重組亞單位疫苗的制作方法

專利名稱：重組亞單位疫苗的制作方法
技術領域：
本發明領域本發明總體上涉及用于包括哺乳動物、人類、禽類和魚在內的動物的治療劑及其開發領域。更具體地講，本發明涉及能有效抗引起感染的病原體的亞單位疫苗，該疫苗可用于包括哺乳動物、人類、禽類和魚在內的動物。
背景技術：
科學背景治療劑的開發，特別是針對諸如病毒、細菌、原生動物、真菌的疫苗的開發正在進行中。業已證實，所述研究在預防包括人類在內的動物中疾病的傳播方面具有不可估量的價值。實際上，在現代醫學中，包括免疫接種在內的免疫療法已經根除了天花，并且基本上根除了諸如脊髓灰質炎、破傷風、結核病、水痘和麻疹的疾病。
一般，理想的疫苗具有長的貨架壽命，能夠誘導針對預定的病原體及所有表型變體的長期的免疫性，不會導致該疫苗所要針對的疾病，在治療方面和預防方面是有效的，容易用經濟的標準方法制備并且可以用本領域方法方便的服用。
有四種主要類型的商業化疫苗。其中，包括無生命的完整生物疫苗，有生命的減毒疫苗，載體疫苗，和亞單位疫苗。用諸如蛋白的無生命材料接種典型的會導致抗體反應或CD4+輔助T細胞反應，而用有生命的材料(例如，感染性病毒)接種典型的會導致CD8+細胞毒性T-淋巴細胞(CTL)反應。對于傳染性病毒和細菌的病原體防護來說，CTL反應是關鍵的。由此產生的實際問題是，CTL反應的為數不多的某些途徑是使用有生命的試劑，這些試劑本身就是致病性的。這一問題典型的是通過使用減毒的病毒和細菌菌株或者通過對可用于接種的完整細胞進行滅活而克服的。上述策略一直是有效的，但使用減毒的菌株總是具有風險，因為減毒的試劑可能在宿主中發生遺傳重組，并轉變成有毒的菌株。因此，能夠通過用諸如蛋白這樣的無生命的材料，以特定方式免疫接種導致CD8+CTL反應的治療劑和方法是需要的。
亞單位疫苗業已提供了解決上述某些問題的一種方式。這種疫苗典型的包括源于感興趣的病原體的亞細胞成分。亞單位成分可以是由病原體的特定亞細胞部分產生的，可以是純化的蛋白，核酸或多糖。上述所有因子都具有能夠刺激針對感興趣的病原體的免疫反應的抗原性決定子。一般，所述亞單位疫苗的亞細胞成分是通過純化破碎的病原體制備物而獲得的，或者用已知方法合成。
不過，亞單位疫苗具有某些局限。首先，生產所述疫苗的前提條件是所述抗原決定子必須是確定的和鑒定過的。這對它的應用造成了局限，特別是針對高度變性的抗原決定子。其次，亞單位疫苗在刺激毒性T細胞反應方面典型的是無效的。第三，由亞單位疫苗所產生的免疫性典型的是短壽命的，并因此需要連續的強化注射。只有極少數的重組表達的亞單位疫苗被證實能在接種過的動物(包括人)體內誘導有效的和長期的免疫性。一個突出的例外是用于人體的重組乙型肝炎表面抗原疫苗。與使用所述疫苗相關的一個問題是，將所述抗原正確呈遞給所述免疫系統，以便誘導強烈的體液免疫性和強烈的細胞介導的免疫性。具體地講，現有的重組(亞單位)疫苗似乎不能產生有效的‘記憶’反應，因此接種過的動物，在暴露于由病原體所產生的天然感染時會很快作出反應。
僅僅是舉例來說，業已大量報導了由瘟病病毒樣牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)所制備的現有亞單位疫苗的缺陷。這些研究業已證實，即使在疫苗中使用大量的重組蛋白，所產生的保護作用也很差。這表明這種疫苗不能保護由有生命的BVDV分離物所產生的刺激(同源性保護或異源性保護)。
本發明試圖提供一種改進的治療用疫苗，它能減輕現有技術中的至少某些缺陷。一般背景本領域技術人員可以理解的是，可以對本文所描述的發明進行除了這些具體說明以外的改變和改進。應當理解的是，本發明包括所有這樣的改變和改進。本發明還包括在說明書中單獨或統一提到或指明的所有步驟、特征、組合物和化合物，以及其任意的和所有的組合和任何兩個或兩個以上步驟或特征。
盡管一般來說本文所提到的技術在本領域中是公知的，可以特別參考Sambrook等，分子克隆，實驗室手冊(1989)和Ausubel等，分子生物學簡明方法(1999)第4版，John Wiley&Sons公司。
本發明并不局限于由本文所描述的具體實施方法所確定的范圍。這些實施方法只是用于實例說明目的的。功能性等價產物、組合物和方法明顯屬于本發明所描述的發明的范圍。
在本說明書中所提到的出版物的參考文獻的細節在說明書的最后統一給出。所引用的所有文獻都被收作本文參考。不可以將任何一份參考文獻作為現有技術。
在本說明書中，除了文本另有需要，術語“包括”或者其變體被理解成包括特定的整體或整體組合，但不排除任何其他整體或整體組合。
發明概述本發明總體上涉及一種生產含有與異源抗原性多肽結合的熱激蛋白(hsp)的免疫原性組合物的方法，該方法包括(a)在一種細胞中表達所述抗原性多肽，該細胞受到過一種刺激，這種刺激能導致在該細胞中誘導熱激反應；和(b)從所述細胞或培養介質中回收與一個或多個hsps結合的抗原性多肽。
所述細胞優選是非哺乳真核細胞，更優選是昆蟲細胞。典型的，所述抗原性多肽是通過將編碼所述抗原性多肽的多核苷酸導入所述細胞中而在該細胞中表達的，所述多核苷酸可操作地連接于能夠指導所述多肽在該細胞中表達的調控序列。所述多核苷酸優選是病毒或病毒載體的一部分，如桿狀病毒。
本發明還提供了一種含有與異源抗原性多肽結合的hsp的組合物，該組合物是通過本發明的方法生產的。理想的是，該組合物能夠增強動物對一種病原體的免疫反應力。所述hsp優選源于非哺乳動物真核細胞，更優選昆蟲細胞。
與至少一種抗原性肽/多肽結合的hsps，如昆蟲hsps，提供了作為在背景技術部分所討論的疫苗的替代性治療疫苗，用于刺激動物的免疫系統，以便引起針對外源病原體的免疫反應。盡管hsps已經包括在治療制劑中，就申請人所知，還沒有人把與至少一種抗原性肽/多肽結合的源于非哺乳動物真核細胞的hsps，特別是昆蟲細胞hsps，用于對諸如家養動物和人類的哺乳動物進行治療。
用本發明的昆蟲細胞/桿狀病毒實施方法所生產的不同亞單位疫苗的綜合特征包括(1)該復合體是完全沒有傳染性的。
(2)該復合體在用于動物時是安全的，因為桿狀病毒不會感染動物細胞。
(3)本發明所生產的治療劑的生產成本較低，因為與相當的系統相比，桿狀病毒感染的昆蟲細胞培養物能產生更高產量的抗原性蛋白。
(4)業已發現本發明所開發的治療劑能在動物體內產生非常強的記憶反應。因此，當一種動物隨后在受到一種病原體刺激攻擊時，它會產生針對該病原體的非常迅速而有效的反應。
因此，本發明還提供了一種含有與異源抗原性多肽結合的源于非哺乳真核細胞的熱激蛋白(hsp)的組合物，該組合物能夠在哺乳動物中誘導針對抗原性多肽的免疫反應。
優選的hsp是昆蟲熱激蛋白。因此，在一種優選實施方法中，本發明提供了能夠在動物體內誘導免疫反應的改進的亞單位疫苗，它包括與抗原性異源肽或多肽結合的昆蟲細胞hsps。
所述hsp和抗原性多肽優選是通過非共價方式結合的。
所述抗原性多肽優選是一種病原體生物的抗原或其抗原性片段或衍生物。所述抗原性多肽更優選是一種病毒或細菌的抗原，或其抗原性片段或衍生物。在一種優選實施方法中，所述抗原性多肽源于諸如BDVD的瘟病病毒(pestivirus)，特別是E1/E2或NS3/NS4a多肽或其片段或衍生物。
在一種高度優選的實施方法中，所述組合物可以通過這樣一種方法獲得，包括(a)在一種非哺乳動物真核細胞中表達所述抗原性多肽，該細胞受到過一種刺激，這種刺激能導致在該細胞中誘導熱激反應；和(b)從所述細胞或培養介質中回收與一個或多個hsps結合的抗原性多肽。
因此，本發明還提供了制備hsp-抗原性異源肽或多肽復合體的方法，包括(a)將編碼至少一種抗原性肽或多肽的核苷酸序列導入所述細胞，所述核苷酸序列是以這樣一種方式導入該細胞的，當該序列位于所述細胞內時該核苷酸序列可以翻譯；(b)在能表達所述肽或多肽的條件下培養所述細胞；(c)讓所述細胞接受一種能夠在該細胞中啟動熱激蛋白產生的脅迫(d)回收所表達的復合體。該方法還可以包括以下步驟通過本領域所公知的任何方法純化所述復合體。在一種優選實施方法中，用所述方法所生產的復合體是從昆蟲細胞多肽中分離。
本發明的組合物可用于治療方法中，用于誘導針對抗原性異源肽或多肽的免疫反應。
本發明還提供了一種藥用組合物，該組合物含有免疫原性劑量的本發明的組合物和一種可以藥用的載體或稀釋劑。
在另一種實施方法中，本發明提供了一種在動物體內誘導針對一種病原體的免疫反應力的方法，該方法包括以下步驟給一種動物服用有效劑量治療的與抗原性肽或多肽結合的非哺乳真核細胞hsp和可以藥用的載體。
本發明的方法優選包括，通過服用含有治療有效量的復合體的組合物，在需要治療或預防傳染病的個體內引起免疫反應的方法，其中，所述復合體主要包括與一種抗原性分子非共價結合的hsps，可以使用任何方便的服用方法。可以使用多種服用技術，其中包括口服、鼻腔和其他形式的經黏膜服用，腸胃外技術，如皮下、靜脈和腹膜內注射和導管插入術等。
本發明的詳細說明本發明基于這樣的發現，即用以受到過熱激的昆蟲細胞中的桿狀病毒系統所表達的BVDV為基礎的重組亞單位疫苗，在預防奶牛和綿羊感染BVDV方面是高度有效的，包括一種與BVDV菌株的親源關系很遠的攻擊菌株(challenge strain)，其多肽亞基被用作該疫苗的基礎。這一點并不與以前所披露的針對BVDV的亞單位疫苗完全矛盾，那些亞單位疫苗不能產生針對來自多種不同菌株的BVDV感染的廣泛保護。
該系統不僅能產生高度有效的疫苗組合物，而且比現有的其他疫苗便宜和安全。熱激蛋白和抗原性多肽熱激蛋白(hsps)是細胞在受到熱激和其他形式的細胞脅迫時產生的。主要的hsps在脅迫的細胞中能積累到很高的水平，但它在未受到脅迫的細胞中以低的至中等水平存在。用于本發明的熱激蛋白是這樣的蛋白(i)當細胞受到脅迫刺激時其細胞內濃度提高，(ii)它可以結合其他蛋白或肽，和(iii)在存在腺苷三磷酸(ATP)或低pH條件下能夠釋放所結合的蛋白或肽。適用于本發明的范圍的熱激蛋白的具體例子包括被稱為分子伴侶的一類蛋白的某些。
