調(diào)節(jié)植物細(xì)胞分裂的組合物和方法
                            
            
                            
            文檔序號(hào)：3564136閱讀：4945來(lái)源：國(guó)知局
            
                            
                        
            
                        
            
                        
            
                            專利名稱：調(diào)節(jié)植物細(xì)胞分裂的組合物和方法
            
技術(shù)領(lǐng)域：
            本發(fā)明一般涉及調(diào)節(jié)植物細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)的組合物和方法。具體而言，本發(fā)明提供促進(jìn)具有增長(zhǎng)或減少細(xì)胞數(shù)量的植物的生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因載體、細(xì)胞、植株及它們的生產(chǎn)方法。
            
背景技術(shù)：
            植物體模型的精心構(gòu)建，主要依賴于在稱為分生組織的生長(zhǎng)位點(diǎn)上準(zhǔn)確調(diào)節(jié)細(xì)胞的分裂與細(xì)胞的分化。在種子植物中，由頂端分生組織操控頂端生長(zhǎng)。芽尖分生組織盡管在結(jié)構(gòu)上是相同的，但在個(gè)體發(fā)育方面則有差異。在胚胎發(fā)生過(guò)程中發(fā)生初生的芽尖分生組織，并成為初生幼芽的頂端。隨后在該初生幼芽的旁邊長(zhǎng)出一些次生芽尖分生組織并形成一群側(cè)芽。在許多種子植物中，幼芽的放射形生長(zhǎng)是由芽體內(nèi)的圓柱形分生組織層即形成層賦予的。從頂端分生組織側(cè)面形成的各種過(guò)渡型分生組織中發(fā)生側(cè)向的“葉狀”器官(即，葉片、花瓣等)的生長(zhǎng)。根系的生長(zhǎng)是從類似的頂端分生組織和形成層分生組織發(fā)生的。目前對(duì)這些不同類型的分生組織的調(diào)節(jié)和相互作用的了解還很少。
            
栽培植物的商品價(jià)值直接與產(chǎn)量有關(guān)，即與所收獲的植株部分的大小和數(shù)量相關(guān)，這些又取決于相應(yīng)植株組織中細(xì)胞分裂的數(shù)量。雖然研究植物生長(zhǎng)的基因方法已提供了有關(guān)植株體形和器官形態(tài)發(fā)生方面的重要信息(參見(jiàn)例如Riechmann等人，1997 Biol.Chem.，3781079-1101；Barton，1998 Current Opin.Plant Biol.，137-42；Christensen等人，1998 Current Biol.，8643-645；Hudson，1999 CurrentOpin.Plant Biol.，256-60；Irish，1999 Dev.Biol.，209211-220；Scheres等人，1999 Current Topics Dev.Biol.，45207-247)，但是對(duì)于什么和如何調(diào)節(jié)植物細(xì)胞分裂以及由此產(chǎn)生的植物器官的整體大小還是知之甚少。因此，對(duì)可通過(guò)對(duì)細(xì)胞分裂的調(diào)節(jié)作用來(lái)控制器官大小的基因進(jìn)行分離和處理，實(shí)際上將對(duì)每一種具有商業(yè)價(jià)值的植物物種的生產(chǎn)性能產(chǎn)生巨大的影響。
            
Hermerly等人(1995 EMBO J，143925-3936)使用擬南芥(Arabidopsisthaliana)Cdc2激酶基因的顯性失活突變作用研究了對(duì)煙草植株生長(zhǎng)和發(fā)育的影響。所有各種真核生物的細(xì)胞周期要正確地運(yùn)行都需要有Cdc2激酶活性。Hermerly等人指出，在煙草植物中編碼顯性失活Cdc2蛋白質(zhì)的擬南芥基因的表達(dá)，可產(chǎn)生在形態(tài)學(xué)方面正常但由于細(xì)胞分裂頻率減少而體形變小的植物。因此，對(duì)植物細(xì)胞分裂的調(diào)節(jié)作用至少是部分地與植株的發(fā)育脫節(jié)的。但是，在正常的植物生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中，為了促成植物細(xì)胞分裂，必須由其它的調(diào)節(jié)性蛋白質(zhì)來(lái)激活Cdc2激酶活性。
            
已分離出大批的植物突變體，這些突變體具有各種異常的形態(tài)和生長(zhǎng)表型(例如參見(jiàn)Lenhard等人，1999 Current Opin.Plant Biol.，244-50)。但是，從視覺(jué)上難以分辨出哪種植物形態(tài)表型是由于決定某個(gè)植物細(xì)胞是否生長(zhǎng)與分裂假定的關(guān)鍵性控制基因或是規(guī)定細(xì)胞發(fā)育結(jié)局的其它一些基因中發(fā)生突變而形成。而且，即使能夠區(qū)別出這種假定的植物生長(zhǎng)突變體，仍需要付出巨大的努力來(lái)分辨起到調(diào)節(jié)植物細(xì)胞分裂的突變基因產(chǎn)究竟是由哪個(gè)DNA片段編碼的。
            
例如，Talbert等人(1995 Development，1212723-2735)報(bào)道，擬南芥突變體中有一個(gè)稱為revoluta(REV)的基因存在缺陷，這種缺陷使得該突變植物的分生組織區(qū)域中的細(xì)胞分裂呈現(xiàn)異常調(diào)節(jié)。具體而言，原本需要該REV基因來(lái)促進(jìn)頂端分生組織包括側(cè)芽(paraclade)分生組織、花的分生組織和初生芽尖分生組織的生長(zhǎng)。同時(shí)，REV基因?qū)θ~子、花器官和莖的分生組織則起著反向的作用。即，在葉子、花器官和莖組織中，REV的作用是限制細(xì)胞分裂，從而減小植物生長(zhǎng)的速率及其組織的最終大小。葉子、花器官和莖等組織中功能性REV蛋白質(zhì)的缺失，可導(dǎo)致這些組織的細(xì)胞數(shù)量和大小的增加。相反，頂端分生組織細(xì)胞中功能性REV蛋白質(zhì)的缺失，則可導(dǎo)致細(xì)胞分裂和器官大小的減少。Talbert等人(1995，本文將其納入作為參考)報(bào)道了在同質(zhì)結(jié)合的revoluta植物中觀察到的詳細(xì)的形態(tài)學(xué)變化。記錄下的revoluta突變體的失常的形態(tài)學(xué)強(qiáng)烈表明，REV基因產(chǎn)物具有調(diào)節(jié)擬南芥的頂端和非頂端分生組織的相對(duì)生長(zhǎng)的作用。這種revoluta突變作用已被用來(lái)繪制REV基因在擬南芥5號(hào)染色體比較遠(yuǎn)端具體的位置的基因圖譜。但是，在本發(fā)明之前，關(guān)于REV基因序列以及使用多核苷酸來(lái)編碼在轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞中調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂的REV蛋白質(zhì)的方法還是未知的。
            
原則上，在DNA或蛋白質(zhì)水平上比較植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)基因與已知在引發(fā)細(xì)胞周期(如細(xì)胞周期蛋白)或調(diào)節(jié)生長(zhǎng)方面起著重要作用的動(dòng)物或真菌基因的序列相似性，也可鑒別出該調(diào)節(jié)基因中的突變過(guò)程。例如，周知在動(dòng)物中的各種同源框(HB)基因是在規(guī)定軀體生長(zhǎng)規(guī)劃以及調(diào)節(jié)高等生物的發(fā)育方面起到主導(dǎo)控制基因作用的編碼蛋白質(zhì)(Gehring等人，1994，Annu.Rev.Biochem.，63487-526)。動(dòng)物中的HB基因可編碼涉及到DNA結(jié)合作用的稱為同源域(HD)的大約60個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)基元，含有HD的蛋白質(zhì)是起著靶基因表達(dá)調(diào)節(jié)子作用的一種轉(zhuǎn)錄因子。植物和動(dòng)物的HD區(qū)域都是高度保守的。最初是在分離具有改變?nèi)~子發(fā)育的顯性突變的稱為knottedl(knl)的玉米突變體的基礎(chǔ)上，鑒別出了植物同源框基因(Vollbrecht等人，199l，Nature，350241-243)。已鑒定出可編碼與玉米Knotted蛋白質(zhì)同源的各種蛋白質(zhì)的基因，并在其序列同源性的基礎(chǔ)上從很多植物物種中克隆出該基因來(lái)(參見(jiàn)Chan等人的綜述，1998，Biochem.et.Biophys.Acta.，14421-19)。雜交研究表明，擬南芥大約有35-70個(gè)不同的含有HD的基因(Schena等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，893894-3898)。
            
已通過(guò)使用從保守的HD序列制備的簡(jiǎn)并寡核苷酸作為雜交探針或PCR引物來(lái)鑒定和分離cDNA克隆，從而分離出了大批的含有HD的植物基因(Ruberti等人，1991 EMBO J.，101787-1791；Schena等人，1992；Mattsson等人，1992 PlantMol.Biol.，181019-1022；Carabelli等人，1993 Plant J.，4469-479；Schena等人，1994 Proc.Natl.Acad.Sci.USA，918393-8397；Soderman等人，1994 PlantMol.Biol.，26145-154；Kawahara等人，1995 Plant Molec.Biol.，27155-164，Meissner等人，1995 Planta，195541-547；Moon等人，1996 Mol.Cells，6366-373；Moon等人，1996，Mol.Cells，6697-703；Gonzalez等人，1997 Biochem.Biophys.Acta，1351137-149；Meijer等人，1997Plant J.，11263-276；Sessa等人，1998 PlantMol.Biol.，38609-622；Aso等人，1999 Mol.Biol.Evol.，16544-552)。對(duì)這些含有HD的基因的分析，揭示了在植物中存在另一大類含有HD的基因，稱為HD-Zip基因，這些基因因其所編碼的蛋白質(zhì)含有與該同源域結(jié)合的亮氨酸拉鏈而得名。這類HD基因是植物所獨(dú)有的(Schena等人，1992)。在氨基酸序列相似性的基礎(chǔ)上，已根據(jù)HD和亮氨酸拉鏈蛋白質(zhì)區(qū)域內(nèi)氨基酸相似性的程度，將由該HD-Zip基因編碼的蛋白質(zhì)分成4個(gè)HD-Zip亞系(Sessa等人，1994，“植物發(fā)育和代謝的分子遺傳學(xué)分析”，P.Puigdomenech和G.Coruzzi編輯，BerlinSpringerVerlag，第411-426頁(yè)；Meijer等人，1997)。但是，與Knotted類的植物HD基因類似，HD-Zip基因也被認(rèn)為可編碼對(duì)植物發(fā)育起調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)(Chan等人，1998)。HD-Zip蛋白質(zhì)中HD和亮氨酸拉鏈區(qū)域的存在非常強(qiáng)烈地表明，這些蛋白質(zhì)經(jīng)由亮氨酸拉鏈區(qū)域形成了多聚體結(jié)構(gòu)，然后經(jīng)由HD區(qū)域結(jié)合到特殊的DNA序列上，以轉(zhuǎn)錄方式調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)(Chan等人，1998)。已通過(guò)對(duì)許多HD-Zip蛋白質(zhì)的體外實(shí)驗(yàn)從實(shí)驗(yàn)上證明了這種推論(Sessa等人，1993；Aoyama等人，1995Plant Cell，71773-1785；Ganzalez等人，1997 Biochem.Biophys.Acta.，1351137-149；Meijer等人，1997；Palena等人，1999 Biochem.J.，34181-87；Sessa等人，1999)，本文納入這些出版物作為參考。
            
已使用一些HD-Zip亞系I、II、III和IV基因進(jìn)行反義和異位表達(dá)實(shí)驗(yàn)，以阻斷HD-Zip表達(dá)和使整個(gè)植株過(guò)量生產(chǎn)HD-Zip蛋白質(zhì)而獲得各種表型結(jié)果(Schena等人，1993；Aoyama等人，1995；Tomero等人，1996，Meijer等人，1997；Altamura等人，1998)。已從原位雜交實(shí)驗(yàn)和Northern印跡雜交實(shí)驗(yàn)中推斷出關(guān)于HD-Zip功能的額外證據(jù)，確定了HD-Zip基因表達(dá)在植物整個(gè)發(fā)育過(guò)程中的短暫模式，以及確定了顯示HD-Zip基因表達(dá)的特定的植物細(xì)胞或組織的位置(見(jiàn)表1)。但是，正如表1中匯總的信息顯示，不論是在超系還是在亞系水平上，都不存在關(guān)于HD-Zip蛋白質(zhì)在植物生長(zhǎng)和發(fā)育方面起著何種調(diào)節(jié)作用的明確模式。而且，也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)HD-Zip基因產(chǎn)物參與調(diào)節(jié)植物細(xì)胞分裂的跡象。
            
表1.HD-Zip基因及其可能的功能  
            
表1歸納的結(jié)果顯示，不能根據(jù)基因所處的是哪一個(gè)HD-Zip亞系來(lái)推測(cè)任何一個(gè)單獨(dú)的HD-Zip基因產(chǎn)物的調(diào)節(jié)作用。可通過(guò)對(duì)HD與亮氨酸拉鏈區(qū)域中的氨基酸序列的調(diào)整和比較確定這些HD-Zip亞系(參見(jiàn)Aso等人，1999，圖2關(guān)于最新的HD-Zip區(qū)域調(diào)整)。在許多情況中，根據(jù)在HD-Zip區(qū)域之外發(fā)現(xiàn)的保守蛋白質(zhì)功能區(qū)中的氨基酸序列相似性的程度，就可預(yù)測(cè)到HD-Zip調(diào)節(jié)功能的保存情況。即，從不同植物物種獲得的彼此功能類似(即執(zhí)行相同的生物學(xué)功能)的HD-Zip基因產(chǎn)物，不僅共有保守的HD-Zip區(qū)域，而且在蛋白質(zhì)鏈的全長(zhǎng)方面還比其它執(zhí)行不同生物學(xué)作用的HD-Zip蛋白質(zhì)顯示出更大的氨基酸序列相似性。因此，表1歸納的數(shù)據(jù)顯示出所推斷的各個(gè)HD-ZipI、II、III和IV基因產(chǎn)物的生物學(xué)功能不一致的結(jié)論是毫不足怪的。盡管如此，關(guān)于HD-Zip超系的各種蛋白質(zhì)在調(diào)節(jié)植物發(fā)育中起著重要作用的推測(cè)還仍然廣為流傳(例如參見(jiàn)Chan等人，1998)。
            
鑒于植物生長(zhǎng)在農(nóng)藝學(xué)方面的重要性，如今對(duì)于各種轉(zhuǎn)基因組合物產(chǎn)生了強(qiáng)烈的需求，其中的基因序列含有在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)時(shí)可調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)。使用本發(fā)明的組合物和方法就可以創(chuàng)造各種有用的轉(zhuǎn)基因植物，這些植物可表達(dá)REVOLUTA轉(zhuǎn)基因而調(diào)節(jié)其細(xì)胞分裂。如本發(fā)明所提供的各種組合物和方法，可通過(guò)控制(如增加)特定的植株組織中的細(xì)胞分裂數(shù)量的能力來(lái)控制(包括增加)植株的大小。
            
本發(fā)明的組合物和方法提供了另一種途徑，以滿足由于世界人口的持續(xù)增長(zhǎng)以及整個(gè)世界要提高生活標(biāo)準(zhǔn)的愿望而對(duì)糧食和植物纖維的日益增長(zhǎng)的需求。盡管近年來(lái)在農(nóng)業(yè)上成功地保持著糧食產(chǎn)量與世界人口同步增長(zhǎng)，但是當(dāng)今世界仍有超過(guò)8億人長(zhǎng)期處于營(yíng)養(yǎng)不良的狀態(tài)，有1.8億兒童的體重嚴(yán)重地低于其所處年齡段的體重標(biāo)準(zhǔn)，有4億育齡期婦女缺鐵和貧血，這導(dǎo)致嬰兒和母親死亡。到2020年還要再養(yǎng)活額外增長(zhǎng)的20億人，并且會(huì)有多于這一數(shù)量的人將長(zhǎng)期營(yíng)養(yǎng)不良。例如，在林木中，形成層負(fù)責(zé)樹(shù)干的增長(zhǎng)。在蕃茄(和其它許多植物)中，子房壁不僅負(fù)責(zé)成熟果實(shí)的大小，還負(fù)責(zé)可溶性固體成分的含量。在谷類作物中，胚乳決定種子的大小。在有些情況下，可通過(guò)增加果實(shí)支撐結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)度來(lái)提高產(chǎn)量，如玉米果穗是修改過(guò)的莖時(shí)，該莖的長(zhǎng)度可決定玉米籽粒的數(shù)量。此外，轉(zhuǎn)基因植物作為藥劑和工業(yè)品，來(lái)源的可能用途可能要求對(duì)器官特定生長(zhǎng)調(diào)節(jié)過(guò)程進(jìn)行控制。
            
農(nóng)業(yè)上發(fā)展增加增長(zhǎng)或降低增長(zhǎng)的技術(shù)的潛力是非常大的。對(duì)于每一種農(nóng)作物，小至幾個(gè)百分比的產(chǎn)量增加都是非常理想的。相反，在許多水果類農(nóng)作物中，非常希望的是無(wú)籽的果實(shí)。在本發(fā)明中，除了可在全部現(xiàn)有各種植物種類之外應(yīng)用，還可改變農(nóng)作物的育種方式。植物育種可致力于耐壓抑性和抗有害生物性以及營(yíng)養(yǎng)和滋味品質(zhì)等方面?？稍诟呒?jí)精選種系中引入本發(fā)明的生長(zhǎng)賦予的品質(zhì)，以強(qiáng)化其生產(chǎn)潛力。
            
發(fā)明概要本發(fā)明通過(guò)改變轉(zhuǎn)基因植物中REVOLUTA蛋白質(zhì)的水平提供調(diào)節(jié)植物細(xì)胞分裂的各種組合物和方法。具體而言，本發(fā)明將使用REVOLUTA轉(zhuǎn)基因與增加或降低生物學(xué)活性REVOLUTA蛋白質(zhì)的表達(dá)相聯(lián)系，從而調(diào)節(jié)植物細(xì)胞分裂過(guò)程。
            
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，提供了含有可編碼至少與擬南芥REVOLUTA蛋白質(zhì)序列〔SEQ ID NO2〕約有70％相同的REVOLUTA蛋白質(zhì)的多核苷酸序列的DNA分子。在某些實(shí)施例方面，該蛋白質(zhì)至少約有80％與SEQ ID NO2相同。較佳的是，該DNA分子含有可編碼具有與擬南芥REVOLUTA蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性相同的REVOLUTA蛋白質(zhì)的多核苷酸序列，即它能調(diào)節(jié)植物細(xì)胞分裂。在某些較佳實(shí)施例中，由該DNA分子編碼的蛋白質(zhì)具有REV表型。
            
根據(jù)某些較佳實(shí)施例，本發(fā)明提供了一種與擬南芥REVOLUTA核酸序列的外顯子3-18(SEQ ID NO1的第3670-3743、3822-3912、4004-4099、4187-4300、4383-4466、4542-4697、4786-4860、4942-5048、5132-5306、5394-5582、5668-5748、5834-5968、6051-6388、6477-6585、6663-6812和6890-7045的核苷酸)中的至少一個(gè)有至少80％相同的多核苷酸。
            
同樣，本發(fā)明提供一種含有與選自SEQ ID NO187、SEQ ID NO188、SEQ IDNO189、SEQ ID NO190、SEQ ID NO191、SEQ ID NO192、SEQ ID NO193、SEQ ID NO194、SEQ ID NO195和SEQ ID NO196的蕃茄Rev基因(或多核苷酸)中的至少一個(gè)相同至少約80％的多核苷酸序列的分離的DNA分子。
            
根據(jù)其它實(shí)施例，本發(fā)明提供了含有可編碼由與REV基因產(chǎn)物的某些區(qū)域至少相同約95％的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸序列，尤其是選自SEQ IDNO130、SEQ ID NO131、SEQ ID NO132、SEQ ID NO133、SEQ ID NO134、SEQID NO135、SEQ ID NO136和SEQ ID NO137的序列的分離的DNA分子。
            
根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施例，該編碼的蛋白質(zhì)含有選自SEQ ID NO2、SEQ IDNO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO159、SEQ IDNO160、SEQ ID NO164、SEQ ID NO171和SEQ ID NO173的氨基酸序列。
            
本發(fā)明還提供了一些實(shí)施例，其中的多核苷酸序列選自SEQ ID NO1、SEQ IDNO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ IDNO157、SEQ ID NO158、SEQ ID NO163、SEQ ID NO164、SEQ ID NO169、SEQID NO170和SEQ ID NO172。
            
本發(fā)明的另一實(shí)施例提供了選自SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9和SEQ ID NO11的多核苷酸序列，其中，該多核苷酸序列可編碼與野生型REV蛋白質(zhì)相比在細(xì)胞分離的常規(guī)調(diào)節(jié)方面有缺陷的突變體REVOLUTA蛋白質(zhì)。本發(fā)明還提供含有從野生型擬南芥REVOLUTA蛋白質(zhì)〔SEQ ID NO2〕和圖3所示以rev-1、rev-2，4、rev-3、rev-5和rev-6表示的各種revoluta突變體蛋白質(zhì)等組成的序列群中選出的氨基酸序列的分離的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還提供了其它各種REVOLUTA蛋白質(zhì)，它們含有與擬南芥REV氨基酸序列(SEQ ID NO2中顯示)至少相同約70％的氨基酸序列。
            
本發(fā)明的又一實(shí)施例提供了含有復(fù)制子和REVOLUTA轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因載體，該REVOLUTA轉(zhuǎn)基因含有選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQID NO7、SEQ ID NO9和SEQ ID NO11的核酸序列。較佳的是，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因載體還含有針對(duì)REVOLUTA轉(zhuǎn)基因表達(dá)的結(jié)構(gòu)性或組織特異性啟動(dòng)子區(qū)域和Poly A額外區(qū)域。REVOLUTA轉(zhuǎn)基因的表達(dá)可引起對(duì)經(jīng)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因載體轉(zhuǎn)化了的植株細(xì)胞的細(xì)胞分裂過(guò)程進(jìn)行調(diào)節(jié)。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因載體含有一多核苷酸序列，該序列含有可編碼與野生型擬南芥REVOLUTA蛋白質(zhì)序列〔SEQ ID NO2〕至少相同約70％的蛋白質(zhì)的序列。在本發(fā)明的又一實(shí)施例中，多核苷酸序列可編碼具有一個(gè)肽區(qū)域的蛋白質(zhì)；該肽區(qū)域與野生型擬南芥REVOLUTA蛋白質(zhì)的區(qū)域至少相同約70％，在SEQ ID NO2中該肽區(qū)域限定為第114位氨基酸到包括第842位氨基酸。
            
本發(fā)明另一方面提供了轉(zhuǎn)基因植物，該植物含有上述多核苷酸和REVOLUTA轉(zhuǎn)基因載體中的至少一種。一方面，相對(duì)于未轉(zhuǎn)化植物，當(dāng)本發(fā)明REVOLUTA轉(zhuǎn)基因在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，該轉(zhuǎn)化的植物的細(xì)胞分裂受到調(diào)節(jié)。具體而言，與未轉(zhuǎn)化植物的對(duì)照種群相比，本發(fā)明提供具有調(diào)節(jié)的細(xì)胞分裂的轉(zhuǎn)基因植物(在遺傳學(xué)上被含有選自有義基因、反義基因、反向復(fù)制基因或糖酶基因的REVOLUTA轉(zhuǎn)基因的核酸序列轉(zhuǎn)化)。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物可進(jìn)一步繁殖，而產(chǎn)生具有經(jīng)調(diào)節(jié)的細(xì)胞分裂特性的在遺傳學(xué)上的不分離系植物種群。此外，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物還可與其它具有一種或多種理想表型特征(如耐壓抑性和抗有害生物性或營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和滋味品質(zhì))的植物種類雜交，產(chǎn)生具有前述理想特征與調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂的轉(zhuǎn)基因特性相結(jié)合的新穎植物。
            
另一方面，本發(fā)明提供調(diào)節(jié)植物細(xì)胞分裂的方法，該方法包括將REVOLUTA轉(zhuǎn)基因?qū)胫辽僖粋€(gè)植物細(xì)胞中的一系列步驟。本發(fā)明的方法還包括用REVOLUTA轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生一種或多種植株的步驟。再生的植株可隨意篩選，以鑒別出與未轉(zhuǎn)化植株相比具有經(jīng)過(guò)調(diào)節(jié)的細(xì)胞分裂特性的植株。調(diào)節(jié)了細(xì)胞分裂的轉(zhuǎn)基因植株與未轉(zhuǎn)化的植株相比，至少有一個(gè)植物器官或組織(由于細(xì)胞的數(shù)量增加或減少的體形)較大或較小。目前用于實(shí)施本發(fā)明方法的最佳的REVOLUTA轉(zhuǎn)基因是上面所述的多核苷酸序列。另外，還可使用選自有義基因、反義基因、反向復(fù)制基因和REVOLUTA核糖酶基因的REVOLUTA轉(zhuǎn)基因來(lái)實(shí)施本發(fā)明的各種方法。
            
本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施例提供了從植物中分離REVOLUTA基因的一種方法。具體而言，該方法包括下述步驟a)使用正向和反向寡核苷酸引物擴(kuò)增植物多核苷酸序列，該引物可編碼與SEQ ID NO2中相應(yīng)的氨基酸序列至少相同約50％的氨基酸序列；b)將該擴(kuò)增的植物多核苷酸雜交到重組植物DNA克隆的文庫(kù)上；c)從與該擴(kuò)增的植物多核苷酸雜交的重組DNA克隆中分離出DNA分子；d)將含有所述擴(kuò)增的植物多核苷酸或DNA分子的載體轉(zhuǎn)化到植株中；e)通過(guò)比較轉(zhuǎn)化的與未轉(zhuǎn)化的植物，確定轉(zhuǎn)化植物中的細(xì)胞分裂已被調(diào)節(jié)。較佳的是，由本發(fā)明方法分離的DNA可編碼與具有SEQ ID NO2序列的REVOLUTA蛋白質(zhì)中的氨基酸序列至少相同約70％的氨基酸序列。此外，較佳通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因植株或其組織或器官與相應(yīng)的未轉(zhuǎn)化的植株或其組織或器官進(jìn)行比較來(lái)確定細(xì)胞分裂的調(diào)節(jié)情況。與未轉(zhuǎn)化的植株相比，轉(zhuǎn)基因植物株或其組織或器官中的細(xì)胞數(shù)量的增加或減少，表明了分離的DNA分子可編碼本發(fā)明的REVOLUTA基因。
            
本發(fā)明還提供了一種含有嵌合型植物基因的植物，該嵌合型基因具有一個(gè)在植物細(xì)胞中起作用的啟動(dòng)子序列；可引起可編碼融合多肽的RNA的產(chǎn)生或引起同源基因抑制的RNA轉(zhuǎn)錄的編碼序列，從而該嵌合型植物基因的表達(dá)可調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)，如調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂；以及可編碼多腺苷酸化信號(hào)的3′非翻譯區(qū)，該信號(hào)在植物細(xì)胞中起到可引起多腺苷酸核苷酸添加到該RNA的3′端的作用；其中，該啟動(dòng)子相對(duì)于該編碼序列是異源的，并適用于引起該嵌合型植物基因的充分表達(dá)，以調(diào)節(jié)該嵌合型基因轉(zhuǎn)化的植株的生長(zhǎng)。
            
附圖的簡(jiǎn)短描述對(duì)本發(fā)明上述各點(diǎn)和許多附帶的優(yōu)點(diǎn)是比較容易評(píng)價(jià)的，同時(shí)再結(jié)合各例附圖并參照相應(yīng)的詳細(xì)描述，就會(huì)有更好的理解，其中
            

            
圖1是擬南芥5號(hào)染色體1.95Mb區(qū)域的遺傳圖譜。
            
圖2顯示了圖1中的遺傳圖譜的放大區(qū)域，其中使用單一序列長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記進(jìn)行遺傳雜交確定了REVOLUTA基因的位置。
            
圖3表示從分離自擬南芥REVOLUTA基因〔SEQ ID NO1〕推斷得到的完整的蛋白質(zhì)序列〔SEQ ID NO2〕。空心三角形表示編碼REVOLUTA的DNA序列(SEQ ID NO1〕中的外顯子和內(nèi)含子核苷酸序列之間的拼合連接。暗框中表示保守的同源域和亮氨酸拉鏈基元。下面劃線的氨基酸區(qū)表示另一可能的亮氨酸拉鏈基元。倒置三角形表示內(nèi)含子-外顯子連接。野生型序列下的粗體字表示rev-4突變體氨基酸C-末端延伸。
            
圖4顯示了擬南芥的HD-ZipIII族蛋白質(zhì)的校準(zhǔn)。使用多序列校準(zhǔn)方程(http//dot.imgen.bcm.tmc.edu9331/multh-align/multi-align.html)和boxshade(http//www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html)校準(zhǔn)出各蛋白質(zhì)序列。黑色區(qū)顯示的殘基相同，是灰色區(qū)域顯示的是保留的殘基。
            
圖5顯示各rev-1突變體的部分互補(bǔ)關(guān)系。圖片(A)顯示在內(nèi)源啟動(dòng)子(右)的控制下用空虛載體(左)或含有野生型REV基因的5′REV結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化所獲得的各rev-1轉(zhuǎn)基因植株的比較。圖片(B)顯示轉(zhuǎn)化了rev-1載體的植株的特寫，該植株顯示出rev突變體植物的葉腋空和虛花朵增大的特征。圖片(C)是用5′REV結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化的rev-1植株的特寫。與野生型類似，許多葉腋具有腋芽，花朵較小。圖片(D)是顯示反向復(fù)制結(jié)構(gòu)的對(duì)照植株(空載體)，哥倫比亞(Columbia)生態(tài)型。圖片(E-G)顯示用35S-REVIR結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化了的哥倫比亞型植株，該植株顯示出一些Rev-表型的特征，包括空葉腋(箭頭所示)。它的花與野生型的花大小類似，不像rev植株的花朵增大。圖片(H)顯示了35S-REVIP轉(zhuǎn)基因植株(左)和母本哥倫比亞型植株(右)的比較。
            
圖6顯示在REVmRNA水平的半定量RT-PCR分析。
            
圖7顯示REV mRNA的表達(dá)模式。圖片(A-C)顯示花序頂部的縱切面。(A)中箭頭表示顯示REV表達(dá)的葉腋分生組織。(B)是葉腋花序分生組織。數(shù)字表示花原基的發(fā)育期。im＝花序分生組織、g＝雌蕊群、s＝雄蕊、se＝萼片。圖片(D)顯示第1O期雌蕊群的縱切面。op＝胚珠原基、st＝柱頭。圖片(E)顯示幼齡莖生葉的縱切面。圖片(F)是在花粉囊和雌蕊群顯示最高表達(dá)的第4期營(yíng)養(yǎng)組織花的縱切面。圖片(G)是在花粉囊和雌蕊群顯示最高表達(dá)的第9期花朵的橫切面。t＝營(yíng)養(yǎng)組織層、PMC＝花粉母細(xì)胞。圖片(H)顯示了在雄蕊和花瓣中呈現(xiàn)REV表達(dá)的第8期花朵的縱切面。圖片(I)顯示了在雄蕊和花瓣中呈現(xiàn)REV表達(dá)的第9期花朵的縱切面。圖片(J)顯示了發(fā)育中的種子的縱切面，表明了在胚乳中的表達(dá)。圖片(K)顯示了發(fā)育中的種子的縱切面，顯示了胚乳中的REV表達(dá)。箭頭所指表示胚柄。圖片(L)顯示了發(fā)育中的種子的縱切面，顯示出在早期心形胚中的表達(dá)。圖片(M)顯示了發(fā)育中的魚雷形胚中組蛋白H4的表達(dá)。圖片(N)顯示了在發(fā)育中的晚期心形胚中的REV有義探針。圖片(O)顯示了具有REV有義探針的花序頂部的縱切面。圖片(P)顯示了用反義REV作為探針研究的莖部橫切面，co＝皮層。圖片(Q)顯示了具有REV有義探針的莖部橫切面。圖片(R)顯示了Talbert等人(1995)所述的在番紅O和固綠FCF中染色的rev-1莖部橫切面的亮視野像。圖片(S)顯示了野生型的莖橫切面的亮視野像。
            
圖8顯示rev-1和野生型組織中組蛋白H4和FIL的表達(dá)。圖片(A)是野生型花序頂部的縱切面圖，顯示組蛋白H4的表達(dá)。圖片(B)是rev-1花序頂部的縱切面圖，顯示了組蛋白H4的表達(dá)。圖片(C)是A的放大圖。圖片(D)是B的放大圖，顯示在葉的近軸側(cè)呈現(xiàn)H4表達(dá)的細(xì)胞的數(shù)量增加。圖片(E)是野生型花序分生組織(im)，包括第3和第5期花的雄蕊(st)和萼片(se)原基的橫切面圖，顯示了FIL在其中的表達(dá)。圖片(F)是野生型花的橫切面圖，顯示了心皮瓣(va)和花瓣(pe)遠(yuǎn)軸側(cè)中的FIL表達(dá)。圖片(G-H)是rev-1花序頂部和發(fā)育中的雄蕊(st)的遠(yuǎn)軸側(cè)中的發(fā)育第7期花的縱切面圖，顯示了FIL在其中的表達(dá)。圖片(I)是顯示FIL表達(dá)的rev-1花的橫切面圖，顯示了在心皮瓣(va)和花瓣(pe)遠(yuǎn)軸側(cè)中FIL的表達(dá)。
            
圖9顯示了各種rev雙重突變體。圖片(A)顯示了花序大大縮短的rev lfy雙重突變體，該花序終止于一束短絲。該植株還呈現(xiàn)的葉片翻卷。插圖是在rev lfy植株莖部發(fā)現(xiàn)的細(xì)絲狀附器的放大圖。圖片(B)顯示花序大大縮短和葉片翻卷的rev fil雙重突變體。圖片(C)顯示了rev lfy植株上的細(xì)絲狀附器，類似于在rev突變植株的葉腋部常見(jiàn)的結(jié)構(gòu)。圖片(D)顯示具有細(xì)絲狀附器的rev-1突變植原的葉腋。圖片(E)顯示具有一束無(wú)花細(xì)絲的rev lfy植株的花序結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)星形毛狀體或心皮樣的特征。圖片(F)顯示具有一束光滑的無(wú)花細(xì)絲的rev fil植株的花序結(jié)構(gòu)。圖片(G)顯示rev fil花序的SEM。標(biāo)尺長(zhǎng)1mm。圖片(H)顯示具有心皮樣特征的revlfy花序的SEM。圖片(I)顯示rev lfy花序的SEM。
            
圖10顯示用空對(duì)照載體(C)轉(zhuǎn)化的標(biāo)準(zhǔn)植株和用35S-REV基因(LS)轉(zhuǎn)化的植株產(chǎn)生的種子大小的比較。
            
圖11提供了用空載體(C)轉(zhuǎn)化的植株和用35S-REV基因(LS)轉(zhuǎn)化的植株產(chǎn)生的蓮座短莖和葉片大小的例子。
            
圖12提供了用空載體(C)轉(zhuǎn)化的植株和用35S-REV基因(LS)轉(zhuǎn)化的植株產(chǎn)生的花序莖和莖生葉的大小的例子。
            
最佳實(shí)施例的詳細(xì)描述本文所用術(shù)語(yǔ)“氨基酸”指所有天然存在的L-α-氨基酸或其殘基。以單個(gè)字母或三個(gè)字母一組來(lái)表示這些氨基酸Asp D   天冬氨酸 IleI  異亮氨酸Thr T   蘇氨酸   LeuL  亮氨酸Ser S   絲氨酸   TyrY  酪氨酸Glu E   谷氨酸   PheF  苯丙氨酸Pro P   脯氨酸   HisH  組氨酸Gly G   甘氨酸   LysK  賴氨酸Ala A   丙氨酸   ArgR  精氨酸Cys C   半胱氨酸 TrpW  色氨酸Val V   纈氨酸   GlnQ  氨酰胺Met M   甲硫氨酸 AsnN  天冬酰胺本文所用術(shù)語(yǔ)“核苷酸”指DNA或RNA的單體單元，其分子中含有一個(gè)糖部分(戊糖)、一個(gè)磷酸酯和一個(gè)含氮的雜環(huán)堿基。堿基通過(guò)糖苷碳鍵(戊糖的1′碳)與糖部分連接，堿基與糖的結(jié)合稱為核苷。堿基是核苷酸的特征，DNA具有4種堿基，分別是腺嘌呤(“A”)、鳥嘌呤(“C”)、胞嘧啶(“C”)和胸腺嘧啶(“T”)。次黃嘌呤核苷(“I”)是合成堿基，能用它來(lái)取代任何天然的4種堿基(A、C、G或T)。RNA的四個(gè)堿基是A、G、C和U(尿嘧啶)。本文所述核苷酸序列是由相鄰戊糖的3′和5′碳原子之間的磷酸二酯鍵連接的核苷酸的線性陣列。
            
