3，3-二甲基-2-丁酮鹽酸鹽(130.96g，0.8637mol，1當量)溶于3.025L CH2Cl2中。加入三乙胺(301mL，2.16mol，2.5當量)，隨后加入溶于175mL CH2Cl2中的氯代乙酰氯(75.7mL，0.450mol，1.1當量)。將得到的淤漿在-5℃到-10℃下攪拌2小時。加入水(1.575L)，隨后加入175mL濃HCl。將有機相再一次用1.75L的10％HCl水溶液洗滌，然后用500mL水洗滌。將有機相經Na2SO4干燥并在真空下濃縮，得到N-氯代乙酰基-1-氨基-3，3-二甲基-2-丁酮155.26g(93.8％)，HPLC R.T.＝2.27min(Phenomenex 5m C18柱4.6×50mm，含有0.2％磷酸的10-90％含水甲醇，用4分鐘，4mL/min，在220nm處檢測)。D.5-叔-丁基-2-氯代甲基噁唑 在N2下，將N-氯代乙酰基-1-氨基-3，3-二甲基-2-丁酮(180.13g，0.9398mol，1當量)與磷酰氯(262mL，2.8109mol，3當量)混合。將該反應混合物在105℃下加熱1小時。將該混合物冷卻至室溫，然后用1.3kg冰猝滅。將含水相用乙酸乙酯(1L，然后2×500mL)萃取。將有機萃取液用飽和NaHCO3水溶液(4×1L)洗滌(用乙酸乙酯反萃取洗液數次)。合并有機相，用飽和NaHCO3水溶液(500mL)洗滌，隨后用飽和NaCl水溶液(300mL)洗滌，經MgSO4干燥并在真空下濃縮，得到棕色油狀物。將該粗制產物在高真空、100℃下蒸餾，得到5-叔-丁基-2-氯代甲基噁唑155.92g(96％)。HPLC R.T.＝3.62min(Phenomenex 5mC18柱4.6×50mm，含有0.2％磷酸的10-90％含水甲醇，用4分鐘，4mL/min，在220nm處檢測)。
另外一種使用Burgess’試劑的替代方法作為一種替代方法，可以通過使合適的氯代酰胺與2當量Burgess’鹽(氫氧化(甲氧基-羰基氨磺酰基)三乙銨內鹽)在四氫呋喃中反應，制備5-叔-丁基-2-氯代甲基噁唑。E.S-[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫脲 在N2下，將5-叔-丁基-2-氯代甲基噁唑(1.77g，10.2mmol，1.02當量)與硫脲(0.76g，9.98mmol，1當量)在10mL無水乙醇中混合。將該反應混合物在回流下加熱1.5小時。將該混合物冷卻至室溫并在真空下濃縮。將得到的粗制產物用叔-丁基甲基醚研磨，得到S-[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫脲2.32g(93％)。HPLC R.T.＝2.05min(Phenomenex 5m C18柱4.6×50mm，含有0.2％磷酸的10-90％含水甲醇，用4分鐘，4mL/min，在220nm處檢測)。1H NMR(d-DMSO)δ9.48(s，3H)，6.85(s，1H)，4.73(s，2H)，1.24(s，9H)。F.2-氨基-5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]噻唑 將S-[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫脲(1.25g，5mmol，1當量)加入到NaOH(3.0g，75mmol，15當量)、水(10mL)、甲苯(10mL)和硫酸四丁基銨(50mg，0.086mmol，0.017當量)的混合物中。加入5-溴代-2-氨基噻唑氫溴酸鹽(1.70g，5mmol，1當量)并將該反應混合物在室溫下攪拌14.5小時，用水稀釋并用乙酸乙酯萃取兩次。將有機萃取液用水(4×10mL)洗滌，經MgSO4干燥并在真空下濃縮，得到2-氨基-5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]噻唑1.1g(82％)。HPLC86.3％在2.75min(Phenomenex 5m C18柱4.6×50mm，含有0.2％磷酸的10-90％含水甲醇，用4分鐘，4mL/min，在220nm處檢測)。1HNMR(CDCl3)δ6.97(s，1H)，6.59(s，1H)，5.40(br s，2H)，3.89(s，2H)，1.27(s，9H)。G.4-(溴代甲基)-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺 在0℃下，將1，3-二環己基碳二亞胺(7.18g，34.8mmol，1.25當量)加入到2-氨基-5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]噻唑(7.5g，27.8mmol，1當量)和4-溴代甲基苯乙酸(7.97g，34.8mmol，1.25當量)的175mL CH2Cl2混合物中。將該反應混合物加溫至室溫。30分鐘后，LC/MS顯示該反應完成。將該混合物過濾并在真空下濃縮到20g硅膠上。將該物質在硅膠上經快速層析純化，用60％乙酸乙酯的己烷溶液洗脫，得到4-(溴代甲基)-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺11.5g(83％)，為黃色固體。
在另外一種制備方法中，在N2、室溫下，將1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(13.8g，72mmol，2當量)加入到2-氨基-5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]噻唑(2.0g，7.42mmol，1當量)和4-溴代甲基苯乙酸(2.60g，11.3mmol，1.5當量)的CH2Cl2(30mL)混合物中。1小時后，將該反應混合物用20mL乙酸乙酯稀釋并用飽和NaHCO3水溶液(2×20mL)洗滌。然后將有機相用10％檸檬酸水溶液洗滌，經MgSO4干燥并在真空下濃縮，得到黃色固體。將該物質用乙醚研磨得到4-(溴代甲基)-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺3.01g(84.4％)。HPLCR.T.＝3.69min(YMCS5 ODS柱4.6×50mm，含有0.2％磷酸的10-90％含水甲醇，用4分鐘，4mL/min，在220nm處檢測)。1H NMR(CDCl3)δ7.37-7.24(m，5H)，6.54(s，1H)，4.47(s，2H)，3.93(s，2H)，3.79(s，2H)，1.27(s，9H)。H.4-(氨基甲基)-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺 將4-(溴代甲基)-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺(純度70％，1.05g，1.53mmol，1當量)溶于40mL N，N-二甲基甲酰胺中并冷卻至-70℃。加入過量的液態氨(6mL)，將反應容器密封后，將該混合物溫熱至室溫。1小時后，將該反應物用乙酸乙酯稀釋，用水(20mL)和飽和NaCl水溶液洗滌，經MgSO4干燥并在真空下濃縮。將得到的黃色油狀物經制備性HPLC純化，得到4-(氨基甲基)-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺270mg(42.4％)。MS417[M+H]+；HPLC R.T.＝3.17min(YMC S5 ODS柱4.6×50mm，含有0.2％磷酸的10-90％含水甲醇，用4分鐘，4mL/min，在220nm處檢測)。