包括陪伴蛋白在內的分子伴侶是能通過非酶促方式促進蛋白折疊的多肽，其中，它不會催化折疊中的多肽在結構上發生任何化學修飾，但能夠通過促進正確的結構排列促使多肽正確折疊。分子伴侶為本領域所公知，業已鑒定了其中的若干家族。不同生物之間的分子伴侶是高度保守的。分子伴侶的例子包括hsp70家族(DnaK型)，hsp60家族(GroEL型)，ER相關分子伴侶，hsp90家族，Hsc70，hsp40家族(DnaJ)，線粒體hsp70，線粒體mAAA和酵母Ydj1。特別優選的是使用hsp60、hsp70和hsp90家族的成員，其分子內濃度會根據脅迫刺激而增加。
熱激蛋白存在于原核細胞和真核細胞中，并且當所述免疫原性組合物通過本發明的熱激方法產生時存在有熱激蛋白，存在于hsp/抗原復合體中的hsps可以來自任何來源，包括原核細胞或真核細胞。不過，hsps優選源于非哺乳動物細胞，更優選非哺乳真核細胞，如昆蟲細胞。
因此，存在于本發明組合物中的hsps典型的源于非哺乳真核細胞。
“非哺乳真核細胞”是除了哺乳動物細胞以外的所有真核細胞。例如，非哺乳動物真核細胞包括酵母細胞、真菌細胞、無脊椎動物細胞，如昆蟲細胞，和非哺乳脊椎動物細胞，如兩棲動物細胞。優選使用能夠對在所述細胞中表達的異源多肽進行糖基化的細胞，而其他翻譯后修飾典型的是在哺乳動物細胞的內質網/高爾基體中進行的。不過，沒有必要象在哺乳動物細胞中那樣，需要所述細胞進行精確的相同翻譯后修飾。例如，昆蟲細胞與哺乳動物細胞相比，傾向于將更少的復合糖類結合到新合成的氨基酸鏈上。
“非哺乳動物細胞”包括上文所披露的非哺乳動物真核細胞以及原核細胞。原核細胞包括真細菌，如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和任何其他適用于表達異源多肽的真細菌。原核細胞可能更適用于表達除了病毒抗原以外的細菌抗原。可用于本發明方法中的“哺乳動物細胞”包括諸如CHO細胞，HeLa細胞的細胞系，和適用于表達異源多肽的任何其他類型的哺乳動物細胞。
本文所使用的術語“hsp抗原性肽/多肽復合體”，是指可以從細胞培養物中分離的任何復合體，它包括與至少一種異源肽或多肽結合的hsps，它具有至少一個抗原決定子。所述結合優選是通過非共價鍵實現的。
本文所使用的術語“非哺乳動物hsp-抗原性肽/多肽復合體”，是指可以能夠從非哺乳動物細胞的培養物中分離的任何復合體，它包括與至少一種異源肽或多肽結合的非哺乳動物hsps，具有至少一個抗原決定子。所述結合優選是通過非共價鍵實現的。
本文所使用的術語“異源多肽”是指對諸如非哺乳動物細胞的細胞來說不是內源性的肽或多肽，即不是由該細胞的基因組所編碼的。它優選是在正常情況下在體內不與hsps內源結合的物質，并且正常情況下不能與諸如非哺乳真核細胞hsps共同純化。
本文所使用的術語“多肽”是指長度超過一個氨基酸的任何氨基酸序列，因此包括長度為兩個或兩個以上氨基酸的肽，典型的具有5、10或20個以上的氨基酸，這些氨基酸可以是通過化學方法修飾過的或未修飾過的。本文所使用的術語“多肽”還包括蛋白，蛋白是一個包括單鏈多肽分子和多個多肽復合體的術語，其中，單一的組成多肽通過共價方式或非共價方式連接。
當一種分子能夠與免疫系統的抗原識別分子，如免疫球蛋白(抗體)或T細胞抗原受體專一性地相互作用時，該分子是“抗原性的”。抗原性多肽包括至少大約5個，優選至少大約10個氨基酸。一個分子的抗原性部分可以是抗體或T細胞受體識別的免疫顯性部分，或者它可以是用于產生該分子抗體的部分。
抗原性分子可以從本領域已知的分子中篩選，或者通過其結合抗體或MHC分子或產生免疫反應的能力篩選。它包括可以誘導針對感染劑的免疫反應的任何分子，感染劑例如，病毒、細菌、真菌、寄生物等的抗原。在本發明的一種優選實施方法中，所述抗原性分子可以源于，但不限于(1)病毒蛋白，如任何免疫缺陷病毒的蛋白，包括I型人類免疫缺陷病毒(HIV-I)和II型人類免疫缺陷病毒(HIV-II)，黃病毒，瘟病病毒樣牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)，邊界病病毒(borderdisease virus)(BDV)和經典豬熱病毒(CSFV)、甲型肝炎，乙型肝炎，丙型肝炎，戊型肝炎，庚型肝炎(GB)，流感，水痘，腺病毒，I型單純皰疹(HSV-I)，II型單純皰疹(HSV-II)，牛瘟病病毒，鼻病毒，艾柯病毒(echovirus)，輪狀病毒，呼吸道合胞體病毒，乳頭瘤病毒，乳多空病毒，組病毒，巨細胞病毒，海膽病毒，蟲媒病毒，漢坦病毒，柯薩奇病毒，腮腺炎病毒，麻疹病毒，風疹病毒和脊髓灰質炎病毒；(2)抗原性細菌蛋白，選自但不限于分支桿菌屬，立克次氏體，支原體，奈瑟菌屬和軍團(legionella)菌屬；(3)抗原性原生動物蛋白，選自但不限于利什曼原蟲屬，球蟲屬和錐蟲屬；和(4)抗原性寄生物蛋白選自，但不限于衣原體和立克次氏體。
特別優選的是使用源于瘟病病毒蛋白的抗原性多肽，如C/E0，E1/E2，NS3/NS4A和/或NS5A/B。瘟病病毒優選選自BVDV(I型和/或II型)和BDV。
本發明的組合物可以含有一種以上不同的hsp/抗原性多肽復合體。例如，可以用兩種或兩種以上不同的抗原性多肽增強本發明的免疫原性。所述兩種或兩種以上抗原性多肽可源于相同的蛋白或不同的蛋白。對于瘟病病毒來說，特別優選的是使用至少一種源于一種結構蛋白的抗原性多肽和至少一種源于非結構多肽的抗原性多肽。例如，在一種高度優選的實施方法中，本發明的組合物包括hsp-瘟病病毒E1/E2復合體和hsp-瘟病病毒NS3/NS4A復合體。
當本發明的組合物中存在一種以上抗原時，至少有一種抗原性多肽當作為hsp復合體的一部分給人或動物服用時，應當能夠產生保護性免疫反應。不過，也希望包括一種hsp/抗原性多肽，當接種過的宿主隨后被相應的天然病原體感染時，不會引起抗體反應和抑制或減弱針對特定抗原的免疫反應的產生。這為疫苗接種者提供了有用的標記。舉例來說，業已在實施例部分證實了一種截短的BVDV NS3/NS4A抗原能夠提供這種用途。
制備含有與抗原性多肽結合的hsps的組合物含有與抗原性多肽結合的hsps的本發明的組合物可以通過多種方法制備。
例如，通過重組方法、化學合成獲得的和/或從諸如非哺乳動物真核細胞的細胞裂解物這樣的天然來源中獲得的純化的或部分純化的非哺乳動物真核hsps，可以在合適的容器中在體外與一種或一種以上抗原性多肽混合，所述抗原性多肽可以通過重組方法、化學合成獲得，和/或從合適的天然來源的細胞裂解物中獲得，如病毒感染過的哺乳動物細胞或病原體細菌的培養物。在與抗原性多肽結合之前，可以用ATP或低pH對hsps進行預處理，以便除去有可能與感興趣的hsps結合的任何肽。可以通過添加腺苷三磷酸雙磷酸酶從所述制劑中除去多余的ATP。當采用低pH時，應當將pH重新調整到中性pH。通過在合適的容器中將預處理過的hsp和抗原性肽混合并培養10分鐘至若干小時，hsps可以與所述抗原性肽結合。典型的使用的抗原性多肽與hsps的比例大于1。可以選擇性地純化所述混合物，以便除去未結合的抗原性肽。
在本發明的一種高度優選的實施方法中，所述hsps/抗原性多肽復合體是通過在一種條件下表達所述抗原性多肽而制備的，在所述條件下，可以誘導細胞的脅迫反應并且內源熱激蛋白的細胞內含量增加。該方法是特別方便的，因為它不必純化或合成hsps，當使用其hsps沒有充分鑒定的細胞時這是有利的。另外，在存在內源hsps時，在細胞內環境中表達抗原性多肽，有可能導致比無細胞系統更有效的結合。
優選使用非哺乳動物細胞，如非哺乳動物真核細胞或原核細胞，更優選非哺乳動物真核細胞。
因此，在本發明的一種優選方法中，本發明的組合物是通過首先將編碼感興趣的抗原性多肽的多核苷酸導入細胞而制備的。所述多核苷酸可以包括調控序列，如啟動子，一個或多個增強子和其他轉錄/翻譯控制序列，以便可以在所述細胞中表達所述抗原性多肽。有可能需要使用能夠使所述抗原性多肽進行誘導型表達的調控序列，例如，根據服用外源分子或實際上受到諸如熱激這樣的刺激而表達。這樣可以確保在通過熱激刺激將熱激蛋白上調到所述水平之前，不會合成所述抗原性多肽。另外，只是在需要表達所述多肽時將所述多核苷酸導入所述細胞，可以臨時控制所述抗原性多肽的表達。
還可以方便地包括一個N-末端分泌信號，以便所述抗原性多肽被分泌到細胞介質中，正如在實施例中所披露的E1/E2 BVDV多肽的情況。
在一種優選實施方法中，所述多核苷酸是病毒載體的一部分，如桿狀病毒載體或傳染病毒，如桿狀病毒。這樣提供了一種方便的系統，因為不僅可以在使用之前保持并保存重組病毒母液，而且，已知對于諸如桿狀病毒的病毒來說，可以推遲感染后蛋白表達，這樣便可以方便地確定并再現對宿主細胞進行休克的最佳時間。可以將編碼所述抗原性肽或多肽的核苷酸序列插入重組桿狀病毒中，該病毒業已進行過遺傳工程改造，能產生抗原性肽或多肽，例如，按照Smith等(1983)的方法進行改造，分子細胞生物學(Mol Cell Biol)122156-2165。有多種病毒轉移載體可以將一個以上編碼多肽的多核苷酸序列插入同一個載體上，以便可以由相同的重組載體對它們進行共表達。
本發明的方法不局限于在所述宿主細胞中一次產生一種抗原性多肽。可將編碼感興趣的不同抗原性多肽的多種多核苷酸導入同一種宿主細胞中。所述多核苷酸可以是同一種核酸分子的部分或單獨的核酸分子。
一旦將所述編碼感興趣的抗原性多肽的多核苷酸導入所述宿主細胞，就在合適的條件下培養該細胞，以便表達所述蛋白。然后對所述細胞進行熱激，以便誘導內源hsps的表達(或增強其表達)。對多種宿主細胞進行熱激的條件為本領域所公知。例如下面提供了昆蟲細胞的特定條件。
一旦將所述細胞培養了一段合適的時間使得蛋白表達，就可以從細胞中回收抗原性多肽/hsp復合體。就此而言，所述復合體可以存在于細胞內部和/或存在于細胞介質中。細胞內復合體可以用標準裂解和純化方法回收。分泌的復合體可以從外部介質中回收，并通過諸如用Centricon試管濃縮的方法進行純化。當本發明的復合體被分泌到介質中時，優選讓所述宿主細胞在無血清介質中生長。
然后，典型的將回收的hsp/抗原性多肽復合體與一種可以藥用的載體或稀釋劑和/或其他成分混合，以便生產藥用組合物/疫苗組合物。