術(shù)語(yǔ)“DNA序列編碼”、“DNA編碼”和“核酸編碼”指沿著脫氧核糖核酸鏈的脫氧核糖核苷酸編排順序或序列。這些脫氧核糖核苷酸的順序決定了所翻譯的多肽鏈上氨基酸的順序。因而DNA序列可編碼氨基酸序列。
            
術(shù)語(yǔ)“重組DNA分子”指通過(guò)在體外將兩個(gè)或多個(gè)DNA分子連接成一個(gè)重組分子而產(chǎn)生的任何DNA分子。“重組DNA分子的文庫(kù)”指含有一批不同重組DNA分子的任何克隆庫(kù)，其中，該重組DNA分子含有可復(fù)制的載體和得自源生物體的DNA序列。
            
“寡核苷酸”指通過(guò)磷酸二酯鍵連接的脫氧核糖核苷酸的短的單鏈或雙鏈序列。寡核苷酸可由已知的方法化學(xué)合成并純化，例如，用聚丙烯酰胺凝膠純化。
            
術(shù)語(yǔ)“植物”包括全植株、植物器官(如葉、莖、花、根等)、種子和植物細(xì)胞(包括組織培養(yǎng)細(xì)胞)及其后代。可用于本發(fā)明方法的植物的種類十分廣泛，一般為可適用于轉(zhuǎn)化技術(shù)的各類高等植物(包括單子葉植物和雙子葉植物)以及某些低等植物(如藻類)。它包括各種倍性水平的植物，包括多倍體、二倍體和單倍體。
            
“異種序列”是來(lái)自外來(lái)物種的序列，或者，如果是來(lái)自同一物種的序列，則該序列已在其原始形式上被大大地修改。例如，操作性連接于一個(gè)結(jié)構(gòu)基因的異種啟動(dòng)子，與衍生該結(jié)構(gòu)基因的物種不同，或者，如果該啟動(dòng)子是來(lái)自同一物種，則它已在其原始形式上被大大修改。
            
本文所用術(shù)語(yǔ)“REVOLUTA基因”或“REVOLUTA轉(zhuǎn)基因”指任何可編碼REVOLUTA蛋白質(zhì)或促進(jìn)其表達(dá)和/或生產(chǎn)的多核苷酸序列。因而，術(shù)語(yǔ)“REVOLUTA基因”和“REVOLUTA轉(zhuǎn)基因”包括側(cè)接REVOLUTA蛋白質(zhì)編碼序列的各種序列。具體而言，術(shù)語(yǔ)“REVOLUTA基因”和“REVOLUTA轉(zhuǎn)基因”包括蛋白質(zhì)編碼序列(外顯子)、間插序列(內(nèi)含子)、側(cè)接DNA的5′和3′區(qū)域的含有REVULOTA基因正常表達(dá)所需序列(即分別是啟動(dòng)子和Poly A附加區(qū)域，以及任何增強(qiáng)子序列)的序列。
            
本文所用術(shù)語(yǔ)“REVOLUTA蛋白質(zhì)”、“REVOLUTA同源物”或“REVOLUTA在源物”指(當(dāng)用于實(shí)施本發(fā)明方法時(shí))能調(diào)節(jié)植物細(xì)胞的分裂并且其氨基酸序列與SEQ ID NO2的第1-842個(gè)(包括本數(shù))氨基酸殘基具有至少約70％、更佳至少約75％、最佳至少約80％的相同的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的REVOLUTA蛋白質(zhì)還與限定在SEQ ID NO2的第114-842個(gè)氨基酸(包括本數(shù))的氨基酸區(qū)域相同至少約70％、更佳至少約75％、最佳至少約80％。本發(fā)明的REVOLUTA蛋白質(zhì)還是與限定在SEQ ID NO2的第433-842個(gè)氨基酸(包括本數(shù)的氨基酸區(qū)域)有至少約70％、更佳至少約75％、最佳約80％相同的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的REVOLUTA蛋白質(zhì)還是與限定在SEQ ID NO2的第611-745個(gè)氨基酸(包括本數(shù))的氨基酸區(qū)域有至少約70％、更佳至少約75％、最佳約80％相同的蛋白質(zhì)。
            
可采用如下方法來(lái)確定氨基酸序列的同一性。利用2.0.9版的BLASTP程序(Altschul等人，1997 Nucleic Acids Res.，253389-3402)，使用從第1個(gè)氨基酸延伸到第842個(gè)氨基酸(包括第842個(gè))的REVOLUTA的氨基酸序列部分(如圖3所示)來(lái)檢索核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)，如Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)?；蛘?，可使用從SEQ ID NO2的第114個(gè)到第842個(gè)(包括第842個(gè))氨基酸、或者第433個(gè)到第842個(gè)(包括第842個(gè))氨基酸、或者第611個(gè)到第745個(gè)氨基酸的REVOLUTA蛋白質(zhì)序列進(jìn)行檢索。該程序使用默認(rèn)模式。所檢索到的那些與SEQ ID NO2的任何上述指定的區(qū)域具有至少約70％相同的序列，都可認(rèn)為是REVOLUTA蛋白質(zhì)。
            
對(duì)兩條(或多條)多核苷酸或多肽之間的序列比較，一般是通過(guò)“比較窗”比較兩個(gè)序列，以確定和比較序列局部區(qū)域的相似性。在本文中所用的“比較窗”指在對(duì)兩條序列進(jìn)行最優(yōu)排列之后，它們中至少約有20個(gè)、一般約有50-200個(gè)、更一般約有100-150個(gè)鄰接的位置的一個(gè)片段，其中一個(gè)序列與對(duì)比序列相似，具有同等數(shù)量的鄰接位置。
            
可采用如下方法進(jìn)行用于比較的序列的最佳排列采用局部同一性或類似性算法(如Smith和Waterman，所述的算法)、1981，Adv.Appl.Math.2482)、Needleman和Wunsch所述的同源排列算法(1970，J.Mol.Biol.，48443)、Pearsn和Lipman的相似性方法的探索(1988 Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，852444)、這些算法的計(jì)算機(jī)化輔助手段〔Wisconsin Genetics Sofiware Package中的GAP、BESTFIT、BLAST、BLASTP2.0.9、TBLASTN、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group(GCG)，575 Science，Dr.Madison，Wis；Atlschul等人，1997〕或者通過(guò)檢查。
            
術(shù)語(yǔ)“同一性百分?jǐn)?shù)”指當(dāng)使用http//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/wblast2.cgi上的BLASTP2.0.9程序檢測(cè)兩條肩并肩排列的氨基酸序列或兩條核酸序列時(shí)，在相同的相對(duì)位置上所占有的氨基酸或核苷酸的百分?jǐn)?shù)。本文中使用的“氨基酸序列同一性百分?jǐn)?shù)”是使用BLASTP2.0.9的缺陷矩陣BLOSUM62(開(kāi)放缺口＝11，缺口延伸代價(jià)＝1)來(lái)測(cè)定的。該百分?jǐn)?shù)是這樣計(jì)算的測(cè)定在兩條序列中出現(xiàn)相同核酸堿基或氨基酸殘基的位置數(shù)，求得匹配位置數(shù)，將此匹配位置數(shù)除以比較窗中的位置總數(shù)，然后乘以100，得到序列同一性的百分?jǐn)?shù)。不論是N-或C-末端的延伸部分還是插入部分都不可解釋為它們減少了序列同一性。
            
術(shù)語(yǔ)“相似性百分?jǐn)?shù)”是兩條相比較的蛋白質(zhì)序列的相關(guān)性程度的統(tǒng)計(jì)學(xué)量度。相似性百分?jǐn)?shù)由計(jì)算機(jī)程序算得，該程序根據(jù)其化學(xué)相似性(如比較的各氨基酸是否是酸性的、堿性的、疏水的、芳族的等)和/或在進(jìn)化距離上確定該成對(duì)相比較的氨基酸的數(shù)值。進(jìn)化距離是將一個(gè)可編碼相比較的成對(duì)氨基酸中的一個(gè)成員的密碼子轉(zhuǎn)化成可編碼其中另一成員的密碼子所需的堿基對(duì)改變的最小數(shù)值來(lái)算得。通過(guò)對(duì)所有可能的排列進(jìn)行交互比較憑經(jīng)驗(yàn)將兩條序列進(jìn)行最佳擬合排列后，進(jìn)行計(jì)算。(Henikoff等人，1992 Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8910915-10919)。
            
多核苷酸序列的“基本上相同”指使用上述程序(最佳是BLAST2)的各項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)，多核苷酸與參照序列比較具有至少60％、較佳至少70％、更佳至少80％、最佳至少90％的序列同一性。熟練的技術(shù)人員能夠判別這些數(shù)值可適當(dāng)調(diào)整，在考慮到密碼子簡(jiǎn)并性、氨基酸相似性、閱讀框位置等因素的情況下，來(lái)測(cè)定兩條核苷酸序列所編碼的各種蛋白質(zhì)的相應(yīng)的同一性。在這方面適用的氨基酸序列的基本上相同，一般指至少有60％、較佳至少有70％、更佳至少有80％的序列同一性?！盎旧项愃啤钡亩嚯亩季哂猩鲜龈鞣N序列，除了不相同的各殘基位置因保守的氨基酸有變化而可能有所不同。保守的氨基酸取代方式指具有類似側(cè)鏈的殘基的互換性。例如，具有脂肪族側(cè)鏈的一組氨基酸族有甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；具有脂肪族-羥基側(cè)鏈的一組氨基酸族有絲氨酸和蘇氨酸；具有含酰胺側(cè)鏈的一組氨基酸族是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳族側(cè)鏈的一組氨基酸族是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有堿性側(cè)鏈的一組氨基酸族是賴氨酸、精氨酸和組氨酸；具有含硫側(cè)鏈的一組氨基酸族是半胱氨酸和甲硫氨酸。最佳的保守氨基酸取代群是纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、賴氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
            
核苷酸序列基本上相同的另一指征是，在嚴(yán)格的條件下，兩個(gè)分子是否相互雜交，或都與第3個(gè)核酸分子雜交。嚴(yán)格條件是序列依賴性的，在不同環(huán)境中有所不同。通常，所選擇的嚴(yán)格條件約低于在確定的離子強(qiáng)度和pH中的具體序列的熱熔點(diǎn)(Tm)5℃。Tm是(在確定離子強(qiáng)度和pH下)50％的靶序列與最佳匹配探針雜交時(shí)的溫度。一般情況下，嚴(yán)格條件是鹽濃度在pH7時(shí)約為0.02摩爾和溫度至少約為60℃的條件。當(dāng)在從不同物種分離得到的多核苷酸序列之間進(jìn)行異種雜交時(shí)，更佳使用適度嚴(yán)格條件。
            
用于鑒定(用Southern印跡法)編碼REVOLUTA-同源物的附加核酸分子的高嚴(yán)格的雜交條件和洗滌條件的范例是在68℃、含有1mM Na2EDTA、20％十二烷基硫酸鈉的0.25M Na2HPO4緩沖液(pH7.2)中進(jìn)行雜交；在含有1mM Na2EDTA、1％(w/v)十二烷基硫酸鈉的20mM Na2HPO4緩沖液(pH7.2)中進(jìn)行洗滌(65℃洗滌3次，每次20分鐘)。
            
用于鑒定(Southem印跡法)編碼REVOLUTA-同源物的附加核酸分子的適度嚴(yán)格的雜交條件和洗滌條件的范例是在45℃、含有1mM Na2EDTA、20％十二烷基硫酸鈉的0.25M Na2HPO4緩沖液(pH7.2)中進(jìn)行雜交；在55-65℃、在含有0.1％(w/v)十二烷基硫酸鈉的5×SSC中進(jìn)行洗滌?？s寫“SSC”指在核酸雜交溶液中使用的緩沖液。1升20×(20倍濃度)原液SSC緩沖液(pH7.0)含有175.3g氯化鈉和88.2g檸檬酸鈉。
            
在轉(zhuǎn)基因表達(dá)和內(nèi)源基因的抑制同時(shí)發(fā)生的例子(如，通過(guò)反義、核糖酶、反向復(fù)制、有義抑制或轉(zhuǎn)基因?qū)虻耐粗亟M)，熟練的技術(shù)人員將可判別，插入的多核苷酸序列不需要與產(chǎn)生它的基因的序列完全相同，只要“基本上相同”即可。如下面所解釋，這個(gè)術(shù)語(yǔ)專門包羅了這類變種。
            
在插入的多核苷酸序列被轉(zhuǎn)錄并被翻譯而產(chǎn)生一種功能性多肽的情況下，熟練的技術(shù)人員將可判別，由于密碼子的簡(jiǎn)并性，可有大量的多核苷酸序列編碼同一種多肽。這些變化方式特別地包含在術(shù)語(yǔ)“REVOLUTA基因”和“REVOLUTA轉(zhuǎn)基因”的含義中。此外，這些術(shù)語(yǔ)特別包括與基因序列基本上相同(如下面所述測(cè)定)并且可編碼保留了REVOLUTA基因產(chǎn)物的功能的蛋白質(zhì)的全長(zhǎng)序列。
            
在使用多核苷酸來(lái)抑制內(nèi)源基因表達(dá)的例子中，所導(dǎo)入的序列不需要與靶內(nèi)源基因的序列完全相同。該導(dǎo)入的多核苷酸序列一般至少與該靶內(nèi)源序列基本上相同(如下面所述測(cè)定)。
            
當(dāng)如上述將兩條核酸序列或多肽校準(zhǔn)至最大一致時(shí)，如果在該兩個(gè)序列中它們的核苷酸序列或氨基酸殘基分別相同，那么就可說(shuō)這兩條核酸序列或多肽“相同”。術(shù)語(yǔ)“與...互補(bǔ)”在本文中指互補(bǔ)的序列與整條參考多核苷酸序列或其部分相同。
            
術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞分裂的調(diào)節(jié)”指與對(duì)照組的植株相比，在整個(gè)植株或任何植物組織或植物器官中的細(xì)胞分裂數(shù)量發(fā)生的任何改變。例如，本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植株中的細(xì)胞分裂的調(diào)節(jié)可，增加它的葉子的細(xì)胞數(shù)量而使該葉子大于未轉(zhuǎn)化的植株的葉子。細(xì)胞分裂的調(diào)節(jié)，可在一個(gè)植物組織或器官的細(xì)胞類型中產(chǎn)生，或者在整個(gè)植株中產(chǎn)生，這取決于負(fù)責(zé)REVOLUTA轉(zhuǎn)基因表達(dá)的啟動(dòng)子。此外，由REVOLUTA轉(zhuǎn)基因引發(fā)的細(xì)胞分裂的調(diào)節(jié)，可能會(huì)在由于細(xì)胞分裂休止或減少以至其植株生長(zhǎng)停止的轉(zhuǎn)基因植物或組織中產(chǎn)生。可采用植物解剖學(xué)領(lǐng)域中熟知的各種方法來(lái)測(cè)定細(xì)胞分裂的調(diào)節(jié)(例如參見(jiàn)Esau，Anatomy of Seed Plants[2nd ed.]，1977，JohnWiley & Sons，Inc.，New York)。例如，可測(cè)定轉(zhuǎn)基因植株的總質(zhì)量，或者可進(jìn)行器官或組織細(xì)胞計(jì)數(shù)，從而可算出代表性組織或器官橫截面中的所有的細(xì)胞。對(duì)于REVOLUTA轉(zhuǎn)基因在胚胎中表達(dá)的情況，也可通過(guò)測(cè)量含有該轉(zhuǎn)基因胚胎的種子的大小作為該胚胎內(nèi)細(xì)胞的數(shù)量來(lái)確定細(xì)胞分裂的調(diào)節(jié)。
            
術(shù)語(yǔ)“變化”、“氨基酸序列變化”、“變體”和“氨基酸序列變體”指REVOLUTA蛋白質(zhì)與相應(yīng)的天然(即天然存在的)REVOLUTA蛋白質(zhì)相比，其中的各氨基酸序列有一些不同。通常，變體與相應(yīng)的天然REVOLUTA蛋白質(zhì)具有至少約67％的同一性，較佳至少有約80％的同一性。本發(fā)明范圍內(nèi)的REVOLUTA蛋白質(zhì)的氨基酸序列變體在某些位點(diǎn)具有取代、刪除和/或插入等變化。可使用REVOLUTA的各種序列變體來(lái)獲得所需的提高或減少的DNA結(jié)合、蛋白質(zhì)寡聚化、參與特殊的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用或修飾的能力、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的活性，或者調(diào)節(jié)植物細(xì)胞分裂的修正活性。
            
取代性REVOLUTA蛋白質(zhì)變體是在天然REVOLUTA蛋白質(zhì)序列中至少有一個(gè)氨基酸殘基被去除，并且在該位置插入一個(gè)不同的氨基酸的蛋白質(zhì)變體。取代可以是單一的，在其分子中僅有一個(gè)氨基酸被取代，或者是多元取代，在同一分子中有兩個(gè)或多個(gè)氨基酸被取代。通過(guò)使用另一種在其側(cè)鏈的電荷和/或結(jié)構(gòu)與天然氨基酸明顯不同的氨基酸取代本發(fā)明的REVOLUTA蛋白質(zhì)分子的氨基酸，就可使本發(fā)明的該種分子的活性發(fā)生重大的變化。使用這種類型的取代方式有可能影響多肽骨架的結(jié)構(gòu)和/或該分子的取代區(qū)域中的電荷或疏水性。
            
通過(guò)用其電荷和/或結(jié)構(gòu)與天然分子類似的側(cè)鏈取代本發(fā)明REVOLUTA蛋白質(zhì)的氨基酸，使本發(fā)明的該蛋白質(zhì)分子的功能性活性發(fā)生中等的變化。這種類型的取代稱為保守取代，并不期望這種取代會(huì)大大改變多肽骨架的結(jié)構(gòu)或分子中取代區(qū)域的電荷或疏水性。但是，可以預(yù)期當(dāng)這類變化是在對(duì)蛋白質(zhì)功能起關(guān)鍵作用的氨基酸位置發(fā)生時(shí)，即使是上述保守的氨基酸取代，也可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能的劇烈變化。
            
插入性REVOLUTA蛋白質(zhì)變體是在天然REVOLUTA蛋白質(zhì)分子中緊接特定位置的氨基酸插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)變體。緊接氨基酸的位置指與該氨基酸的α-羧基或α-氨基功能團(tuán)連接的位置?？刹迦胍粋€(gè)或多個(gè)氨基酸。通常是插入一個(gè)或多個(gè)保守的氨基酸。與鄰近插入位點(diǎn)的氨基酸的電荷和/或結(jié)構(gòu)類似的氨基酸都可定義為保守的。本發(fā)明則不然，其插入氨基酸的包括電荷和/或結(jié)構(gòu)卻與鄰近插入位點(diǎn)的氨基酸大大不同。
            
刪除性變體是天然REVOLUTA蛋白質(zhì)分子中有一個(gè)或多個(gè)氨基酸被除去的那些分子。通常，刪除性變體是在REVOLUTA蛋白質(zhì)分子的特定區(qū)域中刪除了一個(gè)或兩個(gè)氨基酸。
            
術(shù)語(yǔ)“生物學(xué)活性”、“生物學(xué)上活躍的”、“活性”、“活躍的”、“生物學(xué)功能”、“REV生物學(xué)活性”和“功能性”都是指本發(fā)明REVOLUTA蛋白質(zhì)，二聚化(或組合成蛋白質(zhì)寡聚物)的能力、或者調(diào)節(jié)或影響天然野生型(如內(nèi)源的)REVOLUTA蛋白質(zhì)的二聚化的能力。但是，這些術(shù)語(yǔ)還包括本發(fā)明REVOLUTA蛋白質(zhì)與其它分子結(jié)合和/或相互作用的能力，其中，所述結(jié)合和/或相互作用過(guò)程可介導(dǎo)植物細(xì)胞的分裂，并最終賦于REV表型；或者這些術(shù)語(yǔ)包括調(diào)節(jié)或影響其它分子與天然野生型REVOLUTA蛋白質(zhì)(如內(nèi)源的)的結(jié)合和/或相互作用的能力，其中，所述結(jié)合和/或相互作用過(guò)程可介導(dǎo)植物細(xì)胞的分裂，并最終賦予REV表型。這類分子的例子包括如HD-ZipIII族的其它一些成員。
            
本文所使用的關(guān)于本發(fā)明的核酸的生物學(xué)活性，是指該核酸調(diào)節(jié)或影響它的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯，和/或最終賦予REV表型的能力。本文所使用的關(guān)于本發(fā)明核酸的生物學(xué)活性，還包括該核酸調(diào)節(jié)或影響天然野生型(如內(nèi)源的)核酸REVOLUTA的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯、和/或最終賦予REV表型的能力。
            
在文中使用的REV表型指由本發(fā)明的REV核酸或蛋白質(zhì)賦予的表型，具體包括表現(xiàn)出與野生型相關(guān)的對(duì)器官或組織大小產(chǎn)生影響(如增加了種子、葉子、果實(shí)或根的大小)的特征。通常，通過(guò)檢查植株，將其中不同組織中含有的細(xì)胞數(shù)與母本植株的相應(yīng)組織的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行比較。具有REV表型的植株，在其組織的代表性橫切面上的細(xì)胞數(shù)都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性集確定REV表型變化。
            
可采用本領(lǐng)域周知的多種方法來(lái)測(cè)量本發(fā)明REVOLUTA蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性，例如，轉(zhuǎn)錄活性試驗(yàn)法、DNA結(jié)合試驗(yàn)法、或蛋白質(zhì)寡聚化試驗(yàn)法。Sessa等人，1993；1997 J.Mol.Biol.274303-309、1999、Gonzalez等人，1997；和Palena等人，1999 Biochem.J.，34181-87都已在關(guān)于HD-Zip蛋白質(zhì)的文章中描述了這種實(shí)驗(yàn)試法(本文納入上述出版物的內(nèi)容作為參考)。本發(fā)明的REVOLUTA蛋白質(zhì)的氨基酸序列變體可具有合乎需要的改變了的生物學(xué)活性，包括例如，增加或降低的對(duì)DNA靶位點(diǎn)的結(jié)合親和力、增加或降低形成同源和/或異源蛋白質(zhì)寡聚物的能力，和改變了的靶基因的調(diào)節(jié)。
            
術(shù)語(yǔ)“載體”、“表達(dá)載體”指通常是雙鏈的一段DNA，其中可能已插入一段外源DNA。載體或復(fù)制子可以是例如質(zhì)粒，或者是病毒源性的。載體含有促進(jìn)其在宿主細(xì)胞中進(jìn)行自主復(fù)制的“復(fù)制子”多核苷酸序列。本公開(kāi)的文章中的術(shù)語(yǔ)“復(fù)制子”還包括靶向或促進(jìn)載體序列重組到宿主染色體中的序列區(qū)域。此外，有時(shí)外源DNA從一開(kāi)始就插入DNA病毒載體中，該病毒載體DNA轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中后可能導(dǎo)致該病毒DNA轉(zhuǎn)換成病毒RNA載體分子。外源DNA被定義為異源性DNA，它不是宿主細(xì)胞中天然發(fā)現(xiàn)的DNA，例如它可復(fù)制載體分子和可編碼可選擇或可篩選的標(biāo)記物或轉(zhuǎn)基因。該載體可被用于將外源或異源DNA轉(zhuǎn)運(yùn)到合適的宿主細(xì)胞中。一旦進(jìn)入宿主細(xì)胞中，該載體就能獨(dú)立于宿主的染色體DNA進(jìn)行復(fù)制，或與染色體DNA重合，而產(chǎn)生該載體和它插入的(外源)DNA的幾個(gè)拷貝。或者，該載體可以定向?qū)⑼庠碊NA插入宿主染色體。此外，該載體還含有一些必需元素可使外源DNA轉(zhuǎn)錄成mRNA分子，或者引起該外源DNA復(fù)制多份RNA拷貝。有些表達(dá)載體還額外含有一些鄰近插入的外源DNA的序列要素，可使mRNA翻譯成蛋白質(zhì)分子。由此可快速合成由該外源DNA編碼的許多mRNA和多肽分子。
            
術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因載體”指含有外源DNA的插入片段的載體，該插入片段就是在宿主細(xì)胞中可轉(zhuǎn)錄成mRNA或復(fù)制成RNA的“轉(zhuǎn)基因”。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因”不僅指轉(zhuǎn)化成RNA的外源DNA的部分，還指RNA的轉(zhuǎn)錄或復(fù)制所必需的載體的一些部分。此外，轉(zhuǎn)基因不必含有包含能生產(chǎn)蛋白質(zhì)的開(kāi)放讀框的多核苷酸序列。
            
術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞”、“轉(zhuǎn)化的”和“轉(zhuǎn)化作用”指將DNA導(dǎo)入細(xì)胞中。該細(xì)胞的術(shù)語(yǔ)稱為“宿主細(xì)胞”，它可以是原核或真核細(xì)胞。典型的原核宿主細(xì)胞包括大腸桿菌(E.coli)的各種菌株。典型的真核宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞如玉米細(xì)胞、酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞。所導(dǎo)入的DNA通常是一種含有插入的DNA片段的載體形式?？蓮呐c宿主細(xì)胞相同的物種或不同的物種中獲得該導(dǎo)入的DNA序列；或者該序列可以是雜合的DNA序列，含有一些外源DNA和一些得自宿主物種的DNA。
            
除了天然的REVOLUTA氨基酸序列外，本發(fā)明的范圍還包括除受現(xiàn)有技術(shù)限制外所包括的由刪除、取代、突變和/或插入該產(chǎn)生的各種序列變體?？刹捎美缤ǔ７Q為位點(diǎn)定向誘變的技術(shù)使可編碼野生型REVOLUTA的DNA序列發(fā)生突變，從而構(gòu)建本發(fā)明的各種REVOLUTA核酸序列變體?？刹捎帽绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的各種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)，來(lái)引起本發(fā)明編碼REVOLUTA蛋白質(zhì)的核酸分子發(fā)生突變。例如參見(jiàn)“PCR策略”，M.A.Innis、D.H.Gelfand和J.J.Sninsky編輯，1995，Academic Press，San Siego，CA(第14章)；“PCR方案方法和應(yīng)用指南”，M.A.Innis、D.H.Gelfand、J.J.Sninsky和T.J.White編輯，Academic Press，NY(1990)。
            
通過(guò)非限制性實(shí)施例，可使用用于Clontech的Transformer Site-DirectedMutagenesis試劑盒的兩個(gè)引物系統(tǒng)，將位點(diǎn)定向突變體導(dǎo)入本發(fā)明的REVOLUTA基因中。隨著本系統(tǒng)的靶質(zhì)粒發(fā)生變性，兩條引物同時(shí)退火到該質(zhì)粒上；一條引物含有合乎需要的位點(diǎn)定向突變，另一條含有在該質(zhì)粒的另一位點(diǎn)上的突變而導(dǎo)致其限制性位點(diǎn)的消除。然后進(jìn)行與這兩個(gè)突變緊密地連接的第二條鏈的合成，并將所形成的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌的mutS株中。從轉(zhuǎn)化的細(xì)菌中分離出質(zhì)粒DNA，用相關(guān)的限制性酶進(jìn)行限制(從而使各未發(fā)生突變的質(zhì)粒直線化)，然后將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。這個(gè)系統(tǒng)可使表達(dá)質(zhì)粒直接產(chǎn)生突變，而不必經(jīng)過(guò)亞克隆化或產(chǎn)生單鏈?zhǔn)闪?。兩種突變的緊密連接以及接下來(lái)的未發(fā)生突變的質(zhì)粒的直線化導(dǎo)致高的突變效率和大大減少篩選過(guò)程。在原初限制性位點(diǎn)引物合成之后，本方法對(duì)每個(gè)突變位點(diǎn)只需要使用一種新的引物類型。與分別制備各種位點(diǎn)性突變體相比，這樣有可能一次性合成一組“按計(jì)劃變性”的寡核苷酸引物，以便將所有合乎需要的突變同時(shí)導(dǎo)入在給定的位點(diǎn)。通過(guò)給質(zhì)粒DNA的誘變區(qū)域測(cè)序以確定和挑選突變體克隆，從而篩選出相應(yīng)的轉(zhuǎn)化子。然后可在突變檢測(cè)強(qiáng)化(Mutation Detection Enhancement)凝膠(J.T.Baker)上進(jìn)行電泳，以確證在已產(chǎn)生的序列中沒(méi)有其它不相干的變化(通過(guò)與未誘變的對(duì)照品的條帶偏移比較)，從而限制和分析每一個(gè)突變體DNA?；蛘撸蓪?duì)整個(gè)DNA區(qū)域進(jìn)行測(cè)序，以確證在靶區(qū)域外沒(méi)有發(fā)生額外的突變現(xiàn)象。
            
可使用pET(或其它)超表達(dá)載體中經(jīng)檢驗(yàn)的突變體雙顯性組合，來(lái)轉(zhuǎn)化大腸桿菌例如大腸桿菌BL21(DE3)pLysS株，以獲得高水平產(chǎn)量的突變體蛋白質(zhì)，并采用標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程進(jìn)行純化?？墒褂肍AB-MS繪圖方法快速檢查突變體表達(dá)的保真度。這種技術(shù)可提供遍及整個(gè)蛋白質(zhì)的測(cè)序用片段，并提供了在測(cè)序任務(wù)中必需的可靠性。在這種類型的繪圖實(shí)驗(yàn)中，用蛋白酶消化蛋白質(zhì)(依即將進(jìn)行修飾的特定區(qū)域而作出選擇，因?yàn)橹饕P(guān)注的就是這個(gè)片段，余下的圖譜應(yīng)與未誘變的蛋白質(zhì)的圖譜相同)。使用微孔HPLC(反相或離子交換，同樣依賴于所要修飾的特定區(qū)域)將解離的片段分級(jí)分離，每一級(jí)中要提供幾條肽，這些肽的分子量可由FAB-MS測(cè)定。然后將這些分子量和預(yù)期從預(yù)定序列的消化處理中得到的肽的分子量進(jìn)行比較，并迅速確定該序列的正確性。由于這種對(duì)蛋白質(zhì)修飾的誘變方法是定向的，所以如果其MS與預(yù)期值相一致，就不需對(duì)該改變的肽進(jìn)行測(cè)序。如果需要核實(shí)一個(gè)改變的殘基，可使用CAD-級(jí)聯(lián)MS/MS對(duì)有問(wèn)題的混合物中的一些肽類進(jìn)行測(cè)序，或者依修飾的位置采用負(fù)式Edman降解法或羧肽酶Y消化法對(duì)純化的靶肽進(jìn)行測(cè)序。
            
在特定位點(diǎn)定向誘變?cè)O(shè)計(jì)中，通常需要首先制備非保留性取代(如用Ala取代Cys、His或Glu)，并確定所得結(jié)果的活性是否被極大地?fù)p傷。然后特別著重于DNA靶位點(diǎn)結(jié)合和HD-Zip蛋白質(zhì)寡聚化以檢查誘變蛋白質(zhì)的特性，再采用先前所述的試驗(yàn)方法，與天然REVOLUTA蛋白質(zhì)的特性進(jìn)行比較，就可推斷出這種特性。如果通過(guò)這種方法證明了該殘基對(duì)于活性的削弱、或者對(duì)于剔除具有重要作用，那么就可進(jìn)行保守的取代，如用Asp取代Glu，以改變側(cè)鏈的長(zhǎng)度，用Ser取代Cys，或者用Arg取代His。對(duì)于疏水性片段，其大部分的大小可有效地被改變，即使是芳族的殘基也可被烷基側(cè)鏈取代。DNA結(jié)合和蛋白質(zhì)多聚化過(guò)程的變化，將揭示REVOLUTA蛋白質(zhì)的哪些特性已經(jīng)在突變過(guò)程發(fā)生改變。
            
也可對(duì)本發(fā)明的核苷酸序列使用其它位點(diǎn)定向誘變技術(shù)。例如，如Sambrook等人(Molecular Cloning A Laboretory Manual，第二版，1989，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York，NY)在第15.3節(jié)所述，可先用限制性核酸內(nèi)切酶消化DNA，接著進(jìn)行綁扎，以產(chǎn)生REVOLUTA的各種刪除性變體。如Sambrook等人(同上)所述，可采用類似的策略構(gòu)建各種插入性變體。最近Zhu等人(1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，968768-8773)設(shè)計(jì)了一種使用各種嵌合性RNA/DNA寡核苷酸在體內(nèi)使植物基因靶向突變的方法。
            
還可使用寡核苷酸定向誘變的方法制備本發(fā)明的各種取代性變體。該方法還可方便地用來(lái)制備本發(fā)明的各種刪除性和插入性變體。這種技術(shù)是本領(lǐng)域中熟知的，如Adelman等人(1983，DNA，2183)、Sambrook等人(同上)；“分子生物學(xué)中的通用方案”，1991，Wiley(NY)，F(xiàn).T.Ausubel、R.Brent、R.E.Kingston、D.D.Moore、J.D.Seidman、J.A.Smith和K.Struhl編輯中所述。
            
通常，至少用長(zhǎng)度為25個(gè)核苷酸的寡核苷酸進(jìn)行插入、刪除或取代可編碼本發(fā)明的REVOLUTA蛋白質(zhì)的核酸分子中的兩個(gè)或多個(gè)核苷酸。最佳的寡核苷酸是在供突變的核苷酸編碼的任一側(cè)具有12-15個(gè)最佳匹配的核苷酸。為了誘變可編碼本發(fā)明的野生型REVOLUTA基因的各種核酸，須在合適的雜交條件下將該寡核苷酸退火到單鏈DNA的模板分子上。然后加入DNA聚合酶，通常是用大腸桿菌聚合酶I的Klenow片段。這種酶使用該寡核苷酸作為引物，來(lái)完成具有突變鏈的DNA的合成。從而DNA的一條鏈可編碼插入載體中的野生型REVOLUTA從而形成雜合雙顯性組合分子，另一條則可編碼插入相同載體中的突變形式的REVOLUTA。然后將這個(gè)雜合雙顯性組分分子轉(zhuǎn)化到合適的宿主細(xì)胞中。
            
可以幾種方式中的一種產(chǎn)生具有超過(guò)一個(gè)氨基酸取代的各種突變體。如果這些氨基酸在該多肽鏈中都處于接近的位置，那么可使用一個(gè)寡核苷酸來(lái)編碼所有合乎需要的氨基酸取代而使它們同時(shí)突變。但是，如果各氨基酸位置相互之間有一些距離(如有超過(guò)10個(gè)氨基酸將它們隔開(kāi))，那么產(chǎn)生一個(gè)可編碼所有所需的變化的單一的寡核苷酸就比較困難。替代的辦法是可在下述兩種方法中選擇一種。第一種方法是，為每一個(gè)被取代的氨基酸產(chǎn)生一個(gè)分離的寡核苷酸。然后將各該寡核苷酸同時(shí)退火到單鏈模板DNA上，從該模板合成的DNA的第二鏈就可編碼所有所需的氨基酸取代過(guò)程。另一方法是經(jīng)過(guò)兩輪或多輪的誘變處理來(lái)產(chǎn)生所需的突變體。第一輪在單一突變體方面已有描述使用野生型REVOLUTA DNA作為模板，將編碼第一條所需的氨基酸取代的寡核苷酸強(qiáng)化到該模板上，就可產(chǎn)生雜合雙顯性組合DNA。第二輪誘變是使用在第一輪誘變中產(chǎn)生的突變的DNA作為模板。因此，這個(gè)模板已經(jīng)含有一種或多種突變因素。然后將可編碼額外合乎需要的氨基酸取代過(guò)程的寡核苷酸強(qiáng)化到這個(gè)模板上，所形成的DNA鏈就可編碼第一輪和第二輪誘變所產(chǎn)生的一系列突變。所得的該DNA可用作第三輪誘變的模板，依次類推。轉(zhuǎn)基因植物例如將可編碼REVOLUTA的轉(zhuǎn)基因載體(如質(zhì)粒、病毒等)轉(zhuǎn)移到植物中就可獲得轉(zhuǎn)基因植物。較佳的是，當(dāng)該載體是質(zhì)粒時(shí)，它還可含有可選擇的標(biāo)記基因，如可編碼抗卡那霉素的卡那(kan)基因。最常用的植物轉(zhuǎn)化方法是，如Hoeckema等人所述(1983，Nature，303179-181)，將靶轉(zhuǎn)基因克隆到植物轉(zhuǎn)化載體中，然后將該載體轉(zhuǎn)化到含有輔助Ti-質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumifaciens)中。如An等人所述(1986，Plant Physiology，81301-305；還參見(jiàn)Hooykaas，1989，Plant Mol.Biol.，13327-336)，將含有該轉(zhuǎn)基因載體的土壤農(nóng)桿菌細(xì)胞與用于轉(zhuǎn)化的植株的葉切片一起培育。如上面所述，通過(guò)根癌農(nóng)桿菌通常就可實(shí)現(xiàn)培育的植物宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過(guò)程。通常采用最初由Graham等人(1978，Virology，52546)所述后來(lái)在Sambrook等人(同上)的第16.32-16.37各節(jié)中所述的改良的磷酸鈣方法，就可使不具有剛性細(xì)胞膜隔障的宿主細(xì)胞培養(yǎng)物轉(zhuǎn)化。但是，還可使用其它可將DNA導(dǎo)入細(xì)胞的各種方法，如1，5-二甲基-1，5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物法(Polybrene)(Kawai等人，1984，Mol.Cell.Biol.，41172)、原生質(zhì)體融合法(Schaffner，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，772163)、電穿孔法(Neumann等人，1982，EMBOJ.，1841)和細(xì)胞核內(nèi)直接微注射法(Capecchi，1980，Cell，22479)。通過(guò)在含有如卡那霉素和適量植物激素(如用于誘導(dǎo)愈傷組織和幼芽病傷組織的萘乙酸和芐基腺嘌呤的培養(yǎng)基中使細(xì)胞生長(zhǎng)，根據(jù)可選擇的標(biāo)記物選出轉(zhuǎn)化的植物。植物細(xì)胞就會(huì)再生，并可采用本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員所熟知的方法將所得到的植物轉(zhuǎn)移到土壤中。
            