實施例2N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[(3-羥基-2，2-二甲基丙基)氨基]甲基]苯乙酰胺的制備 A.4-甲酰基苯乙酸 將4-溴代苯乙酸(10.075g，50mmol，1當量)溶于250mL無水四氫呋喃中并冷卻至-60℃。加入苯基鋰(1.8M溶于70％環己烷的乙醚溶液中，65mL，117mmol，2.34當量)并將該反應混合物在-75℃下攪拌50分鐘。然后加入叔-丁基鋰(1.7M，90mL，153mmol，3.06當量)并將該反應混合物在-75℃下攪拌40分鐘，然后溫熱至-45℃。35分鐘后，將反應混合物冷卻至-65℃并加入10mL無水N，N-二甲基甲酰胺。30分鐘后，加入乙酸乙酯(150mL)并加入1N HCl水溶液使該溶液的pH為10。分離含水相，用6N HCl水溶液酸化并用乙酸乙酯萃取兩次。合并有機物，用水洗滌，經MgSO4干燥并在真空下濃縮。將得到的粗制物用乙醚和己烷研磨，得到1.9g米黃色物質。將濾液在硅膠上經快速層析，用3∶1∶1的己烷∶乙酸乙酯∶乙醇的1％乙酸溶液洗脫得到附加量的1.2g所述物質。經制備性HPLC后從不純的部分中也得到附加量的產物(270mg)，共得到3.37g(41％)的4-甲酰基苯乙酸。B.N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-甲酰基苯乙酰胺 在0℃下，將草酰氯(2.0M溶于CH2Cl2中，9.1mL，18.2mmol，3當量)緩慢加入到4-甲酰基苯乙酸(2.0g，12.2mmol，2當量)的CH2Cl2溶液中。將該反應混合物在0℃下攪拌5分鐘。將得到的含有酰氯的反應混合物滴加2-氨基-5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]噻唑(1.64g，6.09mmol)和三乙胺(3.2mL)的二氯甲烷溶液處理，用30分鐘溫熱至室溫。將該反應混合物用飽和NaHCO3水溶液和CH2Cl2(220mL)稀釋。分離有機相，順序用飽和NaHCO3水溶液、0.1N HCl和飽和NaCl洗滌，經MgSO4干燥。在真空下濃縮得到棕色油狀物，將該油狀物用己烷/乙酸乙酯溶液研磨，得到1.03g黃色固體。將濾液在硅膠上經快速層析，用50-60％梯度的乙酸乙酯的己烷溶液洗脫得到附加量的1.02g所述物質。總共得到2.05g(81％)的N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-甲酰基苯乙酰胺。HPLC97％在3.90min(YMC S5 ODS柱4.6×50mm，含有0.2％磷酸的10-90％含水甲醇，用4分鐘，4mL/min，在220nm處檢測)。C.N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[(3-羥基-2，2-二甲基丙基)氨基]甲基]苯乙酰胺 將N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-甲酰基苯乙酰胺(1.1g，2.65mmol，1當量)溶于20mL四氫呋喃中并冷卻至0℃。加入3-氨基-2，2-二甲基-1-丙醇(1.0g，9.7mmol，3.7當量)，隨后加入乙酸(1mL)和三乙酰氧基硼氫化鈉(2.6g，12.3mmol，4.6當量)。將該反應混合物在室溫下攪拌1小時。加入NaHCO3水溶液并將該混合物用乙酸乙酯萃取。合并有機物，用水洗滌，經MgSO4干燥并在真空下濃縮。將殘余物溶于甲醇中并用4N HCl的二噁烷溶液酸化，在硅膠上經快速層析，用含有2.7％三乙胺的10％甲醇的乙酸乙酯溶液洗脫，得到N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[(3-羥基-2，2-二甲基丙基)氨基]甲基]苯乙酰胺530mg(40％)，為米黃色固體。MS503[M+H]+；HPLC97％在3.28min(YMC S5 ODS柱4.6×50mm，含有0.2％磷酸的10-90％含水甲醇，用4分鐘，4mL/min，在220nm處檢測)。
實施例3N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-(1-吡咯烷基甲基)苯乙酰胺鹽酸鹽的制備 在0℃下，將4-(溴代甲基)-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺(2.0g，4.2mmol，1當量)溶于25mL N，N-二甲基甲酰胺中并加入到吡咯烷(5.21mL，62.4mmol，15當量)的50mLN，N-二甲基甲酰胺溶液中。將該反應混合物在0℃下攪拌15分鐘，然后在室溫下攪拌過夜。將該混合物用500mL乙酸乙酯稀釋。將有機相順序用飽和NaCl水溶液和飽和NaHCO3水溶液洗滌，經MgSO4干燥并在真空下濃縮。將粗制物經制備性HPLC(C18 50×500mm柱，50-100％甲醇水溶液，用30分鐘)純化，隨后凍干(2×1N HCl水溶液，1×水)，得到N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-(1-吡咯烷基甲基)苯乙酰胺鹽酸鹽195mg(10％)，為黃色固體。MS471[M+H]+；HPLC97％在3.17min(YMC S5 ODS柱4.6×50mm，含有0.2％磷酸的10-90％含水甲醇，用4分鐘，4mL/min，在220nm處檢測)。
實施例4N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[(2-羥基乙基)氨基]甲基]苯乙酰胺鹽酸鹽的制備 在0℃下，將4-(溴代甲基)-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺(10.47g，21.8mmol，1當量)溶于100mLN，N-二甲基甲酰胺中并加入到乙醇胺(19.73mL，0.327mol，15當量)的200mL N，N-二甲基甲酰胺溶液中。將該反應混合物在0℃下攪拌1小時并用700mL乙酸乙酯稀釋。將有機萃取液順序用水和飽和NaHCO3水溶液(4×300mL)洗滌，經MgSO4干燥并在真空下濃縮。將粗制物經制備性HPLC(C18 50×500mm柱，50-100％甲醇水溶液，用30分鐘)純化，隨后凍干(2×1N HCl水溶液，1×水)，得到N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[(2-羥基乙基)氨基]甲基]苯乙酰胺鹽酸鹽4.8g(47.8％)，為黃色固體。MS461[M+H]+；HPLC97％在3.15min(YMC S5 ODS柱4.6×50mm，含有0.2％磷酸的10-90％含水甲醇，用4分鐘，4mL/min，在220nm處檢測)。