盡管根據本發明的方法，有多種非哺乳動物真核細胞，如酵母細胞、真菌細胞、無脊椎動物細胞和非哺乳脊椎動物細胞可以用作宿主細胞，但優選使用昆蟲細胞。優選的昆蟲細胞來自鱗翅目，例如，草地灘夜蛾(Spodoptera frugiperda)，如Sf9和Sf21細胞系。
例如，抗原性蛋白與昆蟲細胞hsps在體外的簡單結合可以很簡單地完成，在感染24-48小時之間，將受感染的細胞放入例如43℃的水浴中(放在容器中)，處理大約10分鐘，以便對所述細胞進行熱激。然后在大約27.5℃下將所述細胞再培養2-24小時，以便表達結合的重組蛋白和hsps。在所有感染之后72-96小時結束，收獲重組蛋白培養物。
本領域技術人員可以容易地確定在各種合適的宿主細胞中誘導熱激反應并進行抗原性多肽的最佳表達的最佳時間和溫度，例如通過進行一定時間過程，或者對于很多細胞系來說已經測定過。
典型的，所述熱激反應是在誘導所述抗原性多肽表達之后或者大體上同時誘導的，更優選在之后誘導。
在給人類或動物對象服用之前，可以選擇使用本領域所公知的體外測定方法，如混合淋巴細胞靶培養物測定(MLTC)，對hsp/抗原性多肽組合物的免疫原性進行測定。組合物優選將含有與抗原性多肽結合的hsps的本發明的組合物與各種成分混合，以便生產本發明的組合物。優選將所述組合物與可以藥用的載體或稀釋劑混合，以便生產藥用組合物(該組合物可用于人類或動物)。還可將含有與抗原性多肽結合的hsps的本發明的組合物與適合的成分混合，以便獲得疫苗組合物。
因此，本發明提供了含有非哺乳動物真核hsp-抗原性肽或多肽復合體的藥用/疫苗組合物，該組合物能增強宿主個體的免疫能力并誘導針對病原體的特定免疫性。以下描述了本發明的治療方法和藥用組合物。據信，所述組合物具有預防傳染性疾病發作和發展的能力。
一般，本發明的藥用組合物和/或疫苗組合物，含有有效治療劑量的與一種抗原性多肽結合的hsp。
術語“可以藥用的載體或稀釋劑”是指在給人服用以后生理上可以承受，并且典型的不會產生過敏性或類似的不適反應，如胃腸不適和頭昏等的分子實體和組合物。在本文中，術語“可以藥用的”優選是指獲得了聯邦或州政府的管理機構的批準或被列在了用于動物，尤其是用于人類的美國藥典或其他被普遍認可的藥典上。術語“載體”是指用它來服用有關化合物的稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒介物。所述藥用載體可以是無菌液體，如水和油，包括石油、動物油、植物油或合成的油，如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。優選將水或可溶的鹽溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液用作載體，特別是用作注射溶液。合適的藥用載體披露于以下文獻中Martin，Remington’s藥物科學，第18版，Mack出版公司，Easton，PA，1990。
本文所使用的術語“治療有效量”是指足于對動物免疫系統產生至少大約15％，優選至少50％，更優選至少90％，最優選產生完全刺激的量，使它產生針對所述抗原性決定子的免疫記憶。
一般，本發明包含的藥用組合物含有本發明的有效治療劑量和可以藥用的稀釋劑、防腐劑、穩定劑、乳化劑、佐劑和/或載體。所述組合物可以包括各種緩沖成分的稀釋劑(例如，Tris-HCl，乙酸鹽、磷酸鹽)，pH和離子強度；添加劑，例如去垢劑和增溶劑(例如，Tween80，Polysorbate80)、抗氧化劑(例如，抗壞血酸、偏亞硫酸氫鈉)、防腐劑(例如，Thimersol，芐醇)和填充物質(例如，乳糖、甘露糖)；將所述材料摻入聚合化合物的顆粒制劑中，如聚乳酸、聚乙醇酸等或摻入脂質體中。還可以使用透明質酸。所述組合物可以影響該復合體的物理狀態、穩定性、體內釋放速度和體內清除速度。參見例如，Martin，Remington’s藥物科學，第18版(1990，Mack出版公司，Easton，PA，18042)，1435-1712頁，該文獻被收作本文參考。所述組合物可以制成液體形式或者是干粉形式，如凍干的形式。
藥用組合物可以通過注射使用，或者制備成用于口服、肺吸入、鼻腔或其他服用形式。按照本發明制備的復合體的服用方式必須取決于以下因素，如該復合體在生理條件下的穩定性，所需要的免疫反應強度，和病原體的類型等。
所述復合體優選用標準方法服用，例如，靜脈內、皮下、肌內、眼眶內、眼內、心室內、頭蓋骨內、囊內、脊柱內、腦池內、腹膜內、口腔內、直腸內、陰道內、鼻腔內、口服或通過噴霧劑服用。
還可以用本發明的一種或多種hsp/抗原性多肽復合體制備疫苗。對于含有免疫原性復合體作為活性成分的疫苗的制備，是本領域技術人員所公知的。典型的，所述疫苗被制備成可注射形式，作為液體溶液或懸浮液；還可以制備成適合在注射之前溶解在或懸浮在液體中的固體形式。還可以對該制劑進行乳化，或者將所述蛋白膠囊化于脂質體中。所述活性免疫原性成分典型的與賦形劑混合，所述賦形劑是可以藥用的并且與所述活性成分兼容。例如，合適的賦形劑有水、鹽溶液、葡萄糖、甘油、乙醇等及其組合。
另外，如果需要，所述疫苗含有微量輔助物質，如濕潤劑、乳化劑、pH緩沖劑，和/或能增強該疫苗效力的佐劑。
本文所使用的術語“佐劑”是指能增強針對一種組合物的免疫反應的化合物或混合物，該組合物含有與具有至少一個抗原決定子的肽或多肽結合的hsp。佐劑可以起著組織倉庫的作用，它能緩慢釋放所述抗原，并且還可以起著淋巴系統激活劑的作用，它能非專一性地增強免疫反應。
可能有用的佐劑的例子包括，但不限于氫氧化鋁、N-乙酰-肉桂酰-L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺(thr-MDP)，N-乙酰-正-肉桂酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺(CGP11637，被稱為正-MDP)，N-乙酰肉桂酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰-L-丙氨酰-2-(1’-2’-二棕櫚酰-sn-甘油-3-羥基磷酸氧基)-乙胺(CGP19835A，被稱為MTP-PE)，和RIBI，它含有從細菌中提取的三種成分，單磷酸脂A，海藻糖二霉菌酸酯和細胞壁骨骼(MPL+TDM+CWS)，溶解在2％角鯊烯/Tween80乳液中。
佐劑和其他試劑的另外的例子包括氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁鉀(礬)、硫酸鈹、二氧化硅、高嶺土、碳、油包水乳液、水包油乳液、肉桂酰二肽、細菌內毒素、脂類X、小棒桿菌(瘡皰丙酸桿菌)、百日咳桿菌、聚核糖核苷酸、藻酸鈉、羊毛脂、溶血卵磷脂、維生素A、皂草苷、免疫刺激復合體(ISCOMs)、脂質體、左旋咪唑、DEE-葡聚糖、嵌段共聚物或其他合成佐劑。所述佐劑可以通過商業渠道從各種來源獲得，例如，Merck佐劑65(Merck公司，Rahway，N.J.)或弗氏不完全佐劑和完全佐劑(Difco實驗室，Detroit，Michigan)。
典型的，使用諸如Amphigen(水包油)、Alhydrogel(氫氧化鋁)的佐劑，或Amphigen和Alhydrogel的混合物。只容許將氫氧化鋁用于人類。
免疫原和佐劑的比例可以在很大范圍內波動，只要這兩者都以有效量存在即可。例如，氫氧化鋁可以占疫苗混合物量的大約0.5％(以氧化鋁為基礎計算)。典型的將疫苗制備成含有終濃度為0.2-200微克/毫升的免疫原，優選5-50微克/毫升，最優選15微克/毫升。
在制備之后，可以將疫苗裝入無菌容器中，然后將容器密封并在諸如4℃的低溫下保存，或者冷凍干燥。冷凍干燥可以以穩定形式長期儲存。
佐劑的效果可以通過測定抗本發明的免疫原性復合體的抗體的量測定，這種抗體是通過服用含有該復合體以及各種佐劑的疫苗而產生的。
所述疫苗典型的以注射方式通過腸胃外途徑服用，例如皮下注射或肌內注射。適用于其他服用方式的其他制劑包括栓劑，以及在某些場合下為口服制劑。對于栓劑來說，傳統的粘結劑和載體可以包括，例如，聚亞烷基二醇或甘油三酯；所述栓劑可以由含有0.5％-10％，優選1％-2％的活性成分的混合物制成。口服制劑包括常用的賦形劑，例如，藥用等級的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素和碳酸鎂等。所述組合物采用溶液、懸浮液、片劑、丸劑、膠囊、緩式制劑或粉劑形式，并含有10-95％的活性成分，優選25-70％。當所述疫苗組合物是凍干的時，可以在服用之前對凍干的材料進行重建，例如，重建成懸浮液。重建優選在緩沖液中進行。
用于給患者口服的膠囊、片劑和丸劑，可以具有一個腸溶衣，例如，包括Eudragit“S”、Eudragit“L”、乙酸纖維素、乙酸纖維素鄰苯二甲酸酯或羥丙基甲基纖維素。
可以將本發明的復合體制成中性或鹽形式的疫苗。可以藥用的鹽包括酸加成鹽(由肽的游離氨基基團形成)，這種鹽是由無機酸形成的，例如，鹽酸或磷酸，或由有機酸形成的，由乙酸、草酸、酒石酸和馬來酸。由游離羧基基團所形成的鹽還可源于無機堿，例如，氫氧化鈉、鉀、銨、鈣、或鐵，以及有機堿，如異丙基胺、三甲胺、2-乙基氨基乙醇、組氨酸和魚精蛋白。其他活性成分本發明的組合物還可以包括不與hsps結合的抗原性多肽，和/或其主要目的不是用作抗原，而是用作調節某些其他方面的免疫反應的生物學活性分子。用于調節動物或人類對象的免疫系統的生物學分子的例子包括細胞因子。
術語“細胞因子”是指能影響介導免疫反應的其他細胞的功能的任何分泌型多肽。細胞因子的某些例子包括，但不限于白介素-1.α(IL-1.α)、白介素-1.β(IL-1.β)、白介素-2(IL-2)、白介素-3(IL-3)、白介素-4(IL-4)、白介素-5(IL-5)、白介素-6(IL-6)、白介素-7(IL-7)、白介素-8(IL-8)、白介素-9(IL-9)、白介素-10(IL-10)、白介素-11(IL-11)、白介素-12(IL-12)、干擾素-α(IFN.α)、干擾素-β(IFN.β)、干擾素-γ(IFN.γ)、腫瘤壞死因子α(TNFα)、腫瘤壞死因子β(TNFβ)、粒細胞克隆刺激因子(G-CSF)、粒細胞/巨噬細胞克隆刺激因子(GM-CSF)、轉化生長因子β(TGF-β)。治療用途本發明的組合物可用于使動物和人對傳染性疾病進行免疫。術語“動物”包括哺乳動物，如家畜，包括綿羊、山羊、豬、奶牛(cow)、馬、IIAMAS，家養寵物，如狗和貓，以及靈長類動物；禽類，如雞、鵝和鴨；魚類；和爬行動物，如鱷魚和短吻鱷。