除了上述各種方法外，本領(lǐng)域還已知多種可將克隆的DNA轉(zhuǎn)移到種類繁多的植物物種(包括裸子植物、被子植物、單子葉植物和雙子葉植物)中的方法(例如參見(jiàn)Glick和Thompson編輯，1993，Methods in Plant Molecular Biology，CRC出版社，Boca Raton，F(xiàn)lorida；Vasil，1994，Plant Mol.Biol.，25925-937；和Komari等人，1998，Current Opinions PlantBiol.，1161-165(綜述)；Loopstra等人，1990，PlantMol.Biol.，151-9和Brasileiro等人，1991，PlantMol.Biol.，17441-452(樹(shù)木的轉(zhuǎn)化)；Eimert等人，1992，Plant Mol.Biol.，19485-490(蕓苔的轉(zhuǎn)化)；Hiei等人，1994，Plant J.，6271-282；Hiei等人，1997，Plant Mol.Biol.，35205-218；Chan等人，1993，Plant Mol.Biol.，22491-506；美國(guó)專利第5,516,668和5,824,857號(hào)(稻子的轉(zhuǎn)化)；美國(guó)專利第5,955,362號(hào)(小麥的轉(zhuǎn)化)、5969213(單子葉植物的轉(zhuǎn)化)、5,780,798(玉米的轉(zhuǎn)化)、5,959,179和5,914,451(大豆的轉(zhuǎn)化)〕。代表性的實(shí)施例包括電穿孔-促進(jìn)法的原生質(zhì)體對(duì)DNA的吸收(Rhodes等人，1988，Science，240(4849)204-207；Bates，1999，Methods Mol.Biol.，111359-366；D′Halluin等人，1999，Methods Mol.Biol.，111367-373；美國(guó)專利第5,914,451號(hào))、用聚乙二醇處理原生質(zhì)體法(Lyznik等人，1989，Plant Molecular Biology，13151-161；Datta等人，1999，Methods Mol.Biol.，111335-34)、和用帶有拋射微粒的DNA轟擊細(xì)胞法(Klein等人，1989，Plant Physiol.，91440-444；Boynton等人，1988，Science，240(4858)1534-1538；Register等人，1994，Plant Mol.Biol.，25951-961；Barcelo等人，1994，Plant J.，5583-592；Vasil等人，1999，Methods Mol.Biol.，111349-358；Christou，1997，Plant Mol.Biol.，35197-203；Finer等人，1999，Curt.Top.Microbiol.Immunol.，24059-80)。此外，Birch R.G.(1997，Ann Rev PlantPhys Plant Mol Biol，48297)和Forester等人(1997，Exp.Agric.，3315-33)已綜述了各種植物轉(zhuǎn)化的策略和技術(shù)。對(duì)這些技術(shù)稍微改動(dòng)就可應(yīng)用于廣泛的植物物種。
            
對(duì)于單子葉植物的轉(zhuǎn)化，顆粒轟擊似乎是一些大學(xué)實(shí)驗(yàn)室選用的最經(jīng)濟(jì)方法。但是，也可使用Hiei等人的1997年1月7日出版的題為“單子葉植物轉(zhuǎn)化的方法”的美國(guó)專利第5591616號(hào)中所述的用根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化如玉米之類的單子葉植物。另一影響玉米轉(zhuǎn)化的方法是，將從胚胎發(fā)生懸浮液培養(yǎng)物中獲得的細(xì)胞與纖維(5％w/v，Silar SC-9穗須)和質(zhì)粒DNA(1μg/μl)的懸浮液混合，然后將所得混合物垂直放在Vortex Genie II渦流混合器(Scientific Industries Inc.，Bohemia，NY，USA)上的多樣品頭中，或者水平放在Mixomat齒科用汞齊混合器(Degussa Canada Ltd.，Burlington，Ontario，Canada)的支架上。然后以全速混合處理60秒鐘(Vortex Genie II)或以固定速率震動(dòng)1秒鐘(Mixomat)，進(jìn)行轉(zhuǎn)化。這一過(guò)程導(dǎo)致穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體別無(wú)選擇的細(xì)胞種群的產(chǎn)生。植株可從穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的愈傷組織中再生，據(jù)Southern雜交分析法可顯示出這些植株和它們的后代都已是轉(zhuǎn)基因植物。此方法的主要優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單和低成本。與粒子轟擊法不同，它不需要昂貴的設(shè)備和材料。Coffee等人的1995年11月7日出版的題為“植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化”的美國(guó)專利第5,464,765號(hào)描述了使用須狀物來(lái)轉(zhuǎn)化植物的細(xì)胞尤其是玉米。
            
Dan等人的1999年10月19日出版的題為“大豆轉(zhuǎn)化和再生方法”的美國(guó)專利5,968,830號(hào)描述了轉(zhuǎn)化和再生大豆的方法。Hall等人的1999年10月19日出版的美國(guó)專利第5,969,215號(hào)描述了生產(chǎn)轉(zhuǎn)化的甜菜(Beta vulgaris)植株如制糖甜菜的轉(zhuǎn)化技術(shù)。
            
上述各種轉(zhuǎn)化技術(shù)都具有不同的優(yōu)缺點(diǎn)。在每一種技術(shù)中，對(duì)從質(zhì)粒得到的DNA進(jìn)行遺傳工程改造，使其不僅含有相關(guān)的基因，還含有可選擇且可篩選的各種標(biāo)記基因。一種可選擇的標(biāo)記基因只可被用來(lái)選擇那些具有質(zhì)粒的完整副本的細(xì)胞(其結(jié)構(gòu)方式是該相關(guān)的基因和可選擇、可篩選的基因可被作為一個(gè)單元進(jìn)行轉(zhuǎn)移)。該可篩選的基因可給那些僅僅攜帶相關(guān)的基因的細(xì)胞的成功培養(yǎng)提供另一種檢驗(yàn)方法。
            
傳統(tǒng)的可用具有抗生素抗性的可選擇標(biāo)記物轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌的方法還存在一些問(wèn)題，因?yàn)楣娨烟岢龇磳?duì)意見(jiàn)，認(rèn)為這種植物會(huì)給動(dòng)物和人類散布不適當(dāng)?shù)目股啬褪苄燥L(fēng)險(xiǎn)。采用與Komari等人的1998年3月24日出版的題為“將兩個(gè)T-DNA導(dǎo)入植物使之成為載體的方法”的美國(guó)專利第5,731,179號(hào)所述的類似的根癌農(nóng)桿菌技術(shù)來(lái)轉(zhuǎn)化植物，就可從植株中消除這種抗生素標(biāo)記物。如1998年1月27日出版的題為“單子葉植物的轉(zhuǎn)化程序”的美國(guó)專利第5,712,135號(hào)中所述，通過(guò)使用bar或pat來(lái)編碼各序列，可有效避免抗生素抗性問(wèn)題。這些都是可編碼抑制或抵消谷氨酰胺合成酶抑制子除草劑膦絲菌素(glufosinate)和glufosinate銨鹽(Basta，Ignite)的作用的次級(jí)蛋白質(zhì)或多肽的最佳的標(biāo)記DNA。
            
采用先前提到的任何一種技術(shù)，可將含有這些基因中的一種或多種的質(zhì)粒導(dǎo)入植物原生質(zhì)體或愈傷組織細(xì)胞中。如果該標(biāo)記基因是一種可選擇基因，那么僅有那些已摻入了DNA包的細(xì)胞才能夠在使用恰當(dāng)?shù)闹参锒拘灾苿┻x擇的條件下保持生存。一旦鑒別出適當(dāng)?shù)募?xì)胞并將其繁殖，就可再生植株。必須檢驗(yàn)該轉(zhuǎn)化的植株的后代，以確保該DNA包已被成功地整合到該植株的基因組中。
            
可影響成功轉(zhuǎn)化的因素很多。外源基因結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)和構(gòu)建及其調(diào)節(jié)要素都可影響該外源序列整合到植物細(xì)胞核的染色體DNA中，從而影響該細(xì)胞表達(dá)該轉(zhuǎn)基因的能力。以無(wú)傷害的方式將外源基因結(jié)構(gòu)導(dǎo)入植物細(xì)胞核的合適的方法是很重要的。尤其是，如果要遍及整個(gè)植物，則該結(jié)構(gòu)所導(dǎo)入的細(xì)胞類型必須是采用適當(dāng)?shù)脑偕桨缚墒怪偕念愋汀?br>
在本發(fā)明的初始的一些克隆步驟中，還曾使用原核生物細(xì)胞作為宿主細(xì)胞。它們特別有效于進(jìn)行大批DNA的快速生產(chǎn)、用于位點(diǎn)定向誘變的單鏈DNA模板的生產(chǎn)、同時(shí)篩選多種突變體、以及對(duì)所產(chǎn)生的各種突變體進(jìn)行DNA測(cè)序。合適的原核宿主細(xì)胞包括大腸桿菌K12株94(ATCC第31,446號(hào))、大腸桿菌W311O株(ATCC第27,325號(hào))、大腸桿菌X1776株(ATCC第31,537號(hào))和大腸桿菌B；但是，大腸桿菌的許多菌株(如HB101、JM101、NM522、NM538、NM539)和原核生物的其它種類和種屬包括芽孢桿菌類如枯草桿菌桿菌(Bacillus subtilis)、其它腸桿菌屬如鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)或皺縮沙雷氏菌(Serratiamarcesans)和各種假單胞菌屬菌種(Pseudomounas)都可以用作宿主。較佳的是采用Sambrook等人(同上)在1.82節(jié)中所述的氯化鈣方法來(lái)轉(zhuǎn)化具有剛性細(xì)胞壁的原核生物宿主細(xì)胞或其它宿主細(xì)胞。或者，可采用電穿孔的方法轉(zhuǎn)化這些細(xì)胞。Dower，W.J.在《遺傳工程、原理和方法》中(12275-296，Plenum Publishing Corp.，1990)和Hannahan等人(1991，Meth.Enzxymol.，20463)描述了原核生物的各種轉(zhuǎn)化技術(shù)。
            
本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員都熟知，含有復(fù)制子的任何質(zhì)粒載體和得自任何物種的相當(dāng)于宿主細(xì)胞的各種對(duì)照序列都可在本發(fā)明的實(shí)施例中使用。該載體通常具有一個(gè)復(fù)制位點(diǎn)、提供轉(zhuǎn)化細(xì)胞的表型選擇的一些標(biāo)記基因、一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子和含有幾個(gè)可插入外源DNA的限制性位點(diǎn)的多連接物區(qū)域。用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌的質(zhì)粒一般包括pBR322、pUC18、pUC19、pUC118、pUC1 19和Bluescript M13，在Sambrook等人(同上)的第1.12-1.20節(jié)中對(duì)這些質(zhì)粒都進(jìn)行了描述。但是，也有許多其它合適的載體可供使用。這些載體含有可編碼氨芐青霉素和/或四環(huán)素抗性的基因，這些基因可使該由這些載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞能在這些抗生素的存在的條件下生長(zhǎng)。
            
在原核生物載體中最常用的啟動(dòng)子包括，β-內(nèi)酰胺酶(青霉素酶)和若干乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)(Chang等人，1978，Nature，375615；Itakura等人，1977，Science，1981056；Goeddel等人，1979，Nature，281544)和色氨酸(trp)啟動(dòng)子系統(tǒng)(Goeddel等人，1980，Nucl.Acids Res.，84057；EPO Appl.Publ.第36,776號(hào))、和各種堿性磷酸酶系統(tǒng)。這些都是最常使用的，但是也已經(jīng)使用其它各種微生物的啟動(dòng)子，并且已經(jīng)出版了關(guān)于它們的核苷酸序列的詳細(xì)資料，使得熟練的技術(shù)人員能按其功能將它們連接到各種質(zhì)粒載體上(參見(jiàn)Siebenlist等人，1980，Cell，20269)。
            
一般從細(xì)胞中分泌多種真核生物蛋白質(zhì)都含有作為氨基酸序列一部分的內(nèi)源性分泌信號(hào)序列。因而，通過(guò)將信號(hào)序列連接于一般在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)上就可確定該類蛋白質(zhì)分泌的靶向。這很容易實(shí)現(xiàn)將只要可編碼信號(hào)序列的DNA連接到可編碼該蛋白質(zhì)的DNA的5′端，然后在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中表達(dá)此融合蛋白質(zhì)?？删幋a該信號(hào)序列的該DNA可以作為限制性片段而從可編碼帶有該信號(hào)序列的蛋白質(zhì)的任何基因獲得。因而，在本發(fā)明中可以根據(jù)本發(fā)明實(shí)際所用的宿主細(xì)胞的類型而使用原核生物、酵母和真核生物的信號(hào)序列?？删幋a幾種真核生物基因的該信號(hào)序列部分的DNA和氨基酸序列，包括如人生長(zhǎng)激素、胰島素原和清蛋白是已知的(參見(jiàn)Stryer，1988，Biochemistry，W.H.Freeman和公司，NewYork，NY，第769頁(yè))，并且它們可在適當(dāng)?shù)恼婧松锼拗骷?xì)胞中用作信號(hào)序列。酵母的信號(hào)序列如酸性磷酸酯酶(Arima等人，1983，Nuc.Acids Res.，111657)、α-因子、堿性磷酸酯酶和轉(zhuǎn)化酶可用來(lái)指示酵母宿主細(xì)胞中的分泌過(guò)程。從可編碼如Lamb或OmpF(Wong等人，1988，Gene，68193)、MalE、PhoA或β-內(nèi)酰胺酶的各種基因以及其它基因獲得的原核生物信號(hào)序列，都可用作原核生物細(xì)胞在培養(yǎng)基中表達(dá)的各種靶蛋白質(zhì)。
            
采用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA方法可制備含有可編碼各種復(fù)制序列、調(diào)節(jié)序列、表型選擇基因和有關(guān)的REVOLUTA DNA的DNA的各種合適載體的結(jié)構(gòu)。各種分離的質(zhì)粒、病毒載體和DNA片段都可被分割、裁剪，并以特定的順序連接一起，以產(chǎn)生所需的載體，這是本領(lǐng)域所周知的(參見(jiàn)如Maniatis，同上和Sambrook等人，同上)。
            
如上所述，通過(guò)位點(diǎn)定向誘變方法可以突變方式產(chǎn)生各種REVOLUTA變體。這種方法需要合成和使用特殊的寡核苷酸，該寡核苷酸可編碼所需突變的序列和足量的鄰近核苷酸，以使其穩(wěn)定地雜交到DNA模板上。
            
本發(fā)明包括調(diào)節(jié)植物細(xì)胞分裂的各種組合物和方法。可以使用含有衍生自多核苷酸的REVOLUTA的多種多樣的轉(zhuǎn)基因載體來(lái)實(shí)施本發(fā)明。當(dāng)本發(fā)明的各種REVOLUTA轉(zhuǎn)基因被導(dǎo)入植物中，并且表達(dá)RNA或RNA及隨后的蛋白質(zhì)時(shí)，植物細(xì)胞的分裂就得到調(diào)節(jié)。下面提供了采用多種不同方法的一些實(shí)施例，其中可使用REVOLUTA轉(zhuǎn)基因來(lái)增加或降低轉(zhuǎn)基因植株中REVOLUTA蛋白質(zhì)的量。改變的REVOLUTA蛋白質(zhì)水平可在整個(gè)植株中、或者在某組織或器官中以特殊的方式發(fā)生，這取決于操作性連接于REVOLUTA轉(zhuǎn)基因的啟動(dòng)子序列的類型。
            
本發(fā)明還提供了一種轉(zhuǎn)基因植物；含有具有可在植物細(xì)胞中起作用的啟動(dòng)子序列的嵌合型植物基因；引起可編碼融合多肽的RNA產(chǎn)生的編碼序列、或者引起同源基因抑制而使該嵌合型植物基因表達(dá)以調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)的RNA。該嵌合型植物基因還具有與可編碼多腺苷酸化信號(hào)的基因的3′端緊密連接的3′非翻譯區(qū)域。該多腺苷酸化信號(hào)在植物細(xì)胞中起作用，可引起各種多腺苷酸化核苷酸加到該RNA的3′端。用于轉(zhuǎn)錄激活該嵌合型植物基因的5′啟動(dòng)子序列，是一種與該編碼序列異源的啟動(dòng)子，它適用于引起該嵌合型基因充分表達(dá)，以調(diào)節(jié)由該基因轉(zhuǎn)化的植物的植株生長(zhǎng)。REVOLUTA基因表達(dá)的抑制有多種方法可用于抑制植物中基因的表達(dá)。例如，可方便地采用反義RNA技術(shù)。先前已經(jīng)證明，反義RNA在各種發(fā)育系統(tǒng)中可成功地抑制不需要的基因的表達(dá)(Van der Krol等人，1990，Plant Mol.BioL，14457；Visser等人，1991，Mol.Gen.Genet.，225289；Hamilton等人，1990，Nature，346284；Stockhaus等人，1990，EMBO J.，93013；Hudson等人，1992，Plant Physiol.，98294；美國(guó)專利第4,801,340、5,773,692、5,723,761和5,959,180號(hào))。例如，聚半乳糖醛酸酶對(duì)蕃茄成熟后階段的果實(shí)軟化產(chǎn)生作用(Hiatt等人，1989，GeneticEngineering，Setlow編輯，第49頁(yè)；Sheehy等人，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，858805；Smith等人，1988，Nature，334724)。在CaMV 35S啟動(dòng)子的控制下，整合到基因組中各反義結(jié)構(gòu)，可抑制這種軟化過(guò)程。對(duì)聚半乳糖醛酸酶mRNA水平的檢測(cè)結(jié)果顯示有90％的基因表達(dá)受到抑制。
            
反義基因是當(dāng)有義基因相對(duì)于它正常的轉(zhuǎn)錄表現(xiàn)呈反向時(shí)所產(chǎn)生的一種DNA序列?！坝辛x”基因指過(guò)程在其正常定向使用反義技術(shù)可控制其定向的一種基因?？梢远喾N不同方式構(gòu)建反義基因，條件是能干擾有義基因的表達(dá)。較佳的是，使有義基因的編碼區(qū)域以相對(duì)于其正常的轉(zhuǎn)錄表現(xiàn)相反的方向構(gòu)建反義基因，使它的互補(bǔ)序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，因此由該反義和有義基因編碼的各種RNA都可互補(bǔ)。據(jù)了解，本發(fā)明的結(jié)合到反義結(jié)構(gòu)中的一部分可能足以有效地干擾有義基因的表達(dá)，因而術(shù)語(yǔ)“反義基因”在本文中包括該全長(zhǎng)反義基因的任何功能性部分。術(shù)語(yǔ)“功能性”包括能有效干擾有義基因的表達(dá)的反義基因的部分。
            
被導(dǎo)入的核酸片段一般與將被抑制的內(nèi)源REVOLUTA基因或基因系列的至少一部分基本上相同。但是，該序列不需完全都要抑制表達(dá)。通常，可采用較高的同源性來(lái)對(duì)較短的REVOLUTA序列的使用予以補(bǔ)償。此外，所導(dǎo)入的REVOLUTA序列不需具有相同的內(nèi)含子或外顯子模式，非編碼片段的同源性可以同等有效。通常，應(yīng)該使用長(zhǎng)約25-40個(gè)核苷酸的序列和接近全長(zhǎng)的REVOLUTA基因序列，雖然較佳的是至少長(zhǎng)約100個(gè)核苷酸的序列，更佳的是至少長(zhǎng)約200個(gè)核苷酸的序列，特別優(yōu)選至少長(zhǎng)約500個(gè)核苷酸的序列。然后將此結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化到植株中，以產(chǎn)生RNA的反義鏈。
            
還可使用各種催化性RNA分子或核糖酶來(lái)抑制各種REVOLUTA基因的表達(dá)。設(shè)計(jì)可編碼各種RNA核糖酶的各種核糖酶轉(zhuǎn)基因是可能的，該轉(zhuǎn)基因?qū)嶋H上可特異地與任何靶RNA配對(duì)，并在特殊位點(diǎn)分裂磷酸二酯鍵骨架，從而從功能上使該靶RNA滅活。在進(jìn)行這種分裂時(shí)，核糖酶自身并不改變，因而它能再使用于分裂其它分子，成為一種適用的酶。在反義RNA中包含的核糖酶序列賦予該反義RNA以RNA分裂活性，從而增加了這類結(jié)構(gòu)活性。
            
有一類核糖酶可從能在各種植物中的多種自主分裂和復(fù)制的小型環(huán)狀RNA中產(chǎn)生。這些RNA或可單獨(dú)復(fù)制(類病毒RNA)或可與輔助病毒(衛(wèi)星RNA)一起復(fù)制。例子包括鱷梨曬斑病類病毒的各種RNA和煙草環(huán)斑病毒、紫花苜蓿一時(shí)性條紋病毒、柔性煙草斑紋(velvet tobacco mottle)病毒、茄屬斑紋(solanumnodiflorum mottle)病毒和隱藏三葉草斑紋(subterranean clover mottle)病毒等的各種衛(wèi)星RNA。Haseloff等人(1988，Nature，334585-591；還參見(jiàn)美國(guó)專利第5,646,023號(hào))描述了靶RNA特異性核糖酶類的設(shè)計(jì)和應(yīng)用。Tabler等人(1991，Gene，108175)通過(guò)將反義RNA的優(yōu)點(diǎn)和核糖酶技術(shù)組合到簡(jiǎn)單結(jié)構(gòu)中，從而極大地簡(jiǎn)化了催化性RNA的構(gòu)建。核糖酶催化作用需要較小區(qū)域的同源性，因此如果是保留著一些分裂位點(diǎn)，就可促進(jìn)基因大家族不同成員的抑制。同時(shí)，這些結(jié)果指出了使用反義RNA和/或各種核糖酶作為操控組建各種有價(jià)值的農(nóng)作物的實(shí)用手段的可行性。
            
另一抑制REVOLUTA蛋白質(zhì)表達(dá)的方法是有義抑制作用。最近的研究顯示，以有義定向方式裝配的核酸的導(dǎo)入，是一種可阻斷靶基因轉(zhuǎn)錄的有效的方法。采用這種方法調(diào)節(jié)各種內(nèi)源基因表達(dá)的例子可參見(jiàn)Napoli等人(1990，Plant Cell，2279-289)、Hamilton等人(1999，Science，286950-952)和美國(guó)專利第5,034,323、5,231,020、5,283,184和5,942,657號(hào)。
            
最近發(fā)展了一種新的抑制靶基因表達(dá)的方法。這種方法涉及將一種反向重復(fù)轉(zhuǎn)基因?qū)胨拗骷?xì)胞中，該轉(zhuǎn)基因可指導(dǎo)能自行退火而形成雙鏈(ds)RNA結(jié)構(gòu)的mRNA的產(chǎn)生(Vionnet等人，1998，Cell，95177-187；Waterhouse等人，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9513959-13964；Misquitta等人，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，961451-1456；Baulcombe，1999，Current Opinion Plant Biol.，2109-113；Sharp，1999，Genes and develop，13139-141)。該dsRNA分子以現(xiàn)尚未知的一種方式干擾與該dsRNA同源的各種內(nèi)源基因轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)。已顯示dsRNA的同源區(qū)域必須含有與靶基因的外顯子部分同源的區(qū)域。因而，該dsRNA可能包括與靶基因的非編碼部分同源的各種序列。或者，也可通過(guò)用兩種不同的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化細(xì)胞而產(chǎn)生基因抑制性dsRNA，其中一種轉(zhuǎn)基因表達(dá)有義RNA，而另一種轉(zhuǎn)基因則與反義RNA互補(bǔ)。
            
采用下述Waterhouse等人(1998)實(shí)施的一個(gè)通用例子可制備含有反向重復(fù)的REVOLUTA轉(zhuǎn)錄序列的結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)的反向重復(fù)部分含有約200-1500bp的轉(zhuǎn)錄的DNA，以頭對(duì)頭或尾對(duì)尾的排列方式重復(fù)。重復(fù)部分被約200-1500bp非重復(fù)DNA隔開(kāi)，這些非重復(fù)DNA也可以是轉(zhuǎn)錄的REVOLUTA區(qū)域的一部分，或者可以從不同的基因獲得，它們可能含有內(nèi)含子。將下列部分以正確的順序連接，可制備合適的REVOLUTA抑制子轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)植物啟動(dòng)子；從以正確的“有義”定向方式確定的REVOLUTA cDNA得到的3′區(qū)域；從該cDNA獲得的5′區(qū)域；從該cDNA獲得但以“反義”定向方式確定REVOLUTA編碼序列的相同的3′區(qū)域；最后是poly A額外信號(hào)。不論該順序如何選擇，通過(guò)將該反向重復(fù)轉(zhuǎn)基因?qū)氚兄参锼a(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄的REVOLUTA RNA，都可具有形成內(nèi)在dsRNA區(qū)域的潛力，該區(qū)域含有從即將被抑制的REVOLUTA轉(zhuǎn)基因獲得的各種序列?？蛇x擇這類dsRNA序列以抑制單一的或可能多種REVOLUTA基因。在一些例子中，具有dsRNA形成潛力的序列可由兩種或多種REVOLUTA基因產(chǎn)生。
            
適合于抑制REVOLUTA活性的附加策略是要求根據(jù)顯性失活突變過(guò)程產(chǎn)生的一般標(biāo)準(zhǔn)REVOLUTA蛋白質(zhì)以突變的或部分刪除的形式的有義表達(dá)(HerskowitzI，1987，Nature，329219-222)。該REV蛋白質(zhì)是在同源域的DNA結(jié)合基元部位發(fā)生突變，或者以產(chǎn)生截短的REV蛋白質(zhì)的方式發(fā)生突變。Mizukami(1996)、Emmler(1995)、Sheen(1998)和Paz-Ares(1990)提供了產(chǎn)生各種顯性失活突變過(guò)程的策略的一些例子。
            
通常，在需要的表達(dá)過(guò)程抑制時(shí)，所導(dǎo)入的序列有一些可被轉(zhuǎn)錄。當(dāng)所導(dǎo)入的序列本身不含有編碼序列，但僅含有內(nèi)含子或與存在于內(nèi)源序列的原始轉(zhuǎn)錄文本中的各種序列同源的未翻譯的序列時(shí)，就可能發(fā)生這種影響。該導(dǎo)入的序列通常與要抑制的內(nèi)源序列基本上相同。最小同一性一般大于約65％，但較大的同一性可表現(xiàn)更有效地抑制各種內(nèi)源序列的表達(dá)。基本上同一性超過(guò)約80％時(shí)更佳，如果是約95％到完全相同則最佳。至于反義調(diào)節(jié)，這種影響應(yīng)適用于表現(xiàn)同一性或基本上相同的類似基因家族內(nèi)的其它任何蛋白質(zhì)。
            
對(duì)于有義抑制過(guò)程，相對(duì)于主要的轉(zhuǎn)錄過(guò)程產(chǎn)物或經(jīng)全長(zhǎng)加工的mRNA，所導(dǎo)入的序列不需要完全相同，也不需要全長(zhǎng)。這樣可有利于避免同時(shí)產(chǎn)生一些超表達(dá)的植物。短于全長(zhǎng)的序列的較大同一性可補(bǔ)償較長(zhǎng)但同一性較差的序列的不足。此外，導(dǎo)入的序列不需要具有相同的內(nèi)含子或外顯子模式，各種非編碼片段的同一性是同等有效的。通常是使用上述大小范圍的序列來(lái)進(jìn)行反義調(diào)節(jié)。
            
通過(guò)采用對(duì)REVOLUTA基因側(cè)接一些DNA區(qū)域來(lái)靶向該REVOLUTA編碼序列的插入性斷裂部位，也可消除或減少野生型REVOLUTA基因的功能(Miao等人，1995，Plant J.，7359-365；Kempin等人，1997，Nature，389802-803)。REVOLUTA的靶向基因的替換是由得自側(cè)接該REV基因的各種DNA區(qū)域的轉(zhuǎn)化載體中的各種序列和相應(yīng)的各種染色體序列之間的同源重組來(lái)介導(dǎo)的。在REV的一些側(cè)接區(qū)域中含有一個(gè)可選擇的標(biāo)記物如卡那霉素、bar或pat，或者含有一個(gè)可篩選的標(biāo)記物，如β-葡糖醛酸酶(GUS)。這些標(biāo)記物有利于對(duì)進(jìn)行REV基因替換的細(xì)胞的鑒別。也可鑒別出發(fā)生了成功的REVOLUTA基因替換的各種植物，因?yàn)橹参锏慕M織中細(xì)胞數(shù)有變化。啟動(dòng)子可用于本發(fā)明的實(shí)踐的應(yīng)答性啟動(dòng)子系統(tǒng)的直觀例子是玉米中的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)。GST是一族可給常用作芽前除草劑的各種疏水性親電子化合物解毒的酶類(Weigand等人，1986，Plant Molecular Biology，7235-243)。一些研究已顯示這種GST類直接參與引起這種增強(qiáng)的除草劑耐受性。其作用主要由一個(gè)特殊的1.1kb的mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物介導(dǎo)。簡(jiǎn)言之，玉米中天然存在著一種靜止的基因，該基因可對(duì)外部刺激應(yīng)答并可被誘導(dǎo)產(chǎn)生一種基因產(chǎn)物。先前已鑒別和克隆了此基因。因而，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，從GST應(yīng)答基因中取得該啟動(dòng)子，將其連接到REVOLUTA的編碼序列上。如果該REVOLUTA基因得自基因組DNA，那么在構(gòu)建嵌合型基因的過(guò)程中需要除去它的天然啟動(dòng)子。這個(gè)經(jīng)改造的基因是由對(duì)外部化學(xué)刺激應(yīng)答的啟動(dòng)子和負(fù)責(zé)成功產(chǎn)生REVOLUTA蛋白質(zhì)的基因組合而成。
            
可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子是能直接或間接激活對(duì)誘導(dǎo)物應(yīng)答的一種或多種DNA序列或一些基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程的啟動(dòng)子。缺乏誘導(dǎo)物時(shí)，這類DNA序列或基因就無(wú)法轉(zhuǎn)錄。通常，特異地結(jié)合于可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子上以激活轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)因子是以靜止形式存在，在誘導(dǎo)物的存在下，該啟動(dòng)子就會(huì)直接或間接轉(zhuǎn)化成活性形式。誘導(dǎo)物可以是一種化學(xué)因子如蛋白質(zhì)、代謝物、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)子、除草劑或酚類化合物，或者是由熱、冷、鹽或毒性元素直接強(qiáng)加或通過(guò)病原體或致病因子如病毒間接引起一種生理應(yīng)力。通過(guò)在外部給細(xì)胞或植物使用誘導(dǎo)物，如采用噴灑、澆水、加熱或類似的方法，可將含有可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子的植物細(xì)胞暴露于該誘導(dǎo)物中。如果需要在植物發(fā)育過(guò)程的特定時(shí)間激活靶基因的表達(dá)，那么可在該時(shí)間使用誘導(dǎo)物。
            
這些可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子的例子包括，各種熱激啟動(dòng)子，如黑腹果蠅(Drosphiliamelanogaster)的可誘導(dǎo)的70KD的熱激啟動(dòng)子(Freeling等人，Ann.Rev.of Genetics，19297-323)；冷性可誘導(dǎo)啟動(dòng)子，如從蕪菁甘藍(lán)(B.napus)獲得的冷性可誘導(dǎo)啟動(dòng)子(White等人，1994，Plant Physiol.，106)；和由乙醇誘導(dǎo)的醇脫氫酶啟動(dòng)子(NagaoR.T.等人，Miflin B.J.編輯，Oxford Surveys of Plant Molecular and Cell Biology，1986，第3卷，第384-438頁(yè)，牛津大學(xué)出版社，牛津)。
            
或者，可使用如BCE.4苷藍(lán)(B.campestris胚胎)啟動(dòng)子使本發(fā)明的各種REVOLUTA轉(zhuǎn)基因表達(dá)，已顯示該啟動(dòng)子可在種子發(fā)育非常早的階段指導(dǎo)高水平的表達(dá)(即在蕪菁素(napin)啟動(dòng)子之前已轉(zhuǎn)錄)。對(duì)于芥類植物種子這是在貯存產(chǎn)物積累之前而色素快速的生物合成的時(shí)期(Johnson-Flanagan等人，1989，J.PlantPhysiol.，136180；Johnson-Flanagan等人，1991，Physiol.Plant，81301)。還已顯示各種種子貯存蛋白質(zhì)啟動(dòng)子可以種子特異性方式指導(dǎo)高水平的表達(dá)(Voelker等人，1989，Plant Cell，195；Altenbach等人，1989，Plant Mol.Biol.，13513；Lee等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，996181；Russell等人，1997，Transgenic Res，6157-68)。已顯示蕪菁素(napin)啟動(dòng)子可指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因芥類植物中的油質(zhì)蛋白基因的表達(dá)，此時(shí)油質(zhì)蛋白可累積到總種子蛋白質(zhì)的約1％(Lee等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，996181)。表2列出了可用于本發(fā)明的其它胚胎特異性啟動(dòng)子。
            
表2.胚胎特異性啟動(dòng)子 
            
在選擇啟動(dòng)子時(shí)，可能需要使用組織特異性或調(diào)節(jié)發(fā)育的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子使得某些組織中的表達(dá)被抑制或超表達(dá)而不影響其它組織中的表達(dá)?！敖M織特異性啟動(dòng)子”指主要指導(dǎo)在特殊組織如根、葉、莖、雌蕊、花藥、花瓣、種皮、種仁或表皮層中的基因表達(dá)的編碼區(qū)域?？蓪⒏鞣N轉(zhuǎn)錄刺激物、增強(qiáng)子或激活子整合到組織特異性啟動(dòng)子中，以產(chǎn)生具有高活性水平并保留了組織特異性的啟動(dòng)子。例如，在超表達(dá)中使用的各種啟動(dòng)子最佳是具有組織特異性。在錯(cuò)誤的組織中的超表達(dá)可能是有害的，如當(dāng)試圖在種子貯存區(qū)域中超表達(dá)結(jié)果卻在葉子中超表達(dá)。本發(fā)明最佳的表達(dá)盒一般包括但不限于種子特異性啟動(dòng)子。使用種子特異性啟動(dòng)子是為了確保接下來(lái)只限于在種子中表達(dá)。
            
種子特異性啟動(dòng)子的例子，包括Thomas等人在1999年11月2日出版的題為“用于改變植物種子脂質(zhì)組合物的油質(zhì)蛋白5′調(diào)節(jié)區(qū)域”(本文已全部引為參考)的美國(guó)專利第5,977,436號(hào)中所述的擬南芥油質(zhì)蛋白基因的一些5′調(diào)節(jié)區(qū)域，當(dāng)將該區(qū)域操作性連接于異源基因的編碼序列或與天然植物基因互補(bǔ)的序列時(shí)，它可指導(dǎo)該異源基因或在植物種子中的互補(bǔ)序列的表達(dá)。
            