實施例5N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[[2-(1-吡咯烷基)乙基]氨基]甲基]苯乙酰胺的制備 在氬氣氛下，將N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-(甲酰基)苯乙酰胺(0.70g，1.68mmol，1當量)溶于28mL四氫呋喃中。加入1-(2-氨基乙基)吡咯烷(1.0mL，7.89mmol，4.7當量)，隨后加入乙酸(1mL)和三乙酰氧基硼氫化鈉(2.07g，9.28mmol，5.5當量)。將該反應混合物在室溫下攪拌30分鐘。加入NaHCO3水溶液并將該混合物用乙酸乙酯萃取。將有機萃取液經MgSO4干燥并在真空下濃縮。將所述物質在硅膠上經快速層析純化，用含有0.6％氫氧化銨的15-30％梯度甲醇的乙酸乙酯溶液洗脫，得到N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[[2-(1-吡咯烷基)乙基]氨基]甲基]苯乙酰胺602mg(70％)。通過加入2.34mL 1N HCl水溶液并隨后凍干，可以得到二鹽酸鹽為淺色易碎固體。MS514[M+H]+；HPLC100％在2.93min(YMC S5 ODS柱4.6×50mm，含有0.2％磷酸的10-90％含水甲醇，用4分鐘，4mL/min，在220nm處檢測)。
實施例6N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[(2-羥基-1，1-二甲基乙基)氨基]甲基]苯乙酰胺鹽酸鹽的制備 在0℃下，向1，1-二甲基乙醇胺(1.08g)的N，N-二甲基甲酰胺(1.25mL)溶液中加入4-(溴代甲基)-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺(600mg)的N，N-二甲基甲酰胺(3mL)溶液。將該反應混合物在室溫下攪拌30分鐘并用甲醇水梯度的制備性HPLC純化。合并所需部分，在真空下濃縮并凍干得到產物，為游離堿。將所述游離堿用鹽酸的二噁烷溶液(4N，0.48mL)處理并在真空下濃縮得到N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[(2-羥基-1，1-二甲基乙基)氨基]甲基]苯乙酰胺的鹽酸鹽(460mg)。HPLC R.T.＝2.66min(YMC S5 ODS柱4.6×50mm，含有0.2％磷酸的10-90％含水甲醇，用4分鐘，4mL/min，在220nm處檢測)。MS489[M+H]+。
實施例7N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-3-[[(2-羥基乙基)氨基]甲基]苯乙酰胺鹽酸鹽的制備 A.N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-3-甲酰基苯乙酰胺 在0℃下，用20分鐘將草酰氯(2.0M溶于CH2Cl2中，21.0mL，42.0mmol，3.13當量)加入到含有數滴N，N-二甲基甲酰胺的3-(甲酰基)苯乙酸(75％，3.5g，16.0mmol，1.2當量)的CH2Cl2溶液中。將該反應混合物在0℃下攪拌20分鐘，然后溫熱至室溫。10分鐘后，將該反應混合物在真空、室溫下濃縮1.5小時。將酰氯中間體溶于60mL CH2Cl2中并在0℃下，用40分鐘將得到的溶液加入到2-氨基-5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]噻唑和三乙胺(5.90mL，42.3mmol，3.15當量)的120mL CH2Cl2溶液中。將該反應混合物在0℃下攪拌30分鐘。加入飽和NaHCO3水溶液并將該混合物用CH2Cl2萃取。將有機萃取液順序用0.05N HCl水溶液和飽和NaCl水溶液洗滌并經MgSO4干燥。將有機相在真空下濃縮得到棕色油狀物，將該油狀物用乙醚研磨得到N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-3-甲酰基苯乙酰胺5.04g(90.6％)。HPLC87％在3.930min(YMC S5 ODS柱4.6×50mm，含有0.2％磷酸的10-90％含水甲醇，用4分鐘，4mL/min，在220nm處檢測)。B.N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-3-[[(2-羥基乙基)氨基]甲基]苯乙酰胺鹽酸鹽 在N2下，將乙醇胺(0.73mL，12.1mmol，5當量)加入到N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-3-(甲酰基)苯乙酰胺(1.0g，2.4mmol，1當量)的60mL無水四氫呋喃溶液中。將該反應混合物攪拌15分鐘。加入乙酸(1mL)和三乙酰氧基硼氫化鈉(2.97g，14.0mmol，5.8當量)并將反應混合物攪拌40分鐘。加入NaHCO3水溶液并將該混合物用乙酸乙酯(3×80mL)萃取。將有機萃取液經MgSO4干燥并在真空下濃縮。將該物質在硅膠上經快速層析純化，用含有0.2-0.4％氫氧化銨的10-20％梯度甲醇的乙酸乙酯溶液洗脫。用1.5mL 1N HCl水溶液酸化，隨后凍干得到N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-3-[[(2-羥基乙基)氨基]甲基]苯乙酰胺鹽酸鹽686mg(57.5％)，為米黃色泡沫狀固體。MS461[M+H]+；HPLCR.T.＝2.670min(YMC S5 ODS柱4.6×50mm，含有0.2％磷酸的10-90％含水甲醇，用4分鐘，4mL/min，在220nm處檢測)。
實施例8N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-3-[[(3-羥基-2，2-二甲基丙基)氨基]甲基]苯乙酰胺的制備 在N2下，將3-氨基-2，2-二甲基-1-丙醇(0.37g，3.59mmol，5當量)加入到N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-3-(甲酰基)苯乙酰胺(300mg，0.72mmol，1當量)的20mL無水四氫呋喃溶液中。加入乙酸(0.5mL)和三乙酰氧基硼氫化鈉(0.80g，3.58mmol，5當量)并將反應混合物攪拌1.5小時。加入NaHCO3水溶液并將該混合物用乙酸乙酯萃取。將有機萃取液經MgSO4干燥并在真空下濃縮。將該粗制物在硅膠上經快速層析純化，用含有0.5％氫氧化銨的10-20％梯度甲醇的乙酸乙酯溶液洗脫，得到N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-3-[[(3-羥基-2，2-二甲基丙基)氨基]甲基]苯乙酰胺0.206g(57％)。用1NHCl水溶液酸化，隨后凍干得到上述物的鹽酸鹽，為灰白色易碎固體。MS583[M+H]+；HPLCR.T.＝3.38min(YMC S5 ODS柱4.6×50mm，含有0.2％磷酸的10-90％含水甲醇，用4分鐘，4mL/min，在220nm處檢測)。