因此，本發明提供了一種在動物或人體內誘導針對一種病原體的保護性免疫反應的方法，該方法包括所述動物或人類服用有效量的本發明的組合物。
因此，本發明還提供了用于增強動物的免疫能力和免疫效應細胞針對一種病原體的活性的方法。所述方法典型的包括以下步驟服用含有治療有效量的昆蟲細胞hsp-抗原性肽/多肽復合體的組合物，其中，該復合體主要包括與一種異源肽或多肽抗原分子結合的hsp。
在一種高度優選的實施方法中，本發明提供了由源于瘟病病毒的蛋白和多肽制備的hsps復合體，優選牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)、更優選BVDV E1/E2和/或NS3/NS4A和/或其抗原性片段。hsp可來自任何來源，但優選來自非哺乳動物真核細胞。
本文所使用的術語“疫苗”是指本發明的含有與具有至少一個抗原決定子的肽或多肽結合的hsp的任何組合物，該組合物在給動物服用時能夠刺激針對所述抗原決定子的免疫反應。可以理解的是，術語疫苗不一定意味著該組合物可以提供全面的保護反應。只要有治療效果就足夠了。
術語“免疫反應”是指在受到抗原刺激之后在動物體內所產生的任何細胞過程，這些過程是朝向從動物體內消除病原的方向的。免疫反應典型的是由一群或多群細胞介導的，其特征是淋巴細胞和/或吞噬細胞。
針對所導入的hsps-抗原性肽或多肽復合體所產生的免疫反應，是由位于該復合體的肽或多肽上的抗原決定簇的氨基酸組成決定的。所述決定簇可以確定體液或細胞介導的抗原區。不受任何特定作用模式的局限，希望由所述昆蟲細胞hsps-抗原性肽或蛋白復合體所產生的免疫反應優選包括液體和細胞介導的免疫反應。當細胞能有效介導免疫反應時，它優選引起T細胞級聯反應，更具體地講是通過細胞毒性T細胞級聯反應進行。
本文所使用的術語“細胞毒性T細胞”是指能表達細胞表面糖蛋白標記CD8+的任何T淋巴細胞，它能夠尋找并裂解在其細胞表面上具有主要組織兼容性I型(MHC I型)復合體并且受到細胞內病原體感染的靶細胞。
可以通過本發明的方法治療或預防的疾病，是由包括，但不限于病毒、細菌、真菌、原生動物和寄生生物的病原體引起的。
可以用本發明方法治療或預防的病毒性疾病包括，但不限于由以下病毒所引起的疾病免疫缺陷病毒，包括I型人類免疫缺陷病毒(HIV-I)和II型人類免疫缺陷病毒(HIV-II)，甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、黃病毒、瘟病病毒樣牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)，邊界病病毒(BDV)和經典豬熱病毒(CSFV)、流感、水痘、腺病毒、I型單純皰疹(HSV-I)、II型單純皰疹(HSV-II)、牛瘟病病毒、鼻病毒、艾柯病毒、輪狀病毒、呼吸道合胞體病毒、乳頭瘤病毒、組病毒、乳多空病毒、巨細胞病毒、海膽病毒、蟲媒病毒、漢坦病毒、柯薩奇病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、風疹病毒和脊髓灰質炎病毒。
可以用本發明方法治療或預防的細菌性疾病是細菌引起的，這些細菌包括，但不限于分支桿菌屬、立克次氏體、支原體，奈瑟菌屬和軍團菌屬。
可以用本發明方法治療或預防的原生生物疾病是由原生生物引起的，所述原生生物包括，但不限于利什曼原蟲屬、球蟲屬、和錐蟲屬。
可以用本發明方法治療或預防的寄生生物疾病是由寄生生物引起的，所述寄生生物包括，但不限于衣原體和立克次氏體。
根據一種高度優選的實施方法，提供了一種針對牛群的BVDV感染的亞單位治療劑，它能夠在牛體內誘導免疫反應，該治療劑含有與抗原性BVDV肽或多肽結合的hsp。hsps優選與所述抗原性BVDV肽或多肽進行非共價結合。
所有現代病毒傳染治療的主要目的都是基于其預防病毒通過胎盤傳遞的能力，因此阻斷了在牛群中的循環傳染。胚胎保護指數是BVDV疫苗效力的唯一客觀標準。該標準在海外日益被采納作為未來BVDV疫苗注冊的必需條件。
本發明的該實施方法的一個另人吃驚的前途是在BVDV感染之前在牛體內觀察到了100％的保護作用。所述保護作用是由于僅僅短時間接觸活病毒刺激之后所出現的針對BVDV的異常高水平的中和抗體所產生的。該亞單位疫苗所產生的中和抗體水平是申請人從來所沒有見到過的。另外，所述亞單位疫苗產生了另人吃驚的有效記憶細胞毒性T細胞反應。另外，所述亞單位疫苗首次產生了對病毒從母獸到胎兒的跨胎盤轉移的100％的有效抑制。
除了上述優點之外，按照本發明的該實施方法所生產的疫苗具有優于其他BVDV疫苗的特別優點，特別是優于其他BVDV亞單位疫苗。使用活的減毒疫苗或完整生物疫苗的一個缺陷是，在生產疫苗期間有可能感染細胞培養物。相反，亞單位疫苗是非傳染性的。具體地講，本發明的亞單位疫苗不需要用血清生產，因此降低了與處理諸如胎牛血清的血清制品相關的危險。
所述疫苗的另一個優點是在對諸如牛這樣的商業化動物群進行免疫接種以使其抗BVDV時的安全性。本發明的亞單位疫苗可以安全地用于動物，而沒有傳染(活的減毒病毒)或由病毒感染動物細胞的危險。因此，可將其安全用于所有動物，包括懷孕的動物。
根據本發明所生產的BVDV亞單位疫苗的另一個優點是生產這種亞單位疫苗的成本高效的特點。可以獲得高產量的抗原性蛋白。具體地講，在本發明的一種優選實施方法中，亞單位疫苗是通過用載體桿狀病毒感染昆蟲細胞培養物，產生能有效抗BVDV的亞單位疫苗而生產的。所得到的疫苗具有抗更多種抗原多樣性BVDV分離物的效力。
源于BVDV的任何抗原區都可用于所確定的亞單位疫苗。所述抗原性肽或多肽優選源于主要免疫原區E0、E1/E2、NS3/NS4A。在本發明該實施方法的一種高度優選的形式中，所述亞單位疫苗是利用BVDV分離物的截短的NS3/NS4A蛋白生產的。另人吃驚的是，NS3/NS4A蛋白抗原在用所述亞單位疫苗接種過的牛血清中，不會導致可檢測含量的抗體的產生。因此，將NS3/NS4A蛋白摻入所述亞單位疫苗中可以提供一種有用的標記，可以在牛群中區分受感染的牛和接種過的牛。在歐洲和美國的優選做法是，在疫苗中包含一種標記，以便識別受感染的動物和接種過的動物。因此，本發明的亞單位疫苗提供了一種用于區分受群中的受感染的動物和接種過的動物的良好的標記。服用腸胃外遞送可以通過與可以藥用的無毒賦形劑或載體混合，而將本文所提供的化合物制成藥用組合物，并通過任何腸胃外技術服用，如皮下、靜脈內或腹膜內注射。另外，該制劑可以選擇性地含有一種或多種佐劑。口服本文還涉及口服固體劑型，該劑型被披露于收作本文參考文獻的以下文獻中Martin，Remington’s藥物科學，第18版(1990，Mack出版公司，Easton，PA18042)，第89章。固體劑型包括片劑、膠囊、丸劑、糖錠或酊劑、扁膠囊或小藥丸。另外，可將脂質體或類蛋白質膠囊化用于制備這些組合物(例如，U.S.Patent No.4,925,673中報道的類蛋白質微球體)。可以使用脂質體膠囊化，而脂質體可以來自各種聚合物(例如，U.S.Patent No.5,013,556)。用于治療的可行的固體劑型披露于被收作本文參考文獻的以下文獻中Marshall，現代藥物學，第10章，Banker和Rhodes著，1979。一般，所述制劑可以包括hsp-抗原性肽/多肽復合體(或其化學修飾形式)，以及能在胃腸環境保護并在腸道中釋放生物活性材料的惰性成分。
另外，特別關注上述衍生的hsp-抗原性肽/多肽復合體的口服劑型。在這一方面，所述復合體可以是化學修飾過的，以便口服有效。一般，所述化學修飾包括將至少一個成分結合到所述蛋白(或肽)分子本身上，其中，所述成分能夠(a)抑制蛋白分解；和(b)從胃或腸中吸收到血液中。還希望提高該蛋白的總體穩定性，并延長在體內的循環時間。所述成分的例子包括聚乙二醇，乙二醇和丙二醇的共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯基醇、聚乙烯吡咯烷酮和聚葡氨酸。Abuchowski等，1981，同上；Newmark等，應用生物化學雜志，4185-189，1982。可以使用的其他聚合物有聚-1，3-二惡烷和聚-1，3，6-tioxocane。對于上述藥用用途來說，優選聚乙二醇成分。
對于hsp-抗原性肽/多肽復合體來說，釋放的部位可以是胃、小腸(十二指腸、空腸或回腸)，或大腸。本領域技術人員可以獲得這樣的制劑，該制劑不會溶解在胃中，但能將材料釋放到十二指腸或小腸的其他部位。所述釋放應當避免胃環境的有害影響，這一目的可以通過保護復合體來實現，或者通過在胃環境以外的部位釋放生物學活性材料而實現，例如腸道。
為了確保全面的胃部抵抗性，至少pH5.0不能滲透的包衣是必需的。被用作腸衣的更常用的惰性成分的例子是纖維素乙酸苯三酸酯(CAT)、羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯(HPMCP)、HPMCP 50、HPMCP55、聚乙烯乙酸鄰苯二甲酸酯(PVAP)、Eudragit L30D、Aquateric、纖維素乙酸鄰苯二甲酸酯(CAP)、EudragitL、EudragitS和Shellac。所述包衣劑可以用作混合的薄膜。
還可將包衣劑或包衣劑的混合物用在片劑上，這種包衣劑不是用于保護胃的破壞作用的。這些包衣劑可以包括糖衣、或使得片劑更容易吞咽的包衣。膠囊可以用硬的外殼組成(如凝膠)，用于服用干的治療劑，如粉劑；對于液體形式來說，可以使用軟凝膠外殼。膠囊的外殼材料可以是厚的淀粉或其他可以食用的紙。對于丸劑、酊劑、模制的片劑或片劑粉來說，可以使用濕成塊技術。
所述治療劑可以以顆粒大小大約為1毫米的顆粒或丸形式的多個細小顆粒包含在所述制劑中。用于膠囊服用的材料的制劑還可以是粉劑、壓緊的栓劑甚至是片劑。所述治療劑可以通過壓縮制備。