這些例子還包括各種種子貯存蛋白質(zhì)的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子以高度調(diào)節(jié)的方式例如在雙子葉植物的種子中表達(dá)這些蛋白質(zhì)，如菜豆蛋白(豆子葉)(Sengupta-Gopalan等人，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，823320-3324)；蕪菁素啟動(dòng)子、conglycinin啟動(dòng)子和大豆外源凝集素啟動(dòng)子、patatin(馬鈴薯塊莖)(Rocha-Sosa等人，1989，EMBO J.，823-29)；convicilin、vicilin和莢豆蛋白legumin(豌豆子葉)(Rerie等人，1991，Mol.Gen.Genet.，259148-157；Newbigin等人，1990，Planta，180461-470；Higgins等人，1988，Plant Mol.Biol.，11683-695)；植物血凝素(豆子葉)(Voelker等人，1987，EMBO J.，63571-3577)；conglycinin和大豆球蛋白(大豆子葉)(Chen等人，1988，EMBO J.，7297-302)；和sporamin(甘薯塊根)(Hattori等人，1990，Plant Mol.Biol.，14595-604)。對(duì)于單子葉植物，用于本發(fā)明的實(shí)踐的啟動(dòng)子包括但不限于玉米的玉米醇溶蛋白啟動(dòng)子(Schemthaner等人，1988，EMBO J.，71249-1255)、玉米醇溶蛋白啟動(dòng)子、蠟質(zhì)啟動(dòng)子、皺縮(shrunken)-1啟動(dòng)子、球蛋白1啟動(dòng)子和皺縮(shrunken)-2啟動(dòng)子、谷蛋白(稻米胚乳)、大麥醇溶蛋白(大麥胚乳)(Marris等人，1988，Plant Mol.Biol.，10359-366)、麥谷蛋白和麥醇溶蛋白(小麥胚乳)(美國(guó)專利第5,650,558號(hào))。可使用示差篩選技術(shù)來(lái)分離在特定(發(fā)育)時(shí)間在如果實(shí)發(fā)育期間表達(dá)的啟動(dòng)子。但是，可用在本發(fā)明中的其它一些啟動(dòng)子都是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所熟知的。
            
特別優(yōu)選的啟動(dòng)子是那些使種子特異性表達(dá)的啟動(dòng)子。這種啟動(dòng)子可能特別有用，因?yàn)榉N子是應(yīng)予關(guān)注的主要器官，并且種子特異性表達(dá)將避免在非種子組織中的任何潛在的有害的影響。組織特異性啟動(dòng)子的例子包括但不限于各種種子貯存蛋白質(zhì)的一些啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子在許多植物中可表達(dá)到占總種子蛋白的90％的量。種子貯存蛋白質(zhì)都受到嚴(yán)格地調(diào)節(jié)，幾乎是專一地在種子中以高度組織特異性和階段特異性的方式表達(dá)(Higgins等人，1984，Ann.Rev.Plant Physiol.，35191-221；Goldberg等人，1989，Cell，56149-160)。此外，不同的種子貯存蛋白質(zhì)都可在種子發(fā)育的不同階段表達(dá)。已非常詳細(xì)地研究了不同的種子特異性基因的表達(dá)〔參見(jiàn)Goldberg等人(1989)和Higgins等人(1984)的綜述〕。目前有關(guān)于在各種轉(zhuǎn)基因雙子葉植物中的各種種子貯存蛋白質(zhì)基因的種子特異性表達(dá)的大量例子。這些例子包括從雙子葉植物得到的豆類β-菜豆蛋白(Sengupta-Gopalan等人，1985；Hoffman等人，1988，Plant Mol.Biol.，11717-729)、豆類外源凝集素(Voelker等人，1987)、大豆外源凝集素(Okamuro等人，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，838240-8244)、大豆Kunitz胰蛋白酶抑制物(Perez-Grau等人，1989，Plant Cell，11095-1109)、大豆β-conglycinin(Beachy等人，1985，EMBO J.，43047-3053)、豌豆球蛋白(Higgins等人，1988)、豌豆convicilin(Newbigin等人，1990，Planta，180461-470)、豌豆豆球蛋白(Shirsat等人，1989，Mol.Gen.Genetics，215326-331)、油菜籽蕪菁素(Radke等人，1988，Thero.Appl.Genet.，75685-694)的基因，以及從單子葉植物獲得的基因，如玉米15kD的玉米醇溶蛋白(Hoffman的，1987，EMBO J.，63213-3221)、玉米18kD油質(zhì)蛋白(Lee等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8886181-6185)、大麥β-大麥醇溶蛋白(Manrris等人，1988，Plant Mol.Biol.，10359-366)和小麥麥谷蛋白(Colot等人，1987，EMBO J.，63559-3564)的基因。此外，各嵌合型基因結(jié)構(gòu)中操作性連接于各異源編碼序列的一些種子特異性基因的啟動(dòng)子，也維持了它們?cè)诟鞣N轉(zhuǎn)基因植物中的時(shí)間和空間上的表達(dá)模式。這些例子包括，使用擬南芥2S種子貯存蛋白質(zhì)基因啟動(dòng)子在擬南芥和蕪菁(B.napus)種子中表達(dá)腦啡肽(Vandekerckhove等人，1989，Bio/Technology，7929-932)、使用豆類的leclin和豆類的β-菜豆蛋白啟動(dòng)子表達(dá)熒光素酶(Riggs等人，1989，Plant Sci.，6347-57)和使用小麥麥谷蛋白啟動(dòng)子表達(dá)氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(Colot等人，1987)。
            
還適合用于本發(fā)明的核酸片段的表達(dá)的有從幾種大豆種子貯存蛋白質(zhì)基因中獲得的異源啟動(dòng)子，如Kuntiz胰蛋白酶抑制物(Jofuku等人，1989，Plant Cell，11079-1093)、大豆球蛋白(Nielson等人，1989，Plant Cell，1313-328)和β-Conglycinin(Harada等人，1989，Plant Cell，1415-425)的啟動(dòng)子；對(duì)在一些轉(zhuǎn)基因植物種子發(fā)育的中到晚期，在子葉中表達(dá)mRNA或反義RNA的大豆β-conglycinin貯存蛋白質(zhì)的α-和β-亞單元的一些基因的啟動(dòng)子(Beachy等人，1985，EMBO J.，43047-3053)；蕪菁的異檸檬酸鹽裂解酶和蘋果酸鹽合成酶(Comai等人，1989，Plant Cell，1293-300)、從紅花(Thompson等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，882578-2582)和蓖麻(Shanklin等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，882510-2514)得到Δ-9去飽和酶，從擬南芥(Post-Beittenmiller等人，1989，Nucl.Acids.Res.，171777)、蕪菁(Safford等人，1988，Eur.J.Biochem.，174287-295)和B.campestris(Rose等人，1987，Nucl.Acids Res.，157197)得到的?；d體蛋白質(zhì)(ACP)，從大麥得到的β-酮?；?ACP合成酶(Siggaard-Andersen等人，199l，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，884114-4118)以及從玉蜀黍(Zea mays)(Lee等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，886181-6185)、大豆(Genbank登記號(hào)碼X60773)和B.napus(Lee等人，1991，Plant Physiol.，961395-1397)得到的油質(zhì)蛋白。
            
本發(fā)明的一些核酸片段要獲得正確的表達(dá)水平，可能需要用到使用不同啟動(dòng)子的不同嵌合型基因。這種嵌合型基因或者可以在單一表達(dá)的載體中一起或者以使用1個(gè)以上的載體轉(zhuǎn)移到宿主植物中。
            
另一方面，花粉特異性啟動(dòng)子，即在授粉之前或之后不久可調(diào)節(jié)短暫的表達(dá)以誘導(dǎo)果實(shí)的發(fā)育和成熟而不需明顯的種子發(fā)育的一類啟動(dòng)子，通常是不需要的。這種不需要的啟動(dòng)子，包括但不限于各種可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子、小孢子或大孢子啟動(dòng)子、花粉特異性啟動(dòng)子或母系組織啟動(dòng)子(如種子表皮啟動(dòng)子)或者任何與涉及授粉或  胚珠成熟或發(fā)育的基因有關(guān)的其它啟動(dòng)子。
            
此外，常常需要各種增強(qiáng)子，或者增強(qiáng)子有助于增加本發(fā)明的基因的表達(dá)。這些要需要操作性連接于可編碼所需蛋白質(zhì)的序列，并且這些調(diào)節(jié)性要素是可操作的。各種增強(qiáng)子和增強(qiáng)子樣要素可以是天然的或者是嵌合型的核酸片段。其中可包括病毒的增強(qiáng)子如35S啟動(dòng)子中發(fā)現(xiàn)的增強(qiáng)子(Odell等人，1988，Plant Mol.Biol.，10263-272)、從冠癭堿基因得到的增強(qiáng)子(Fromm等人，1989，Plant Cell，1977-984)、或者從任何其它來(lái)源得到的增強(qiáng)子，當(dāng)將其加到可操作性連接于本發(fā)明的核酸片段的啟動(dòng)子中時(shí)可提高轉(zhuǎn)錄過(guò)程。例如，一種結(jié)構(gòu)可以包括帶有連接于煙草Etch病毒(TEV)5′非翻譯前導(dǎo)區(qū)的雙重轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子的CaMV 35S啟動(dòng)子。該TEV前導(dǎo)區(qū)起到增加蛋白質(zhì)產(chǎn)量的翻譯可增強(qiáng)子的作用。
            
可根據(jù)已完全確定的方法將表2中描述的啟動(dòng)子要素與各種REVOLUTA序列和一種合適的終止物(聚腺苷酸化區(qū)域)相融合。已經(jīng)可以獲得對(duì)不同組織類具有型特異性的各種啟動(dòng)子，或者可使用已各種完全確定的技術(shù)分離出這種啟動(dòng)子(例如參見(jiàn)美國(guó)專利第5,792,925、5,783,393、5,859,336、5,866,793、5,898,096和5,929,302號(hào))。
            
DNA的“消化”、“剪切”或“分裂”指使用僅在DNA的具體位置起作用的酶對(duì)DNA進(jìn)行的催化分裂。這些酶稱為限制性內(nèi)切核酸酶，而在DNA序列上各酶分裂的位點(diǎn)就稱為限制性位點(diǎn)。用于本發(fā)明的各種限制酶可從市售獲得，并根據(jù)制造商所提供的說(shuō)明來(lái)使用(參見(jiàn)Sambrool等人第1.60-1.61和3.38-3.39各節(jié)，同上)。
            
從限制酶切消化物中對(duì)DNA給定片段的“回收”或“分離”指在聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分離所得的DNA片段，通過(guò)與已知分子量的標(biāo)記DNA片段的遷移率相比鑒別感興趣的片段，取得含有所需片段的凝膠部分和從凝膠中分離出DNA。這種方法是眾所周知的。例如，參見(jiàn)Lawn等人(1982，Nucleic AcidsRes.，96103-6114)和Geoddel等人(1980)。
            
結(jié)合下述一些代表性實(shí)施例可能會(huì)更充分理解上述內(nèi)容，在這些實(shí)施例中，“質(zhì)?！庇蛇B接字母數(shù)字標(biāo)記的小寫p表示。用于本發(fā)明的起始質(zhì)粒可無(wú)限制地公開(kāi)從商品途徑獲得，或者可采用已發(fā)表的方法由可得到的質(zhì)粒構(gòu)建。此外，其它相當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒在本領(lǐng)域中是已知的，并且對(duì)于普通技工來(lái)說(shuō)也容易掌握。下述一些實(shí)施例并不局限于本發(fā)明的范圍，而只是在于闡明實(shí)施本發(fā)明的多種可能方法。
            
實(shí)施例1REVOLUTA的鑒別使用多態(tài)DNA標(biāo)記物繪制REVOLUTA基因?yàn)榱耸褂肈NA中的小差異或多態(tài)性繪制基因，已從兩種不同生態(tài)型篩選出擬南芥的隔離種群。為了產(chǎn)生這種隔離種群，將含有在Nossen(No)生態(tài)型的revoluta基因(rev-1)中發(fā)生一些突變過(guò)程的純合植株與Landsberg erecta(Ler)生態(tài)型的野生型植株雜交。在所得的F1代中，各對(duì)染色體中有一條是No生態(tài)型的，另一條是Ler生態(tài)型的。所有的F1代含有從No母本得到的rev-1突變和從Ler母本的野生型REVOLUTA基因。使F1代植株中的一株(稱為21A)自體受精，得到F2代種子，在此種子中已發(fā)生了No和Ler染色體之間的重組。由這些種子長(zhǎng)成的F2代植株就會(huì)因不同的多態(tài)性或標(biāo)記物以及rev-1突變而發(fā)生分離。
            
為了檢測(cè)不同生態(tài)型之間的多態(tài)性，使用了一種稱為簡(jiǎn)單序列長(zhǎng)度多態(tài)性(SSLP)的技術(shù)(Bell等人，1994，Genomics，19137-144)。SSLP標(biāo)記物是一組在PCR反應(yīng)(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))中可擴(kuò)增基因組DNA的特殊區(qū)域的兩個(gè)引物。擴(kuò)增的基因組DNA的大小在不同的擬南芥生態(tài)型之間的特殊區(qū)域中可以是不同的。這就可確定該區(qū)域是源于Ler還是No生態(tài)型。已在確定含有REVOLUTA基因的第5條染色體的區(qū)域中鑒定出兩條SSLP引物nga129和MBK5(Talbert等人，1995)。nga129引物(表3)可擴(kuò)增從來(lái)自Ler生態(tài)型的179號(hào)堿基對(duì)(bp)片段，和來(lái)自No生態(tài)型的165號(hào)bp的片段(Bell等人，1994)。已知MBK5引物可擴(kuò)增來(lái)自Ler生態(tài)型的～180bp的片段(http//genome.bio.upenn.edu/SSLP_info/coming-soon.html)。在No生態(tài)型DNA上使用這些引物進(jìn)行的一組實(shí)驗(yàn)證明了來(lái)自No生態(tài)型的～207bp的片段可被這些引物擴(kuò)增。
            
因此，可使用這些SSLP引物篩選上述21A子代的隔離種群。首先，從形態(tài)學(xué)上鑒別出對(duì)rev-1突變純合的F2代植株(Talbert等人，1995)。然后制備基因組DNA如下。用blue杵(Kontes Glass Co.，Vineland，NJ)在微離心管中研磨約50mg葉子材料10秒鐘。然后，加入100μl PEB(100mM Tris，8.0，50mM EDTA，0.5MNaCl，0.7％SDS和20mg/ml新鮮加入的蛋白酶K)，再研磨該葉子材料20秒鐘。最后，加入325μl PEB，繼續(xù)研磨該材料，直到不存在大塊葉子(15秒鐘)。在65℃加熱1小時(shí)后，加入260μl飽和NaCl。以高速微離心該管20分鐘。將上清液轉(zhuǎn)移到含有850μl、85％異丙醇的新管中。將此混合物離心10分鐘，在70％乙醇中洗滌所得沉積物。然后將干燥的沉積物再懸浮在200μl TE緩沖液中，然后加入133μl LiCl，4℃保存該管。在室溫下使RNA沉淀10分鐘。將上清液轉(zhuǎn)移到新管中再加入2體積的乙醇。離心10分鐘后，使所得沉積物在空氣中干燥，然后再懸浮在50μl、10mM Tris(pH8.0)中。使用1μl的此DNA或1μl 1∶10稀釋的DNA進(jìn)行PCR。
            
在1X緩沖液、2mM MgCl2、0.2mM dNTPs、0.25mM寡核苷酸、2U Taq聚合酶中使用nga129引物或MBK5引物(表3)(Life Technologies，Inc.，Rockville，MD)進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增基因組DNA。PCR條件包括在94℃變性處理3分鐘；接著在94℃30秒鐘、55℃30秒鐘、72℃40秒鐘，此為一輪循環(huán)，共進(jìn)行35輪。各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中包括從No、Ler和21A植株獲得的對(duì)照DNA。在(從186株植株中)最初篩選的372條染色體中，有60條具有Ler標(biāo)記物，這表明在No染色體和Ler染色體之間產(chǎn)生了重組。在用于分析MBK5的360條染色體中，僅有15條具有Ler標(biāo)記物。
            
使用一種稱為K21L19的nga129F/R的～3.4Mb向南(朝向端粒)SSLP標(biāo)記物篩選額外的rev-1植株。此SSLP標(biāo)記物和其它標(biāo)記物都使用下述方法鑒定。首先，從第5條染色體的接近繪入rev-1的區(qū)域的已知DNA序列上產(chǎn)生DNA序列的文本文件(FASTA格式)(http//www.ncbi.nlm.hih.gov/Entrez/nucleotide.html)。僅將該DNA序列的文本文件保存為Microsoft Word 98的文件，并將其用作通過(guò)http//blocks.fhcrc.org/～jorja/blastnew/html網(wǎng)頁(yè)獲得的搜索引擎的數(shù)據(jù)庫(kù)。以重復(fù)性DNA串(如至少長(zhǎng)12bp的“GA”或“TA”重復(fù)基元)搜索擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)。然后使用引物程序選擇側(cè)接該重復(fù)區(qū)域的各種PCR引物(http//www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer′primner3_www.cgi)。要選擇可擴(kuò)增大約150-250bp大小的區(qū)域的引物對(duì)。然后用以對(duì)從No、Ler和21A植株抽提得到的DNA樣品進(jìn)行測(cè)試，以確定是否能檢測(cè)到任何多態(tài)性。進(jìn)一步使用擴(kuò)增的在No和Ler生態(tài)型之間具有多態(tài)性的DNA片段的引物對(duì)繪制REVOLUTA基因。這些新的SSLP標(biāo)記物(見(jiàn)表3)都以它們被從其中發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌人工染色體克隆(BAC)來(lái)命名(擬南芥基因組已被克隆成～100Kb的片段，被克隆到BAC或其它類似的載體中，這些片段沿著該染色體連續(xù)排列)。如果在BAC中鑒別出一個(gè)以上標(biāo)記物，那么該引物對(duì)就可出現(xiàn)額外的鑒別數(shù)。
            
表3供SSLP使用的寡核苷酸 
            
當(dāng)使用K21L19L和K21L19R引物(K21L19L/R)(表3)從含有nga129F/R/rev-1重組染色體的植物中篩選出DNA時(shí)，在原來(lái)的60條nga129重組染色體中有6條也是在K21L19L/R DNA區(qū)域的重組子。此外，對(duì)350條以上的染色體分析了K21L19L/R多態(tài)性標(biāo)記物，在所得到的總共15個(gè)重組子中僅有9條是K21L19L/R的重組子。還使用MBK5-1和MBK5-2 PCR引物(MBK5 1/2)(表3)分析了這350條重組染色體。在對(duì)總共23個(gè)MBK5 1/2重組子中的MBK5 1/2引物對(duì)所限定的MBK5位置上鑒別出8個(gè)新的重組子。K21L19L/R和MBK5 1/2位置限定了擬南芥第5號(hào)染色體中的1.95Mb的區(qū)域。
            
在此區(qū)域產(chǎn)生了其它SSLP引物/標(biāo)記物，在這些引物/標(biāo)記物中，最能提供信息的是MUP24-1和2(MUP24 1/2)和MAF19L和R(MAF19L/R)(表3，圖1)引物。可使用這些標(biāo)記物篩選從K21L19和MBK5 1/2重組植物中分離得到的DNA。在15條K21L19L/R重組子中，有3條是對(duì)MUP24 1/2標(biāo)記物的重組子，而沒(méi)有對(duì)MAF19L/R標(biāo)記物的重組子。在23條MBK5 1/2重組子中，有6條是對(duì)MAF19L/R重組子的，而沒(méi)有對(duì)MUP24 1/2的重組子。如圖1所示，這些結(jié)果將REVOLUTA基因放置于MUP24 1/2和MAF19L/R之間包含～340Kb的區(qū)域中。
            
在此區(qū)域中可產(chǎn)生各種新的SSLP標(biāo)記物，使用這些新的標(biāo)記物可進(jìn)一步限定Ler和No(含有rev-1)染色體之間產(chǎn)生重組過(guò)程的位置。這些標(biāo)記物列在圖2中，包括MUP24 3/4、MUP24 13/14、MAE1 1/2、MAE1 3/4和MAE1 5/6。REVOLUTA被MUP24.4編碼且它是一種新的HD-ZipIII亞族成員從上述繪圖的結(jié)果可以得到，含有REVOLUTA基因的最小的染色體區(qū)域長(zhǎng)約68,000bp。對(duì)此區(qū)域中的翻譯的開(kāi)放讀框的檢測(cè)結(jié)果揭示了約有11個(gè)可編碼REVOLUTA的潛在基因。MUP24.4這種含有蛋白質(zhì)的同源域亮氨酸拉鏈(HD-Zip)被確定為感興趣的基因。在從6個(gè)不同的revoluta等位基因(rev1-6)中分離出來(lái)的DNA中確定了可編碼此HD-Zip蛋白質(zhì)的DNA序列。如上述可從具有不同rev等位基因的葉子制備基因組DNA。采用長(zhǎng)距離PCR，使用表4中的各種引物可擴(kuò)增MUP24.4基因，擴(kuò)增條件如Henikoff等人(1998，Genetics，149307-318)所述，還要在94℃進(jìn)行變性處理步驟，并且在總共40輪的PCR擴(kuò)增處理中，第10輪以后的每一輪都要延長(zhǎng)20秒鐘時(shí)間。
            
表4.采用LD-PCR擴(kuò)增MUP24.4所用的各種引物 
            
根據(jù)制造商的指導(dǎo)，將從各revoluta突變體和野生型REVOLUTA基因得到的PCR產(chǎn)物克隆到TOPO II載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，只是建議對(duì)TOPO載體和PCR產(chǎn)物的用量減半。
            
使用spin minikrep試劑盒(QIAGEN Inc.，Valencia，CA)純化含有插入片段的質(zhì)粒，并使用表5中所列的各種寡核苷酸和根據(jù)制造商指導(dǎo)使用ABI PRISM BigDye試劑盒(Applied Biosystems，現(xiàn)在是PE Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)給該質(zhì)粒測(cè)序。
            
表5用于給HD-Zip蛋白質(zhì)MUP24.4測(cè)序的引物 
            
對(duì)每個(gè)revoluta等位基因的兩個(gè)獨(dú)立產(chǎn)生的克隆進(jìn)行的序列分析表明，REVOLUTA基因序列〔SEQ ID NO1〕在這6個(gè)revoluta等位基因的每一個(gè)中都發(fā)生了突變。在兩個(gè)假定的基因編碼序列(rev-3〔SEQ ID NO5〕和rev-5〔SEQ IDNO5))和假定內(nèi)含子/外顯子拼合連接點(diǎn)(rev-1〔SEQ ID NO3〕、rev-2，4〔SEQ IDNO7〕和rev-6〔SEQ ID NO11〕)中都發(fā)現(xiàn)了觀察到的突變(參見(jiàn)圖3)。因而，DNA序列分析鑒別出在所有6個(gè)revoluta突變體基因中都能表達(dá)REV HD-Zip蛋白質(zhì)的開(kāi)放讀框，但是在各例子中制得的revoluta蛋白質(zhì)都具有改變的氨基酸序列。圖3〔SEQ ID NO2〕顯示了對(duì)野生型REVOLUTA蛋白質(zhì)的預(yù)測(cè)氨基酸序列，并標(biāo)出了各突變體氨基酸和拼接位點(diǎn)。rev-4突變體DNA〔SEQ ID NO7〕的翻譯過(guò)程表明，突變引起了在外顯子10的起始點(diǎn)的翻譯移碼，產(chǎn)生了一個(gè)新的有8個(gè)氨基酸羧基末端的序列。rev-4蛋白質(zhì)終止在讀數(shù)框終止密碼子外，因而rev-4等位基因的轉(zhuǎn)譯過(guò)程產(chǎn)生了截短的rev-4多肽〔SEQ ID NO8〕。SEQ ID NO1列出了完整的可編碼REVOLUTA基因的基因組DNA區(qū)域的野生型DNA序列。表6列出了各revoluta等位基因中發(fā)生突變的核苷酸位置和與各突變體等位基因相關(guān)的核苷酸的改變。
            
表6擬南芥的存在于revoluta的各突變體等位基因中的No-生態(tài)型變化 
            
圖4顯示了842個(gè)氨基酸REV蛋白質(zhì)序列和先前確定的HD-Zip類III族的各成員的排列方式。REV和其它4種蛋白質(zhì)之間在它們的全長(zhǎng)上還存在大范圍的同源性。REV與ATHB-9和ATHB-14具有66％的同一性(78％的相似性)，與ATHB-8具有61％的同一性(75％相似性)。REV與假定是該家族的新成員F5F19.21(AAD12689.1)具有64％的同一性和77％的相似性。當(dāng)使用RT-PCR(未顯示)進(jìn)行分析時(shí)F5F19.21就可表達(dá)，且可表現(xiàn)在多元Genbank EST數(shù)據(jù)庫(kù)的各登記口。當(dāng)該蛋白質(zhì)的含有同源框和亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域的N-末端區(qū)域在校準(zhǔn)之前被除去(剩下第114-832號(hào)各個(gè)殘基)時(shí)，這些蛋白質(zhì)之間的同源性仍非常高REV與ATHB-9和ATHB-14具有64％的同一性，與F5F19具有61％的同一性，與ATHB-8具有58％的同一性。對(duì)REV蛋白質(zhì)序列的進(jìn)一步分析表明，該蛋白質(zhì)在第432-453殘基含有第二個(gè)亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)。在已知的擬南芥HD-Zip III族各成員中，REV是含有第二個(gè)預(yù)測(cè)的亮氨酸拉鏈的唯一蛋白質(zhì)。
            
實(shí)施例2REVOLUTA克隆和表達(dá)載體已制備了含有從得自擬南芥Columbia(Co)生態(tài)型和Nossen(No〕生態(tài)型的基因組DNA中分離得到的野生型REVOLUTA基因的各種重組DNA克隆。此外，已從各revoluta突變體rey-1、rev-2、rev-3、rev-4、rev-5和rev-6中獲得基因組DNA的各種克隆。revoluta突變體rev-1、rev-2和rev-4存在于No生態(tài)型背景中，rev-3、rev-5和rev-6各突變體存在于Co生態(tài)型背景中。將野生型Columbia RevolutacDNA的各重疊區(qū)域分別克隆到載體中，以進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該cDNA包含不轉(zhuǎn)的5′序列的大約350個(gè)核苷酸、全部的Revoluta編碼區(qū)域和具有不轉(zhuǎn)譯的3′序列的大約400個(gè)核苷酸。該野生型Columbia REV cDNA序列與在Kazusa數(shù)據(jù)庫(kù)地址〔www.kazusa.or.jp/arabi/chr5/clone/MUP24/index.html〕中可找到的預(yù)測(cè)的拼接核苷酸序列是一致的。REVOLUTA從內(nèi)源啟動(dòng)子的表達(dá)進(jìn)行PCR從Columbia基因組DNA擴(kuò)增得到從Revoluta編碼序列(5′不轉(zhuǎn)譯的DNA)的大約2.8kb上游到初始甲硫氨酸的200bp下游之間的基因組DNA區(qū)域，并將其克隆到pCRII-TOPO載體(Invitrogen)中〔使用的各種PCR引物有正向引物(包括BamHI限制位點(diǎn))5′TTGGATCCGGGAACACTTAAAGTATAGTGCAATTG3′[SEQ ID NO49]，反向引物5′CAGACTTTGATCTGCTTAGGCTC3′[SEQ ID NO50]〕。對(duì)從獨(dú)立的各種PCR反應(yīng)產(chǎn)生的各種克隆進(jìn)行測(cè)序，以證實(shí)PCR擴(kuò)增處理的精確度。選擇使用其序列與擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)相匹配的克隆，對(duì)內(nèi)源Revoluta啟動(dòng)子區(qū)域(SEQ IDNO1的第1-2848位核苷酸)進(jìn)行克隆，只是在Revoluta編碼序列的5′端大約1.2kb的12Ts鏈上的1T bp被明顯刪除。從No生態(tài)型植株中已分離出含有REVOLUTA的基因組DNA序列的克隆pNO84。含有大約2.6kb的啟動(dòng)子和上游序列以及0.2kb的REV編碼序列的2.8kb BamHI-Sal1限制性消化的DNA片段已被克隆到克隆pNO84的BamHI和Sal1位點(diǎn)中，以從與其內(nèi)源啟動(dòng)子連接的No生態(tài)型產(chǎn)生REVOLUTA基因。為了將3′聚腺苷酸化信號(hào)克隆到pNO84 Revoluta基因的3′端上，并使用下述寡核苷酸〔5′引物，包括NotI位點(diǎn)5′TTGCGGCCGCTTCGATTGACAGAAAAAGACTAATTT3′[SEQ ID NO51]；3′引物，包括ApaI和KpnI位點(diǎn)5′TTGGGCCCGGTACCCTCAACCAACCACATGAC3′[SEQ ID NO52]〕進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，擴(kuò)增起始于接近REV終止密碼子下游長(zhǎng)約0.7kb的Revoluta Co基因的3′端。即可將擴(kuò)增的poly A附加位點(diǎn)DNA片段克隆到REVOLUTA編碼序列3′端pNO84的NotI和ApaI位點(diǎn)上。通過(guò)DNA測(cè)序證實(shí)含有所需的3′poly A附加序列的REVOLUTA表達(dá)的各種轉(zhuǎn)基因。使用KpnI從原始載體中克隆出所得到的含有REV啟動(dòng)子、編碼區(qū)域和3′區(qū)域的REVOLUTA轉(zhuǎn)基因，并將其連接到pCGN1547 T-DNA雙重載體上(McBride等人，1990，PlantMol.Biol.，14269-276)。從35S花椰菜花葉病毒啟動(dòng)子表達(dá)REVO采用PCR，使用引物5′AAGGTACCAAGTTCGACGGAGAAGGTGA3′[SEQ IDNO53]和5′AAGGATCCTGTAGAGAGAGACTGGTGATTTCAG3′[SEQ ID NO54]由pHomer102質(zhì)粒擴(kuò)增可編碼大約900bp的35S花椰菜花葉病毒的DNA片段。對(duì)含有從獨(dú)立PCR反應(yīng)所擴(kuò)增的各DNA片段的克隆進(jìn)行測(cè)序，以證實(shí)該P(yáng)CR擴(kuò)增過(guò)程的精確度。各PCR引物中包含了KpnI和BamHI限制位點(diǎn)，可為含有擴(kuò)增的35S CaMV啟動(dòng)子的900bp KpnI-BamHI片段的分離作準(zhǔn)備。在克隆物pNO84中的REV基因組序列的5′端的KpnI和BamHI位點(diǎn)插入此KpnI-BamHI 35S CaMV片段，以產(chǎn)生在35S CaMV啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的下游大約70bp連接的NoRevoluta轉(zhuǎn)基因。采用上述同樣的方法可將該REV基因的3′端放到REV編碼區(qū)域的下游。使用KpnI可將整個(gè)35S CaMV Revoluta轉(zhuǎn)基因克隆到T-DNA雙重載體pCGN1547中。REV反向重復(fù)結(jié)構(gòu)使用下列各種引物REVIR-1(TTATCGATAGCTTTGCTTATCCGGGAAT[SEQID NO138])和REVIR-2(TTGCGGCCGCCTG-ACAAGCCATACCAGCAA[SEQ IDNO139])；REVIR-3(TTGCGGCCGCAGTTCAACGTGTTGC-AATGG[SEQ IDNO140])和REVIR-4(TTGCATGCGCTAGCGTCGTCGCTTCCAAGTGAAT[SEQID NO141])；REVIR-5(TTGTCGACCCGCGGAGCTTTGCTTATCCGGGAAT[SEQID NO142])和REVIR-6(TTGATGCGCTAGCCTGACAAGCCATACCAGCAA[SEQID NO143])來(lái)擴(kuò)增REV cDNA。這些PCR產(chǎn)物以1/2、3/4然后5/6的順序被克隆在CaMV 35S啟動(dòng)子之后，然后再被克隆到pCGN1547中。所有這些IR引物在其末端都具有限制性位點(diǎn)。REVIR-1和REVIR5對(duì)應(yīng)于第5496-6615堿基對(duì)(在外顯子12中)，REVIR-2和REVIR-6對(duì)應(yīng)于第6226-6245bp(在外顯子15中)。連接的序列由對(duì)應(yīng)于第6268-6288bp(在外顯子15中)的REVIR-3和對(duì)應(yīng)于第6509-6528bp(在外顯子16)的REVIR-4的產(chǎn)物形成。因此，該結(jié)構(gòu)含有CLAI限制位點(diǎn)5496-5582、5668-5748、5834-5968、6051-6245；NOTI限制位點(diǎn)6268-6388、6477-6528；NHEI SPHI限制位點(diǎn)6245-6051、5968-5834、5748-5668、5582-5496；SACII限制位點(diǎn)(SEQ ID NO144)。
            
基本上如上述制備各種附加的反向重復(fù)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)包括從含有外顯子3-7、3670-3743的At REV、3822-3912、4004-4099、4187-4300和4383-4466(SEQ IDNO145)、外顯子15(SEQ ID NO146)和SEQ ID NO147的連接物制得的反向重復(fù)結(jié)構(gòu)。同樣，從含有SEQ ID NO148和SEQ ID NO150的蕃茄REV可制得具有SEQ ID NO149的連接物的反向重復(fù)結(jié)構(gòu)。從稻米可制得一些反向重復(fù)結(jié)構(gòu)，包括從含有SEQ ID NO151和SEQ ID NO153的稻米R(shí)ev1制得的具有SEQ IDNO152的連接物的反向重復(fù)結(jié)構(gòu)，和從含有SEQ ID NO154和SEQ ID NO156的稻米R(shí)ev2制得的具有SEQ ID NO155連接物的反向重復(fù)結(jié)構(gòu)。
            
實(shí)施例3使用REVOUTA轉(zhuǎn)基因?qū)evoluta突變體的互補(bǔ)用上述各種構(gòu)建物轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌屬菌株At503，并使其與從rev-1和野生型Nossen的2-3周齡籽苗育成的根外植體一起培育(Valvekens等人，1988，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，855536-5540)。通過(guò)比較轉(zhuǎn)化植株與沒(méi)有轉(zhuǎn)化的rev突變體植株，分析由這種組織再生的植株的rev表型的互補(bǔ)?；蛘?，可使用植株活體(in planta)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生表達(dá)Revoluta轉(zhuǎn)基因的擬南芥植株(Betchtold等人，1998，Methods Mol.BioL，82259-266)。使用不與內(nèi)源Revoluta mRNA明顯雜交的Revoluta轉(zhuǎn)基因特異性雜交探針進(jìn)行Northem印跡雜交試驗(yàn)，測(cè)定各轉(zhuǎn)基因的基因表達(dá)。或者，在分離的mRNA樣品上進(jìn)行反向轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)，然后使用從該反向轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)獲得的拷貝DNA進(jìn)行PCR，從而測(cè)定Revoluta基因的表達(dá)〔參見(jiàn)“PCR策略”，M.A.Innis、D.H.Gelfand和J.J.Sninsky編輯，1995，Academic Press，San Diego，CA(第14章)；“PCR方案方法和應(yīng)用指南”，M.A.Innis、D.H.Gelfand、J.J.Sninsky和T.J.White編輯，Academic Press，NY(1990)〕。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的量反映了植物中的Revoluta基因在收集該組織制備mRNA樣品時(shí)的表達(dá)水平。rev-1突變體的部分互補(bǔ)我們通過(guò)將含有野生型編碼區(qū)域的構(gòu)建物轉(zhuǎn)化到純化rev-1植株中，確定了由MUP24.4編碼的HD-Zip蛋白是REV基因的產(chǎn)物。在6個(gè)5′REV結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化的多產(chǎn)的T2系列中有一個(gè)被發(fā)現(xiàn)有部分互補(bǔ)。圖5A顯示了兩株T2 rev-1植株，一株僅由載體轉(zhuǎn)化(左)，另一株則由5′REV結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化(右)。相對(duì)于由載體轉(zhuǎn)化的rev-1對(duì)照植析，由5′REV結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化的植sri在主要花序上的莖生葉的葉腋中側(cè)生芽的數(shù)量增加。相對(duì)于rev-1對(duì)照，它們還具有較狹小的葉柄，以及較小的、后卷較差的葉子。另外，此轉(zhuǎn)化系中的花如野生型的花一樣，小于rev-1對(duì)照植株的花(圖5B和5C)。這些結(jié)果一起支持了HD-Zip編碼區(qū)域是REV基因的結(jié)論，但也提出了由于沒(méi)有植株與花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子-Revoluta結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)，可能需要特殊的表達(dá)模式補(bǔ)償rev-1突變過(guò)程。具有反向重復(fù)轉(zhuǎn)基因?qū)EV的抑制將反義RNA和反向重復(fù)基因?qū)胍恍┮吧陀袡C(jī)體中，其結(jié)果顯示，在大多數(shù)系統(tǒng)中它們可干擾正常的基因功能(Sharp和Zamore的綜述，2000)。最近，Waterhouse等人(1998)指出，在普遍存在的啟動(dòng)子的控制下，用含有野生型基因的反向重復(fù)子的結(jié)構(gòu)的野生型植株的轉(zhuǎn)化過(guò)程可誘導(dǎo)使內(nèi)源基因沉默。這些結(jié)果已由Chuang和Meyerowitz(2000)證實(shí)。因此，為了進(jìn)一步證實(shí)關(guān)于所鑒定的HD-Zip蛋白質(zhì)就是REV基因的結(jié)論，我們?cè)贑aMV 35S啟動(dòng)子的控制下將此ORF的反向復(fù)制結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化到野生型Columbia植株中，并測(cè)定Rev表型的誘導(dǎo)過(guò)程。在所檢測(cè)的16例獨(dú)立轉(zhuǎn)化的植株中，有5例顯示出具有與由弱等位基因rev-3和rev-5賦予的強(qiáng)度類似或較小的Rev表型。具體而言，與野生型Columbia植株(圖5D和H)相比，這些植株(如rev突變體植株)具有大量的空的葉腋(圖5E-H)。圖5H示出了對(duì)照Columbia植株(右)和含有該反向重復(fù)結(jié)構(gòu)的Rev-樣植株(左)。
            