實施例93-(氨基甲基)-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺的制備 在N2下，向N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-3-(甲酰基)苯乙酰胺(1.51g，3.63mmol)的乙腈(20mL)溶液中加入叔-丁基物質(1.26g，10.7mmol)，隨后加入三氟乙酸(0.54mL)和三乙基硅烷(1.71mL，10.7mmol)。將反應混合物在室溫下攪拌20小時并用乙醚稀釋。將得到的有機溶液順序用飽和碳酸氫鈉溶液和飽和氯化鈉溶液洗滌，經硫酸鈉干燥并蒸發至干，得到2.55g粗制產物。將該粗制產物溶于二氯甲烷(35mL)中，冷卻至0℃并加入三氟乙酸(15mL)。將該反應混合物在室溫下攪拌16小時，在真空下濃縮并經制備性HPLC純化，得到3-(氨基甲基)-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺(472mg)。MS417[M+H]+；HPLC R.T.＝3.24min(YMC S5 ODS柱4.6×50mm，含有0.2％磷酸的10-90％含水甲醇，用4分鐘，4mL/min，在220nm處檢測)。
實施例104-[[(2，3-二羥基丙基)氨基]甲基]-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺鹽酸鹽的制備 在室溫下，將4-(溴代甲基)-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺(2.0g，4.16mmol，1當量)加入到3-氨基-1，2-丙二醇(5.0mL，64.5mmol，15.5當量)的20mL N，N-二甲基甲酰胺和40mL無水四氫呋喃混合物中。將該反應混合物攪拌5小時并在真空下濃縮。將混合物用160mL乙酸乙酯稀釋并用10％LiCl水溶液洗滌兩次，用飽和NaCl水溶液洗滌一次。將有機相經MgSO4干燥并在硅膠上經快速層析純化，用含有0.8％氫氧化銨的15％甲醇的乙酸乙酯溶液洗脫，得到4-[[(2，3-二羥基丙基)氨基]甲基]-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺1.08g(49.3％)。用1N HCl水溶液酸化，隨后凍干得到上述物的鹽酸鹽為米黃色固體。MS491[M+H]+；HPLCR.T.＝2.53min(YMC S5 ODS柱4.6×50mm，含有0.2％磷酸的10-90％含水甲醇，用4分鐘，4mL/min，在220nm處檢測)。
實施例11N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[[2-羥基-1-(羥基甲基)乙基]氨基]甲基]苯乙酰胺鹽酸鹽的制備 將4-(溴代甲基)-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺(1.0g，2.08mmol，1當量)溶于20mL N，N-二甲基甲酰胺中并在0℃下，加入到2-氨基-1，3-丙二醇(2.84g，31.2mmol，15當量)的50mL N，N-二甲基甲酰胺溶液中。將該反應混合物在室溫下攪拌18小時。將混合物用500mL乙酸乙酯稀釋并用飽和NaCl水溶液(2×250mL)和飽和NaHCO3水溶液(3×300mL)洗滌。將有機相經MgSO4干燥并在真空下濃縮。用1N HCl水溶液酸化，隨后凍干得到N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[[2-羥基-1-(羥基甲基)乙基]氨基]甲基]苯乙酰胺鹽酸鹽790mg(77.4％)，為黃色固體。MS491[M+H]+；HPLCR.T.＝2.53min(YMC S5 ODS柱4.6×50mm，含有0.2％磷酸的10-90％含水甲醇，用4分鐘，4mL/min，在220nm處檢測)。
實施例12N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[(2-羥基-1-甲基乙基)氨基]甲基]苯乙酰胺鹽酸鹽的制備 將2-氨基-1-丙醇(1.88g，24.97mmol，15當量)冷卻至0℃并用5分鐘加入4-(溴代甲基)-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺(0.80g，1.66mmol，1當量)在3.75mL N，N-二甲基甲酰胺中的溶液。將該反應混合物在室溫下攪拌1小時。將該混合物直接用制備性HPLC(Sep Tek柱50×500mm，10-100％含水甲醇，用60分鐘，45mL/min，在220nm處檢測)純化。將合適的部分凍干得到N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[(2-羥基-1-甲基乙基)氨基]甲基]苯乙酰胺658mg(83.7％)。用4N HCl的二噁烷溶液酸化得到所述物的鹽酸鹽，為灰白色固體。MS475[M+H]+；HPLC100％在2.60min(YMC S5 ODS柱4.6×50mm，含有0.2％磷酸的10-90％含水甲醇，用4分鐘，4mL/min，在220nm處檢測)。
實施例13N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[1-[(2-羥基乙基)氨基]乙基]苯乙酰胺鹽酸鹽的制備 A.4-(2-(乙氧基羰基)乙烯基)苯乙酸 在氬氣氛、0℃下，將4-溴代苯乙酸(86.02g，0.748mol，1當量)溶于含有乙酸乙酸(64mL，0.591mol，0.79當量)、丙烯酸叔-丁基酯(20mL，0.136mol，0.18當量)、乙酸鈀(II)(1.81g，8.06mmol，0.01當量)和三苯膦(4.40g，16.7mmol，0.022當量)的無水N，N-二甲基甲酰胺中。用40分鐘加入N，N-二異丙基乙胺(178mL)并將該反應混合物在100℃下加熱17小時。將混合物冷卻至室溫并用1.5L 1N HCl水溶液稀釋。將含水相用乙酸乙酯(3×1L)萃取。將有機萃取液順序用1N HCl水溶液(2×1L)、水(1L)和飽和NaCl水溶液(0.5L)洗滌，經Na2SO4干燥并在真空下濃縮，得到定量收率(107.4g)的4-(2-(乙氧基羰基)乙烯基)苯乙酸，為帶有叔-丁基酯的順式和反式烯烴的混合物。B.4-甲酰基苯乙酸 在氬氣氛下，將部分A的粗制物質(107.4g)溶于1L二噁烷和1L水的混合物中。加入四氧化鋨水溶液(10％，2.0g)，隨后加入高碘酸鈉(209g，0.98mol)和4-甲基嗎啉N-氧化物(2.30g，19.6mmol)。48小時后，將該反應混合物用氬氣沖洗30分鐘，然后在室溫下再攪拌47小時。將該混合物過濾除去固體，用1L乙酸乙酯漂洗。將含水相用1L乙酸乙酯萃取。將合并的有機萃取液用1L水洗滌，隨后用0.5L 1NNaOH水溶液洗滌。將含水相用60mL濃HCl酸化并用1L乙酸乙酯萃取。將該有機萃取液用0.5L水、0.5L飽和NaCl水溶液洗滌，用MgSO4干燥并在真空下濃縮，得到36g 4-甲酰基苯乙酸，為黃色固體。C.N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-甲酰基苯乙酰胺 將4-甲酰基苯乙酸(1.72g，10.5mmol，1.1當量)與2-氨基-5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]噻唑(2.56g，9.53mmol，1當量)、CH2Cl2(20mL)和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(2.61g，13.6mmol，1.3當量)混合。