還可以含有著色劑和芳香劑。例如，可以制備hsp-抗原性肽/多肽復合體(如通過脂質體或微球體膠囊化)，然后進一步包含在可食用的產品中，如含有著色劑和芳香劑的冷凍飲料。
人們可以用惰性材料稀釋或增加治療劑的體積。所述稀釋劑可以包括糖類，特別是甘露糖醇、α-乳糖、無水乳糖、纖維素、蔗糖、改性的葡聚糖和淀粉。可以用作填料的某些無機鹽包括三磷酸鈣、碳酸鎂和氯化鈉。某些商業化的稀釋劑有Fast-Flo、Emdex、STA-Rx1500、Emcompress和Avicell。
在制成固體劑型的治療劑中可以含有分散劑。用作分散劑的材料包括，但不限于淀粉，包括基于淀粉的商業化分散劑Explotab。淀粉乙醇酸鈉、Amberlite、羧甲基纖維素鈉、ultramylopectin、藻酸鈉、明膠、橙皮、酸性羧甲基纖維素、天然海綿和硼潤土都可以使用。另一種形式的分散劑是不溶性陽離子交換樹脂。粉末狀的樹膠可以用作分散劑和粘接劑，這些樹膠可以包括諸如瓊脂、刺梧桐和黃耆膠。還可將藻酸及其鈉鹽用作分散劑。
粘接劑可用于將治療劑粘接在一起，以便形成硬的片劑，粘接劑包括來自天然產品的材料，如金合歡膠、黃耆膠、淀粉和明膠。其他的包括甲基纖維素(MC)、乙基纖維素(EC)和羧甲基纖維素(CMC)。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和羥丙基甲基纖維素(HPMC)都可用于醇溶液中，以便使治療劑成粒。
在所述治療劑的制劑中可以含有潤滑劑，以便避免在制備過程中發生粘接。潤滑劑可以作為層狀材料用作治療劑和模具壁之間，潤滑劑可以包括，但不限于硬脂酸，包括其鎂鹽和鈣鹽，聚四氟乙烯(PTFE)、液體石蠟、植物油和蠟。還可以使用可溶性潤滑劑，如月桂酰硫酸鈉、月桂酰硫酸鎂、各種分子量的聚乙二醇和Carbowax4000和6000。
可以添加能夠改善在制備期間所述復合體的流動特性并有助于在壓縮期間重新排列的潤滑劑。所述潤滑劑可以包括淀粉、滑石、焦化二氧化硅和水合硅鋁酸鹽。
為了有助于將所述治療劑溶解在水環境中，可以添加一種表面活性劑作為濕潤劑。表面活性劑可以包括陰離子去垢劑，如月桂酰硫酸鈉、二辛基硫代琥珀酸鈉和二辛基磺酸鈉。可以使用陽離子洗滌劑，并且可以包括氯化苯甲烴銨(benzalkonium)或氯化benzethomium。可以作為表面活性劑添加到該制劑中的潛在的非離子洗滌劑包括lauromacrogo1400、聚烴氧基40硬脂酸酯、聚氧乙烯氫化蓖麻油10、50和60、硬脂酸單甘油酯、聚山梨酸酯(polysorbate)40、60、65和80，蔗糖脂肪酸酯、甲基纖維素和羧甲基纖維素。所述表面活性劑可以單獨或者作為不同比例的混合物存在于所述復合體的制劑中。
可以增強所述復合體的吸收的添加劑有例如脂肪酸、油酸、亞油酸和亞麻酸。
可能需要控制釋放制劑。可將所述復合體摻入可以通過擴散或滲露機制允許釋放的惰性介質中，即樹膠。還可將緩慢降解的介質摻入該制劑中。該治療劑的另一種形式的控制釋放是通過基于Oros治療系統的方法(Alza公司)，即將藥物包在半透膜中，該膜容許水進入并且通過滲透壓作用經過單一的小孔將藥物排出。某些腸衣材料也具有緩釋作用。
其他包衣劑也可用于所述制劑。其中包括可用于包衣盤中的多種糖類。所述治療劑還可以以薄膜包衣片劑的形式提供；在這種情況下所使用的材料分成兩類。第一類是非腸溶衣材料，包括甲基纖維素、乙基纖維素、羥乙基纖維素、甲基羥基乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基-甲基纖維素、羧基甲基纖維素鈉、providone和聚乙二醇。第二類包括腸溶衣材料，這種材料典型的是磷苯二甲酸酯。
可以用各種材料的混合物提供最佳的膜包衣。膜包衣可以在噴式包衣裝置或在在硫化床中進行或通過壓縮包衣。肺遞送本發明還涉及所述復合體的肺遞送。所述hsp-抗原性肽/多肽復合體可以通過吸入遞送到動物的肺，并通過肺上皮層進入血液中。
本發明的實施涉及多種為了肺遞送治療產品而設計的機械裝置，包括，但不限于噴霧器、定量吸入器、粉末吸入器、所有這些裝置為本領域技術人員所熟悉。
適用于本發明的商業化裝置的某些具體例子有由Mallinckrodt公司(St.Louis，Missouri)生產的Ultravent噴霧器；由Marquest醫學制品(Englewood，Colorado)所生產的Acorn II噴霧器；由Glaxo公司(Research Triangle Park，North Carolina)所生產的Ventolin定量吸入器；和由Fisons公司(Bedford，Massachusetts)所生產的Spinhaler粉末吸入器。
所有上述裝置需要使用適合分散所述復合體的制劑。典型的，每一種制劑是專門適用于所采用類型的裝置的，除了并可用于治療的常用稀釋劑、佐劑和/或載體之外，還可以包括使用合適的推進材料。另外，還涉及使用脂質體、微型膠囊或微球體，包含復合體或其他類型的載體。根據化學修飾的類型或所采用裝置的類型，化學修飾過的蛋白還可以制成不同的制劑。
適用于噴霧器，噴射噴霧器或超聲波噴霧器的制劑典型的包含懸浮在水中的復合體，其濃度為每毫升溶液含有0.1-25毫克的生物學活性蛋白。該制劑還可以含有一種緩沖液和簡單的糖類(例如，用于蛋白的穩定和調節滲透壓)。噴霧器制劑還可以含有一種表面活性劑，以便降低或避免由于在形成氣溶膠的過程中霧化該溶液所導致的表面誘導蛋白的聚合。
用于定量吸入裝置的制劑典型的含有一種很細的粉末，該粉末在表面活性劑的幫助下將所述復合體懸浮在推進劑中。推進劑可以是用于該目的的任何常規材料，如氯氟烴、氫氯氟烴、氫氟烴或烴，包括三氯氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇、和1，1，1，2-四氟乙烷，或其組合。合適的表面活性劑包括山梨聚糖三油酸酯和大豆卵磷脂。還可將油酸用作表面活性劑。
用于從粉末吸入器中分配的制劑，可以含有其中包含所述復合體的很細的干粉，并可以含有填充劑，如乳糖、山梨醇、蔗糖或甘露糖醇，其用量有利于該粉末從所述裝置中分散，例如，占該制劑重量的50-90％。所述蛋白(或衍生物)最好被制成顆粒形式，其平均顆粒大小小于10微米，最優選0.5-5微米，以便最有效地遞送到很深的肺里面。鼻腔遞送還涉及所述復合體的鼻腔遞送。鼻腔遞送在治療產品服用到鼻腔以下可以直接將所述蛋白遞送到血液中，而沒有必要使該產品沉積在肺里。用于鼻腔遞送的制劑包括含有葡聚糖或環化葡聚糖的制劑。與其他化合物服用本發明的治療方法和藥用組合物還可以與其他免疫反應增強劑或生物學反應改性劑同時服用，包括，但不限于細胞因子IFN-α、IFN-γ、IL-II、IL-IV、IL-VI、TNF、或其他細胞因子影響的免疫細胞。根據本發明的這一方面，hsp和抗原性分子的復合體，在組合治療中與治療有效量的一種或多種上述細胞因子同時使用。在本文中，術語“細胞因子”表示能影響介導免疫反應的其他細胞的功能的任何分泌多肽。因此，預計所述復合體可以與一種細胞因子同時服用，以便增強針對腫瘤的免疫反應。優選的細胞因子包括，但不限于白介素-1.α(IL-1α)、白介素-1.β(IL-1β)、白介素-2(IL-2)、白介素-3(IL-3)、白介素-4(IL-4)、白介素-5(IL-5)、白介素-6(IL-6)、白介素-7(IL-7)、白介素-8(IL-8)、白介素-9(IL-9)、白介素-10(IL-10)、白介素-11(IL-11)、白介素-12(IL-12)、干擾素-α(IFNα)、干擾素-β(IFNβ)、干擾素-γ(IFNγ)、腫瘤壞死因子α(TNFα)、腫瘤壞死因子β(TNFβ)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、轉化生長因子β(TGF-β)。
另外，常用的抗生素可以與所述脅迫蛋白-肽復合體同時使用。不過，合適抗生素的選擇取決于有關的疾病。劑量對于上述所有分子來說，隨著進一步研究的展開，將會得到用于治療各種患者的各種癥狀的合適的劑量水平的信息，并且普通技術人員可以根據治療方法、受體的年齡和總體健康狀況確定適當的劑量。
典型的，所述復合體的服用量應當足以在動物隨后受到刺激之后能夠啟動針對有關病原體的免疫反應。昆蟲細胞hsp抗原性肽/多肽復合體的服用量優選在大約0.1-1.0微克復合體/每公斤動物體重/服用范圍內服用。最優選大約0.2-0.5微克復合體/每公斤動物體重/服用。
對于體重大約為75公斤的人類受試者來說，典型的劑量在大約0.5至大約50微克范圍內。另外，通過給所述個體反復服用所述復合體可以增強其免疫反應的強度。因此，在一種例子中，動物可以合適的月份間隔接受至少兩個劑量的昆蟲細胞hsp抗原性肽/多肽復合體。如果必要，可以在以后的時間通過服用所述復合體加強免疫反應。不過，可以理解的是，本領域技術人員通過常規實驗可以發現最佳劑量和免疫方法。試劑盒本發明還提供了用于實施本發明治療方法的試劑盒。所述試劑盒包括一個或多個容器，其中含有治療或預防有效劑量的可以藥用形式的昆蟲細胞hsp抗原性肽/多肽復合體。在本發明的試劑盒的小瓶里的hsp抗原性分子復合體可以是可以藥用的溶液形式，例如，與無菌鹽水混合、葡萄糖溶液或緩沖液、或其他可以藥用的無菌液體。另外，可以將所述復合體凍干或脫水，在這種情況下，所述試劑盒還選擇性地在容器中裝有一種可以藥用的溶液(例如鹽水、葡萄糖溶液等)，優選是無菌的溶液，以便重建所述復合體形成用于注射的溶液。
在另一種實施方法中，本發明的試劑盒還包括一個針或注射器，優選以無菌形式包裝，用于注射所述復合體，和/或包裝好的酒精棉球。還選擇性地包括說明書，以便指導臨床醫生或患者服用hsp-抗原性分子復合體。
實施本發明的最佳方法在下面的非限定附圖和實施方法中將對本發明的其他特征作更全面的說明。不過，應當理解的是，這些說明僅僅是用于說明本發明的目的的。不應當以任何方式將其理解為對所提供的本發明的范圍的限定。在附圖中

圖1表示在活病毒攻擊(C)之前和之后，在小母牛的接種組(-○-)和對照組(-■-)中抗-E2(中和)抗體濃度的發展。
圖2表示在活病毒攻擊(C)之前和之后，在小母牛的接種組(-○-)和對照組(-■-)中抗-NS3(中和)抗體濃度的發展。