實(shí)施例4REV mRNA在增殖和不分裂組織中的表達(dá)原位雜交如http//www/arabidopsis/org/cshl-course/5-in_situ.html/中所述進(jìn)行非放射性原位雜交。使用引物REVcentral-1(GGAGCCTTGAAGTTTTCACTATG[SEQ IDNO175])和REVcentral-2(AGGCTGCCTTCCTAATCCAT[SEQ ID NO176])或REV3′-1(TGAGGAGCGTGATCTCATCAG[SEQ ID NO177])和REV3′-2(CAAAATTATCACATCATTCCCTTT[SEQ ID NO178])，由上述cDNA擴(kuò)增REV的455bp的中心部分或其3′端的779bp部分，并將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到Topo II載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)。中心REV探針用于圖7中的A-L、N-O，3′REV探針用于P-Q。使用FIL-1(CGTCTATGTCCTCCCCTTCC[SEQ ID NO179])和FIL-2(AACGTTAGCAGCTGCAGGA[SEQ ID NO180])由cDNA擴(kuò)增662bp的FIL，并將其克隆到Topo II載體中。使用引物H4-1(TGGAAAGGGAGGAAAAGGTT[SEQID NO181])和H4-2(GCCGAATCCGTAAAGAGTCC[SEQ ID NO182])從cDNA擴(kuò)增Histone H4，并將其克隆到Topo II載體中。使用試劑盒(Roche Biochemicals，Indianapolis，IN)并根據(jù)其方案產(chǎn)生一組有義和反義探針。使用Nikon Coolpix數(shù)碼相機(jī)在Nikon Microphot上制成一組圖象，并將所得影象輸入Adobe Photoshop4.01中。
            
為了測(cè)定不同組織中REV表達(dá)的水平，使用從該REV基因得到的一組引物，用從3-4周齡植株(幼小莖生葉、幼小簇狀葉)和6-7周齡植株(芽、花、莖、老的莖生葉、老的簇生葉)分離得到的RNA進(jìn)行半定量RT-PCR。同時(shí)使用從肌動(dòng)蛋白基因(ACT2；登記號(hào)碼ATU41998)得到的一組引物進(jìn)行一系列對(duì)照反應(yīng)。
            
采用RT-PCR對(duì)從各種植物組織制得的cDNA同時(shí)進(jìn)行REV和ACT2的擴(kuò)增。對(duì)所得的產(chǎn)物進(jìn)行印跡，并用它們各自的基因進(jìn)行探測(cè)。使用Phosphorimager檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)印跡點(diǎn)定量，然后用NIH Image(1.60)分析。使用ACT2水平計(jì)在加樣差異方面對(duì)REV水平進(jìn)行校正。對(duì)于這兩種基因，基因組序列的擴(kuò)增產(chǎn)生的片段大于使用相同的一組引物從cDNA擴(kuò)增得到的片段預(yù)期是由于缺乏一組intronic序列所致。從重復(fù)的實(shí)驗(yàn)中也得到類似的結(jié)果。各泳道的組織來(lái)源如下(A)芽、(B)花、(C)莖、(D)3-4周齡植株的幼小莖生葉、(E)6-7周齡植株的老莖生葉、(F)3-4周齡幼齡簇生葉、(G)6-7周齡老齡簇生葉、(H)沒(méi)有cNDA的對(duì)照，(I)0.005ng基因組(c)DNA、(J)0.05ng基因組DNA、(K)0.5ng基因組DNA、(L)5ng基因組DNA。
            
進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，對(duì)各所得反應(yīng)產(chǎn)物用它們各自的基因進(jìn)行印跡和探測(cè)。經(jīng)歸一化為ACT2信號(hào)后的REV信號(hào)定量的強(qiáng)度表明了在所有受試的組織中都可檢測(cè)到REV mRNA，如圖6中所示。但是，REV mRNA的量在花和芽中最豐富(圖6，泳道A和B)。莖和幼小的莖生葉中REV mRNA的量下降了約兩倍(泳道C和D)，并在老的莖生葉和簇生葉中進(jìn)一步下降(泳道E、F和G)。
            
使用REV反義探針進(jìn)行的原位雜交試驗(yàn)所獲得的結(jié)果與使用RT-PCR試驗(yàn)的結(jié)果一致，該結(jié)果顯示圖7中。在頂端和整個(gè)植株中細(xì)胞分裂活躍的區(qū)域，該REVmRNA最豐富(圖7A-L)。REV在野生型花序的分生組織中表達(dá)，并且它在花的原基中的表達(dá)增加(圖7A-C)。在花的分生組織中，相對(duì)圍繞花組織的器官，萼片、雄蕊和心皮原基中的REV mRNA濃度增加(圖7C-D和7F-I)。但是，REV的表達(dá)在晚期花的萼片中下降，而在此階段的發(fā)育中的心皮和雄蕊的表達(dá)仍維持強(qiáng)度(圖7A、C和F)。REV mRNA在輔助分生組織中的量也是豐富的(圖7A)。在莖生葉中同時(shí)檢測(cè)到了兩個(gè)梯度的表達(dá)，一個(gè)沿著葉子的近端向遠(yuǎn)端下降，另一個(gè)沿著葉子的近軸端向遠(yuǎn)軸端減少(圖7E)。在早期的胚胎中可檢測(cè)到REV mRNA(圖7K)，并且在胚胎發(fā)生的整個(gè)細(xì)胞分裂階段以及在胚乳中可持續(xù)檢測(cè)到高水平REVmRNA(圖7L和J)。最后，在莖的成熟的不分裂組織中，尤其在皮層和脈管區(qū)域中可檢測(cè)到REV mRNA(圖7P)。與野生型莖(圖7S)相比較，這種表達(dá)模式與在rev-1莖的皮層中(圖7R)發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞層的數(shù)量增加有關(guān)。顯示S-階段細(xì)胞改變模式的Rev-1突變體植株histone H4基因僅在活躍分裂的細(xì)胞和進(jìn)行核內(nèi)復(fù)制的細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄。因而，可使用histone H4 mRNA作為細(xì)胞周期活性的標(biāo)記物。為了更好理解REV基因影響發(fā)育中植株的細(xì)胞分裂模式，在野生型和rev-1突變體植株中進(jìn)行了histone H4mRNA的原位雜交。如圖8A和8B所示，rev-1突變體植株中表達(dá)H4 mRNA的細(xì)胞的數(shù)量相對(duì)于野生型植株有所增加。這在莖生葉的近軸端和莖中特別明顯，這兩個(gè)區(qū)域都是rev突變體過(guò)度生長(zhǎng)的區(qū)域。這種明顯局限在rev莖生葉的近軸端區(qū)域的細(xì)胞分裂可影響整個(gè)葉子的長(zhǎng)度。在腋的近端增厚區(qū)域，rev-1突變體(圖8D)中的細(xì)胞分裂簇相對(duì)于野生型植株(圖8C)更常見(jiàn)。
            
實(shí)施例5REV雙重突變體FIL在rev突變體中的正確表達(dá)REV雙重突變體如Talbert等人(1995)所述獲得lfy REV雙重突變體。簡(jiǎn)言之，從rev-1 X lfy-6/+雜交得到的各種REV F2個(gè)體，都是可用于測(cè)試lfy rev F3的雙重突變體的分離現(xiàn)象的子代。因?yàn)閞ev和lfy緊密連接，所以要進(jìn)行PCR測(cè)試假定的lfy-6 rev-1植株，以證實(shí)lfy突變的存在。所使用的各種lfy-6 CAPS標(biāo)記物可設(shè)計(jì)成可利用單個(gè)堿基對(duì)改變以引起lfy-6的突變第32個(gè)密碼子上的CAA變成UAA。引物是AACGAGAGCATTGGTTCAAG[SEQ ID NO183]和CAACGAAAGATATGAGAGAG[SEQ ID NO184]。使用MaeIII剪切所得的PCR產(chǎn)物，可從野生型基因辨別lfy-6突變體。將純合的rev-1植株的與雜合的fil-1植株的花粉進(jìn)行雜交可得到rev fil突變體。將雜合后代與rev-1花粉雜交，就可鑒定olant純合植株的rev-1和fil-1。
            
掃描電子顯微鏡檢查用3％戊二醛的0.02M、pH7.0的磷酸鈉溶液固定樣品，真空浸潤(rùn)15-30分鐘，然后4℃保存16小時(shí)或以上。將樣品放到1％四氧化鋨(Polyscience，Warrington，PA)中2-4小時(shí)再用乙醇體系進(jìn)行脫水。使用Denton DCP-1 Critical Point DryingApparatus(Denton Vacuum Inc.，Moorestown，NJ)對(duì)樣品干燥處理。將樣品固定于與SEM的樣品載片連接的導(dǎo)電碳?jí)|上，并用Au/Pd涂覆。使用Jeol JSM-840A型掃描顯微鏡。使用Polaroid 55型膠片成象，然后掃描并輸入Adobe Photoshop 4.01。
            
在各種fil突變體中，在野生型植株中花形成較早，由于莖生葉的基底明顯缺少分生組織的形成的緣故導(dǎo)致沒(méi)有形成第三級(jí)幼芽，并且花顯示出異常的數(shù)目、形狀和花器的排列。此外，嚴(yán)重的fil等位基因有時(shí)可形成無(wú)花的花梗，或者在它們的遠(yuǎn)端形成與rev植株中形成的花絲(Chen等人，1999；Sawa等人，1999)類似的具有單一萼片結(jié)構(gòu)的花梗。在fil rev雙重突變體中，初級(jí)花序嚴(yán)重縮短，所有的花原基出現(xiàn)與無(wú)花花梗一樣的結(jié)局。這些結(jié)構(gòu)，如野生型花上的花梗，都是平滑的。但是，因?yàn)樗械幕ㄔ汲蔀闊o(wú)花花梗，一度曾認(rèn)為，REV和FIL是在促進(jìn)花原基中花的形成方面的局部性多余的功能(Chen等人，1999)。
            
這種強(qiáng)烈的雙重突變體表型可能有助于確定FIL mRNA在rev植株中的表達(dá)。在野生型植株中，F(xiàn)IL mRNA在整個(gè)SAM中的表達(dá)是微弱的，但由于花的分生組織與SAM截然不同，因而FIL在該分生組織遠(yuǎn)端側(cè)的表達(dá)增加(Siegfried等人，1999)。FIL在rev-1組織中的部位與野生型對(duì)照并無(wú)區(qū)別，這表明rev基因產(chǎn)物的損壞沒(méi)有影響FIL的表達(dá)(圖7E-I)。
            
具有其它突變的rev的相互作用為了充分地理解花分生組織中的REV活性，我們培育了一些rev-1 lfy-6雙重突變體植株。LFY功能是正確鑒定花分生組織的性狀所需要的。如圖9所示，lfy rev雙重突變體如rev fil雙重突變體，是具有終端形成束狀花絲結(jié)構(gòu)的單一花序的短小植株。與rev fil雙重突變體中形成的通常平滑和類似無(wú)花花梗的花絲結(jié)構(gòu)(圖9B、F和G)不同，在rev lfy雙重突變體上形成的花絲結(jié)構(gòu)是從根部向頂端由平滑變成毛糙，并且是具有星形毛狀體的葉子樣結(jié)構(gòu)(圖9A、E、H-I)也有些是心皮樣結(jié)構(gòu)。在各花絲的基部可以看到鱗狀結(jié)構(gòu)(圖9H和I)，可能是退化的襯托器官(Long和Barton，2000)。此外，rev lfy雙重突變體通常在第一片莖生葉的對(duì)側(cè)具有一個(gè)或多個(gè)莖部的絲狀附器(圖9A和C)。該附器與通常在rev單突變體的軸中檢測(cè)到的結(jié)構(gòu)(圖9D)類似。與fil rev雙重突變體一樣，lfy rev雙重突變體表明了REV具有維護(hù)花的分生組織的作用。
            
與LFY一致，需要有APETALA 1來(lái)建立花分生組織。植株發(fā)育過(guò)程中LFY或AP1的異位表達(dá)可導(dǎo)致早熟花的形成〔Weigel和Nilsson(1995)，Nature，377，495；Mandel和Yanofsky(1995)，Nature，377522)。AP1在第一和第二輪生體中的萼片和花瓣器官的身份確定中起輔助性作用。尤其是，在ap1-1突變體中，萼片被轉(zhuǎn)化成莖生葉或苞葉樣結(jié)構(gòu)，花瓣由于缺乏而無(wú)法引發(fā)。此外，花分生組織在莖生葉樣萼片的軸中被部分或完全轉(zhuǎn)化成花序分生組織，導(dǎo)致高度分支結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生(Bowman，1993，Dev 119，721-743，圖9)。與rev lfy雙重突變體不同，rev-1ap1-1雙重突變體可產(chǎn)生具有預(yù)期來(lái)自各自單一突變體表型的花的各種缺陷的正常大小的花序(圖9)。rev-1 ap1-1突變體的花與單一的ap1-1突變體的花類似(圖91)。雖然rev-1 ap1-1突變體的這種表型是附加的，但是rev-1突變體的附屬分生組織的缺乏，對(duì)于ap1-1突變體的附屬分生組織數(shù)量的增加是一種上位關(guān)系，這導(dǎo)致產(chǎn)生了無(wú)分支的結(jié)構(gòu)(圖9)。
            
AGAMOUS是調(diào)節(jié)花器性狀的另一種多功能基因，它是確定花的生長(zhǎng)所需要的。在ag-1突變體中，在第三輪生體花瓣的發(fā)育替代了雄蕊，在第四輪生體新的花萌發(fā)面替代心皮。rev-1 ag-1突變體的表型可加上與rev-1植株一樣的產(chǎn)生擴(kuò)大的花瓣的雙在突變體花，但是，與ag-1一樣在第三輪生體上具有花瓣(圖9)。同樣，rev-1 ag-1雙重突變體的花與ag-1單突變體的花一樣，在第四輪生體上重復(fù)出現(xiàn)花的發(fā)育。
            
CLAVATA基因控制著頂端分生組織的大小。喪失clv功能的突變體由于未分化干細(xì)胞在頂端分生組織的中心區(qū)域聚集，而具有擴(kuò)大的頂端分生組織。強(qiáng)的clv1-4突變體也由于額外的心皮的存在而具有三葉草花形種籽莢。clv1-4 rev-1雙重突變體表型是協(xié)調(diào)的，因?yàn)樵谒鼈兓ɡ賰?nèi)有大量過(guò)度生長(zhǎng)的結(jié)構(gòu)。這些愈傷組織樣的組織竟然會(huì)繼續(xù)生長(zhǎng)而從種籽莢中爆裂出來(lái)。這一結(jié)果與REV限制的花組織(如該雙重突變體表型所顯示)中細(xì)胞分裂的作用相同，這類組織由于雙重突變體表型而顯示CLV1有部分過(guò)剩。
            
實(shí)施例6從其它植物物種中鑒別和分離REVOLUTA本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例提供了一種對(duì)各種REVOLUTA基因和蛋白質(zhì)在分離它們的各種植物中所起的細(xì)胞分裂調(diào)節(jié)物功能的鑒別和使用方法。結(jié)合使用“序列類似性試驗(yàn)”和REVOLUTA“基因功能試驗(yàn)”來(lái)分離與擬南芥REVOLUTA基因直向同源的各種REVOLUTA基因。首先，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，使用擴(kuò)增各種亞族III HD-Zip多核苷酸的“CODEHOP”PCR引物(Rose等人，1998，Nucleic AcidsRes.，261628-1635)從靶植株DNA中分離出候選的REVOLUTA基因序列，例如維持在基因庫(kù)中的基因組DNA或DNA。然后對(duì)擴(kuò)增的DNA進(jìn)行測(cè)序，以確定該P(yáng)CR產(chǎn)物對(duì)蛋白質(zhì)一個(gè)區(qū)的編碼，該編碼的區(qū)與對(duì)應(yīng)于該P(yáng)CR擴(kuò)增區(qū)域的擬南芥REVOLUTA蛋白質(zhì)序列至少具有約70％的同一性、更佳至少約為75％的同一性、最佳至少約為80％的同一性。然后使用從候選REVOLUTA編碼序列得到的多核苷酸區(qū)進(jìn)行“基因功能試驗(yàn)”，該編碼序列已被轉(zhuǎn)移到植株轉(zhuǎn)化載體中，并被轉(zhuǎn)化回從中產(chǎn)生該候選REVOLUTA基因的植物物種中。實(shí)際的REVOLUTA基因是那些當(dāng)REVOLUTA轉(zhuǎn)基因在轉(zhuǎn)化的植株中表達(dá)時(shí)可調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂的基因。
            
HD-ZipIII亞族PCR引物的鑒別為了產(chǎn)生HD-ZipIII亞族CODEHOP引物，使已知的HD-ZipIII氨基酸序列輸入位于Hutchinson Cancer Research Center websitehttp//blocks/fhcrc.org中的信息編組(blockmaker)程序中。該程序相當(dāng)于序列，并可產(chǎn)生保存在不同蛋白質(zhì)之間的同源信息組。表8列出了從六個(gè)HD-ZipIII族成員中制得的HD-ZipIII氨基酸信息組。
            
表8使用Fred Hutchinson Cancer Research Center“block”計(jì)算機(jī)程序鑒別HD-ZipIII氨基酸信息組HD-ZiP信息組   氨基酸序列HD-ZiP蛋白質(zhì)HD-ZipIII信息組A(信息組寬度＝43)REVOLUTA124 GKYVRYTAEQVEALERVYAECPKPSSLRRQQLIRECSILANIESEQ ID No.2Athb-14 24 GKYVRYTPEQVEALERVYTECPKPSSLRRQQLIRECPILSNIESEQ ID No.55Athb-8  14 GKYVRYTPEQVEALERLYNDCPKPSSMRRQQLIRECPILSNIESEQ ID No.56Athb-9  20 GKYVRYTPEQVEALERVYAECPKPSSLRRQQLIRECPILCNIESEQ ID No.57CRHB1   19 GKYVRYTSEQVQALEKLYCECPKPTLLQRQQLIRECSILRNVDSEQ ID No.58F5F 19.21   16 GKYVRYTPEQVEALERLYHDCPKPSSIRRQQLIRECPILSNIESEQ ID No.59HD-ZipIII信息組B信息組寬度＝42REVOLUTA70 IKVWFQNRRCRDKQRKEASRLQSVNRKLSAMNKLLMEENDRLSEQ ID No.2Athb-14 70 IKVWFQNRRCREKQRKEAARLQTVNRKLNAMNKLLMEENDRLSEQ ID No.55Athb-8  60 IKVWFQNRRCREKQRKEASRLQAVNRKLTAMNKLLMEENDRLSEQ ID No.56Athb-9  66 IKVWFQNRRCREKQRKESARLQTVNRKLSAMNKLLMEENDRLSEQ ID No.57CRHB1   65 IKVWFQNRRCREKQRKEWCRLQSLNGKLTPINTMLMEENVQLSEQ ID No.58F5F19.2162 IKVWFQNRRCREKQRKEASRLQAVNRKLTAMNKLLMEENDRLSEQ ID No.59HD-ZipIII.信息組C信息組寬度＝29REVOLUTA154 SPAGLLSIAEETLAEFLSKATGTAVDWVQSEQ ID No.2Athb-14 167 NPAGLLSIAEEALAEFLSKATGTAVDWVQSEQ ID No.55Athb-8  153 SPAGLLSIADETLTEFISKATGTAVEWVQSEQ ID No.56Athb-9  163 NPANLLSIAEETLAEFLCKATGTAVDWVQSEQ ID No.57CRHB1   109 HVAQLVTINHALRRQLSSTPSHFRFPTVSSEQ ID No.58F5F19.21154 SPAGLLSIAEETLAEFLSKATGTAVEWVQSEQ ID No.59HD-ZipIII信息組D信息組寬度＝31REVOLUTA  446 VLCAKASMLLQNVPPAVLIRFLREHRSEWADSEQ ID No.2Athb-14   464 VLCAKASMLLQNVPPAVLVRFLREHRSEWADSEQ ID No.55Athb-8452 VLCAKASMLLQNVPPSILLRFLREHRQEWADSEQ ID No.56Athb-9460 VLCAKASMLLQNVPPLVLIRFLREHRAEWADSEQ ID No.57CRHB1 138 LMNIYAIVRLQHVPIPECRS2XXXXXXXXXXXSEQ ID No.58F5F19.21  453 VLCAKASMLLQNVPPAILLRFLREHRSEWADSEQ ID No591此數(shù)值表明使用在所提及的SEQ ID數(shù)值中公開(kāi)的各蛋白質(zhì)序列中的氨基酸數(shù)值的各信息組中第一氨基酸的氨基酸位置；2X指在最佳的計(jì)算機(jī)排列中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的氨基酸。
            
通過(guò)使用吉布斯算法或基元算法將表8中的HD-ZipIII“信息組”序列數(shù)據(jù)輸入CODEHOP程序中，用HD-ZipIII“信息組”氨基酸序列設(shè)計(jì)HD-ZipIII族PCR引物。通過(guò)選擇具體的植物物種(在本實(shí)施例中是稻米)進(jìn)一步精選PCR引物輸出，其中所挑選的PCR引物對(duì)于根據(jù)為稻米編碼的優(yōu)選使用的密碼子的這些具體的植物具有偏好(也可使用CODEHOP程序選擇其它植物偏好的密碼子)。表9列出一組可使用CODEHOP程序編制以擴(kuò)增來(lái)自稻米、大麥和玉米的HD-ZipIIIPCR基因的各種可能的CODEHOP HD-ZipIII PCR引物。
            
表9使用Fred Hutchinson Cancer Research Center“CODEHOP”計(jì)算機(jī)程序設(shè)計(jì)的HD-ZipIII PCR引物HD-Zip信息組 寡核苷酸序列1HD-ZipIII信息組A正向稻米  A1F  5′-GGCGGCAGCAGCTGathmgngartg-3′SEQ ID No.60 R  Q  Q  L  I  R  E  CDegen2＝48，temp3＝62.4稻米  A2F  5′-GGAGAGGGTGTACTGCGAGtgyccnaarcc-3′SEQ ID No.61 E  R  V  Y  C  E  C  P  K  PDegen＝16，temp＝62.2 rice A2稻米  A3F  5′-TGCGGTACACCCCCgarcargtnea-3′SEQ ID No.62 R  Y  T  P  E  Q  V  EDegen＝32，temp＝63.3稻米  A4F  5′-TGCGGTACACCCCCGArcargtnsarg-3′SEQ ID No.63 R  Y  T  P  E  Q  V  E  ADegen＝64，temp＝63.3稻米  A5F  5′-CGGTACACCCCCGAGcargtnsargc-3′SEQ ID No.64 R  Y  T  P  E  Q  V  E  ADegen＝32，temp＝64.2稻米  A6F  5′-TGGAGAGGGTGTACTGCgantgyccnaa-3′SEQ ID No.65 E  R  V  Y  C  E  C  P  K
            
Degen＝32，temp＝60.4稻米  A7F 5′-TGGAGAGGGTGTACTGCGAntgyccnaarc-3′SEQ ID No.66E  R  V  Y  C  E  C  P  K  PDegen＝64，temp＝60.4稻米  A8F 5′-CCGACCTCCATGCGGmgncarcaryt-3′SEQ ID No.67P  S  S  L  R  R  Q  Q  LDegen＝64 temp＝60.8稻米  A9F 5′-CCATGCGGCGGcarcarytnat-3 ′SEQ ID No.68L  R  R  Q  Q  L  IDegen＝32，temp＝62.4HD-ZipIII信息組A反向稻米  A1R 5′-CGGGGGTGTACCGCacrtayttncc-3′SEQ ID No.69Degen＝16，temp＝62.1與下列序列互補(bǔ)4G  K  Y  V  R  Y  T  P  EccnttyatrcaCGCCATGTGGGGGC稻米  A2R 5′-CTGCTCGGGGGTGTACcknacrtaytt-3′SEQ ID No.70Degen＝32，temp＝60.1與下列序列互補(bǔ)K  Y  V  R  Y  T  P  E  QttyatrcankcCATGTGGGGGCTCGTC稻米  A3R 5′-ACCTGCTCGGGGTGtancknacrta-3′SEQ ID No.71
            
Degen＝64，temp＝60.1與下列序列互補(bǔ)Y  V  R  Y  T  P  E  Q  VatrcankcnatGTGGGGGCTCGTCCA稻米  A4R 5′-CCACCTGCTCGGGGgtrtancknac-3′SEQ ID No.72Degen＝64，temp＝63.2與下列序列互補(bǔ)V  R  Y  T  P  E  Q  V  EcankcnatrtgGGGGCTCGTCCACC稻米  A5R 5′-CACCCTCTCCAGGGCCtsnacytgytc-3′SEQ ID No.73Degen＝32，temp＝61.2與下列序列互補(bǔ)E  Q  V  E  A  L  E  R  VctygtycanatCCGGGACCTCTCCCAC稻米  A6R 5′-CAGTACACCCTCTCCAGGGcytsnacytgyt-3′SEQ ID No.74Degen＝64 temp＝62.0與下列序列互補(bǔ)Q  V  E  A  L  E  R  V  Y  CtygtycanstycGGGACCTCTCCCACATGAC稻米  A7R 5′-CAGTACACCCTCTCCAGGgcytsnacytg-3′SEQ ID No.75Degen＝32，temp＝62.0與下列序列互補(bǔ)Q  V  E  A  L  E  R  V  Y  CgtycanatycgGGACCTCTCCCACATGACHD-ZipIII信息組B正向稻米  B1F 5′-CCATGAACAAGATGCTGatggargaraa-3′SEQ ID No.76M  N  K  M  L  M  E  E  N
            
Degen＝4，temp＝63.3稻米  B2F 5′-CGGCTGCAGACCGTGaayvgnaaryt-3′SEQ ID No.77R  L  Q  S  V  N  R  K  LDegen＝96，temp＝63.3稻米  B3F 5′-GACCGCCATGAACAAGATGytnatggarga-3′SEQ ID No.78T  A  M  N  K  M  L  M  E  EDegen＝16，temp＝60.1稻米  B4F 5′-CCGCCATGAACAAGATGCTnatggargara-3′SEQ ID No.79A  M  N  K  M  L  M  E  E  NDegen＝16，temp＝62.2稻米  B5F 5′-CCATGAACAAGATGCTGATggargaraayg-3′SEQ ID No.80M  N  K  M  L  M  E  E  N  DDegen＝8，temp＝63.3HD-ZipIII信息組B反向稻米B1R   5′-CGGCCCGCCGGttytgraacca-3′SEQ ID No.81Degen＝4，temp＝64.2與下列序列互補(bǔ)W  F  Q  N  R  R  C  RaccaargtyttGGCCGCCACGGC稻米  B2R 5′-ATCTGGTTCATGGCGGTCaryttncbrtt-3′SEQ ID No.82Degen＝96，temp＝60.1與下列序列互補(bǔ)N  R  K  L  T  A  M  N  K  M
            
ttrbcnttyraCTGGCGGTACTTGTTCTA稻米  B3R5′-CGCCGGTTCTGGaaccanacytt-3 ′SEQ ID No.83degen＝8，temp＝64.3與下列序列互補(bǔ)K  V  W  F  Q  N  R  RttycanaccaaGGTCTTGGCCGC箱米  B4R5′-GCACCGCCGGTTCtgraaccanac-3′SEQ ID No.84degen＝8，temp＝61.0與下列序列互補(bǔ)V  W  F  Q  N  R  R  CcanaccaargtCTTGGCCGCCACGHD-ZipIII信息組D正向稻米  D1F5′-CCAAGGCCACCATGCTGytncarmaygt-3′SEQ ID No.85   K  A  S  M  L  L  Q  N  VDegen＝64，temp＝62.3稻米  D2F5′-AAGGCCACCATGCTGCTncarmaygtnc-3′SEQ ID No.86   K  A  S  M  L  L  Q  N  V  PDegen＝128，temp＝60.4稻米  D3F5′-CCACCATGCTGCTGcarmaygtncc-3′SEQ ID No.87   S  M  L  L  Q  N  V  PDegen＝32，temp＝60.1稻米D4F5′-CCCGTCTGCATCCGGttyytnmgnga-3′SEQ ID No.88   A  V  C  I  R  F  L  R  EDegen＝128，temp＝63.1稻米  D5F  5′-CCGTCTGCATCCGGTTCytnmgngarca-3′SEQ ID No.89 V  C  I  R  F  L  R  E  HDegen＝128，temp＝61.2稻米  D6F  5′-GTCTGCATCCGGTTCCTGmgngarcaymg-3.′SEQ ID No.90 V  C  I  R  F  L  R  E  H  RDegen＝64，temp＝60.2稻米  D7F  5′-TGCGGGAGCACCGGnvngartgggc-3′SEQ ID No.91 R  E  H  R  S  E  W  ADegen＝96，temp＝62.9稻米  D8F  5′-GCGGGAGCACCGGTCngartgggcng-3′SEQ ID No.92 R  E  H  R  S  E  W  A  DDegen＝32，temp＝62.6稻米  D9F  5′-GGAGCACCGGTCGgartgggcnga-3′SEQ ID No.93 E  H  R  S  E  W  A  DDegen＝8，temp＝60.3HD-ZipIII信息組D反向稻米  D1R  5′-GACGGGCGGCggnacrtkytg-3′SEQ ID No.94Degen＝32，temp＝60.4與下列序列互補(bǔ)Q  N  V  P  P  A  VgtyktrcanggCGGCGGGCAG稻米D2R  5′-GACGGGCGGCGgnacrtkytgna-3′SEQ ID No.95Degen＝128，temp＝60.4與下列序列互補(bǔ)Q  N  V  P  P  A  VangtyktrcangGCGGCGGGCAG稻米  D3R   5′-CACTCCGACCGGTGCtcncknarraa-3′SEQ ID No.96Degen＝128，temp＝61.5與下列序列互補(bǔ)F  L  R  E  H  R  S  E  WaarrankcnctCGTGGCCAGCCTCAC1第一行顯示CODEHOP設(shè)計(jì)的引物的寡核苷酸序列。CODEHOP所使用的簡(jiǎn)化核苷酸字母表是A→A，C→C，G→G，T→T，R→AG，Y→CT，M→AC，K→GT，W→AT，S→CG，B→CGT，D→AGT，H→ACT，V→ACG，N→ACGT。第二行顯示由所有多余的引物編碼的氨基酸序列。
            
2“Degen”指編碼指定氨基酸序列的引物組合中簡(jiǎn)并的寡核苷酸數(shù)。
            
3“Temp”指簡(jiǎn)并寡核苷酸引物組合的平均熔點(diǎn)溫度。
            
4“與下列序列互補(bǔ)”指指定反向寡核苷酸與之互補(bǔ)的HD-Zip氨基酸信息組，即HD-Zip信息組肽編碼鏈序列區(qū)域。
            
通過(guò)改變表9中列出的各種引物的序列可以選擇其它各種HD-ZipIII PCR引物，以反映靶植物種類的適當(dāng)?shù)拿艽a子使用偏好。但是，如下面所示，特異地為稻米設(shè)計(jì)的各種CODEHOP HD-ZipIII引物也能擴(kuò)增來(lái)自單子葉植物玉米和大麥的HD-Zip片段。
            
單子葉植物HD-Zip克隆的分離使用選自表9的CODEHOP引物稻米A2F[SEQ IDNO71]和稻米B2R[SEQIO81]或稻米A2F和稻米B2R[SEQ ID NO82]來(lái)鑒別單子葉植物的各種HD-ZipIII同源物。這些引物在20μL的使用2單位Amplitaq Gold(perkin Elmer)的PCR反應(yīng)中使用，所用的緩沖液為2mM MgCl2、0.2mM dNTPs，各引物使用0.5μM。用于PCR的各種模板DNA有1.5μL稻米(Oryza sativa L.indicamvar.IR36)cDNA庫(kù)(Stratagene FL1041b)；1.5μL純化基因組的稻米(Oryzasativa)DNA(大約400ng)；1.5μL純化基因組的大麥(Hordeum vulgare)DNA(大約400ng)；1.5μL純化基因組的玉米(Zea may)DNA(大約400ng)。PCR條件包括95℃培育9分鐘，繼以95℃(30秒)、60-55℃(30秒)，共5輪，后一溫度每輪下降1℃；72℃(2分鐘)；然后95℃(30秒)、55℃(30秒)共35輪；和72℃(2分鐘)。所得的各種PCR DNA產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析，然后從TAE緩沖液中的0.8％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠(SeaPlaque，F(xiàn)MC Bioproducts，Rockland，ME)上切下，用PCR凈化試劑盒(Promega)純化。將各DNA片段克隆到TOPO II載體試劑盒(Invitrogen)中。使用旋轉(zhuǎn)微量制備試劑盒(Qiagen)從細(xì)菌細(xì)胞中純化DNA，并使用BIG染料(Applied Biosystems)測(cè)序。稻米、玉米和大麥的DNA和蛋白質(zhì)序列分別公開(kāi)在SEQID NO97-126中。
            
使用Altschul等人(1997)的BLAST2計(jì)算機(jī)程序?qū)U(kuò)增的單子葉各種序列和擬南芥REVOLUTA中對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)區(qū)域進(jìn)行比較。使用國(guó)立衛(wèi)生研究所網(wǎng)頁(yè)位置http//www.ncbi.nim.gov/gorf/wblast2.cgi上的BLAST2.0.9版本進(jìn)行計(jì)算機(jī)輔助的序列比較。各擴(kuò)增的序列與擬南芥REVOLUTA蛋白質(zhì)具有高度的氨基酸序列同一性或相似性(約79-88％的氨基酸同一性和約87-97％的氨基酸相似性)。這些數(shù)據(jù)證明，可使用表9中公開(kāi)的可編碼與擬南芥蛋白質(zhì)的相應(yīng)氨基酸區(qū)域[SEQ IDNO2]具有高，序列同源性的肽區(qū)域的HD-Zip CODEHOP引物，從遠(yuǎn)緣關(guān)系的各種單子葉植物中分離出基因。
            
REVOLUTA功能實(shí)驗(yàn)使用上述各種方法分離的植物基因，就可進(jìn)行Revoluta功能檢測(cè)。通過(guò)使用表9所列的正向和反向HD-Zip信息組的各種PCR引物組合，將所擴(kuò)增的各種多核苷酸序列克隆到各種植物轉(zhuǎn)化載體中，從而進(jìn)行功能測(cè)試以鑒別實(shí)際的Revoluta基因。使用先前提出的基因抑制策略中的一個(gè)，如通過(guò)制備反向重復(fù)轉(zhuǎn)基因或反義轉(zhuǎn)基因，使假定的Revoluta序列在植物轉(zhuǎn)化載體中定向。檢測(cè)各種再生的轉(zhuǎn)基因植物，比較各種組織中含有的細(xì)胞的數(shù)量與未轉(zhuǎn)化的植株的對(duì)應(yīng)組織中的細(xì)胞數(shù)量。經(jīng)含有本發(fā)明Revoluta基因的各種抑制性轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化的植株，在其組織的代表性橫截面區(qū)域內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著改變?；蛘?，各種植物器官如葉子和芽的大小也與Taylor等人(1995)對(duì)擬南芥描述的明顯不同。
            
或者，通過(guò)在PCR中使用例如素或放射性標(biāo)記的核苷酸，使用表9中列出的各種正向和反向HD-Zip CODEHOP PCR引物來(lái)擴(kuò)增標(biāo)記的DNA序列。然后用該標(biāo)記的HD-ZipIII序列經(jīng)由核酸雜交篩選cDNA或基因組植物克隆庫(kù)。然后分離出與標(biāo)記的PCR所擴(kuò)增的各種HD-Zip序列正向雜交的克隆物，并通過(guò)DNA測(cè)序表征的各種DNA插入子，以鑒別HD-ZipIII的編碼和非編碼序列。然后經(jīng)活體外操作該分離的HD-ZipIII基因的一些區(qū)域，以構(gòu)建基因抑制性轉(zhuǎn)基因，然后在轉(zhuǎn)基因植物中檢測(cè)該轉(zhuǎn)基因，以鑒定具有與REVOLUTA相同的功能即可調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂的功能的各種HD-ZipIII基因。
            
從蕃茄中鑒別和分離REVOLUTA使用由上述Codehops程序產(chǎn)生的各種引物來(lái)鑒定蕃茄REV基因。如上述實(shí)施例1所述從50mg幼番茄(Lycopersicam esculantum)葉中分離出基因組DNA。使用實(shí)施例3中所述的條件進(jìn)行PCR，擴(kuò)增1微升的DNA。使用下列引物稻米A2F，GGAGAGGGTGTACTGCGAGTGYCCNAARCC[SEQ ID NO61]和蕃茄J1R，CAGCAGAATAAGCATCAACATTATAATCNGCCCAYT[SEQ ID NO162]。給產(chǎn)物測(cè)序，鑒別出可編碼與Rev-1蛋白質(zhì)具有84％同一性和94％相似性的蛋白質(zhì)的基因組克隆(SEQ ID NO163)。該蕃茄Rev蛋白質(zhì)顯示的編碼區(qū)域和氨基酸序列分別是SEQ ID NO164和SEQ ID NO165。
            
進(jìn)一步的分析顯示，在蕃茄REV和其它擬南芥HD-ZipIII族成員之間的氨基酸水平具有明顯的同一性(見(jiàn)表10)。
            
表10蕃茄REV 
            
然后測(cè)試蕃茄REV，結(jié)果顯示，它基本上具有如上面所述的REVOLUTA功能。
            
從稻米中鑒別和分離REVOLUTA稻米R(shí)EV1.
            