將該反應混合物在室溫下攪拌1小時，用40mL CH2Cl2稀釋并順序用1N HCl水溶液(2×20mL)、飽和NaHCO3水溶液(20mL)和飽和NaCl水溶液(2×50mL)洗滌，經MgSO4干燥并在真空下濃縮，得到N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-甲酰基苯乙酰胺3.41g(86％)。D.N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[(1-羥基)乙基]苯乙酰胺 在氬氣氛、-78℃下，將N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2噻唑基]-4-甲酰基苯乙酰胺(3.315g，7.98mmol，1當量)溶于100mL無水四氫呋喃中。用5分鐘加入溴化甲基鎂(3M溶于乙醚中，5.60mL，16.8mmol，2.1當量)并將該反應混合物在-78℃下攪拌1.75小時。將反應混合物用飽和NH4Cl水溶液猝滅并用100ml飽和NaHCO3水溶液稀釋。將該混合物用250mL乙酸乙酯萃取。將含水相用1N HCl水溶液酸化至pH5，然后用乙酸乙酯(2×300mL)萃取。將合并的有機萃取液用飽和NaCl水溶液(100mL)洗滌，經MgSO4干燥并在真空下濃縮，得到N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[(1-羥基)乙基]苯乙酰胺2.87g(83％)。E.N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[(1-氯代)乙基]苯乙酰胺 在氬氣氛、0℃下，將N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2噻唑基]-4-[(1-羥基)乙基]苯乙酰胺(0.550g，1.27mmol，1當量)溶于5.5mL無水四氫呋喃中。用6分鐘加入亞硫酰氯(0.102mL，1.40mmol，1.1當量)并將該反應混合物在0℃下攪拌25分鐘。將混合物用300mL乙酸乙酯稀釋并用飽和NaHCO3水溶液(2×30mL)和飽和NaCl(30mL)洗滌。將有機相用MgSO4干燥并在真空下濃縮，得到N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[(1-氯代)乙基]苯乙酰胺533mg(93％)。F.N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[1-[(2-羥基乙基)氨基]乙基]苯乙酰胺鹽酸鹽 將N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2噻唑基]-4-[(1-氯代)乙基]苯乙酰胺(480mg，1.07mmol，1當量)溶于2.5mL N，N-二甲基甲酰胺中并在0℃下，用7分鐘加入到2-氨基乙醇(979mg，16.0mmol，15當量)中。將該反應混合物在室溫下攪拌20分鐘。將混合物直接經制備性HPLC(Sep Tek柱50×500mm，15-100％含水甲醇，用50分鐘，45mL/min，在220處檢測)純化。將所需部分在真空下濃縮并用1N HCl水溶液酸化。凍干得到N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[1-[(2-羥基乙基)氨基]乙基]苯乙酰胺鹽酸鹽220mg(38％)，為灰白色固體。MS475[M+H]+；HPLC98％在2.66min(YMC S5 ODS柱4.6×50mm，含有0.2％磷酸的10-90％含水甲醇，用4分鐘，4mL/min，在220nm處檢測)。
實施例14N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[1-[(2-羥基-1-甲基乙基)氨基]乙基]苯乙酰胺鹽酸鹽的制備 將N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[(1-氯代)乙基]苯乙酰胺(0.60g，1.33mmol，1當量)溶于3.75mL N，N-二甲基甲酰胺中并在0℃下，緩慢加入到2-氨基-1-丙醇(1.50g，20.0mmol，15當量)中。將該反應混合物在室溫下攪拌20分鐘，過濾并將得到的固體經制備性HPLC(Sep Tek柱50×500mm，20-100％含水甲醇，用50分鐘，49mL/min，在220處檢測)純化。將所需部分在真空下濃縮并用1N HCl水溶液酸化。凍干得到N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[1-[(2-羥基-1-甲基乙基)氨基]乙基]苯乙酰胺鹽酸鹽550mg(79％)，為白色固體。MS489[M+H]+；HPLC98％在2.70min(YMC S5 ODS柱4.6×50mm，含有0.2％磷酸的10-90％含水甲醇，用4分鐘，4mL/min，在220nm處檢測)。
實施例15(S)-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[(2-羥基乙基)氨基]甲基]-α-甲基苯乙酰胺的制備 A.(S)-2-[4-氯代甲基]苯基丙酸 在氬氣氛下，將(S)-2-苯基丙酸(1.380g，9.19mmol，1當量)與7.0mL 37％HCl水溶液、KCl(3.426g，45.95mmol，5當量)、氯化四甲基銨(252mg，2.30mmol，0.25當量)和低聚甲醛(827mg，27.6mmol，3當量)混合。將該反應混合物在100℃下加熱22小時，冷卻并用乙酸乙酯(2×75mL)萃取。將有機萃取液經Na2SO4干燥并在真空下濃縮。將該物質經制備性HPLC純化，得到(S)-2-[4-氯代甲基]苯基丙酸(94％對位)540mg(基于回收原料629mg的54％)，為澄清的油狀物。e.e＝89％。B.(S)-4-(氯代甲基)-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-α-甲基苯乙酰胺 在室溫、氬氣氛下，將1，3-二環己基碳二亞胺(617mg，2.99mmol，1.1當量)加入到2-氨基-5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]噻唑(732mg，2.72mmol，1當量)和(S)-2-[4-氯代甲基]苯基丙酸(540mg，2.72mmol，1當量)的10mL CH2Cl2混合物中。1.5小時后，將該混合物通過硅藻土過濾，在真空下濃縮并在硅膠上經快速層析純化，用60％乙酸乙酯的己烷溶液洗脫，得到(S)-4-(氯代甲基)-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-α-甲基苯乙酰胺872mg(71％)，為泡沫狀白色固體。C.(S)-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[(2-羥基乙基)氨基]甲基]-α-甲基苯乙酰胺 在氬氣氛下，將(S)-4-(氯代甲基)-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-α-甲基苯乙酰胺(872mg，1.94mmol，1當量)溶于10mL N，N-二甲基甲酰胺中。加入2-氨基乙醇(1.77g，29mmol，15當量)并將該反應混合物在室溫下攪拌2小時。將混合物在真空下濃縮并經制備性HPLC純化。將所需部分在真空下濃縮，得到(S)-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[(2-羥基乙基)氨基]甲基]-α-甲基苯乙酰胺610mg(53％)。用1N HCl水溶液酸化并凍干得到所述物質的鹽酸鹽，為淺黃色固體。MS475[M+H]+；HPLCR.T.＝3.23min(YMC S5 ODS柱4.6×50mm，含有0.2％磷酸的10-90％含水甲醇，用4分鐘，4mL/min，在220nm處檢測)。