圖3表示在活病毒攻擊(C)之前和之后，在綿羊的接種組(-○-)和對照組(-■-)中抗-E2(中和)抗體濃度的發展。
圖4表示在活病毒攻擊(C)之前和之后，在綿羊的接種組(-○-)和對照組(-■-)中抗-NS3(中和)抗體濃度的發展。
在以下實施例中沒有作明確說明的分子克隆方法和蛋白質化學方法報道于有關文獻中，并且被本領域技術人員所公知。介紹本領域技術人員所公知的常用分子生物學、微生物學、和重組DNA技術的一般教科書包括，例如Sambrook等(1989)；Golver(1985)；和Ausubel等當代分子生物學方法。
例1重組桿狀病毒的生產和重組瘟病病毒蛋白的表達瘟病病毒瘟病病毒分離物Trangie-D10、Bega和Clover Lane是在Eligabeth Macarthur農業研究所(EMAI)的病毒學系分離并鑒定的。BVDV分離物Trangie-D10和Bega表示牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)I型瘟病病毒，而Clover Lane分離物是邊界病病毒(BDV)分離物。
用于所述亞單位疫苗中的澳大利亞病毒分離物GenBank保藏號和所使用的基因組片段相對參考菌株BVDV NADL的相對位置(保藏號M31182)如下Bega(AF049221)E0部分序列編碼完整病毒基因組的1171-1897；Trangie(AF049222)E0部分序列編碼完整病毒基因組的1171-1897；Bega(AF049225)E1和E2部分序列編碼完整病毒基因組的2253-3490；Trangie(AF049223)E1和E2部分序列編碼完整病毒基因組的2290-3490；Clover Lane(AF037405，Becher等，1998)E1和E2部分序列編碼完整病毒基因組的2360-3510；Bega(AF052303)NS3、NS4a部分序列編碼完整病毒基因組的5416-7591；Trangie(AF052304)NS3、NS4a部分序列編碼完整病毒基因組的5675-7528。病毒RNA的提取用標準技術由所有主要免疫原區(E0、E1/E2和NS3、NS4A)的澳大利亞BVDV分離物轉錄cDNA。簡單地講，用RNAzol(Biotex實驗室公司)或TRIzox試劑(Gibco BRL)按照生產商的說明從受感染的細胞和/或病毒沉淀中提取病毒RNA。在10微升或20微升用無菌焦碳酸二乙酯(DEPC)(Sigma)處理過的水中重建干燥的DNA沉淀(Sambrook等，1989)。逆轉錄生產E1/E2、NS3和E0免疫原區的cDNA通過按表1所示制備E1/E2逆轉錄酶(RT)混合物，進行逆轉錄生產E1/E2的cDNA。在37℃下在FTS-960熱循環儀(Corbett Research)中加熱試管50分鐘，然后在70℃下加熱10分鐘，以便使逆轉錄酶變性。在通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增cDNA之前在5℃下將RT混合物冷卻2分鐘。
同樣按照表2制備NS3RT混合物，通過RT制備NS3的cDNA。在37℃下在FTS-960熱循環儀中加熱試管59分鐘，然后在94℃下加熱15分鐘，以便使逆轉錄酶變性，然后通過PCR擴增cDNA。
通過按表3所示制備RT混合物生產E0的cDNA。在37℃下在FTS-960熱循環儀中加熱試管50分鐘，然后在70℃下加熱10分鐘，以便使逆轉錄酶變性。在通過PCR擴增cDNA之前在5℃下將RT混合物冷卻2分鐘。
表1

表2

表3

PCR寡聚核苷酸引物BVDV分離物Trangie和Bega的PCR引物基于海外瘟病病毒分離物的公開序列的保守區。BDV分離物Clover Lane的引物是用其公開序列(Becher等，1998)制備的。引物是用計算機程序‘PrimerDesigner-2.0版’(科學和教育軟件，1990，1991)設計的，并包括整合在里面的限制位點，以便能夠定向克隆該cDNA(表4和5)。通過聚合酶鏈式反應擴增cDNA按照類似方法擴增來自E1/E2、NS3/NS4A和E0的cDNA。擴增反應是在100微升的總體積中進行的。向20微升RT中添加8毫升10倍PCR緩沖液(100mMTris-HCl；15mM氯化鎂；500mM氯化鉀；pH8.3Boehringer Mannheim)，7.2毫升25mM氯化鎂(使氯化鎂的最終濃度為3.3mM；Sigma，分子生物學級)，2.5單位Taq DNA(BoehringerMannheim)和有義和反義引物各1微升(每毫升30皮摩爾)。
首先在95℃下將E1/E2 cDNA變性2分鐘，然后進行35個循環的95℃變性30秒，在55℃下退火30秒，并在72℃下延伸1分鐘。包括一個在72℃下進行5分鐘的最終延伸步驟。然后將試管冷卻到5℃保持2分鐘。
表4 a限制酶位點用粗體表示，bGenBank保藏號為AF049223，cGenBank保藏號為AF049225，dGenBank保藏號為AF037405，Becher等(1998)，eGenBank保藏號為F049222，fGenBank保藏號為F049221，gGenBank保藏號為F052304，hGenBank保藏號為M31182Collett等(1988)，★E1/E2片段編碼含有69個氨基酸的蛋白，從E1開始并在E2末端之前35個氨基酸處結束，◆編碼完整長度的E0蛋白， 碼NS3蛋白，沒有絲氨酸蛋白酶，并且包括編碼存在于CSFV中的T-細胞表位的區域(Pauly等，1995)。
表5 a限制酶位點用粗體表示，b在框架中，終止密碼子在反義引物下面劃線表示，cGenBank保藏號為AF049223，dGenBank保藏號為AF049225，eGenBank保藏號為AF037405，Becher等(1998)，fGenBank保藏號為F049222，gGenBank保藏號為F049221，hGenBank保藏號為F052304，iGenBank保藏號為M31182Collett等(1988)，★E1/E2片段編碼含有69個氨基酸的蛋白，從E1開始并在E2末端之前35個氨基酸處結束，○編碼完整長度的E0蛋白，◆編碼NS3蛋白，沒有絲氨酸蛋白酶，并且包括編碼存在于CSFV中的T-細胞表位的區域(Pauly等，1995)。
Clover Lane(BDV)PCR混合物不需要氯化鎂，并且只需要一個單位的Taq DNA聚合酶進行擴增。
按照擴增E1/E2的方法擴增E0，所不同的是，開始的變性步驟是94℃下進行2分鐘。
NS3 cDNA的擴增是在50微升的總體積中進行的，使用來自逆轉錄反應的共20微升反應物，向其中添加了3微升10倍PCR緩沖液(100mMTris-HCl；15mM氯化鎂；500mM氯化鉀；pH8.3BoehringerMannheim)，2微升25mM氯化鎂(使氯化鎂的最終濃度為3mM；Sigma，分子生物學級)，1-2單位Taq DNA(Boehringer Mannheim)和有義和反義引物各1微升(每毫升25-30皮摩爾)。在進行94℃3分鐘最初的變性步驟之后，進行30輪變性94℃30秒，在55℃下退火30秒，并在72℃下延伸2分鐘。在將試管冷卻到4℃之前還要在72℃下進行5分鐘的最終延伸步驟。
PCR片段的克隆用PCR SPINCLEANTM柱(Prgen Industries，Limited)按照生產商的說明純化PCR產物。如果PCR除了所需要的產物之外還產生了非專一性帶，或者必須從其他質粒中亞克隆的話，使用Heery(1990)描述的改進方法從0.8％的瓊脂糖凝膠中洗脫對DNA作進一步的純化。
使用標準克隆方法(SamBrook等，1989；當代分子生物學方法，1991)消化純化的PCR片段，并連接到含有匹配的粘性末端的pBlueBacHis A、B或C桿狀病毒轉化載體(MaxBac桿狀病毒表達系統，Invitrogen公司)上。A、B或C載體提供三種不同的讀框，以便在所述桿狀病毒表達系統中實現蛋白表達(表6)。
表6

業已證實難于將NS3/NS4A直接克隆到pBlueBacHis桿狀病毒轉化載體上，因此首先用Invitrogen TA克隆試劑盒將其克隆到pCRTMII質粒(Invitrogen公司)上。該過程的方法是按照生產商的說明進行的。然后按照克隆該基因組的其他片段的方法將NS3片段亞克隆到pBlueBacHis B載體上。用含有PCR片段的桿狀病毒質粒轉化將粘接產物轉入感受態大腸桿菌菌株Top10(Invitrogen公司)，基因型F-mcrA D(mrr-hsdRMS-mcrBC)f80lacZDM15 DlacX74deoR recA1 araD139D(ara-leu)7697 galU galK rpsL endA1 nupG，和/或Sure大腸桿菌(Stratagene)，基因型e14-(McrA-)D(mcrCB-hsdSMR-mrr)_171 endA1supE44 thi-1 gyrA96 rel A1 lac recB recJ sbcc umuc∷Tn5(kanr)uurC[F’proABlaclaZ D m15 Tn10(Tetr)]c.制備感受態細胞和轉化細菌的方法是從InvitrogenMaxBac桿狀病毒表達系統手冊1.8版獲得的。篩選細菌克隆尋找含有PCR片段的質粒和純化用于轉染的質粒按以下方法鑒定含有pBlueBacHis+PCR片段的細菌克隆生長克隆，用在SamBrook等(1989)所披露的煮沸微量制備方法提取質粒，然后對所述質粒進行限制性消化，以便確定含有正確大小的插入片段。用質粒純化試劑盒(QIAGEN Pty有限公司，tip-20或tip-100柱)按照生產商的說明將重組質粒純化到適合轉染反應的水平。