將從基本上如上述分離的稻米(Oryza)葉DNA或從庫(kù)中得到的cDNA(Stratagene FL1041b)基本如上述用作PCR的模板。對(duì)稻米基因組DNA REV1克隆使用下列引物TG-cDNA，GTRAGTGCCCCATACTTGCT[SEQ ID NO165]；R25AS-J，GCCGTTCACGGCSTCRTTRAANCC[SEQ ID NO166]。為了分出REV1cDNA的5′末端，使用到下列各種引物對(duì)克隆載體R225特異性的引物，CGACGACTCCTGGAGTCCGTCAG[SEQ ID NO167]；和在該基因的編碼區(qū)的引物，TGTATCATTTGCCAGCGGAG[SEQ ID NO168]。在SEQ ID NO169(基因組)和SEQ ID NO170(cDNA)中發(fā)現(xiàn)稻米R(shí)ev1基因的核酸序列。稻米R(shí)ev1的氨基酸序列展示在SEQ ID NO171中。然后測(cè)試該稻米R(shí)ev1，測(cè)試結(jié)果顯示，它基本上具有如上面所述的REVOLUTA功能。
            
稻米R(shí)EV2使用上述稻米cDNA作為實(shí)施PCR的模板，在此PCR中使用的寡核苷酸如下稻米A2f[SEQ ID NO71]，GGAGAGGGTGTACTGCGAGTGYCCNAARCC；R10AS-K[SEQ ID NO]，GCAGCAGCATGGAGGCYTTNGCRCA。
            
基本上如上述進(jìn)行PCR，以分離出稻米R(shí)ev2的cDNA。在SEQ ID NO172上展現(xiàn)了稻米R(shí)ev2的核酸序列。在SEQ ID NO173上展現(xiàn)了稻米R(shí)ev2的氨基酸序列。然后測(cè)試該稻米R(shí)ev2，結(jié)果顯示，它基本上具有如上面所述的REVOLUTA功能。
            
實(shí)施例7玉米中細(xì)胞分裂的調(diào)節(jié)采用美國(guó)專利5712135中公開(kāi)的各種方法從發(fā)育中的玉米(Zea mays)種子中分離出0.1-1mm的合子的未成熟胚胎。用酶溶液II〔O.3％離析酶(Kinki Yakult，Nishinomiya，Japan)在CPW鹽中的溶液(Powell等人，1985，“植物細(xì)胞培養(yǎng)，一種實(shí)用的方法”，R.A.Dixon編輯，第3章)和10％甘露醇以及5mM 2-N-嗎啉代-乙磺酸(MES)，pH5.6〕處理新分離得到的胚胎進(jìn)行1-2分鐘。用該酶溶液培育1-2分鐘后，用N6aph溶液〔N6培養(yǎng)基的常量元素和微量元素(Chu等人，1975，Sci.Sin.Peking，18659)，補(bǔ)充了6mM天冬酰胺、12mM脯氨酸、1mg/l硫胺素-HCl、0.5mg/l煙堿酸、100mg/l酪蛋白水解物、100mg/l肌醇、30g/l蔗糖和54g/l甘露醇〕小心洗滌該胚胎。
            
洗滌后，將該胚胎培育在玉米電穿孔緩沖液EPM-NaCl中〔150mM NaCl，5mMCaCl2，10mM HEPES(N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸)和0.425M甘露醇，pH7.2〕。每個(gè)小杯200μl EPM-NaCl溶液中放入大約100個(gè)胚胎。每個(gè)小杯中再分別加入約20μg線性化的玉米HD-Zip蛋白質(zhì)-3質(zhì)粒DNA。此玉米HD-Zip蛋白質(zhì)-3質(zhì)粒(DNA)含有在SEQ ID NO107中展現(xiàn)的整個(gè)玉米蛋白質(zhì)-3多核苷酸序列的反向重復(fù)。該反向重復(fù)的玉米蛋白質(zhì)-3轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程是在玉米18kD的油質(zhì)蛋白啟動(dòng)子的控制下進(jìn)行(Qu等人，1990，J.Biol.Chem.，2652238-2243)。此外，該玉米HD-Zip蛋白質(zhì)-3質(zhì)粒還含有帶抗卡那霉素基因(neo)的嵌合體基因和在CaMV 35S3啟動(dòng)子(EP 359617)控制下的3′多聚A額外區(qū)域。
            
與該外植體一起培育1小時(shí)后，將小杯轉(zhuǎn)移到冰浴中。在冰中培育10分鐘后，如下進(jìn)行電穿孔從900μF的電容器中釋放場(chǎng)強(qiáng)為375V/cm的一個(gè)脈沖。該電穿孔裝置如Dekeyser等人(1990，Plant Cell，2591)所述。電穿孔完成后，立即將新配制的液體N6aph底物加到小杯內(nèi)的外植體中，之后在冰中再培育該外植體10分鐘。
            
然后，將胚胎轉(zhuǎn)移到Mah1 VII底物中〔含有常量元素和微量元素和維生素并補(bǔ)充了100mg/l酪蛋白水解物、6mM脯氨酸、0.5g/l MES、1mg/l 2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)和2％蔗糖并用0.75g/l MgCl2和1.6g/l植物凝膠(Sigma ChemicalCompany，St Louis，Mo.)固化的N6培養(yǎng)基，pH5.8〕，并補(bǔ)充0.2M甘露醇。2-3天后，將胚胎轉(zhuǎn)移到補(bǔ)充了200mg/l卡那霉素的相同底物中。大約14天后，將胚胎轉(zhuǎn)移到?jīng)]有甘露醇、但補(bǔ)充卡那霉素(200m/l)的Mah1 VII底物中。使胚胎在這種選擇性底物中進(jìn)一步傳代培養(yǎng)約2個(gè)月，傳代培養(yǎng)的時(shí)間間隔約為3周。之后小心地分離出誘導(dǎo)的胚胎發(fā)生組織，將其轉(zhuǎn)移到補(bǔ)充了5mg/l 6-芐基氨基嘌呤或5mg/l玉米素的MS培養(yǎng)基中(Murashige等人，1962，Physicol.Plant，15473-497)。使該胚胎發(fā)生組織維持在此培養(yǎng)基中約14天，接著轉(zhuǎn)移到?jīng)]有激素和含3-6％蔗糖的MS培養(yǎng)基中。將發(fā)育芽轉(zhuǎn)移到含有1.5％蔗糖的1/2MS培養(yǎng)基中，以使其進(jìn)一步發(fā)育成正常的小植株。將這些小植株轉(zhuǎn)移到土壤中，并在溫室中種植。
            
通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)化植株中的玉米籽粒的大小和未轉(zhuǎn)化的對(duì)照植株中的玉米籽粒的大小進(jìn)行比較，測(cè)定植物細(xì)胞分裂的調(diào)節(jié)狀況。具體而言，轉(zhuǎn)基因植株的谷粒中胚胎由于細(xì)胞數(shù)目增加而大小增加。參考Scott等人(1998，Development，1253329-41)和Ingram等人(1999，Plant Mol.Biol.，40343-54)的方法，測(cè)定玉米胚胎的大小和發(fā)育狀況，特別要注意細(xì)胞的數(shù)目。
            
實(shí)施例8玉米根芽體細(xì)胞分裂的調(diào)節(jié)情況如美國(guó)專利5,780,708所述制備胚胎發(fā)生玉米愈傷組織系。使玉米愈傷組織傳代培養(yǎng)7-12天，再進(jìn)行微粒轟擊處理。如下培養(yǎng)用于轟擊的玉米愈傷組織。將5塊(每塊濕重約為50mg)愈傷組織以交叉方式放在無(wú)菌的60×15mm佩特里培養(yǎng)平皿(Falcon 1007)的中心。在整個(gè)轟擊過(guò)程中，平皿都保存在蓋有濕紙巾的容器中。
            
用兩種質(zhì)粒DNA分子的混合物轉(zhuǎn)化玉米愈傷組織。pHD-Zip-invp-1含有稻米肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子和3′nos聚腺苷酸化附加序列區(qū)域。多核苷酸序列SEQ IDNO103的反向重復(fù)可在稻米肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(Wang等人，1992，Mol.Cell.Biol.，123399-3406)和胭脂堿合酶(nos)多聚A序列(Chilton等人，1983)之間插入。pHYGI1是含有潮霉素編碼序列(Gritz等人，1983，Gene，25179-188)和增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因在轉(zhuǎn)基因植物中的蛋白質(zhì)表達(dá)的玉米AdhIS內(nèi)含子序列的質(zhì)粒(美國(guó)專利5780708)。
            
采用完全如Klein等人(1988，Bio/Technology，6559-563)所述的方法，將pHD-Zip-invp-1質(zhì)粒DNA和pHYGI1包涂到M-10鎢顆粒(Biolistics)，除了(i)使用的DNA的量是所提及的兩倍；(ii)在0℃將DNA沉積到顆粒上；(iii)含有包涂了DNA的鎢顆粒的試管在整個(gè)轟擊過(guò)程中都被保存在冰中。
            
所有的試管含有25μl的50mg/ml M-10鎢的水溶液、25μl的2.5M CaCl2和10μl、100mM的硫胺以及總共5μl、1mg/ml的質(zhì)粒DNA。上述各質(zhì)粒DNA存在的量是2.5μl。
            
所有的試管都在冰中培養(yǎng)10分鐘，在室溫下用Eppendorf離心機(jī)離心5秒鐘，使這些顆粒沉積，去除25μl上清液。在轟擊過(guò)程中將試管保存在冰中。所用的各沖擊用制品的轟擊次數(shù)不超過(guò)5次。
            
從Biolistics Inc.(Ithaca，N.Y.)獲得微粒和終止平皿。如供應(yīng)廠商所述，它們是無(wú)菌的。從Biolistics，Inc.獲得微粒轟擊設(shè)備。
            
將樣品平皿盤放在微粒設(shè)備的終止平皿盤的底部下5cm處，該終止平皿位于最接近簡(jiǎn)體的狹槽處。將如上面所述制備的愈傷組織平皿放在該樣品平皿盤的中心，并且移走該培養(yǎng)平皿的蓋。在該開(kāi)放的圓盤上放置由鍍鋅鋼制成的7×7cm方形的剛性絲網(wǎng)目大小為3×3mm，以便在轟擊過(guò)程中保留住組織。如Biolistics，Inc.所述用超聲波處理鎢/DNA制品，用移液管將2.5μl懸浮液加到用于各次轟擊的大粒子的頂部。根據(jù)制造商所述操作該儀器。
            
在所有的樣品轟擊完成后，立即將經(jīng)pHYGI1和pHD-Zip-invp-1質(zhì)粒DNA處理的所有平板中的愈傷組織以平板對(duì)平板的方式轉(zhuǎn)移到含有15mg/l潮霉素B的F-培養(yǎng)基上(每個(gè)平板10塊愈傷組織)。這些平板稱為第1輪篩選平板。將經(jīng)T.E.處理的平板得到的愈傷組織轉(zhuǎn)移到不加潮霉素的F-培養(yǎng)基上。每隔2-3周在非選擇性培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)這種組織，將這種組織稱為未選擇性對(duì)照愈傷組織。
            
經(jīng)過(guò)約14天的選擇后，在選擇性和非選擇性培養(yǎng)基上組織的表現(xiàn)基本上相同。將從經(jīng)pHYGI1/pHD-Zip-invp-1轟擊的平板和一個(gè)經(jīng)T.E.處理的平板得到的所有愈傷組織，從第1輪篩選平板轉(zhuǎn)移到含有60mg/l潮霉素的第2輪篩選平板中。第2輪選擇平板各含有10塊愈傷組織，每塊30mg，結(jié)果導(dǎo)致平板總數(shù)的增加。
            
在第2輪選擇平板上培養(yǎng)大約21天后，將所有的材料轉(zhuǎn)移到含有60mg/l潮霉素的第3輪選擇平板上。轟擊后大約79天，檢查第3輪選擇平板上的愈傷組織的可生存的部分。在經(jīng)pHYGI1/pHD-Zip-invp-1處理的平板上的壞死組織的背景上切下愈傷組織的可生存部分，將其轉(zhuǎn)移到?jīng)]有潮霉素的的F-培養(yǎng)基中。
            
在沒(méi)有潮霉素的F-培養(yǎng)基中培養(yǎng)大約20天后，將該轉(zhuǎn)化的愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有60mg/l潮霉素的F-培養(yǎng)基中。該轉(zhuǎn)化的愈傷組織在60mg/l潮霉素的存在下在多次傳代培養(yǎng)中均能維持生長(zhǎng)。轉(zhuǎn)化的愈傷組織的確認(rèn)為了顯示經(jīng)pHYGI1/pHD-Zip-invp-1處理的愈傷組織獲得了抗潮霉素基因，從能持續(xù)在存在60mg/l潮霉素的條件下生長(zhǎng)的愈傷組織和未選擇的對(duì)照愈傷組織中分離出基因組DNA，并采用Southern印跡法進(jìn)行分析。為從愈傷組織中分離出DNA，使2g愈傷組織在液氮中冷凍，將其研磨成細(xì)粉末，然后將其轉(zhuǎn)移到含有6ml抽提緩沖液(7M脲、250mM NaCl、50mM pH為8.0的Tris-HCl、20mM pH為8.0的EDTA、1％肌氨酸)的30ml Oak Ridge試管中。將7ml 1∶1的苯酚∶氯仿加到此混合液中，搖動(dòng)該試管，并在37℃培養(yǎng)15分鐘。在4℃以8K的速率離心樣品10分鐘。使用miracloth(Calbiochem 475855)將上清液轉(zhuǎn)移到含有1ml、4.4M乙酸銨(pH5.2)的一次性15ml試管(American Scientific Products，C3920-15A)中。加入6ml異丙醇，搖動(dòng)該試管，然后在-20℃培養(yǎng)該樣品15分鐘。在Beckman TJ-6離心機(jī)中以最大速率離心15分鐘，使該DNA沉積。棄去上清液，將沉積物溶解在500μl TE-10(10mM pH為8.0的Tris-HCl，10mM pH為8.0的EDTA)中在室溫下15分鐘。將樣品轉(zhuǎn)移到1.5ml的Eppendorf試管中，加入100μl、4.4M、pH5.2的乙酸銨和700μl異丙醇。在-20℃培養(yǎng)此溶液15分鐘，然后以Eppendorf微離心機(jī)處理(12,000rpm)5分鐘，使DNA沉積。用70％乙醇洗滌該沉積物，干燥，再懸浮于TE-1(10mM、pH8.0的Tris-HCl和1mM EDTA)中。
            
使用限制性內(nèi)切酶消化10μg分離的DNA，然后用從pHD-Zip-invp-1質(zhì)粒和pHYGI1質(zhì)粒得到的探針進(jìn)行Southern Blot雜交分析。在0.8％w/v瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，電泳所用溶液為TAE緩沖液(40mM、pH7.6的Tris-乙酸鹽、1mMEDTA)，電壓為15V，時(shí)間為16小時(shí)。將凝膠上的NDA條帶轉(zhuǎn)移到Nytran膜(Schleicher and Schuell)上。根據(jù)制造商的建議進(jìn)行轉(zhuǎn)移、雜交和洗滌。從經(jīng)玉米HD-Zip-invp-1轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化的具有潮霉素抗性的愈傷組織中抽提得到的DNA樣品都具有特異地與HD-Zip-invp-1雜交探針雜交的DNA片段。在從對(duì)照愈傷組織中得到的DNA樣品中則沒(méi)有觀察到雜交信號(hào)。
            
植物再生和種子的產(chǎn)生直接將含有60mg/l潮霉素的平板中的轉(zhuǎn)化的愈傷組織的部分轉(zhuǎn)移到含有MS基本鹽類(Murashige等人，1962)、補(bǔ)充了0.5mg/l硫胺-HCl、0.75mg/2，4-D、50g/l蔗糖、150mg/l天冬酰胺和2.5g/l Gelrite(Kelco Inc.，San Diego)的RM5培養(yǎng)基(Murashige等人，1962)中。
            
在RM5培養(yǎng)基中培養(yǎng)約14天后，將大多數(shù)轉(zhuǎn)化的愈傷組織和未選擇的對(duì)照愈傷組織轉(zhuǎn)移到R5培養(yǎng)基(RM5培養(yǎng)基，除去2，4-D)中。在26℃將平板放在無(wú)光處培養(yǎng)約7天，然后將它們轉(zhuǎn)移到見(jiàn)光處，以見(jiàn)光培養(yǎng)14小時(shí)、無(wú)光培養(yǎng)10小時(shí)的輪換方式在26℃培養(yǎng)約14天。此時(shí)，將已形成的小植株轉(zhuǎn)移到一個(gè)含有100mlR5培養(yǎng)基的1夸脫罐(Ball)中。將植株從罐子轉(zhuǎn)移到蛭石中約7或8天，再移植到土壤中并讓它們生長(zhǎng)至成熟。。從轉(zhuǎn)化的愈傷組織中長(zhǎng)出約40株植株，從對(duì)照愈傷組織(未轉(zhuǎn)化的對(duì)潮霉素敏感性愈傷組織)中長(zhǎng)出約10株。
            
使用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)，對(duì)玉米MBS501近交系(Mike Brayton Seeds)和FR4326近交系(Illinois Foundation Research)進(jìn)行成熟的轉(zhuǎn)化植株的人工授粉。在授粉后約45天收獲種子，使其進(jìn)一步干燥1-2周。
            
R1子代的分析進(jìn)行PCR分析，測(cè)試R1子代植株中HPT和pHD-Zip-invp-1轉(zhuǎn)基因序列的存在。為了進(jìn)行PCR試驗(yàn)，分別各從植株組織中取得0.1g樣品，在液氮中冷凍保存。然后在40℃在200μl、0.1M的Tris-HCl、0.1M NaCl、20mM EDTA、1％、pH8.5的Sarkosyl中使用120粒度的金剛砂研磨該樣品。接著進(jìn)行苯酚/氯仿抽提和乙醇與異丙醇沉淀處理，然后將樣品懸浮在T.E.中，通過(guò)PCR進(jìn)行分析(K.B.Mullis，美國(guó)專利4,683,202)。
            
在體積為100μl的50mM KCl、10mM Tris-HCl(pH8.4)、3mM MgCl2、100μg/ml明膠、0.25μM的各種適當(dāng)?shù)囊铩?.2mM的各種脫氧核苷三磷酸鹽(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、2.5單位的Taq DNA聚合酶(Cetus)和10μl的DNA制品的溶液中進(jìn)行PCR。用礦物油覆蓋該混合物，加熱到94℃3分鐘，然后擴(kuò)增35輪，每輪55℃1分鐘、72℃1分鐘、94℃1分鐘。然后在55℃培養(yǎng)該混合物2分鐘，在72℃培養(yǎng)5分鐘。使用10μl的PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，并使用溴乙錠染色以使其顯現(xiàn)出來(lái)。
            
對(duì)于潮霉素-B磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPT)基因的存在的進(jìn)行分析，使用到與CaMV 35S啟動(dòng)子互補(bǔ)的PCR引物和與該HPT編碼序列互補(bǔ)的PCR引物。因而，為了產(chǎn)生適當(dāng)大小的PCR產(chǎn)物，該HPT模板DNA必須含有鄰接的CaMV 35S啟動(dòng)子區(qū)域、Adhl內(nèi)含子和5′蛋白質(zhì)HPT編碼序列區(qū)域。對(duì)于玉米HD-Zip蛋白質(zhì)-1反向重復(fù)轉(zhuǎn)基因的存在進(jìn)行分析，使用到與該HD-Zip蛋白質(zhì)-1反向重復(fù)區(qū)域內(nèi)的序列互補(bǔ)的PCR引物。
            
與玉米HD-Zip蛋白質(zhì)-1反向重復(fù)轉(zhuǎn)基因純合的R1子代植株，表現(xiàn)出由內(nèi)源HD-Zip蛋白質(zhì)-1功能的轉(zhuǎn)基因抑制作用引起的植物形態(tài)學(xué)表型。野生型HD-Zip蛋白質(zhì)-1功能的可喪失引起玉米細(xì)胞分裂的調(diào)節(jié)作用。調(diào)節(jié)的細(xì)胞分裂表型可產(chǎn)生其葉子較大并含有更多細(xì)胞的轉(zhuǎn)化植株。按Talbert等人(1995，Development，1212723-35)所述測(cè)定莖和葉中的細(xì)胞數(shù)量。
            
實(shí)施例9稻米種子中細(xì)胞分裂的調(diào)節(jié)作用對(duì)稻米栽培品種日本裸種(Nipponbare)的脫殼的成熟種子經(jīng)表面滅菌處理，將它們放到2N6固體培養(yǎng)基〔N6培養(yǎng)基(Chu等人，1975，Sci.Sin.Peking，18659)，補(bǔ)充了0.5mg/ml煙堿酸、0.5mg/l吡哆醇-HCl、1.0mg/l硫胺-HCl、2.0mg/l2，4-D、30g/l蔗糖和2.0g/l植物凝膠，pH為5.8〕上，在27℃的暗處培育。在3-4周內(nèi)，愈傷組織從胚胎的盾板中長(zhǎng)出。將原生愈傷組織的胚胎發(fā)生部分轉(zhuǎn)移到N67培養(yǎng)基〔N6培養(yǎng)基(Chu等人，1975，Sci.Sin.Peking，18659)，補(bǔ)充了0.5mg/l煙堿酸、0.5mg/l吡哆醇-HCl、1.0mg/l硫胺-HCl、2.0g/l酪蛋白氨基酸(維生素試驗(yàn)，Difco)、1.0mg/l 2，4-D、0.5mg/l 6-芐基氨基嘌呤、20g/l蔗糖、30g/l山梨糖醇和2.0g/l植物凝膠，pH為5.8〕中，以使其繁殖成致密的胚胎發(fā)生愈傷組織。
            
傳代培養(yǎng)后約3-4周，使用稻米基因組HD-Zip gp-1質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化該胚胎發(fā)生愈傷組織。將愈傷組織切成最大長(zhǎng)度約為1.5-2mm的片段。在EPM(5mM CaCl2、10mM HEPES和0.425M甘露醇)中洗滌這些愈傷組織塊兩次，然后在室溫(25℃)下，使這些愈傷組織塊在該緩沖液中質(zhì)壁分離預(yù)處理30分鐘-3小時(shí)。然后用EPM-KCl(EPM緩沖液加80mM KCl)洗滌這些愈傷組織片，然后將其轉(zhuǎn)移到電穿孔處理小杯中。在各個(gè)杯中加入150-200mg的愈傷組織片和100-200μl EPM-KCl。每個(gè)杯中再加入10-20μg質(zhì)粒DNA，或?yàn)榄h(huán)狀的pHD-Zip-asgp-1，或?yàn)榫€狀的pHD-Zip-asgp-1都可以。pHD-Zip-asgp-1是含有反義HD-Zip-蛋白質(zhì)-1轉(zhuǎn)基因的質(zhì)粒，它受到稻米肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制(Wang等人，1992)。反義HD-Zip-gp-1轉(zhuǎn)基因含有從在SEQ ID NO115中展示的稻米基因組DNA(實(shí)施例3)克隆得到的多核苷酸序列。pHD-Zip-asgp-1質(zhì)粒還含有含受CaMZ 35S3啟動(dòng)子(見(jiàn)歐洲專利出版(“EP”)359617〕控制的bar基因的嵌合型基因。該bar基因(見(jiàn)EP242236)可編碼產(chǎn)生具有對(duì)除草劑膦絲菌素抗性的膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶。這種嵌合型bar轉(zhuǎn)基因含有膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶編碼序列和葉綠體靶向運(yùn)送序列。
            
在室溫下將該DNA與愈傷組織片一起培育約1小時(shí)。然后如實(shí)施例4所述進(jìn)行電穿孔處理。電穿孔后，將沒(méi)有酪蛋白氨基酸的N67液體培養(yǎng)基加到愈傷組織片中。然后將這些愈傷組織片放到?jīng)]有酪蛋白氨基酸但補(bǔ)充了5、10或20mg/l的膦絲菌素(PPT)的N67固體培養(yǎng)基中，在27℃、16小時(shí)見(jiàn)光/8小時(shí)無(wú)光的輪換條件下在此選擇性培養(yǎng)基上培育約4周。分離發(fā)育的PPT-抗性愈傷組織，使它們?cè)跊](méi)有酪蛋白氨基酸但含有5mg/l PPT的新配制N67培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)約2-3周。之后，將經(jīng)挑選的PPT-抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到補(bǔ)充了5mg/l PPT的再生培養(yǎng)基N6M25〔N6培養(yǎng)基(Chu等人，1975)，補(bǔ)充了0.5mg/l煙酸、0.5mg/l吡哆醇-HCl、1.0mg/l硫胺-HCl、288mg/l天冬氨酸、174mg/l精氨酸、7.0mg/l甘氨酸、1.0mg/l O-萘乙酸(NAA)、5.0mg/l激動(dòng)素、20g/l蔗糖和2.0g/l植物凝膠，pH5.8〕中。在大約1個(gè)月內(nèi)生長(zhǎng)出小植株，然后將這些小植株轉(zhuǎn)移到不含激素的N6培養(yǎng)基〔(Chu等人，1975)補(bǔ)充了0.5mg/l煙酸、0.5mg/l吡哆醇-HCl、1.0mg/l硫胺-HCl、1.0g/l酪蛋白氨基酸、20g/l蔗糖和2.0g/l植物凝膠，pH5.8〕中，使它們?cè)诖伺囵B(yǎng)基上再生長(zhǎng)2-3周，然后將它們轉(zhuǎn)移到土壤中，并在溫室中培育。
            
轉(zhuǎn)化的稻米植株的特征在土壤中培育上述轉(zhuǎn)化的稻米植株，直到種子形成并成熟。將該轉(zhuǎn)化植株的后代的種子播種在含有70mg/l潮霉素的400倍Homai水合物(Kumiai Kagaku Inc.)水溶液中，并在25℃在此溶液中培育10天，由此選出對(duì)潮霉素具有抗性的植株。播種轉(zhuǎn)化植株的后代的植株的種子各20粒，并培育約3周。從潮霉素抗性R1代植株收集到葉子，將其與從使用上述方法再生但不含有反義HD-Zip-asgp-1轉(zhuǎn)基因的稻米植株中收集到的葉子作比較。從pHD-Zip-asgp-1轉(zhuǎn)化的植株收集到的葉子表現(xiàn)出經(jīng)過(guò)調(diào)節(jié)的細(xì)胞分裂，表現(xiàn)為稻米葉子的尺寸增加。
            
采用Southern雜交技術(shù)分析轉(zhuǎn)化和非轉(zhuǎn)化植株，其中，植株基因組DNA被消化，并使用pRiceHD-Zip-gp-1 DNA探測(cè)。雜交數(shù)據(jù)表明，顯示細(xì)胞分裂調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)基因植株含有至少一部分pRiceHD-Zip-gp-3質(zhì)粒DNA的副本被整合到稻米基因組中。
            
實(shí)施例10稻米莖的細(xì)胞分裂的調(diào)節(jié)作用樣品培養(yǎng)組織的制備制備從日本產(chǎn)稻米(Oryza sativa L.)的變種Koshihikari得到的盾片愈傷組織，將其用于采用Hiei等人(1994；美國(guó)專利5,591,616)的方法進(jìn)行的根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumifaciens)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化過(guò)程中。將稻米的成熟種子浸入70％乙醇中1分鐘，然后浸入1％次氯酸鈉溶液中30分鐘，進(jìn)行無(wú)菌處理。然后將這些種子放到2N6固體培養(yǎng)基〔無(wú)機(jī)鹽類和N6的維生素(Chu，1978，Proc.Symp.PlantTissue Culture，Science Press Keking，pp.43-50)，1g/l酪蛋白氨基酸、2mg/l 2，4-D、30g/l蔗糖、2g/l Gelrite〕。培育這些成熟的種子約3周后，從盾片萌發(fā)出生長(zhǎng)型愈傷組織。將這種盾片愈傷組織轉(zhuǎn)移到2N6培養(yǎng)基培育4-7天。將所得的愈傷組織用作“盾片愈傷組織”樣品。
            
將從盾片萌生的愈傷組織轉(zhuǎn)移到AA液體培養(yǎng)基〔AA的主要無(wú)機(jī)鹽類、AA的氨基酸類和AA的維生素類(Toriyama等人，1985，Plant Science，41179-183)、MS次要的鹽類(Murashige等人，1962，Physiol.Plant.，15473-497)、0.5g/l酪蛋白氨基酸、1mg/l 2，4-D、0.2mg/l激動(dòng)素、0.1mg/l赤霉素和20g/l蔗糖)中，在25℃、無(wú)光條件下在此培養(yǎng)基中培育這些細(xì)胞，同時(shí)以120rpm搖動(dòng)，以獲得懸浮的培養(yǎng)細(xì)胞。每周用新配制的培養(yǎng)基替換原先的培養(yǎng)基。
            
Ti質(zhì)粒(雙重載體)使用下述反向重復(fù)稻米HD-Zip蛋白質(zhì)-1轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)替換CaMV 35S啟動(dòng)子/Gus/nos多聚A轉(zhuǎn)基因，從而改變pTOK232(Hiei等人，1994)的T-DNA區(qū)域。SEQID NO121公開(kāi)了在實(shí)施例3中獲得的稻米cDNA插入子的DNA序列。在稻米肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子區(qū)域和胭脂堿合酶多聚A附加序列之間插入SEQ ID NO121的反向重復(fù)序列。這種改變的pTOK232質(zhì)粒是雙重轉(zhuǎn)化載體，稱為pTOKivr-HD-Zip-p1。
            
將具有被刪去T-DNA區(qū)域的Ti質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium)LBA4404株用作稻米轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)菌。LBA4404菌株具有輔助質(zhì)粒PAL4404(具有完整的vir區(qū))，可從American Type Culture Collection(ATCC 37349)獲得。采用Ditta等人(1980，Proc，Natl.Acad.Sci.USA，777347-7351)的三元雜交法將雙重載體pTOKivr-HD-Zip-p1導(dǎo)入LBA4404菌株。
            
用鉑環(huán)收集培養(yǎng)于含有潮霉素(50μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml)的AB培養(yǎng)基(Drlica等人，1974，Proc.Nail.Acad.Sci.USA，713677-3681)上3-10天的pTOKivr-HD-Zip-p1根癌農(nóng)桿菌株的菌落，將其懸浮在改良的AA培養(yǎng)基(其組分與上述AA培養(yǎng)基相同，但蔗糖和葡萄糖的濃度分別改為0.2M和0.2M，并加入100μM乙酰丁香酮，pH5.2)中。將細(xì)胞數(shù)調(diào)整到3×109-5×109細(xì)胞/毫升，并將該懸浮液用于稻米愈傷組織的接種。
            
接種條件用無(wú)菌水洗滌稻米盾片愈傷組織，然后將它們浸入上述根癌農(nóng)桿菌的懸浮液中3-10分鐘。還用不含有雙重載體的LBA4404菌株進(jìn)行培育，其作為陰性對(duì)照。在含有濃度與上述相同的乙酰丁香酮、葡萄糖和蔗糖的2N6固體培養(yǎng)基中，在25℃、無(wú)光的條件下培育該共培育盾片愈傷組織樣品2-5天。然后用含有250mg/l頭孢噻肟的無(wú)菌水洗滌所得到的接種組織，之后繼續(xù)在含有250mg/l頭孢噻肟的前述2N6固體培養(yǎng)基中培育。
            
轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和組織的選擇將已與根癌農(nóng)桿菌株培育3天的盾片愈傷組織培育在含有250mg/l頭孢噻肟的2N6培養(yǎng)基中約1周。通過(guò)在含有50mg/l潮霉素的2N6培養(yǎng)基中培育該培養(yǎng)組織3周，篩選出具有潮霉素抗性的培養(yǎng)組織(初級(jí)選擇)。將所獲得的抗性組織進(jìn)一步培養(yǎng)在含有50mg/l潮霉素的N6-12培養(yǎng)基(N6無(wú)機(jī)鹽類、N6維生類、2g/l酪蛋白氨基酸、0.2mg/l 2，4-D、0.5mg/l 6BA、5mg/l ABA、30g/l山梨糖醇、20g/l蔗糖和2g/l Gelrite)中約2-3周(次級(jí)選擇)，然后將在此培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有0、20或50mg/l潮霉素的植物再生培養(yǎng)基N5S3中。在與根癌農(nóng)桿菌共培育后所使用到的所有培養(yǎng)基中都加入250mg/l頭孢噻肟。在25℃、連續(xù)照明(約2000lux)的條件下在N6S3培養(yǎng)基上培育愈傷組織。最后將再生的植株轉(zhuǎn)移到罐裝的土壤中，使它們?cè)跍厥抑谐砷L(zhǎng)成熟。
            
將轉(zhuǎn)化植株的后代的種子播種在含有70mg/l潮霉素的400倍Homai水合物(Kumiai Kagaku Inc.)水溶液中，并在25℃下培育10天，由此選擇出對(duì)潮霉素具有抗性的植株。播種20粒轉(zhuǎn)化植株的后代的各植株的種子，并培育約3周。從轉(zhuǎn)化了HD-Zip蛋白質(zhì)-1反向重復(fù)轉(zhuǎn)基因的籽苗和未轉(zhuǎn)化的對(duì)照植株中收集葉子。在轉(zhuǎn)化植株中因?yàn)檗D(zhuǎn)基因誘導(dǎo)了細(xì)胞分裂的調(diào)節(jié)過(guò)程而其葉子中的細(xì)胞數(shù)量增加。采用Talbert等人(1995，Development，1212723-35)所述的方法測(cè)定葉子中細(xì)胞的數(shù)量。
            
還采用Southern印跡雜交法對(duì)轉(zhuǎn)化和非轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行分析，將植株的基因組DNA消化，然后用pRiceHD-Zip-p-1 DNA探測(cè)。雜交數(shù)據(jù)顯示，具有細(xì)胞分裂的調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)基因植株含有整合到稻米基因組pRiceHD-Zip-p-1的一個(gè)拷貝的至少一部分。
            