實施例16N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-6-[[(2-羥基乙基)氨基]甲基]-3-吡啶乙酰胺的制備 A.6-甲基-3-吡啶乙酸乙酯，N-氧化物 將6-甲基-吡啶乙酸乙酯(1.20g，6.70mmol，1當量)與3-氯代過苯甲酸(50％，2.77g，8.03mmol，1.2當量)的25mL CHCl3溶液混合。將該反應混合物在室溫下攪拌4小時。將混合物通過2英寸的Al2O3墊過濾兩次并用100mL 10％甲醇的CH2Cl2溶液洗脫。在真空下濃縮得到6-甲基-3-吡啶乙酸乙酯，N-氧化物1.29g(99％)。B.6-羥基甲基-3-吡啶乙酸乙酯 將6-甲基-3-吡啶乙酸乙酯，N-氧化物(920mg，4.71mmol，1當量)溶于70mL CH2Cl2中并與2，6-二甲基吡啶(5.1mL，37.7mmol，8當量)和三氟乙酸酐(4.8mL，33mmol，7當量)混合。將該反應混合物在70℃下加熱20分鐘，冷卻至室溫，在真空下濃縮。加入無水乙醇(70mL)，隨后加入濃氫氧化銨(8.4mL)。將該混合物在45℃下加熱20分鐘，冷卻至室溫，在真空下濃縮并用120mL飽和NaHCO3水溶液稀釋。將含水相用乙酸乙酯(3×150mL)萃取。將有機萃取液用飽和NaCl水溶液(100mL)洗滌，經MgSO4干燥并在真空下濃縮。在硅膠上經快速層析純化，用1-2％梯度甲醇的CH2Cl2溶液洗脫，得到6-羥基甲基-3-吡啶乙酸乙酯611mg(66％)。C.6-[[叔-丁基二苯基甲硅烷基]氧基]甲基-3-吡啶乙酸乙酯 將6-羥基甲基-3-吡啶乙酸乙酯(500mg，2.56mmol，1當量)溶于20mL CH2Cl2中并與三乙胺(0.54mL，3.84mmol，1.5當量)和叔-丁基氯代二苯基硅烷(0.73mL，2.82mmol，1.1當量)混合。將該反應混合物在室溫攪拌4.5小時。加入附加量的含有N，N-二甲基氨基吡啶(31mg，0.26mmol，0.1當量)的0.25mL叔-丁基氯代二苯基硅烷。2小時后，將該反應混合物用250mL乙酸乙酯稀釋。將有機相用飽和NaHCO3水溶液(2×40mL)和飽和NaCl水溶液(100mL)順序洗滌，經MgSO4干燥并在真空下濃縮。在硅膠上經快速層析純化，用10-25％梯度乙酸乙酯的己烷溶液洗脫，得到6-[[叔-丁基二苯基甲硅烷基]氧基]甲基-3-吡啶乙酸乙酯795mg(72％)。D.6-[[叔-丁基二苯基甲硅烷基]氧基]甲基-3-吡啶乙酸 將6-[[叔-丁基二苯基甲硅烷基]氧基]甲基-3-吡啶乙酸乙酯(786mg，1.81mmol，1當量)溶于8mL甲醇中并與1N NaOH水溶液(3mL，3mmol，1.65當量)混合。將該反應混合物在室溫下攪拌1小時，用50mL5％檸檬酸水溶液稀釋，用乙酸乙酯(3×70mL)萃取。將有機相順序用水(40mL)和飽和NaCl水溶液(100mL)洗滌，經MgSO4干燥并在真空下濃縮得到6-[[叔-丁基二苯基甲硅烷基]氧基]甲基-3-吡啶乙酸691.7mg(94％)。E.N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-6-[[叔-丁基二苯基甲硅烷基]氧基]甲基-3-吡啶乙酰胺 將6-[[叔-丁基二苯基甲硅烷基]氧基]甲基-3-吡啶乙酸(681mg，1.68mmol，1當量)與2-氨基-5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]噻唑(453mg，1.68mmol，1當量)、CH2Cl2(5mL)、2，6-二甲基吡啶(0.5mL)和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(354.4mg，1.84mmol，1.1當量)混合。將該反應混合物在室溫下攪拌1.5小時，用250mL乙酸乙酯稀釋，順序用5％檸檬酸水溶液(2×60mL)、飽和NaHCO3水溶液(50mL)和飽和NaCl水溶液(50mL)洗滌。將有機相經MgSO4干燥，在真空下濃縮并在硅膠上經快速層析純化，用1-9％梯度甲醇的CH2Cl2溶液洗脫，得到N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-6-[[叔-丁基二苯基甲硅烷基]氧基]甲基-3-吡啶乙酰胺(774mg，70％)。F.N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-6-羥基甲基-3-吡啶乙酰胺 將實施例16部分E的產物(760mg，1.16mmol，1當量)溶于15mL無水四氫呋喃中并與氟化四丁基銨(1.0M溶于四氫呋喃中，3mL，3.0mmol，2.6當量)混合。將該反應混合物在室溫下攪拌1小時，用100mL5％檸檬酸水溶液稀釋，用乙酸乙酯(3×120mL)萃取。將有機萃取液順序用飽和NaHCO3水溶液(60mL)和飽和NaCl水溶液(60mL)洗滌，經MgSO4干燥并在真空下濃縮。在硅膠上經快速層析純化，用6％甲醇的CH2Cl2溶液洗脫，得到N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-6-羥基甲基-3-吡啶乙酰胺(411mg，85％)，為無色固體。HPLC100％在2.50min(YMC S5 ODS柱4.6×50mm，含有0.2％磷酸的10-90％含水甲醇，用4分鐘，4mL/min，在220nm處檢測)。G.N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-6-氯代甲基-3-吡啶乙酰胺 在室溫下，向N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-6-羥基甲基-3-吡啶乙酰胺(410mg)的氯仿(10mL)溶液中加入亞硫酰氯(79μL，1.8mmol)。將該反應混合物攪拌30分鐘，用飽和碳酸氫鈉溶液稀釋并用乙酸乙酯(3×120mL)萃取。將合并的有機萃取液用飽和氯化鈉溶液(2×30mL)洗滌，經硫酸鎂干燥，過濾并在真空下濃縮，得到粗制產物(480mg)，將其經層析純化得到N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-6-氯代甲基-3-吡啶乙酰胺(328mg，77％)。H.N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-6-[[(2-羥基乙基)氨基]甲基]-3-吡啶乙酰胺 向氨基乙醇(681mg)中加入N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-6-氯代甲基-3-吡啶乙酰胺(325mg，0.74mmol)的N，N-二甲基甲酰胺(1mL)溶液。將該反應混合物在室溫下攪拌1小時，用甲醇稀釋并過濾得到粗制產物。經制備性HPLC純化后得到N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-6-[[(2-羥基乙基)氨基]甲基]-3-吡啶乙酰胺(248mg，72％)。