通過用于生產重組桿狀病毒的對St9細胞的陽離子脂質體轉染，生產純化的重組桿狀病毒通過陽離子脂質體介導的轉染，將線性化的野生型苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcMNPV)DNA和含有PCR片段的桿狀病毒轉化載體共轉染到Sf9細胞中生產重組桿狀病毒。這是按照InvitrogenMaxBac桿狀病毒表達系統手冊1.8版進行的。對體積作了一些小的改進，但對所采用的總體方法來說這種改變是不明顯的。噬菌斑純化重組桿狀病毒在制備病毒原種之前對重組病毒進行3次噬菌斑純化，以確保所述病毒是由單一的顆粒克隆的，并且不存在野生型病毒。噬菌斑測定是按照InvitrogenMaxBac桿狀病毒表達系統手冊1.8版建立的。
在每一輪噬菌斑純化之后，用改進的瘟病病毒抗原捕獲ELISA(PACE)篩選重組病毒(Shannon等，1991)。所述改進的方法包括將上清液+細胞(50微升/孔)直接添加到封閉的、洗滌過的ELISA平板上，并在37℃下培養平板1小時。然后加入抗體溶液(50微升/孔)。所使用的抗體是生物素化的山羊抗瘟病病毒抗血清或單一的抗E2或抗NS3單克隆抗體(mAbs)。在22℃下培養所述平板過夜，然后按照Shannon等所述方法發展(1991)，對于與生物素化的山羊抗血清起反應的樣品來說，省略與生物素化的抗小鼠IgG的孵育。應當指出的是，在PACE中未檢測到重組的桿狀病毒表達的E0。重組桿狀病毒原種、種子母液和工作母液所構建的每一種桿狀病毒的病毒原種是按照InvitrogenMaxBac桿狀病毒表達系統手冊1.8版制備的。如上所述母液的效價是按照上述噬菌斑測定確定的，所不同的是，用1.5％的羧甲基纖維素(CMC，BDH；溶解在去離子化水中的6％的CMC，以1∶4的比例用完全TC100+X-gal稀釋[125微克/毫升，Boehringer Mannheim])覆蓋所述細胞。7天之后，統計蘭色噬菌斑，得出病毒的效價。
組織母液和工作母液是用0.1-0.5pfu/毫升的低MOI分別由原種和種子母液制備的。所有病毒母液在4℃下保存以便用于疫苗生產。為了長期保存原種、種子母液和工作母液，將每一種重組病毒裝在安培瓶中并在-80℃下冷凍。重組蛋白生產的優化將適應于Gibco BRL所披露方法的Sf-900II無血清培養基(1995)的Sf9昆蟲細胞懸浮液，用于優化重組蛋白表達。用0.1-5.0之間的高和低MOI的重組桿狀病毒，感染裝有50毫升細胞的兩個錐形燒瓶(1.5×106細胞/毫升)。第三個燒瓶被用作未感染的對照培養物。在28℃下對這三個燒瓶進行搖動培養，并以24小時的間隔取出5毫升的樣品，一直持續7天。
在室溫(RT)下以900×g對樣品進行10分鐘的離心，并小心除去上清液。在-20℃下保存沉淀和上清液，直到每天的取樣結束。然后用上述改進的PACE測定樣品中特定重組瘟病病毒蛋白的量。將細胞沉淀重建在200微升或250微升NP-40(1％[v/v]，溶解在PBS中)，旋轉攪拌，并在室溫下以900×g的速度離心10分鐘。對沉淀提取物的系列稀釋液(溶解在1％[v/v]NP40中)進行。對未稀釋過的培養上清液進行測定，并且對系列稀釋過的上清液進行測定(溶解在1％[v/v]NP40中)。
發現細胞生活力在較高感染率的情況下降低。因此，0.1-2MOI是更為合適。優化表達時間以及重組蛋白在昆蟲細胞懸浮培養物中的位置，在上清液或細胞沉淀部分中的位置如表7所示。
表7

a在PACE不能檢測到這些蛋白，因此，收獲的時間取決于收獲其他重組蛋白的時間。b上清液和細胞都需要收獲，因為在昆蟲細胞懸浮培養物中的位置無法精確確定。
對于表達的E1/E2蛋白來說，在構建所述基因組的編碼該部分的cDNA時，以及在制備決定昆蟲細胞培養物中蛋白表達的重組桿狀病毒時，故意去掉了該蛋白的疏水性‘尾巴’。這會導致上述蛋白的大部分通過正常的蛋白分泌途徑從昆蟲細胞中轉運出來，并分泌到細胞培養介質中。因此，大多數蛋白是從昆蟲細胞培養物的上清液部分回收的。
相反，所表達的NS3/NS4A蛋白被“約束”在昆蟲細胞內，因此，是在培養時間結束時從沉淀的細胞中收獲的。用臺式離心機以2000×g的速度離心10分鐘使細胞沉淀，并以小的體積使這種重組蛋白的收獲最大化。對于E0(Erns)重組表達蛋白來說，其位置無法確定，因此，要收獲培養上清液和昆蟲細胞。
例2在體外將免疫遺傳學BVDV蛋白結合在昆蟲細胞hsps上在該實施例中所使用的昆蟲細胞是草地灘夜蛾9(Sf9)細胞。(Invitrogen公司，美國)。建立單層Sf9昆蟲細胞該方法基于InvitrogenMaxBac桿狀病毒表達系統手冊1.8版。在37℃下將冷凍的細胞樣品(典型的是保存在液氮箱中的1.0毫升的小瓶)快速解凍，用70％(v/v)乙醇洗滌所述小瓶，在室溫(RT)下將所述細胞轉移到裝有15毫升完全TC100培養基(GIBCO BRL TC100，補充了10％FCS[Trace生物科學Pty有限公司]并含有青霉素和鏈霉素[各100單位/毫升]75cm2的組織培養瓶中。
在28℃下培養所述燒瓶1小時使細胞結合(Clayson培養箱，Edwards儀器公司)，然后用20毫升新的完全TC100取代所述培養基。每隔48小時更換培養基，直到細胞鋪滿，在此階段按以下方法進行傳代。除去培養基并更換5毫升新的培養基，將細胞輕輕地從燒瓶底部刮下，并在室溫下將1毫升細胞懸浮液轉移到裝有19毫升完全TC100的新的75平方厘米的組織培養燒瓶中。轉動燒瓶使細胞均勻分布在其底部，然后將燒瓶放置在28℃下并使細胞按上述方式生長。Sf9昆蟲細胞的懸浮培養該方法基于InvitrogenMaxBac桿狀病毒表達系統手冊1.8版。在細胞作為單層培養物傳代3-4之后，將其作為懸浮物生長。用于該培養物的培養基是含有1％(v/v)pluronic F-68(10％溶液；Gibco BRL)的完全TC100。為了生產該懸浮培養物，首先取出鋪滿單層的細胞的培養基，并馬上換上5毫升的新的培養基。將細胞輕輕地從燒瓶底部刮下，并將細胞懸浮液轉移到裝有25毫升含有pluronic的培養基的100毫升羅紋蓋錐形燒瓶中，該燒瓶在28℃下培養在定軌搖床上(Bio-Line；Edwards儀器公司)以80rpm的速度至少搖動1小時，然后在剩余的生長時間內將搖動速度提高到110rpm。當細胞密度達到大約2×106細胞/毫升時，再添加30毫升培養基。讓細胞在50毫升體積繼續生長，并在細胞密度達到2×106細胞/毫升時傳代。此時，用培養基稀釋細胞達到大約0.52×106細胞/毫升，并在28℃下培養，以110rpm的速度搖動，直到再次傳代。使Sf9昆蟲細胞適應在由無血清培養基制成的懸浮培養物中生長按照Gibco BRL(1995)所披露的方法，使昆蟲細胞適應在由無血清培養基制成的懸浮培養物中生長。將在含有pluronic的完全TC100中生長的細胞，以5×105細胞/毫升的密度轉移到50毫升含有青霉素和鏈霉素(各100單位/毫升)的無血清培養基(Sf-900II SFM；Gibco BRL)中讓細胞繼續生長到密度為2×106細胞/毫升，然后以5×105細胞/毫升的密度傳代。這一過程一直持續到細胞密度為2×106細胞/毫升，細胞的生活力達到至少80％。然后就認為該細胞適應在無血清培養基中生長，然后用無血清培養基按照細胞在含有pluronicF-68的完全TC100培養基中生長的相同方法進行傳代，如在懸浮液中培養Sf9昆蟲細胞所描述的那樣。用于表達重組瘟病病毒蛋白的Sf9細胞的要求用于表達重組瘟病病毒蛋白的存在于無血清培養基中的Sf9細胞，在培養物中必須低于30代。以0.5×106細胞/毫升的密度用Sf9細胞接種錐形燒瓶(500毫升)，最終體積為150毫升。當該燒瓶中的細胞達到1.0-1.5×106細胞/毫升的密度時，用編碼所需要表達的瘟病病毒蛋白的合適的重組桿狀病毒感染細胞。生產編碼瘟病病毒蛋白的重組桿狀病毒重組桿狀病毒的生產和重組瘟病病毒蛋白的表達如例1所示。感染復數根據各種重組桿狀病毒母液的效價，以0.1-2.0的感染復數(MOI)感染Sf9昆蟲細胞。結果如表8所示。
在用重組桿狀病毒感染過的Sf9細胞培養物中誘導熱激蛋白如下說明的，對于能表達特殊瘟病病毒重組蛋白的Sf9昆蟲細胞培養物，優化其用于誘導在該昆蟲細胞培養物中生產熱激蛋白的實驗時間和溫度。
NS3/NS4A重組桿狀病毒感染過的培養物的熱激條件在28℃下，培養被表達截短的瘟病病毒NS3/NS4A蛋白的重組桿狀病毒感染的Sf9昆蟲細胞，以110rpm的速度搖動培養48小時。將感染細胞培養物的燒瓶連同類似的‘模擬’細胞培養物燒瓶一起放入43℃的水浴中，所述模擬燒瓶中裝有放在150毫升水中的溫度計。當溫度計達到43℃時開始10分鐘的培養，然后每隔2分鐘通過攪拌燒瓶里的培養基和細胞進行輕柔的混合。該條件被確定為表達瘟病病毒重組蛋白的Sf9細胞的最佳熱激條件。然后將細胞培養燒瓶放回培養箱中(28℃)，以110rpm的速度搖動再培養2小時，使得所述昆蟲細胞表達熱激蛋白(hsps)，并與瘟病病毒NS3重組蛋白結合。
表8