實(shí)施例835S花椰菜花葉病毒啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的REVOLUTA基因的有義表達(dá)使用引物AAGGTACCAAGTTCGACGGAGAAGGTGA[SEQ ID NO53]和AAGGATCCTGTAGAGAGAGACTGGTGATTTCAG[SEQ ID NO54]進(jìn)行PCR，從pHomer102質(zhì)粒擴(kuò)增出可編碼大約900bp的35S花椰菜花葉病毒啟動(dòng)子的DNA片段。對(duì)從獨(dú)立的PCR反應(yīng)得到的克隆測(cè)序，以證實(shí)該P(yáng)CR擴(kuò)增作用的精確度?？紤]到包括該擴(kuò)增的35S啟動(dòng)子的900bp的Kpn1-BamH1片段的分離，在該組PCR引物中包括了Kpn1和BamH1限制性位點(diǎn)。在克隆體NO84中REV基因組序列的5′端中的Kpn1和Bam H1位點(diǎn)插入此Kpn1-BamH1片段，以產(chǎn)生在距35S啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)大約70bp的下游處連接的NO REV基因。該REV基因的3′端位于下述REV編碼區(qū)域的下游。
            
如上面所述，NO84是含有從NO生態(tài)型植株中分離得到的REVOLUTA的基因組DNA序列的一個(gè)克隆體。使用引物HDALAAAATGGAGATGGCGGTGGCTAAC[SEQ ID NO33]和HDARTGTCAATCGAATACACAAAAGACCA[SEQ ID NO34]進(jìn)行長(zhǎng)距離PCR，擴(kuò)增該REV NO84基因，擴(kuò)增條件基本上如上面所述，但各變性步驟在94℃進(jìn)行，并且在總共40輪循環(huán)中的第10輪后，每輪延長(zhǎng)20秒鐘。
            
為了將3′聚腺苷酸化信號(hào)克隆到該基因的末端，使用下列各種寡核苷酸(5′引物包括NotI位點(diǎn)TTGCGGCCGCTTCGATTGACAGAAAAAGACTAATTT[SEQID NO51]；3′引物包括ApaI和KpnI位點(diǎn)TTGGGCCCGGTACCCTCAACCAACCACATGGAC[SEQ ID NO52]進(jìn)行PCR，擴(kuò)增起始于鄰近終止密碼子下游的Columbia REV的0.7kb長(zhǎng)的3′端。通過(guò)測(cè)序證明檢驗(yàn)各克隆體，結(jié)果是REV的3′區(qū)域位于載體的NotI和ApaI位點(diǎn)中的NO84REV編碼區(qū)域的下游。使用KpnI從原始載體中克隆出所得到的含有35S啟動(dòng)子、REV編碼區(qū)域和REV 3′區(qū)域的基因，并將其連接到pCGN1547 T-DNA載體中。
            
35S-REV基因的轉(zhuǎn)化用上述結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌At503株，并采用植物活體轉(zhuǎn)化程序用該菌株來(lái)轉(zhuǎn)化各種野生型No植株。
            
鑒定5個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)化系列的生長(zhǎng)表型。我們發(fā)現(xiàn)其葉子、莖和種子尺寸有所增加(圖10-12和表11)。不同系列的增長(zhǎng)程度不同。在種子增長(zhǎng)最大的系列，其種子大小是對(duì)照種子的接近2倍。
            
器官和種子增大的獨(dú)立轉(zhuǎn)基因系列的產(chǎn)生表明，CaMV35S-REV基因在各種植物中的表達(dá)導(dǎo)致了生長(zhǎng)增加。值得注意的是，各種CaMV35S-REV植株的表型并沒(méi)有顯示出rev突變體具有任何異常異常的花、空的軸和扭曲的葉子。因而，REV的有義表達(dá)有助于獲得具有有價(jià)值特征的各種作物植物。
            
本文將上述說(shuō)明書中所提及的所有出版物和專利的內(nèi)容納入作為參考。雖然已對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行了闡述和描述，但是應(yīng)該看到，在不偏離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍的情況下，可對(duì)本文作出各種改動(dòng)。
            
序列表DNA和蛋白質(zhì)序列擬南芥REVOLUTA SEQ ID NO1基于第2849位的ATG的18個(gè)外顯子的起始/末尾位置。
            
284930813390355236703743382239124004409941874300438344664542469747864860494250485132530653945582566857485834596860516388647765856663681268907045啟動(dòng)子的起始是+1GGGAACACTTAAAGTATAGTGCAATTGTATTCAAACTGACAAATTAATCATTAATTGTATTAGAAAATGATATATTGTCATCGTGACTAATTTGTCTTTTGAATTCAATTGTAACTACTAACTACTGGTTTTCATTTTTCAGATTATTTCTCGGTTCTTAAAAAGAAGAAAACACATACCTAATATCGTGTGTATCAAAAAGCCATGTGCGAGCAACCATCTTCCTTTGTAAATTTGACCCTTTTGTGTATCATTTATATCGAGTGTTTGTAATTGTTGGTTGATTTTGTGTTATTTGAGAGGCTAGTCATTTACGCAATTTCTAAATTTATCTTTTAGTACGTATCAAGATGTTGGAGCAACTGTGTCCAACATACATGACATGTGAAATTATAATTGTTAAAACAAAAGGACATGTGAAATTACTATCTACTTAAAGAAAAAAACCAGAAAGAAAAAAAGGTATTAAATTTGGAACTAAAAGAAGGTTAAAAAGTTTTTTACAGAAAGTAATTACACTTGCAGATGAAAGAAAAAAGGCAGCATCATGATATGTAAAAAATTGTCGAAGAGGTTTAGTCGTATCACTTTGTTTGACTGATCACTGTCTTCTGATTCATTTTTCAGTTTTTCTTTTTCAAATTGTAGCTCACAACATTAAAGTTATTCACTGCTTTAATCAGATAGTTTAATACTAGTAACTAGCTCATTTAGGCTTTAAACACCTCTTTCTGATTACTAGCCCACTCTTTGGTGGTTCTTACATATCACACCTAACTATACTGTGTATCCTTGAAGTGAAAATCAAATTTACCATTCGTATCTTACTTACATACACTATTATTTTTCCTTTTTTTTTTCACTCAAGGTCCTACTCTTTGATACCATAGCTATAATTTGGAAATAACTATTTACAGTGTATTAATTATACCTAAACAGTTTAATCTGGACTAAATATTTAGATAGATGTTACAAATTTGGTTCGTCTAATAAATGAAGACAAGACATGCTAACAAATAAAACACTACCACAAAGGGATAGTGAGAGAATGTGTTTTGCAACAAGACATAACTTTGATTGCTTGATGTGTTAAAATGATTATGTCAGAGACAGAGAGCGATCATAGGCTTTCTTTATTTCTAATAACGTCGATTTTCTTCTTCTTTTCTGGCGTTCAATAATGTCGAATTTTAATTCTTGATTTTTGCAACTCTAAATATCCTTAACGACATTGAAGCATGGTGCATGTCGATCGTTAATAATAAAGTTGAACAAAAATCTTGTTGAATTAATTACAAGCACAGCTTCAATAGCATAACTTTACGAGACGACCAGATCTTATAGACGAGTTTCGCTTTTACTTTTTTAATGATTAAAACTTTCATCGGAGAACATAAGTCTTCCTCTTAATTAAAATTACTACCCGTGCATAACTTCATTTTTTAAAACATCAATAATTAATATACGATTACAACCCTAAAAATTAGTCACCCTATAGTACATAACAATGATGATAGTTTTTTCTTTTTGGTGTAATGTTAAAATAAAATGTTAGCCATATTAAACGATAGTTCTTTTAACTTAGCCATTGTAAGATATTTCTTACTTTAGTTTTTCCGTAGAAGATATTCATTATGGTATGGATAGTATATACCTTAACTGAGTTTAAATATTGGATCAATACCATCTAATAACACATATCTGATGTTCAATACTTAATAATTTTGCATAAATGTTAAGCGTGACAACTTAAAAAAAAACACATCAACAGAGTAAAAACATATCTGTTAAATAAGAAAAATGTCATTTTTATAACACTTAAAAAAAAATGCATGAAGCGTTTCATAGTTTTTTTTTTTTTCAAAGTAATGTAGGCGTTAGATATTTCTTACAATTTTTTGAAAAATATTTTTTATGTTGTGATTGGCTGATATCAGGTAACTAAAACTTCTTTAAAGAATTGAAGAAAATTTGAAAAGTAAATAGATGGATTCCTATATTGTCATTTCAGAAAAACAGTAGGGACAACTTCGTAAATGATAGCCGTATTATTAAACAAATAAATTTAAATTAGAAAAAAGGAAAAAAACGCACCACTTTTCTTTTTCGCTGATGCACAGCTTGTCGGTTTGCGTGCAAATCCTCTGTTTCACAATTTTTTCTTCTTCTCTTTCTCTCTCTTCCTCTTTTATTCCTCTGTTCCAAAGTTCAGCAGAAGCAAACACACACATCACTTACTATCTCTCTCTCCTTCTTCACTTTCTCACATAACCAAACTCTCTCTTTCTCTCTTTTTTTTGAAGTCTCCTTTGAAACTATAATTGCCCTTTAGTGTTGTTCGTTCAGAGTCTTCAAAACTTTTGCAGCTTCAATTGTACCTGGGTTTCTTCTTCATTGTTCCTAAGGTTTCTGTGTCCTTCAATTCTTCTGATATAATGCTTCTTTAAGAGAGTTGACATCATCACTTTCTTGGGGTACTCTTCTCTGTTTCTCCCCAGAAAATCCAACTCTGTAATTTTGGGTCTTTATTCTGTTTTTCTCTTTGAAGAATCTTTAAAATTCTCAGATCTTCTGAATCTCTCTTCTTTAAAACTTTTTTTAACTTTATTTTTTGTACTCGCTTCTTTGCCTTCATTTTTCTCGTATCCACATGTCGTTGGTCTTTCGCTACAAGCCACGACCGTAGAATCTTCTTTTGTCTGAAAAGAATTACAATTTACGTTTCTCTTACGATACGACGGACTTTCCGAAGAAATTAATTTAAAGAGAAAAGAAGAAGAAGCCAAAGAAGAAGAAGAAGCTAGAAGAAACAGTAAAGTTTGAGACTTTTTTTGAGGGTCGAGCTAAAATGGAGATGGCGGTGGCTAACCACCGTGAGAGAAGCAGTGACAGTATGAATAGACATTTAGATAGTAGCGGTAAGTACGTTAGGTACACAGCTGAGCAAGTCGAGGCTCTTGAGCGTGTCTACGCTGAGTGTCCTAAGCCTAGCTCTCTCCGTCGACAACAATTGATCCGTGAATGTTCCATTTTGGCCAATATTGAGCCTAAGCAGATCAAAGTCTGGTTTCAGAACCGCAGGTATTGCTTCTCTTTAATATGGCCAGGATTAATTTTTAATTAAGGATTTTGAATTTGATTCTATTGGATTTAGTGTGTTATATTCAATGGATATGAAGGACCACTTTTGTTGTTATTTCAAGATTTGATGCTTCAATTCAATTCTCCGACACAATTTCCTGTTTTTACAAAAGGGTTCCTTTGAATCTGTCTGGTAGATTTGGTTATTCAATAGCTTGGTGTAACTGTTCTTGTGACGATATGGTTACTGTCTGATCTGGTGTCTAATCTTAGGAGTATTGTTGATTCGTTTTGTTGTGTGGTTTCAGGTGTCGAGATAAGCAGAGGAAAGAGGCGTCGAGGCTCCAGAGCGTAAACCGGAAGCTCTCTGCGATGAATAAACTGTTGATGGAGGAGAATGATAGGTTGCAGAAGCAGGTTTCTCAGCTTGTCTGCGAAAATGGATATATGAAACAGCAGCTAACTACTGTTGTATGTAACTTAACATTTCCTTTTGTCAAATGTGTTCTTAAAGAATCATTTGTTACTCCTATCAGTTCAACATGTAGCTTGAGTTATAAAGTTACTGACTTGTTGTTTTAACTTCAGGTTAACGATCCAAGCTGTGAATCTGTGGTCACAACTCCTCAGCATTCGCTTAGAGATGCGAATAGTCCTGCTGGGTAAAGTTTCATTTTTGGTTTTGAAGTAACCTTTTTCTAATCTTTTTTCTTTGCCTAATTGCTTGGTTTTGGTCTTAGATTGCTCTCAATCGCAGAGGAGACTTTGGCAGAGTTCCTATCCAAGGCTACAGGAACTGCTGTTGATTGGGTTCAGATGCCTGGGATGAAGGTTATACGCATCTCGTATCATTACTTAAGTGTTATTTTATCTGTTGATATCTATGGCAATATGTGAAATATTGAAATGTTGTGTGTTGTAGCCTGGTCCGGATTCGGTTGGCATCTTTGCCATTTCGCAAAGATGCAATGGAGTGGCAGCTCGAGCCTGTGGTCTTGTTAGCTTAGAACCTATGAAGGTAAGAAAGGGACACTCTTTTCGTTGCTAAAGATACAAGTCATAATGTTTCATTTTCAACCAGTTTGGGTTTTTTGTGTTCTTACAGATTGCAGAGATCCTCAAAGATCGGCCATCTTGGTTCCGTGACTGTAGGAGCCTTGAAGTTTTCACTATGTTCCCGGCTGGTAATGGTGGCACAATCGAGCTTGTTTATATGCAGGTGAATCCTTTAGCCTCTTCTGGTTTAGTTTTCTATCTCTAACACTTGAAGATGAATGAATAAAGTTGTGACATTTGTTCAGACGTATGCACCAACGACTCTGGCTCCTGCCCGCGATTTCTGGACCCTGAGATACACAACGAGCCTCGACAATGGGAGTTTTGTGGTATGCAGCTCTCATAATGTCTAGTGTTTACAGAAAAACTCTGGGATCTTGATGTTTTTCATATGTCTTTAAAAGGTTTGTGAGAGGTCGCTATCTGGCTCTGGAGCTGGGCCTAATGCTGCTTCAGCTTCTCAGTTTGTGAGAGCAGAAATGCTTTCTAGTGGGTATTTAATAAGGCCTTGTGATGGTGGTGGTTCTATTATTCACATTGTCGATCACCTTAATCTTGAGGTACTTAAATCTTCACATGTGGCATTTTGTGTGTGTTTTCAGGAATTTCTAGAAGAATTGATTATAAACATTTGTTCTTGCATTGTAGGCTTGGAGTGTTCCGGATGTGCTTCGACCCCTTTATGAGTCATCCAAAGTCGTTGC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LSGSGAGPNAASASQFVRAE MLSSGYLIRP CDGGGSIIHI VDHLNLEAWS VPDVL大麥基因組克體大麥2 SEQ ID NO97AGCTCTATCCACCGTCAGCAGTTGATCAGAGAGTGTCCTATTCTCTCCAACATTGAGCCTAAACAGATCAAAGTATGGTTTCAGAACCGAAGGTAATGATGATGCTAACACTCCTTATAATGCAGTTTTAGTGATTCTTTGATCAAAATCTTTTTATAAAAATTCAGATGCAGAGAGAAGCAAAGGAAAGAGGCTTCACGGCTTCAAGCGGTG大麥9 SEQ ID NO99AGCTCTATCCGCCGTCAGCAGTTGATCAGAGAGTGTCCTATTCTCTCCAACATTGAGCCTAAACAGATCAAAGTATGGTTTCAGAACCGAAGGTAATGATGATGCTAACACTCCTTATAATGCAGTTTTAGTGATTCTTTGATCAAAATCTTTTTATAAAAATTCAGATGCAGAGAGAAGCAAAGGAAAGAGGCTTCACGGCTTCGAGCGGTG大麥10 SEQ ID NO101AGCTCTATCCGCCGTCAGCAGTTGATCAGAGAGTGTCCTATTCTCTCCAACATTGAGCCTAAACAGATCAAAGTATGGTTTCAGAACCGAAGGTAATGATGATGCTAACACTCCTTATAATGCAGTTTTAGTGATTCTTTGATCAAAATCTTTTTATAAAAATTCAGATGCAGAGAGAAGCAAAGGAAAGAGGCTTCACGGCTTCAAGCGGTG內(nèi)含子外接的大麥2 SEQ ID NO127AGCTCTATCCACCGTCAGCAGTTGATCAGAGAGTGTCCTATTCTCTCCAACATTGAGCCTAAACAGATCAAAGTATGGTTTCAGAACCGAAGATGCAGAGAGAAGCAAAGGAAAGAGGCTTCACGGCTTCAAGCGGTG內(nèi)含子外接的大麥9 SEQ ID NO128AGCTCTATCCGCCGTCAGCAGTTGATCAGAGAGTGTCCTATTCTCTCCAACATTGAGCCTAAACAGATCAAAGTATGGTTTCAGAACCGAAGATGCAGAGAGAAGCAAAGGAAAGAGGCTTCACGGCTTCGAGCGGTG內(nèi)含子外接的大麥10 SEQ ID NO129AGCTCTATCCGCCGTCAGCAGTTGATCAGAGAGTGTCCTATTCTCTCCAACATTGAGCCTAAACAGATCAAAGTATGGTTTCAGAACCGAAGATGCAGAGAGAAGCAAAGGAAAGGGCTTCACGGCTTCAAGCGGTG大麥2蛋白質(zhì) SEQ ID NO98SSIHRQQLIRECPILSNIEPKQIKVWFQNRRCREKQRKEASRLQAV大麥9蛋白質(zhì) SEQ ID NO100SSIRRQQLIRECPILSNIEPKQIKVWFQNRRCREKQRKEASRLRAV大麥10蛋白質(zhì) SEQ ID NO102SSIRRQQLIRECPILSNIEPKQIKVWFQNRRCREKQRKEASRLQAV玉米基因組克隆玉米1 SEQ ID NO103AGCTCCGCGCGCAGGCAGCAGCTGCTACGCGAGTGCCCCATCCTCTCAAACATCGAGGCCAAGCAGATTAAAGTC玉米2 SEQ ID NO105AGCTCCGCGCGCAGGCAGCAGCTGCTACGCGAGTGCCCCATCCTCTCAAACATCGAGGCCAAGCAGATTAAAGTC玉米3 SEQ ID NO107ACCTCCTCCCGCAGGCAGCAATTGCTGCGTGAGTGCCCCACACTTGCTAACATTGAGCCCAAGCAGATCAAGGTC玉米7 SEQ ID NO109AGCTCCGCGCGCAGGCAGCAGCTGCTACGCGAGTGCCCCATCCTCTCAAACATCGAGGCCAAGCAGATTAAAGTC玉米8 SEQ ID NO111AGCTCCGCGCGCAGGCAGCAGCTGCTACGCGAGTGCCCCATCCTCTCAAACATCGAGGCCAAGCAGATTAAAGTC玉米9 SEQ ID NO113AGCTCCGCGCGCAGGCAGCAGCTGCTACGCGAGTGCCCCATCCTCTCAAACATCGAGGCCAAGCAGATTAAAGTC玉米蛋白質(zhì)1 SEQ ID NO104SSARRQQLLRECPILSNIEAKQIKV玉米蛋白質(zhì)2 SEQ ID NO106SSARRQQLLRECPILSNIEAKQIKV玉米蛋白質(zhì)3 SEQ ID NO108TSSRRQQLLRECPTLANIEPKQIKV玉米質(zhì)白質(zhì)7 SEQ ID NO110SSARRQQLLRECPILSNIEAKQIKV玉米蛋白質(zhì)8 SEQ ID NO112SSARRQQLLRECPILSNIEAKQIKV玉米蛋白質(zhì)9 SEQ ID NO114SSARRQQLLRECPILSNIEAKQIKV稻米基因組克隆稻米基因組1 SEQ ID NO115AGCTCGCTGCGGCGGCAGCAGCTGGTGCGGGAGTGCCCGGCGCTGGCGAACGTGGACCCGAAGCAGATCAAGGTGTGGTTCCAGAACCGCCGGTGCCGGGAGAAGCAGCGCAAGGAGTCGTCGCGGCTGCAGGCGCTC稻米基因組4 SEQ ID NO117AGCTCGCTGCGGCGGCAGCAGCTGGTGCGGGAGTGCCCGGCGCTGGCGAACGTGGACCCGAAGCAGATCAAGGTGTGGTTCCAGAACCGCCGGTGCCGGGAGAAGCAGCGCAAGGAGTCGTCGCGGCTGCAGGCGCTC稻米基因組10 SEQ ID NO119AGCTCGCTGCGGCGGCAGCAGCTGGTGCGGGAGTGCCCGGCGCTGGCGAACGTGGACCCGAAGCAGATCAAGGTGTGGTTCCAGAACCGCCGGTGCCGGGAGAAGCAGCGCAAGGAGTCGTCGCGGCTGCAGGCGCTC稻米基因組蛋白質(zhì)l SEQ ID NO116SSLRRQQLVRECPALANVDPKQIKVWFQNRRCREKQRKESSRLQAL稻米基因組蛋白質(zhì)4 SEQ ID NO118SSLRRQQLVRECPALANVDPKQIKVWFQNRRCREKQRKESSRLQAL稻米基因組蛋白質(zhì)10 SEQ ID NO120SSLRRQQLVRECPALANVDPKQIKVWFQNRRCREKQRKESSRLQAL稻米CDNA克隆稻米cDNA1 SEQ ID NO221TCCTCCCGCAGGCAGCAATTGCTGCGTGAGTGCCCCATACTTGCTAACATTGAGCCCAAGCAGATCAAGGTCTGGTTCCAGAACAGAAAGTGCCGGGATAAGCAGCGGAAGGAGTCTTCACGGCTTCAGGCTGTC稻米cDNA4 SEQ ID NO123TCCTCCCGCAGGCAGCAATTGCTGCGTAAGTGCCCCATACTTGCTAACATTGAGCCCAAGCAGATCAAGGTCTGGTTCCAGAACAGAAGGTGCCGGGATAAGCAGCGGAAGGAGTCTTCACGGCTTCAGGCTHTC稻米cDNA8 SEQ ID NO125TCCTCCCGCAGGCAGCAATTGCTGCGTAAGTGCCCCATACTTGCTAACATTGAGCCCAAGCAGATCAAGGTCTGGTTCCAGAACAGAAGGTGCCGGGATAAGCAGCGGAAGGAGTCTTCACGGCTTCAGGCTGTC稻米cDNA蛋白質(zhì)1 SED ID NO122SSRRQQLLRECPILANIEPKQIKVWFQNRKCRDKQRKESSRLQAV稻米cDNA蛋白質(zhì)4 SEQ ID NO124SSRRQQLLRKCPILANIEPKQIKVWFQNRRCRDKQRKESSRLQAV稻米cDNA蛋白質(zhì)8 SEQ ID NO126SSRRQQLLRKCPILANIEPKQIKVWFQNRRCRDKQRKESSRLQAV///REV基因產(chǎn)物的主要內(nèi)部區(qū)域擬南芥REV序列(SEQ.ID NO2的第123-146位氨基酸)GYMKQQLTTVVNDPSCESVVTTPQ(SEQ ID NO130)相應(yīng)的蕃茄REV序列GYMRQQLQSVTTDVSCESGVTTPQ(SEQ ID NO131)相應(yīng)的稻米R(shí)EV1序列AHMRQQLQNTPLANDTSCESNVTTPQ(SEQ ID NO132)相應(yīng)的稻米R(shí)EV2序列AYMKQQLQNPXLGNDTSXESNVTTPQ(SEQ ID NO133)擬南芥REV序列(SEQ ID NO2的第234-246位氨基酸)CRSLEVFTMFPAG(SEQ ID NO134)蕃茄REV序列CRNVEVITMFPAG(SEQ ID NO135)稻米R(shí)EV1序列CRNLEVFTMIPAG(SEQ ID NO136)稻米R(shí)EV2序列CRSLEVFTMFPAG(SEQ ID NO137)反向重復(fù)構(gòu)建物的引物例子REVIR-1 TTATCGATAGCTTTGCTTATCCGGGAAT  (SEQ ID NO138)REVIR-2 TTGCGGCCGCCTGACAAGCCATACCAGCAA(SEQ ID NO139)REVIR-3 TTGCGGCCGCAGTTCAACGTGTTGCAATGG(SEQ ID NO140)REVIR-4 TTGCATGCGCTAGCGTCGTCGCTTCCAAGTGAAT(SEQ ID NO141)REVIR-5 TTGTCGACCCGCGGAGCTTTGCTTATCCGGGAAT(SEQ ID NO142)REVIR-6 TTGATGCGCTAGCCTGACAAGCCATACCAGCAA (SEQ ID NO143)(SEQID NO144)反向重復(fù)的例子(SEQ ID NO144)ATCGATAGCTTTGCTTATCCGGGAATGAGACCAACAAGATTCACTGGGAGTCAGATCATAATGCCACTAGGACATACAATTGAACACGAAGAAATGCTAGAAGTTGTTAGACTGGAAGGTCATTCTCTTGCTCAAGAAGATGCATTTATGTCACGGGATGTCCATCTCCTTCAGATTTGTACCGGGATTGACGAGAATGCCGTTGGAGCTTGTTCTGAACTGATATTTGCTCCGATTAATGAGATGTTCCCGGATGATGCTCCACTTGTTCCCTCTGGATTCCGAGTCATACCCGTTGATGCTAAAACGGGAGATGTACAAGATCTGTTAACCGCTAATCACCGTACACTAGACTTAACTTCTAGCCTTGAAGTCGGTCCATCACCTGAGAATGAATCTGGAAACTCTTTTTCTAGCTCAAGCTCGAGATGTATTCTCACTATCGCGTTTCAATTCCCTTTTGAAAACAACTTGCAAGAAAATGTTGCTGGTATGGCTTGCGCGGCCGCAGTTCAACGTGTTGCAATGGCGATCTCACCGTCTGGGATAAGCCCGAGTCTGGGCTCCAAATTGTCCCCAGGATCTCCTGAAGCTGTTACTCTTGCTCAGTGGATCTCTCAAAGTTACAGTCATCACTTAGGCTCGGAGTTGCTGACGATTGATTCACTTGGAAGCGACGACGCTAGCGCATGCCAAGCCATACCAGCAACATTTTCTTGCAAGTTGTTTTCAAAAGGGAATTGAAACGCGATAGTGAGAATACATCTCGAGCTTGAGCTAGAAAAAGAGTTTCCAGAAGCATTCTCAGGTGATGGACCGACTTCAAGGCTAGAAGTTAAGTCTAGTGTACGGTGATTAGCGGTTAACAGATCTTGTACATCTCCCGTTTTAGCATCAACGGGTATGACTCGGAATCCAGAGGGAACAAGTGGAGCATCATCCGGGAACATCTCATTAATCGGAGCAAATATCAGTTCAGAACAAGCTCCAACGGCATTCTCGTCAATCCCGGTACAAATCTGAAGGAGATGGACATCCCGTGACATAAATGCATCTTCTTGAGCAAGAGAATGACCTTCCAGTCTAACAACTTCTAGCATTTCTTCGTGTTCAATTGTATGTCCTAGTGGCATTATGATCTGACTCCCAGTGAATCTTGTTGGTCTCATTCCCGGATAAGCAAAGCTCCGCGG從擬南芥REV獲得的反向重復(fù)序列的例子外顯子3-7(SEQ ID NO1的第3670-3743位；等3822-3912位；第4004-4099位；第4187-4300位和第4383-4466位)(SEQID NO145)ATCGATGTTAACGATCCAAGCTGTGAATCTGTGGTCACAACTCCTCAGCATTCGCTTAGAGATGCGAATAGTCCTGCTGGATTGCTCTCAATCGCAGAGGAGACTTTGGCAGAGTTCCTATCCAAGGCTACAGGAACTGCTGTTGATTGGGTTCAGATGCCTGGGATGAAGCCTGGTCCGGATTCGGTTGGCATCTTTGCCATTTCGCAAAGATGCAATGGAGTGGCAGCTCGAGCCTGTGGTCTTGTTAGCTTAGAACCTATGAAGATTGCAGAGATCCTCAAAGATCGGCCATCTTGGTTCCGTGACTGTAGGAGCCTTGAAGTTTTCACTATGTTCCCGGCTGGTAATGGTGGCACAATCGAGCTTGTTTATATGCAGACGTATGCACCAACGACTCTGGCTCCTGCCCGCGATTTCTGGACCCTGAGATACACAACGAGCCTCGACAATGGGAGTTTTGTGCGCGGCCGC連接物(外顯子15)(SEQ ID NO146)GGAGATGTACAAGATCTGTTAACCGCTAATCACCGTACACTAGACTTAACITCTAGCCTTGAAGTCGGTCCATCACCTGAGAATGCTTCTGGAAACTCTTTTTCTAGCTCAAGCTCGAGATGTATTCTCACTATCGCGTTTCAATTCCCTTTTGAAAACAACTTGCAAGAAAATGTTGCTGGTATGGCTTGTCAGTATGTGAGGAGCGTGATCTCATCAGTTCAACGTGTTGCAATGGCGATCTCACCGTCTGGGATAAGCCCGAGTCTGGGCTCCAAATTGTCCCCAGGATCTCCTGAAGCTGTTACTCTTGCTCAGTGGATCTCTCAAAGTTACAGGCTAGCGCATGCCTGCCCGCGATTTCTGGACCCTGAGATACACAACGAGCCTCGACAATGGGAGTITTGTGCGCGGCCGC(SEQ ID NO147)CACAAAACTCCCATTGTCGAGGCTCGTTGTGTATCTCAGGGTCCAGAAATCGCGGGCAGGAGCCAGAGTCGTTGGTGCATACGTCTGCATATAAACAAGCTCGATTGTGCCACCATTACCAGCCGGGAACATAGTGAAAACTTCAAGGCTCCTACAGTCACGGAACCAAGATGGCCGATCTTTGAGGATCTCTGCAATCTTCATAGGTTCTAAGCTAACAAGACCACAGGCTCGAGCTGCCACTCCATTGCATCTTTGCGAAATGGCAAAGATGCCAACCGAATCCGGACCAGGCITCATCCCAGGCATCTGAACCCAATCAACAGCAGTTCCTGTAGCCTTGGATAGGAACTCTGCCAAAGTCTCCTCTGCGATTGAGAGCAATCCAGCAGGACTATTCGCATCTCTAAGCGAATGCTGAGGAGTTGTGACCACAGATTCACAGCTTGGATCGTTAACCCGCGG(SEQ ID NO148)實(shí)施例III.從蕃茄克隆獲得的構(gòu)建物(SEQ ID NO148)ATCGATATTGCTGATATCCTCAAAGATCGACCTTCTTGGTTCCGCGACTGCCGGAATGTTGAAGTTATCACAATGTTTCCTGCTGGAAATGGTGGTACAGTTGAGCTTTTGTATACCCAGATATATGCTCCCACAACTCTGGCTCCCGCGCGTGATTTTTGGACGCTGAGATACACAACAACCCTAGACAATGGTAGTCTCGTGGTTTGTGAAAGATCCCTATCTGGTAATGGGCCTGGCCCAAATCCTACTGCTGCTTCCCAGTTTGTAAGAGCTCAAATGCTTCCATCTGGATATCTGATCCGACCGTGTGATGGTGGAGGATC
            