實施例17(R)-4-[[(2，3-二羥基丙基)氨基]甲基]-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺鹽酸鹽的制備 在N2下，將(R)-3-氨基-1，2-丙二醇(5.0g，54.9mmol，10.5當量)溶于50mL N，N-二甲基甲酰胺中。分小份加入4-(溴代甲基)-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺(2.50g，5.20mmol，1當量)并將該反應混合物在室溫下攪拌2小時。將該混合物用乙酸乙酯(250mL)稀釋并用水和10％LiCl水溶液洗滌。將含水相用乙酸乙酯反萃取兩次。將有機萃取液經MgSO4干燥并在真空下濃縮。在硅膠上經快速層析純化，用10-20％梯度含有0.5％氫氧化銨的甲醇的乙酸乙酯溶液洗脫，得到(R)-4-[[(2，3-二羥基丙基)氨基]甲基]-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺1.80g(65.6％)。用1N HCl水溶液酸化得到其鹽酸鹽，為白色易碎固體。MS491[M+H]+；HPLC98％在2.54min(YMC S5 ODS柱4.6×50mm，含有0.2％磷酸的10-90％含水甲醇，用4分鐘，4mL/min，在220nm處檢測)。[α]D23＝+0.074°(c1.0，甲醇)。
實施例18(S)-4-[[(2，3-二羥基丙基)氨基]甲基]-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺鹽酸鹽的制備 在N2下，將(S)-3-氨基-1，2-丙二醇(6.3g，68.9mmol，13.2當量)溶于40mL N，N-二甲基甲酰胺中。分小份加入4-(溴代甲基)-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺(2.50g，5.20mmol，1當量)并將該反應混合物在室溫下攪拌1小時。將該混合物用乙酸乙酯(300mL)稀釋并用冰水和10％ LiCl水溶液洗滌。將有機萃取液經MgSO4干燥并在真空下濃縮。在硅膠上經快速層析純化，用10-20％梯度含有0.6％氫氧化銨的甲醇的乙酸乙酯溶液洗脫，得到(S)-4-[[(2，3-二羥基丙基)氨基]甲基]-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺1.765g(69％)。用1N HCl水溶液酸化得到其鹽酸鹽，為白色易碎固體。HPLC98％在2.54min(YMC S5ODS柱4.6×50mm，含有0.2％磷酸的10-90％含水甲醇，用4分鐘，4mL/min，在220nm處檢測)；[α]D23＝-8.4°(c1.0，甲醇)。
權利要求
1.式I的化合物及其對映異構體、非對映異構體和藥學上可接受的鹽 其中R是烷基；R1和R2各獨立是氫或烷基；R3是氫或烷基，和R4是氫或由一個或兩個羥基或一個NR5R6基團取代的烷基，或R3和R4與它們所連接的氮原子一起形成4-到7-元雜環，其中R3R4由-(CH2)n-代表，其中n是3、4、5或6的整數；R5和R6各獨立是氫、烷基、取代的烷基、環烷基或取代的環烷基，或R5和R6與它們所連接的氮原子一起形成4-到7-元雜環，其中R5R6由-(CH2)m-代表，其中m是3、4、5或6的整數；和X是CH或N。
2.權利要求1的化合物，其中R是叔-丁基；R1和R2各獨立是氫或甲基；R3是氫和R4是氫、-CH2C(CH3)2CH2OH、-CH2CH2OH、-C(CH3)2CH2OH、-CH(CH2OH)2、-CH2CH(OH)CH2OH、-CH(CH3)CH2OH或 或R3和R4與它們所連接的氮原子一起形成5-元雜環，其中R3R4由-(CH2)4-代表；和X是CH或N。
3.權利要求1的式Ia的化合物及其對映異構體、非對映異構體和藥學上可接受的鹽 其中R1和R2各獨立是氫或甲基；和R3是氫，和R4是氫、-CH2C(CH3)2CH2OH、-CH2CH2OH、-C(CH3)2CH2OH、-CH(CH2OH)2、-CH2CH(OH)CH2OH、-CH(CH3)CH2OH或 或R3和R4與它們所連接的氮原子一起形成5-元雜環，其中R3R4由-(CH2)4-代表。
4.權利要求3的式Ia的化合物，其中R1和R2各獨立是氫或甲基；和R3是氫，和R4是-CH2C(CH3)2CH2OH、-CH2CH2OH、-C(CH3)2CH2OH、-CH(CH2OH)2、-CH2CH(OH)CH2OH、-CH(CH3)CH2OH或 或R3和R4與它們所連接的氮原子一起形成5-元雜環，其中R3R4由-(CH2)4-代表。
5.權利要求1的式Ib的化合物及其對映異構體、非對映異構體和藥學上可接受的鹽 其中R1和R2各獨立是氫或甲基；和R3是氫，和R4是氫、-CH2C(CH3)2CH2OH、-CH2CH2OH、-C(CH3)2CH2OH、-CH(CH2OH)2、-CH2CH(OH)CH2OH、-CH(CH3)CH2OH或 或R3和R4與它們所連接的氮原子一起形成5-元雜環，其中R3R4由-(CH2)4-代表。
6.權利要求5的式Ib的化合物，其中R1和R2各獨立是氫或甲基；和R3是氫，和R4是-CH2C(CH3)2CH2OH、-CH2CH2OH、-C(CH3)2CH2OH、-CH(CH2OH)2、-CH2CH(OH)CH2OH、-CH(CH3)CH2OH或 或R3和R4與它們所連接的氮原子一起形成5-元雜環，其中R3R4由-(CH2)4-代表。
7.權利要求1的式Ic的化合物及其對映異構體、非對映異構體和藥學上可接受的鹽 其中R1和R2各獨立是氫或甲基；和R3是氫，和R4是氫、-CH2C(CH3)2CH2OH、-CH2CH2OH、-C(CH3)2CH2OH、-CH(CH2OH)2、-CH2CH(OH)CH2OH、-CH(CH3)CH2OH或 或R3和R4與它們所連接的氮原子一起形成5-元雜環，其中R3R4由-(CH2)4-代表。
8.權利要求7的式Ic的化合物，其中R1和R2各獨立是氫或甲基；和R3是氫，和R4是-CH2C(CH3)2CH2OH、-CH2CH2OH、-C(CH3)2CH2OH、-CH(CH2OH)2、-CH2CH(OH)CH2OH、-CH(CH3)CH2OH或 或R3和R4與它們所連接的氮原子一起形成5-元雜環，其中R3R4由-(CH2)4-代表。
9.權利要求1的化合物，它選自N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[[2-羥基-1-(羥基甲基)乙基]氨基]甲基]苯乙酰胺；4-[[(2，3-二羥基丙基)氨基]甲基]-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺；(R)-4-[[(2，3-二羥基丙基)氨基]甲基]-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺；(S)-4-[[(2，3-二羥基丙基)氨基]甲基]-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺；4-(氨基甲基)-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺；N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[(3-羥基-2，2-二甲基丙基)氨基]甲基]苯乙酰胺；N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-(1-吡咯烷基甲基)苯乙酰胺；N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[(2-羥基乙基)氨基]甲基]苯乙酰胺；N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[[2-(1-吡咯烷基)乙基]氨基]甲基]苯乙酰胺；N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[(2-羥基-1，1-二甲基乙基)氨基]甲基]苯乙酰胺；N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-3-[[(2-羥基乙基)氨基]甲基]苯乙酰胺；N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-3-[[(3-羥基-2，2-二甲基丙基)氨基]甲基]苯乙酰胺；3-(氨基甲基)-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺；N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[(2-羥基-1-甲基乙基)氨基]甲基]苯乙酰胺；N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[1-[(2-羥基乙基)氨基]乙基]苯乙酰胺；N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[1-[(2-羥基-1-甲基乙基)氨基]乙基]苯乙酰胺；(αS)-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[(2-羥基乙基)氨基]甲基]-α-甲基苯乙酰胺；N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-6-[[(2-羥基乙基)氨基]甲基]-3-吡啶乙酰胺；和N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[(2-羥基乙基)氨基]甲基]-α-甲基苯乙酰胺；及其藥學上可接受的鹽。
10.N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[[2-羥基-1-(羥基甲基)乙基]氨基]甲基]苯乙酰胺和其藥學上可接受的鹽。
11.N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-[[(2-羥基-1，1-二甲基乙基)氨基]甲基]苯乙酰胺和其藥學上可接受的鹽。
12. 4-[[(2，3-二羥基丙基)氨基]甲基]-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺和其藥學上可接受的鹽。
13.(R)-4-[[(2，3-二羥基丙基)氨基]甲基]-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺和其藥學上可接受的鹽。
14.(S)-4-[[(2，3-二羥基丙基)氨基]甲基]-N-[5-[[[5-(1，1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]苯乙酰胺和其藥學上可接受的鹽。
15.一種藥用組合物，它包含權利要求1的化合物和藥學上可接受的載體。
16.一種藥用組合物，它包含權利要求1的化合物及與其混合的藥學上可接受的載體和以固定劑量配制的抗癌藥。
17.一種藥用組合物，它包含權利要求1的化合物及與其混合的藥學上可接受的載體和以固定劑量配制的p53反式激活調節劑。
18.一種用于調節細胞凋亡的方法，該方法包括給予需要其的哺乳類動物有效調節細胞凋亡量的權利要求1的化合物。
19.一種用于抑制蛋白激酶的方法，該方法包括給予需要其的哺乳類動物有效抑制蛋白激酶量的權利要求1的化合物。
20.一種用于抑制依賴細胞周期蛋白的激酶的方法，該方法包括給予需要其的哺乳類動物有效抑制依賴細胞周期蛋白的激酶量的權利要求1的化合物。
21.一種用于抑制cdc2(cdk1)的方法，該方法包括給予需要其的哺乳類動物有效抑制cdc2量的權利要求1的化合物。
22.一種用于抑制cdk2的方法，該方法包括給予需要其的哺乳類動物有效抑制cdk2量的權利要求1的化合物。
23.一種用于抑制cdk3的方法，該方法包括給予需要其的哺乳類動物有效抑制cdk3量的權利要求1的化合物。
24.一種用于抑制cdk4的方法，該方法包括給予需要其的哺乳類動物有效抑制cdk4量的權利要求1的化合物。
25.一種用于抑制cdk5的方法，該方法包括給予需要其的哺乳類動物有效抑制cdk5量的權利要求1的化合物。
26.一種用于抑制cdk6的方法，該方法包括給予需要其的哺乳類動物有效抑制cdk6量的權利要求1的化合物。
27.一種用于抑制cdk7的方法，該方法包括給予需要其的哺乳類動物有效抑制cdk7量的權利要求1的化合物。
28.一種用于抑制cdk8的方法，該方法包括給予需要其的哺乳類動物有效抑制cdk8量的權利要求1的化合物。
29.一種治療增生性疾病的方法，該方法包括給予需要其的哺乳類動物治療有效量的權利要求15的組合物。
30.一種治療癌癥的方法，該方法包括給予需要其的哺乳類動物治療有效量的權利要求15的組合物。
31.一種治療炎癥、炎性腸疾病或移植排斥的方法，該方法包括給予需要其的哺乳類動物治療有效量的權利要求15的組合物。
32.一種治療關節炎的方法，該方法包括給予需要其的哺乳類動物治療有效量的權利要求15的組合物。
33.一種治療增生性疾病的方法，該方法包括給予需要其的哺乳類動物治療有效量的權利要求16的組合物。
34.一種治療癌癥的方法，該方法包括給予需要其的哺乳類動物治療有效量的權利要求16的組合物。
35.一種治療增生性疾病的方法，該方法包括給予需要其的哺乳類動物治療有效量的權利要求17的組合物。
36.一種治療癌癥的方法，該方法包括給予需要其的哺乳類動物治療有效量的權利要求17的組合物。
37.一種治療與依賴細胞周期蛋白的激酶有關的疾病的方法，該方法包括給予需要其的受治療者有效量的至少一種權利要求1的化合物。
38.一種治療化療引起的脫發、化療引起的血小板減少癥、化療引起的白細胞減少癥或mucocitis的方法，該方法包括給予需要其的哺乳類動物治療有效量的權利要求1的化合物。
全文摘要
本發明介紹式(I)的化合物及其對映異構體、非對映異構體和藥學上可接受的鹽。所述式(I)的化合物是蛋白激酶抑制劑并用于治療增生性疾病如癌癥、炎癥和關節炎。它們也用于治療早老性癡呆、化療引起的脫發和心血管疾病。
文檔編號C07D521/00GK1433415SQ00818899
公開日2003年7月30日 申請日期2000年12月7日 優先權日1999年12月15日
發明者S·D·金巴爾, K·S·金 申請人:布里斯托爾-邁爾斯斯奎布公司