AATCATACATATTGTTGATCACCTGAATCTTGAGGCATGGAGTGCCCCTGAGATTTTGCGTCCACTCTATGAATCGTCGAAAGTTGTGGCACAGAAAATGACTATTGCAGCACTGCGATATGCAAGGCAACTAGCTCAAGAGACTAGCGGCGAGCGCGGCCGC連接物(SEQ ID NO149)GTAGTATATGGTCTAGGAAGGCAACCTGCTGTTCCTCGAACATTCAGCCAGAGATTATGCAGAGGGTTCAATGATGCCATCAATGGATTCGGTGACGATGGCTGGTCAATGTTAAGTTCAGATGGTGCTGAAGATGTCATAGTTGCTGTCAATTCAAGGAAGAACCTCGCAACCACCTCCATTCCTCTTTCCCCGCTTGGTGGCGTCCTTTGTACCAAAGCATCAATGCTACTCCAGAATGTCCCCCCTGCCGTACTGGTTCGGTTTCTGAGGGAGCACCGTTCAGAATGGGCCGATTATGCTAGCGCATGC(SEQ ID NO150)CTCGCCGCTAGTCTCTTGAGCTAGTTGCCTTGCATATCGCAGTGCTGCAATAGTCATTTTCTGTGCCACAACTTTCGACGATTCATAGAGTGGACGCAAAATCTCAGGGGCACTCCATGCCTCAAGATTCAGGTGATCAACAATATGTATGATTGATCCTCCACCATCACACGGTCGGATCAGATATCCAGATGGAAGCATTTGAGCTCTTACAAACTGGGAAGCAGCAGTAGGATTTGGGCCAGGCCCATTACCAGATAGGGATCTTTCACAAACCACGAGACTACCATTGTCTAGGGTTGTTGTGTATCTCAGCGTCCAAAAATCACGCGCGGGAGCCAGAGTTGTGGGAGCATATATCTGGGTATACAAAAGCTCAACTGTACCACCATTTCCAGCAGGAAACATTGTGATAACTTCAACATTCCGGCAGTCGCGGAACCAAGAAGGTCGATCTTTGAGGATATCAGCAATCCGCGG稻米R(shí)EV1的IR的例子(SEQ ID NO151)(SEQ ID NO151)ATCGATtggttcatgagaatgcccacatgcgacagcagctgcagaatactccgctggcaaatgatacaagctgtgaatcaaatgtgactacccctcaaaaccctttaagggatgcaagtaacccctctgggctcctttcaattgcagaggagaccttgacagagttcctctcaaaggctactggtacagctattgattgggtccagatgcctgggatgaagcctggtccggattcggttggtattgtggccatttcacatggttgcccgtggtgttgctgccgtgcctgtggtttggtgaacctagaaccaacaaaagtggtagagatattgaaagatcgtccatcttggttccgtgattgtcgaaacctggaagtctttacaatgattccagcaggaaatggaggaacggttgaacttgtctacacacagttgtatgctccaacaactttagttcctgcaCGCGGCCGC連接物(SEQ ID NO152)atgctagggagtagcagtgatggaggtggctatgataaggtttccgggatggactccggtaaatatgtgcgctacacgcctgagcaggtggaggcgcttgagcgggtgtacgccgattgccccaagccaacctcctcccgcaggcagcaattgctgcgtgagtgccccatacttgctaacattgagcccaagcagatcaaGCTAGCGCATGC(SEQ ID NO153)tgcaggaactaaagttgttggagcatacaactgtgtgtagacaagttcaaccgttcctccatttcctgctggaatcattgtaaagacttccaggtttcgacaatcacggaaccaagatggacgatctttcaatatctctaccacttttgttggttctaggttcaccaaaccacaggcacggcagcaacaccacgggcaaccatgtgaaatggccacaataccaaccgaatccggaccaggcttcatcccaggcatctggacccaatcaatagctgtaccagtagcctttgagaggaactctgtcaaggtctcctctgcaattgaaaggagcccagaggggttacttgcatcccttaaagggttttgaggggtagtcacatttgattcacagcttgtatcatttgccagcggagtattctgcagctgctgtcgcatgtgggcattctcatgaaccaCCGCGG稻米R(shí)EV2的例子(SEQ ID NO154)ATCGATgaatcaaatg tgaccactcc tcagaaccct ctgagagatg caagtaacccgtctggactc cttacaattg cggaggagac cctgacagag ttcctctcca aggctacagggactgctgtt gattgggtgc caatgcctgg gatgaagcct ggtccggatt cgtttggtattgtggccgtt tcacatggtt gccgtggtgt tgctgcccgt gcctgtggtt tggtgaatctagaaccaaca aagatcgtgg agatcttaaa agaccgccca tcttggttcc gtgattgtcgaagtcttgaa gtcttcacaa tgtttccagc tggaaatggt ggcacgatcg aacttgtttacatgcagatg tatgctccta ctactttggt tcctgcacga gatttttgga cacttagatacacaactaca atggatgatg gcagccttgt 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ggtctgtgag agatcattga gtggttctggaggtggtnca agtncagcct ccgcacagca atttgtaaga gctgagatgc ttcctagcggctatctagtg cgcccatgcg agggtggtgg ctccgtcgtg catattgtgg accatctggatcttgaggct tggagtgttc cagaagtgct tcggccactc tacgagtcat ctagggtagttgctcagaaa atgactgctg cagcngtgcg gcacatcaga caaattgctc aagagacaagcggggaggtt gtatacgctt tggggaggca acctgctgtt ttgcggacat ttagtcagaggttgagtaga ggcttcaatg atgctattag tggtttcaac gatgatggtt ggtctgtcatgggtggggat ggcatcgaag atgtgatcat tgcttgcaat gcaaagaggg ttaggaatactagcncttcg gccaatgctt tt稻米R(shí)EV1蛋白質(zhì)(SEQ ID NO159)maaavamlgsssdgggydkvsgmdsgkyvrytpeqvaalervyadcpkptssrrqqllrecpilaniepkqikvwfqnrrcrdkqrkessrlqavnrkltamnkllmeanerlqkqvsqlvhenahmrqqlqntplandtscesnvttpqnplrdasnpsgllsiaeetlteflskatgtaidwvqmpgmkpgpdsvgivaishgcpwcccracglvnleptkvveilkdrpswfrdcrnlevftmipagnggtvelvytqlyapttlvpardfwtlrytttmedgslvvcerslsgsgggpsaasaqqyvraemlpsgylvrpcegggsivhivdhldleawsvpevlrplyessrvvaqkmttaalrhirqiaqetsgevvyalgrqPavlrtfsqrlsrgfndaisgfnddgwsimggdgvedvviacnstkkvrsssnaxiafgapggii稻米R(shí)EV2蛋白質(zhì)(SEQ ID NO160)；ervycecpkpsssrrqqxlrdcpilaniepkqikvwfqnrrcrdkqrkeasrlqaxnrkltamnklxmeenerlqkgxsqlvhenaymkqqlgnpxlgndtsxesnvttpqnplrdasnpsglltiaeetlteflskatgtavdwvpmpgmkpgPdsfgivavshgcrgvaaracglvnleptkiveilkdrpswfrdcrslevftmfpagnggtielvymqmyapttlvpardfwtlrytttmddgslvvcerslsgsgggxsxasaqqfvraemlpsgylvrpcegggsvvhivdhldleawsvpevlrplyessrvvaqkmtaaavrhirqiaqetsgevvyalgrqpavlrtfsqrlsrgfndaisgfnddgwsvmggdgiedviiacnskrvrntsxsanafvtpggvi蕃茄JIR(SEQ ID NO162)CAGCAGAATAAGCATCAACATTATAATCNGCCCAYT蕃茄REV基因組(劃線的是外顯子)(SEQ ID NO163)AGCTCGTTGCGTCGACAGCAATTGATCCGTGAATGTCATATTCTGTCGAATATCGAGCCTAAGCAGATCAAAGTTTGGTTTCAGAACAGAAGGTATACTTCCATTGTTCAATTTTGCCCAAATTTTGGTTTATGTTTTGTTGTTAATTGCATACATTTTTATATGTCTATTGTGTACGATTGATCTGCACTTTACTTTGTTTAGTACTGCTCGAATCTTGTATTAGTTAGATCAGTGATGATAAACTGAATGTATCACTGTAGTTCTCCTTGCCTAGGCTTGTTGGTTGAGTGGTAGGGTATGTGTTAACCTTAGGTGATTGGGAAATTGAGCTTAGAGTTTGGTATGGAGGGTAAACGTTGTATCATTTCAGGTGTCGAGAGAAGCAAAGGAAAGAGTCTTCTCGATTGCAGACTGTGAACAGAAAGTTGTCTGCGATGAATAAACTGTTGATGGAGGAGAATGACCGCTTGCAGAAACAAGTCTCGCAGCTTGTATGTGAAAATGGCTATATGCGGCAACAATTGCAAAATGTAAGCTAACTTAACTCTTCGTTTATTTTTTATGTCCAAAAGCTCCATGTGTTGCTTACTATATAGTAGATTAATGTCAAACATATCTTGTCTTTTTTGTTCACTTGATCTATGCTGCTGAAATGGCTACTCACTGTGTAGTCTAGATTATACAATATTCCACCGCTATTGAGTCCATGATTTTAATCAGTCAGTCTTATAATTCTGGAATGCGTTACTTTATATATGGGACTAAATTGGCATGGCATTATTTTTGTGTAGTAGTACAAGAAACATTTAAGGTCCTGTGACTTCAAAATTGTAAGATGACAGATATCACCAGTCATTTGTGGATCAAGAGGACTTAATTTAAGCTTACTTAAGACTCTAATTGTGTTTGCTGCAGGTATCGGCGGCCACTACTGATGTAAGTTGTGAATCAGGGGTAACCACTCCTCAGCATTCCCTTAGAGATGCTAACAACCCTGCTGGGTAATAATTTAAAACAGCTATTTCTTTCACTCCTTACTTATATGATGTTAATTCTAAAACGTGTTCATACTGTATCTTTGGAGGAAGTAAATAGCAAATTTCACAATTTAAGGGACTGATTATTTATCTCTAAGTCATGTTTATTCTCTATGCAGACTACTACCAATTGCAGAAGAAACCTTGGCAGAGTTCCTTTCTAAGGCTACAGGAACTGCTGTCGATTGGGTCCCGATGCCTGGGATGAAGGTTGAACTCTAGTCAATCACCTTTTATTTTTTAAAATTCAGTATTTCCATCTGTATCATTGACCAGACGGCTAAAAGGCAATATTATCATTCAATTGTCAGCCTGGTCCGGATTCAGTTGGGATTTTTGCCATCTCACACAGTTGCAGTGGAGTGGCAGCCCGAGCATGTGGTCTTGTTAGTTTAGAGCCAACAAAGGTAAACAATTGGAAGTCTATTCAGAAATATTACTGCTGCTCCATTGCTAGTTTTAGTCCATTAATGATTGTAGATGTTGTCAGCTTTTTCTTACTAAAACATTTTACAGATTGCTGATATCCTCAAAGATCGACCTTCTTGGTTCCGCGACTGCCGGAATGTTGAAGTTATCACAATGTTTCCTGCTGGAAATGGTGGTACAGTTGAGCTTTTGTATACCCAGGTGAATACCTTCTCCTCAATCTCTATGTACACTTCTGATTTGATTAGATACAGCATTGAGGGGATCAATGAATCATTTCTTTCAGATATATGCTCCCACAACTCTGGCTCCCGCGCGTGATTTTTGGACGCTGAGATACACAACAACCCTAGACAATGGTAGTCTCGTGGTAAGCAATCCTTCACATTTAAGTGAGCTTGTGTTGGCGACCTGGCCACTTTTATACTTAGTTCTGGCATTCCCTGGTTTAACTAGTCTTTTAACATCTCAACCTTTCAATCCTTGGATTGAACAGAAGTCCTGAAATGTAATATTTTTGGGTCATATTTAACCAAATGCTGCATTATAATCCCCGTCTAGACCTTTGAGTATCTTGCTACTTCAGTATAATACTTGGCTCCATTATTTGTGATTCTTAATAGTGAATTCTATTAGCTGCGTCATTTGGTAGATGTTGCTCACAGTTTCTTTTTGTGTGGCATCAATTTATCCTCCTCACCAAGGTTTGTGAAAGATCCCTATCTGGTAATGGGCCTGGCCCAAATCCTACTGCTGCTTCCCAGTTTGTAAGAGCTCAAATGCTTCCATCTGGATATCTGATCCGACCGTGTGATGGTGGAGGATCAATCATACATATTGTTGATCACCTGAATCTTGAGGTAAGATTTTGTAAAGTACTGCTTACCTTTGTCATGAACCTGTTTTGCATGGTAGCTGCAATTCACTTCATATATTTTTCAGGCATGGAGTGCCCCTGAGATTTTGCGTCCACTCTATGAATCGTCGAAAGTTGTGGCACAGAAAATGACTATTGCAGTGAGTTCAACCCTTCGTTATCATTTAATACGGCATATAGATTTATATGTTTGTCAGGTTTAAAGTACTTGTGCAGTATCACACTTCCCATAGCTTACTGCCACAGAAGAAGAACCATGATTTCATGCTTTACTTTCTTTTCTGTGAAGGCACTGCGATATGCAAGGCAACTAGCTCAAGAGACTAGCGGCGAGGTAGTATATGGTCTAGGAAGGCAACCTGCTGTTCCTCGAACATTCAGCCAGAGATTATGCAGGTGATGCTTATTTCTGATTTTTGTTATGTGGCTTTGAGATGATGAAAATTTATGCACTTCTGAGATGCCAATTCTGAAGTACATATACAAGTACCTTATTAGGCCATTTCTATATTGCAGAGGGTTCAATGATGCCATCAATGGATTCGGTGACGATGGCTGGTCAATGTTAAGTTCAGATGGTGCTGAAGATGTCATAGTTGCTGTCAATTCAAGGAAGAACCTCGCAACCACCTCCATTCCTCTTTCCCCGCTTGGTGGCGTCCTTTGTACCAAAGCATCAATGCTACTCCAGGTGAATAGTGGATCTTTCTTGAACTGAATAGAATTTTTCATTCGACAACTACCTTGCTCTTGTTAATACACAACAAACAGAAGTTCACAAGTTCATATTTGCATCCTCTTTTACGATACCAACTGAGAGACTGGTCCATATCAGCAATAGATGGAGTTAATTGTTAAGACAAGTGTAACTGGATAAATGAGAATAATTTGACTCTTTTGTTTCCTGGCAGAATGTCCCCCCTGCCGTACTGGTTCGGTTTCTGAGGGAGCACCGTTCAGAA蕃茄REV編碼(SEQ 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ID NO165)SSLRRQQLIRECHILSNIEPKQIKVWFQNRRCREKQRKESSRLQTVNRKLSAMNKLLMEENDRLQKQVSQLVCENGYMRQQLQNVSAATTDVSCESGVTTPQHSLRDANNPAGLLPTAEETLAEFLSKATGTAVDWVPMPGMKPGPDSVGIFAISHSCSGVAARACGLVSLEPTKTADILKDRPSWFRDCRNVEVITMFPAGNGGTVELLYTQIYAPTTLAPARDFWTLRYTTTLDNGSLVVCERSLSGNGPGPNPTAASQFVRAQMLPSGYLIRPCDGGGSIIHTVDHLNLEAWSAPEILRPLYESSKVVAQKMTLAALRYARQLAQETSGEVVYGLGRQPAVPRTFSQRLCRGFNDAINGFGDDGWSMLSSDGAEDVIVAVNSRKNLATTSIPLSPLGGVLCTKASMLLQQNVPPAVLVRFLREHRSETG-CDNA(SEQID NO165)GTRAGTGCCCCATACTTGCTR25AS-J(SEQID NO166)GCCGTTCACGGCSTCRTTRAANCCR22S(SEQID NO167)CGACGACTCCTGGAGTCCGTCAG(SEQ ID NO168)TGTATCATTTGCCAGCGGAG稻米基因組REV1(SEQ ID NO169)1  gtaagtgccc catacttgct aacattgagc ccaagcagat caaggtctgg ttccagaaca61 gaaggtaatg ataatagaat tgaatctttc tacgtttgtt ctctgtgaca aaaacttgtt121 atggcagttt tccctgattg tttcatctgt cacctgaaat aacatttcgttagtttcctt181 ctggggaggc tatggttcta atatgctgcg ttgttgttgt gatgatgagcggtattttga241 tatgagggga gctgcaatgc caattgttta tcatttcatt tgtttgcgcaccagcaaaat301 gtagtataat tactttagct gacggctctg catgtatatg attttttcgtttttcatgnt361 cgctgaagtg gatacttgtg cttgtgttgc tctaggtgcc gggataagcagcggaaggag421 tcttcacggc ttcaggctgn caacaggaaa ttgacggcaa tgaacaagctacttatggaa481 gagaatgagc gactccagaa gcaggtctcc caattggttc atgagaatgcccacatgcga541 cagcagctgt agaatgtaag ctcttgatgt gctggtgctg atgttgtcccccatgcataa601 acaygttctc actgaaatgc tatctattcy ttgygcattt tgttatacgcatggcatgtc661 cggggatgtg ttgttctgta ctgtatattg tagattagta taactttaaaatttgatgta721 tgtgtagcta taccagctgg ggccatatgc gtcagttcct ttagaattgatatatgaatt781 aatcctcaga atgtccatga gatcgctaga tttcactgat aacaccacttgcttgggtgc841 agactccgct ggcaaatgat acaagctgtg aatcaaatgt gactacccctcaaaaccctt901 taagggatgc aagtnacccc tctgggtaag taaatagttc tgagtgactcaggtagaatt961 attgttggat ggacktgctc tttcgatatc atgctatctt aactgccttttatcttgytc1021 taggctcctt tcaattgcag aggagacctt gacagagttc ctctcaaaggctactggtac1081 cagctattga ttgggtccag atgcctggga tgaaggttcc atgctagcactgtttgtttt1141 tttgttctgt gattcgtgct aagaggtttt tacttgaaqt gcttactacccttttgtttt1201 catgatgtaa gcctggtccg gattcggttg gtattgtggc catttcacatggttgccgtg1261 gtgttgctgc ccgtgcctgt ggttcggtga acctagancc aacaaaagtaagtgttgtag1321 ctatttgggt acatgggttt ggtattttta tgttncctca gtattccctggtctgtatgt1381 tttctgaagc atctattttg gggtgatagc aagcctatcc accagtcacttagttttctt1441 tgtgtgcaaa tggttagaaa cctactacct ccatcccaaa atatagccaaaagttgctat1501 atcaaaaatc ctatcagaag tggctcctga acacattgct gccgagtgtggaattaagac1561 acactgtaat tcactttaat aaatactaaa ctttgaagat gtcactttagaggtctaatg1621 atttcatgtc tgccaactgt tatcatcaaa tttaatcgtg aagataagcagatatcttgc1681 tttttttgtt actttattca ggagattttg tgtctcatag aactttgttacgtaggtggt1741 agagatattg aaagatcgtc catcttggtt ccgtgattgt cgaaacctggaagtctttac1801 aatgattcca gcaggaaatg gagggacggt tgaacttgtc tacacacaggtgaacactgt1861 ttcattttac attgtataat ggtatatcct cagtcttctc tatcaatgcatgtgcttcat1921 gccatgaaca ttattacttg tttttgctta cagttgtatg ctccaacaactttagttcct1981 gcacgagatt tttggacgtt acggtacaca accacaatgg aagatggcagtcttgtggta2041 tgtatgaaca tgaacactgt tttcacccca caatgagtct caatgtgatgttacccttgc2101 taatattcct ccatctccaa ggtctgtgag agatctttaa gtggttcagggggcggtcca2161 agtgctgcct ctgctcagca atatgtgaga gcggaaatgc ttccaagtggatacctggtt2221 cgcccatgtg aaggtggggg atcaattgtg cacatagtgg accatctggatcttgaggta2281 tttttcacac ttttgtacag ttgaaccatg ttttttgtcc ctttgatgtaggaccatttt2341 tgtatcctgt caaactaata atacaatttg ggtttaatct tttcaggcatggagtgttcc2401 tgaggtgctt cggccactct atgaatcttc aagggtagtc gctcagaaaatgactactgc2461 ggtaagctgt cgtgaaatga tattcagctc aaatttcatt gatgtgattacaagttcatc2521 atttcaagtg aaacttgttt ttaatgaact cttcaagttt cataacattggatttttttt2581 tagaaaaaat aaaataaaaa tccaatatta tgaaacttga agagttcaagctaatgataa2641 agtttgtgtt ttggataaag cttataatat tggatatgtg gtgaaaatgatttatatggg2701 ttggtacaac taatgataaa atttgccttt tggatatgtt gaacagttcattttctgcaa2761 tctactttat actaaccttt tattgtctat cctatatatc aaggcactccggcacatcag2821 acaaattgct caagaaacaa gtggggaagt ggtgtatgcc ttggggaggcaaccagcagt2881 gctacggact tttagtcaaa ggctgagcag gtgatttttt tataaattattactcagcaa2941 ttaatatttt tttcacctgt ttaatctaac accaatatta tgcttttcttagaggtttca3001 acgacgccgt gaacggc稻米R(shí)EV1 cDNA(SEQ ID NO170)1 cggggccgtg gctgtggggt ggctgtgagg gtgcccccgg cggcgctcccctccgcgcct61 gccggcgagg gggctcggac tgaagggatc taggcgagct gaaaattgaagygcaggcaa121 ggagataaga gcagcgtcca aattgtgagt acttcattag caggaggtagtggttgtgct181 tgcttggctc ctttgcaatt tggctttggc gaggtagcaa tggctgcggcagtggcaatg241 ctagggagta gcagtgatgg aggtggctat gataaggttt ccgggatggactccggtaaa301 tatgtgcgct acacgcctga gcaggtggag gcgcttgagc gggtgtacgccgattgcccc361 aagccaacct cctcccgcag gcagcaattg ctgcgtgagt gccccatacttgctaacatt421 gagcccaagc agatcaaggt ctggttccag aacagaaggt gccgggataagcagcggaag481 gagtcttcac ggcttcaggc tgtcaacagg aaattgacgg caatgaacaagctacttatg541 gaagagaatg agcgactcca gaagcaggtc tcccaattgg ttcatgagaatgcccacatg601 cgacagcagc tgcagaatac tccgctggca aatgatacaa gctgtgaatcaaatgtgact661 acccctcaaa accctttaag ggatgcaagt aacccctctg ggctcctttcaattgcagag721 gagaccttga cagagttcct ctcaaaggct actggtacag ctattgattgggtccagatg781 cctgggatga agcctggtcc ggattcggtt ggtattgtgg ccatttcacatggttgcccg841 tggtgttgct gccgtgcctg tggtttggtg aacctagaac caacaaaagtggtagagata901 ttgaaagatc gtccatcttg gttccgtgat tgtcgaaacc tggaagtctttacaatgatt961 ccagcaggaa atggaggaac ggttgaactt gtctacacac agttgtatgctccaacaact1021 ttagttcctg cacgagattt ttggacgtta cggtacacaa ccacaatggaagatggcagt1081 cttgtggtct gtgagagatc tttaagtggt tcagggggcg gtccaagtgctgcctctgct1141 cagcaatatg tgagagcgga aatgcttcca agtggatacc tggttcgcccatgtgaaggt1201 gggggatcaa ttgtgcacat agtggaccat ctggatcttg aggcatggagtgttcctgag1261 gtgcttcggc cactctatga atcttcaagg gtagtcgctc agaaaatgactactgcggca1321 ctccggcaca tcagacaaat tgctcaagaa acaagtgggg aagtggtgtatgccttgggg1381 aggcaaccag cagtgctacg gacttttagt caaaggctga gcagaggctttaacgatgcc1441 attagtggtt tcaatgatga tgggtggtct ataatgggtg gagacggtgttgaagatgta1501 gttattgctt gcaactcaac taagaaagtt aggagtagca gcaatgcngncatcgccttt1561 ggagcccccg gaggtattat a稻米R(shí)EV1蛋白質(zhì)(SEQ ID NO171)maaavamlgsssdgggydkvsgmdsgkyvrytpeqvealervyadcpkptssrrqqllrecpilaniepkqikvwfqnrrcrdkqrkessrlqavnrkltamnkllmeenerlqkqvsqlvhenahmrqqlqntplandtscesnvttpqnplrdasnpsgllsiaeetlteflskatgtaidwvqmpgmkpgpdsvgivaishgcpwcccracglvn1eptkvveilkdrpswfrdcrnlevftmipagnggtvelvytqlyapttlvpardfwtlrytttmedgslvvcerslsgsgggpsaasaqqyvraemlpsgy1vrpcegggsivhivdhldleawsvpevlrplyessrvvaqkmttaalrhirqiaqetsgevvyalgrqpavlrtfsqrlsrgfndaisgfnddgwsimggdgvedvviacnstkkvrsssnaxiaf稻米R(shí)EV2 cDNA(SEQ ID NO172)gactgcccc atcctcgcca acatcgagcc caagcagatc aaggtctggt tccagaacagaaggtgccga gataagcagc ggaaggaggc atcaaggctt caggccgnga accgaaaattgacggcgatg aataagcttn tcatggagga gaatgagcgt cttcagaagc aggnctcccagctggtccat gagaacgcgt acatgaagca gcaacttcag aatccgncat tgggcaatgatacaagctgn gaatcaaatg tgaccactcc tcagaaccct ctgagagatg caagtaacccgtctggactc cttacaattg cggaggagac cctgacagag ttcctctcca aggctacagggactgctgtt gattgggtgc caatgcctgg gatgaagcct ggtccggatt cgtttggtattgtggccgtt tcacatggtt gccgtggtgt tgctgcccgt gcctgtggtt tggtgaatctagaaccaaca aagatcgtgg agatcttaaa agaccgccca tcttggttcc gtgattgtcgaagtcttgaa gtcttcacaa tgtttccagc tggaaatggt ggcacgatcg aacttgtttacatgcagatg tatgctccta ctactttggt tcctgcacga gatttttgga cacttagatacacaactaca atggaggatg gcagccttgt ggtctgtgag agatcattga gtggttctggaggtggtcca agtacagcct ccgcacagca atttgtaaga gctgagatgc ttcctagcggctatctagtg cgcccatgcg agggtggtgg ctccatcgtg catattgtgg accatctggatcttgaggct tggagtgttc cagaagtgct tcggccactc tacgagtcat ctagggtagttgctcagaaa atgactactg cagcngtgcg gcacatcaga caaattgctc aagagacaagcggggaggtt gtatacgctt tggggaggca acctgctgtt ttgcggacat ttagtcagaggttgagtaga ggcttcaatg atgctataag tggtttcaaT gatgatggtt ggtctgtcatgggtggggat ggcattgaag atgtgatcat tgcttgcaat gcaaagaa稻米R(shí)EV2蛋白質(zhì)(SEQ ID NO173)DCPILANIEPKQIKVWFQNRRCRDKQRKFASRLQAXNRKLTAMNKLXMEENERLQKQXSQLVHENAYMKQQLQNPXLGNDTSXESNVTTPQNPLRDASNPSGLLTIAEETLTEFLSKATGTAVDWVPMPGMKPGPDSFGIVAVSHGCRGVAARACGLVNLEPTKIVEILKDRPSWFRDCRSLEVFTMFPAGNGGTIELVYMQMYAPTTLVPARDFWTLRYTTTMEDGSLVVCERSLSGSGGGPSTASAQQFVRAEMLPSGYLVRPCEGGGSIVHIVDHLDLEAWSVPEVLRPLYESSRVVAQKMTTAXVRHIRQIAQETSGEVVYALGRQPAVLRTFSQRLSRGFNDAISGFNDDGWSVMGGDGIEDVIIACNAK嵌合型蛋白質(zhì)(SEQ ID NO174)(RICEREV1/AT REV)(稻米R(shí)EV/AT REV)maaavamlgsssdgggydkvsgmdsgkyvrytpeqvealervyadcpkptssrrqqllrecpilaniepkqikvwfqnrrcrdkqrkessrlqavrrkltamnkllmeenerlqkqvsqlvhenahmrqqlqntplandtscesnvttpqnplrdasnpsgllsiaeetlteflskatgtaidwvqmpgmkpgpdsvgivaishgcpwcccracglvnleptkvveilkdrpswfrdcrnlevftmipagnggtvelvytqlyapttlvpardfwtlrytttmedgslvvcerslsgsgggpsaasaqqyvraemlpsgylvrpcegggsivhivdhldleawsvpevlrplyessrvvaqkmttaalrhirqiaqetsgevvyalgrqPavlrtfsqrlsrgfndaisgfnddgwsimggdgvedv/VAINSTKHLNNISNSLSFLGGVLCAKASMLLQNVPPAVLIRFLREHRSEWADFNVDAYSAATLKAGSFAYPGMRPTRFTGSQIIMPLGHTIEHEEMLEVVRLEGHSLAQEDAFMSRDVHLLQICTGIDENAVGACSELIFAPINEMFPDDAPLVPSGFRVIPVDAKTGDVQDLLTANHRTLDLTSSLEVGPSPENASGNSFSSSSSRCILTIAFQFPFENNLQENVAGMACQYVRSVISSVQRVAMAISPSGISPSLGSKLSPGSPEAVTLAQWISQSYSHHLGSELLTIDSLGSDDSVLKLLWDHQDAILCCSLKPQPVFMFANQAGLDMLETTLVALQDITLEKIFDESGRKAICSDFAKLMQQGFACLPSGICVSTMGRHVSYEQAVAWKVFAASEENNNNLHCLAFSFVNWSFVREV中心-1(SEQ ID NO175)GGAGCCTTGAAGTTTTCACTATGREV中心-2(SEQ ID NO176)AGGCTGCCTTCCTAATCCATREV3′-1(SEQ ID NO177)TGAGGAGCGTGATCTCATCAGREV3′-2(SEQ ID 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NO190)ATTGCTGATATCCTCAAAGATCGACCTTCTTGGTTCCGCGACTGCCGGAATGTTGAAGTTATCACAATGTTTCCTGCTGGAAATGGTGGTACAGTTGAGCTTTTGTATACCCAG蕃茄REV外顯子7(SEQ ID NO191)ATATATGCTCCCACAACTCTGGCTCCCGCGCGTGATTTTTGGACGCTGAGATACACAACAACCCTAGACAATGGTAGTCTCGTG蕃茄REV外顯子8(SEQ ID NO192)GTTTGTGAAAGATCCCTATCTGGTAATGGGCCTGGCCCAAATCCTACTGCTGCTTCCCAGTTTGTAAGAGCTCAAATGCTTCCATCTGGATATCTGATCCGACCGTGTGATGGTGGAGGATCAATCATACATATTGTTGATCACCTGAATCTTGAG蕃茄REV外顯子9(SEQ ID NO193)GCATGGAGTGCCCCTGAGATTTTGCGTCCACTCTATGAATCGTCGAAAGTTGTGGCACAGAAAATGACTATTGCA蕃茄REV外顯子10(SEQ ID NO194)GCACTGCGATATGCAAGGCAACTAGCTCAAGAGACTAGCGGCGAGGTAGTATATGGTCTAGGAAGGCAACCTGCTGTTCCTCGAACATTCAGCCAGAGATTATGCAG蕃茄REV外顯子11(SEQ ID NO195)AGGGTTCAATGATGCCATCAATGGATTCGGTGACGATGGCTGGTCAATGTTAAGTTCAGATGGTGCTGAAGATGTCATAGTTGCTGTCAATTCAAGGAAGAACCTCGCAACCACCTCCATTCCTCTTTCCCCGCTTGGTGGCGTCCTTTGTACCAAAGCATCAATGCTACTCCAG蕃茄REV外顯子12(SEQ ID NO116)CAGAATGTCCCCCCTGCCGTACTGGTTCGGTTTCTGAGGGAGCACCGTTCAGAA
            
權(quán)利要求
            
1.一種分離的DNA分子，它含有編碼由至少約有70％與SEQ ID NO2相同的氨基酸組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
            
2.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述編碼的蛋白質(zhì)具有REV的生物學(xué)活性。
            
3.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述編碼的蛋白質(zhì)賦予REV表型。
            
4.如權(quán)利要求1所述的DNA序列，其特征在于，所述編碼的蛋白質(zhì)含有至少約有70％與SEQ ID NO2的第114-842個(gè)氨基酸相同的氨基酸序列。
            
5.如權(quán)利要求1所述的DNA序列，其特征在于，所述編碼的蛋白質(zhì)含有選自SEQ ID NO2、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8、SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO159、SEQ ID NO160、SEQ ID NO164、SEQ ID NO171和SEQ IDNO173的氨基酸序列。
            
6.如權(quán)利要求1所述的DNA序列，其特征在于，所述多核苷酸序列選自SEQID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ IDNO11、SEQ ID NO157、SEQ ID NO158、SEQ ID NO163、SEQ ID NO164、SEQID NO169、SEQ ID NO170和SEQ ID NO172。
            
7.一種分離的DNA分子，它含有編碼由至少約有80％與SEQ ID NO2相同的氨基酸組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
            
8.一種分離的DNA分子，它含有與選自SEQ ID NO1的第3670-3743、3822-3912、4004-4099、4187-4300、4383-4466、4542-4697、4786-4860、4942-5048、5132-5306、5396-5582、5668-5748、5834-5968、6051-6388、6477-6585、6663-6812和6890-7045個(gè)核苷酸至少約有80％相同的多核苷酸序列。
            
9.一種分離的DNA分子，它含有與選自SEQ ID NO187、SEQ ID NO188、SEQ ID NO189、SEQ ID NO190、SEQ ID NO191、SEQ ID NO192、SEQ IDNO193、SEQ ID NO194、SEQ ID NO195和SEQ ID NO196的多核苷酸至少約有80％相同的的多核苷酸。
            
10.一種分離的DNA分子，它含有編碼由與SEQ ID NO130、SEQ IDNO131、SEQ ID NO132、SEQ ID NO133、SEQ ID NO134、SEQ ID NO135、SEQID NO136和SEQ ID NO137至少約有95％相同的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸序列。
            
11.一種分離的蛋白質(zhì)，它含有選自SEQ ID NO2、SEQ ID NO6、SEQ IDNO8、SEQ ID NO10和SEQ ID NO12的氨基酸序列。
            
12.一種分離的蛋白質(zhì)，它含有至少約有70％與SEQ ID NO2相同的氨基酸序列。
            
13.如權(quán)利要求12所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，它具有與SEQ ID NO2相同的生物學(xué)功能。
            
14.一種載體，它含有復(fù)制子和多核苷酸，該多核苷酸含有選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9和SEQ ID NO11的核酸序列。
            
15.一種載體，它含有復(fù)制子和多核苷酸，該多核苷酸含有編碼至少約有70％與SEQ ID NO2相同的蛋白質(zhì)的序列。
            
16.如權(quán)利要求15所述的載體，其特征在于，所述蛋白質(zhì)由具有SEQ ID NO2的生物學(xué)活性的多核苷酸序列編碼。
            
17.如權(quán)利要求15所述的載體，其特征在于，所述蛋白質(zhì)至少約有70％與SEQ ID NO2的第114-842個(gè)氨基酸相同。
            
18.如權(quán)利要求15所述的載體，其特征在于，所述載體還含有與所述多核苷酸異源的啟動(dòng)子區(qū)域，并且它在植物細(xì)胞中具有操作性。
            
19.如權(quán)利要求15所述的載體，其特征在于，所述啟動(dòng)子區(qū)域可操作性地連接于所述多核苷酸。
            
20.如權(quán)利要求18所述的載體，其特征在于，所述啟動(dòng)子區(qū)域以組織和/或器官特異性的方式具有活躍的轉(zhuǎn)錄作用。
            
21.一種轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，它含有編碼REVOLUTA蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因。
            
22.如權(quán)利要求21所述的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因含有選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9和SEQ ID NO11的核酸序列。
            
23.如權(quán)利要求21所述的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因含有編碼至少約有70％與SEQ ID NO2相同的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
            
24.如權(quán)利要求21所述的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，其特征在于，由所述多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO2的生物學(xué)活性。
            
25.如權(quán)利要求24所述的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，其特征在于，所述蛋白質(zhì)至少約有70％與SEQ ID NO2的第114-842個(gè)氨基酸相同。
            
26.一種含有REVOLUTA轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因植物，它含有與未轉(zhuǎn)化的植物相比其分裂被調(diào)節(jié)的細(xì)胞。
            
27.如權(quán)利要求26所述的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因含有選自SEQID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9和SEQ IDNO11的核酸序列。
            
28.如權(quán)利要求26所述的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因含有編碼至少約有70％與SEQ ID NO2相同的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
            
29.如權(quán)利要求26所述的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于，由所述多核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO2的生物學(xué)活性。
            
30.如權(quán)利要求29所述的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于，所述蛋白質(zhì)至少約有70％與SEQ ID NO2的第114-842個(gè)氨基酸相同。
            
31.一種調(diào)節(jié)植物細(xì)胞分裂的方法，它包括將REVOLUTA轉(zhuǎn)基因?qū)胫参锛?xì)胞中。
            
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因含有選自SEQ IDNO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9和SEQ ID NO11的核酸序列。
            
33.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因含有編碼至少約有70％與SEQ ID NO2相同的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
            
34.如權(quán)利要求33所述的方法，其特征在于，由所述多核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO2的生物學(xué)活性。
            
35.如權(quán)利要求33所述的方法，其特征在于，所述蛋白質(zhì)至少約有70％與SEQ ID NO2的第114-842個(gè)氨基酸相同。
            
36.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因包含REVOLUTA基因的多核苷酸序列的反向重復(fù)序列。
            
37.如權(quán)利要求3 1所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因包含REVOLUTA基因的多核苷酸序列的反義取向序列。
            
38.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因含有REVOLUTA基因的多核苷酸序列的有義取向序列。
            
39.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因是含有從REVOLUTA基因獲得的多核苷酸序列的核糖酶。
            
40.如權(quán)利要求33所述的方法，其特征在于，所述REVOLUTA轉(zhuǎn)基因在植物細(xì)胞中表達(dá)，并且該植物細(xì)胞與未轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞相比具有調(diào)節(jié)的細(xì)胞分裂。
            
41.一種分離REVOLUTA的方法，它包括a)使用正向和反向寡核苷酸引物擴(kuò)增植物多核苷酸序列，所述引物編碼至少約有70％與SEQ ID NO2的對(duì)應(yīng)氨基酸序列相同的氨基酸序列；b)將所述擴(kuò)增的植物多核苷酸雜交到重組植物DNA克隆庫(kù)中；c)從雜交到所述DNA擴(kuò)增的植物多核苷酸的重組DNA克隆中分離出DNA分子；d)將含有所述擴(kuò)增的植物多核苷酸或所述DNA分子的載體轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞中；e)比較轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞與未轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，確定轉(zhuǎn)化植物中的細(xì)胞分裂被調(diào)節(jié)。
            
42.如權(quán)利要求41所述的方法，其特征在于，所述分離的DNA編碼至少約有70％與SEQ ID NO2的氨基酸序列相同的氨基酸序列。
            
43.如權(quán)利要求41所述的方法，其特征在于，所述分離的DNA在所述轉(zhuǎn)化的植物中表達(dá)為選自有義基因、反義基因、反向重復(fù)基因和核糖酶基因的轉(zhuǎn)基因。
            
44.如權(quán)利要求41所述的方法，其特征在于，通過(guò)將所述分離的DNA操作性連接到鄰近異源啟動(dòng)子序列的位置而使其表達(dá)。
            
45.如權(quán)利要求41所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)化的植物至少有一個(gè)器官的細(xì)胞數(shù)量比相應(yīng)的未轉(zhuǎn)化的植物的器官的細(xì)胞數(shù)量多。
            
46.如權(quán)利要求41所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)化的植物至少有一個(gè)器官的細(xì)胞數(shù)量比相應(yīng)的未轉(zhuǎn)化的植物的器官的細(xì)胞數(shù)量少。
            
47.一種含有嵌合型植物基因的植物，它具有i)在該植物細(xì)胞中起作用的啟動(dòng)子序列；ii)導(dǎo)致編碼調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)的融合多肽的RNA的產(chǎn)生的編碼序列；iii)編碼多腺苷酸化信號(hào)的3′端非翻譯區(qū)域，該多腺苷酸化信號(hào)在植物細(xì)胞中引起多腺苷酸化核苷酸加到該RNA的3′端；其中，該啟動(dòng)子與該編碼序列是異源的，并且該啟動(dòng)子習(xí)慣于引起足夠的融合多肽的表達(dá)，以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化了所述基因的植物的生長(zhǎng)。
            
48.一種分離的多核苷酸序列，它含有選自SEQ ID NO103、SEQ ID NO105、SEQ ID NO107、SEQ ID NO109、SEQ ID NO111、SEQ ID NO113、SEQ IDNO115、SEQ ID NO117、SEQ ID NO119、SEQ ID NO121、SEQ ID NO123和SEQ ID NO125的核酸序列。
            
49.一種載體，它含有權(quán)利要求48所述的多核苷酸。
            
50.一種使用權(quán)利要求49所述的載體轉(zhuǎn)化的植物。
            
全文摘要
            
本發(fā)明提供調(diào)節(jié)植物細(xì)胞分裂的組合物和方法。具體而言,本發(fā)明提供編碼REVOLUTA的多核苷酸。此外,本發(fā)明也提供了REVOLUTA載體和轉(zhuǎn)化的植物,其中,相對(duì)于未轉(zhuǎn)化植株的對(duì)照種群,轉(zhuǎn)化植株的細(xì)胞分裂被REVOLUTA轉(zhuǎn)基因的表達(dá)所調(diào)節(jié)。本發(fā)明還提供從高等植物中分離和鑒別REVOLUTA的方法。
            
文檔編號(hào)C07K14/415GK1423520SQ00818298 
            
公開(kāi)日2003年6月11日 申請(qǐng)日期2000年11月10日 優(yōu)先權(quán)日1999年11月10日
            
發(fā)明者安·斯雷德, 琳達(dá)·麥迪森, 盧卡·科麥 申請(qǐng)人:安·斯雷德, 琳達(dá)·麥迪森, 盧卡·科麥
            
                        
            
                        
            
                        
            
                            
                        
            

                        
                            
                    
            
                    
                    


                     
                        
                        
                    

                
            

                
                
            
                    
            
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