E1/E2和E0重組桿狀病毒感染的培養物的熱激條件在28℃下培養用表達E1/E2或E0瘟病病毒蛋白的重組桿狀病毒感染的Sf9昆蟲細胞，以110rpm的速度搖動培養24小時。然后按照與上述完全相同的方法對感染的細胞培養物進行熱激(43℃10分鐘)。然后將裝在燒瓶中的細胞培養物送回到培養箱(28℃)中，并以110rpm的速度搖動培養細胞24小時。在該系統中，在24小時對表達E1/E2蛋白的培養物進行熱激，這一點與NS3/NS4A蛋白的48小時不同，以確保E1/E2重組蛋白在從Sf9細胞中轉運出去并進入細胞培養基中之前與昆蟲細胞hsps結合。由于尚未確定重組E0瘟病病毒蛋白是否是從昆蟲細胞中分泌的，或者是保留在細胞內部，同樣在用所述重組桿狀病毒感染24小時之后對能產生E0瘟病病毒蛋白的Sf9培養物進行熱激。未感染過的對照細胞培養物的熱激條件在28℃下培養(以110rpm的速度搖動)未感染過的Sf9昆蟲細胞培養物48小時。完全按上文所述對該對照細胞培養物進行熱激。然后將細胞培養燒瓶送回到28℃的培養箱中，以110rpm的速度搖動培養2小時，以便由受到脅迫的細胞產生昆蟲細胞熱激蛋白。從Sf9細胞培養物中收獲單一的重組瘟病病毒蛋白[NS3重組蛋白+熱激蛋白(hsps)]通過以2000×g的速度離心10分鐘，從培養基中分離細胞然后將含有NS3/NS4A抗原的細胞沉淀，重新懸浮在體積為原始體積1/6的含有5微克/毫升亮抑蛋白酶肽(蛋白酶抑制劑，ICN生物醫學公司)的無血清培養基中(Sf900II SFM；Gibco BRL)。由此得到了有效的6倍濃度的細胞+重組NS3/NS4A抗原。然后在-80℃下對所述細胞進行兩次冷凍/解凍，以便破壞細胞膜，并將NS3重組蛋白連同重組桿狀病毒一起釋放到培養基中。從Sf9細胞培養物中收獲單一的重組瘟病病毒蛋白[E1/E2重組蛋白+熱激蛋白(hsps)]通過以2000×g的速度離心10分鐘，從培養基中除去細胞。再次向含有表達的E1/E2蛋白的上清液中添加亮抑蛋白酶肽(蛋白酶抑制劑)，使最終濃度為5微克/毫升。添加該蛋白酶抑制劑能抑制所表達的蛋白降解。從Sf9細胞培養物中收獲單一的重組瘟病病毒蛋白[E0重組蛋白+熱激蛋白(hsps)]對于表達這種特殊蛋白的昆蟲細胞培養物來說，收獲所有的培養物(細胞和培養基)，并以5微克/毫升的最終濃度添加亮抑蛋白酶肽。然后對該培養物進行兩次冷凍/解凍，以便破壞細胞膜，將重組桿狀病毒和所有與細胞相關的E0蛋白釋放到培養基中。從Sf9細胞培養物中收獲單一的重組瘟病病毒蛋白[對照細胞+熱激蛋白(hsps)]與上述收獲NS3/NS4A相同的方法收獲對照(未感染過的)培養物。不過，將對照細胞濃縮10倍。重組桿狀病毒的β-丙內酯(βPL)失活對通過桿狀病毒載體表達載體系統所生產的所有重組蛋白制劑進行兩次βPL失活(使用β-丙內酯，Sigma Aldrich Fine Chemicals)，并對對照細胞制劑進行兩次βPL失活。在所有場合下都使用由Commonwealth血清實驗室所采用的標準方法(CSL，“用β-丙內酯使桿狀病毒失活，1998”)。為了確保殘余的傳染性桿狀病毒留在“失活的”材料中，每一種制劑在Sf9單層中傳代3次。最后的傳代在Sf9噬菌斑測定中進行滴定，用含有125毫克/毫升X-gal(BoehringerMannheim)的1.5％羧甲基纖維素(CMC，BDH；用去離子水制備的6％CMC，以1∶4的比例用完全TC100稀釋)覆蓋。噬菌斑測定是按照InvitrogenMaxBac桿狀病毒表達系統手冊1.8版建立的，并且噬菌斑測定在第7天讀數。沒有在用于制備所述亞單位疫苗的任何制劑中存在活的有傳染性的桿狀病毒的證據。因此，符合將實驗疫苗用于食品生產動物中的澳大利亞檢疫檢測機構(AQIS)要求。重組E0和E1/E2蛋白制劑的濃度在失活(如上文所述)之后，通過以2000×g的速度離心10分鐘，從培養基中分離表達E0重組蛋白的Sf9細胞，并將這些細胞在4℃下保存待用。然后按照生產商的說明，在單獨的Amicon UltrafiltrationCell步驟中，將含有重組E0蛋白的上清液濃縮5倍。然后將含有濃縮的E0蛋白的上清液再次與E0 Sf9細胞混合，以便制備最終的濃縮制劑。
對于失活的E1/E2重組蛋白來說，僅用AmiconUltrafiltrationCell對上清液部分進行濃縮。所述蛋白都是從重組桿狀病毒感染過的細胞中分離出來的，因此棄掉細胞部分。在瘟病病毒抗原捕獲ELISA(PACE)中通過滴定測定每一種制劑中重組瘟病病毒蛋白的含量通過改進的PACE(參見Shannon等，1991)滴定每一種重組蛋白制劑，測定在βPL失活之后重組蛋白的含量。對公開方法的改進包括，將樣品(50微升/孔)直接加到封閉的、洗滌過的ELISA平板上，并在37℃下培養平板1小時。然后添加抗體溶液(50微升/孔)。所使用的抗體是生物素化的山羊抗瘟病病毒抗血清(pAb)或單一的抗E2或抗NS3單克隆抗體(mAbs)。在22℃下將平板培養過夜，然后按照Shannon等所述方法(1991)進行發展，對于能與生物素化的山羊抗血清反應的樣品來說，省略了與生物素化的抗小鼠IgG孵育的步驟。
應當指出的是，在該測定系統中不能檢測到重組E0蛋白，因為該蛋白既不能與多克隆抗體又不能與單克隆抗體起反應。因此推測該蛋白的濃度與所測定的類似的E1/E2表達的結構糖蛋白的濃度相似。摻入亞單位疫苗中的重組蛋白概述通過該實施例所披露的方法制備重組瘟病病毒蛋白Trangie NS3/NS4A，Trangie E0，Bega E0，Trangie E1/E2，Bega E1/E2，Clover Lane E1/E2，和對照細胞。不過，不對Bega Trangie E1/E2進行熱激，將TrangieE1/E2濃縮6倍而不是5倍，并按照處理重組E0蛋白制劑的方法處理BDV Clover Lane E1/E2重組蛋白。重組實驗亞單位疫苗在表9中示出了例4中使用的疫苗制劑的組成。總之，每一劑重組瘟病病毒疫苗包括1毫升Bega E0，1毫升Trangie E0，1毫升Clover Lane E1/E2，0.5毫升Trangie E1/E2，1毫升Bega E1/E2和0.3毫升Trangie NS3/NS4A。將硫柳汞(汞化合物，Sigma Aldrich)添加到疫苗混合物中，以避免細菌污染，它在疫苗中的最終濃度為0.1％(w/v)。以每一劑疫苗中2毫克的用量添加Isocomatrix佐劑(Commonwealth血清實驗室，澳大利亞)。所制成的疫苗在4℃下保存，直到注射到牛體內(在首次用藥之后4周進行第2次用藥)。對照疫苗在表9中還示出了對照疫苗的配方。總之，每一劑對照疫苗含有4.8毫升的對照細胞制劑。同樣將硫柳汞添加到對照疫苗中，以避免細菌污染，在疫苗中的最終濃度為0.1％(w/v)。以每劑疫苗2毫克的用量添加Isocomatrix佐劑(CSL)，與實驗疫苗中的用量相同。在4℃下保存對照疫苗制劑待用。在試驗中，在給接種動物使用實驗亞單位疫苗的同一天，給對照動物使用兩劑對照疫苗。
表9


表9(續)混合重組蛋白以便生產亞單位疫苗反應抗原 1×劑量 27×劑量BEO 1毫升 27毫升TEO 1毫升 27毫升CLE1/E2 1毫升 27毫升TE1/E2 0.5毫升 13.5毫升TNS3/NS4A0.3毫升 8.1毫升BE1/E2 1毫升 27毫升總體積 129.6毫升將1.29毫升硫柳汞添加到129.6毫升疫苗混合物中，取出9.6毫升，并以1毫升的等份試樣在-20℃下保存。
向其余的120毫升混合物中添加32.5毫升Iscomatrix佐劑，并攪拌2分鐘以便充分混合。
將其等分到兩個容器中，即每個容器68毫升，并在4℃下保存。
在具有18號針頭的10毫升注射器中建立疫苗-每個劑量的最終體積為6毫升。
對照疫苗1個劑量 16個劑量對照細胞制劑4.8毫升 28.8毫升Iscomatrix佐劑 3毫升7.8毫升硫柳汞 0.048毫升0.29毫升在具有18號針頭的10毫升注射器中建立對照疫苗-每個劑量的最終體積為6毫升。
例3亞單位疫苗對澳大利亞牛的影響亞單位胚胎保護實驗方法一共選擇22頭瘟病病毒抗體陰性、未懷孕的小母牛用于該實驗。用按照例1和例2所制備的亞單位疫苗(6毫升)對一組動物(n＝10)接種兩次，中間間隔4周。用對照制劑(6毫升)對另一組動物(n＝12)進行接種。以規定的間隔對所有動物進行放血，并使用復合體-跟蹤-封閉ELISA(CTB-ELISA)方法測定抗E2和抗NS3的流動，該測定方法是由Elizabeth Macarthur農業研究所(EMAI)建立的。
在第2次接種之后，使這些動物同時發情。在檢測出發情之后馬上進行人工受精。在第2次接種之后11周，所有動物都被判定為受孕，并發育了超過6周的胚胎，這一時間點被認為是容易受BVDV感染的時間。然后用一個劑量(3×106TCID50)的活的異源BVDV分離物GienInnes刺激這些小母牛。
在病毒刺激之后6周，在出口屠宰場(Mudgee)分兩組宰殺所有的小母牛。從懷孕的小母牛體內收集胚胎。就是說，在接種組中有來自10個動物的7個胚胎，而在對照組中有來自12個動物的9個胚胎。
在無菌條件下收集每一個胚胎組織。采用了若干方法來測試BVDV感染的存在。首先使用了對E2抗原或NS3抗原專一的兩種抗原捕獲ELISA。其次，用一組單克隆抗體檢測用標準技術分離的受感染的細胞，并進行免疫過氧化物酶(IPX)染色。最后，使用5’-UTR病毒專一性RT-PCR。上述方法的組合可以靈敏地和專一地檢測從所述小母牛中收集到的受感染的和未感染的胚胎。E2亞單位疫苗對牛對BVDV免疫反應的影響在圖1中示出了接種過的和對照組的小母牛，在接種之前和之后以及在活的病毒刺激之后，抗E2(中和)抗體的平均濃度。
抗E2抗體的平均濃度對時間作圖表明，該亞單位疫苗在接種組中產生了極高濃度的抗E2抗體。高效價的抗體在服用第2劑疫苗2周之后便出現了。接種過的小母牛體內的抗E2抗體的濃度明顯高于對照組的濃度。在隨后的9周時間內，接種組的抗E2的濃度略有降低，但仍然明顯高于對照組的小母牛。
在用活的BVD病毒刺激7天之后，在接種組中觀察到了E2抗體濃度的快速的記憶性升高，該抗體的濃度持續升高到刺激后9天，此后，保持持續的最大濃度。與這一趨勢相反，在對照組中，只是在用活的病毒刺激之后觀察到抗E2抗體濃度的升高。然后在對照組中觀察到了正常反應的發生，抗E2抗體的平均濃度在刺激之后14天開始發展。不過，直到刺激之后3-4周還沒有達到最強的反應。
因此，用所述亞單位疫苗接種懷孕的小母牛，在病毒感染之后的最初4-7天產生免疫反應。這是一個重要階段，在此期間活的病毒穿過胎盤達到發育中的胚胎。上述結果清楚地表明，在亞單位疫苗接種過的小母牛組(n＝10)，活的病毒的復制受到拮抗。這是首次報導一種亞單位疫苗的這種反應。NS亞單位疫苗對牛對BVDV免疫反應的影響在圖2中示出了接種過的和對照組小母牛中抗NS3抗體的濃度隨時間的變化。另人吃驚的是，在接種之后在接種過的小母牛中沒有檢測到抗NS3抗體。出現這一結果的原因尚不清楚。不過，這一結果具有開發“標記”疫苗的巨大潛力。所有“自然感染”動物在感染BVDV之后21天產生了抗NS3抗體。由于用所述亞單位疫苗接種過的動物不產生抗NS3抗體(如下文所述)，這些動物很容易與“天然感染的”動物區分。
很有可能抗NS3蛋白通過誘導CD8+細胞毒性T細胞導致了強的細胞介導的免疫反應的產生，盡管沒能誘發抗體反應。
在用活的病毒刺激之后，接種過的小母牛(10頭中的7頭)直到刺激之后5-6周才出現明顯的抗NS3抗體。其余的3頭接種過的小母牛在刺激之后3-6周出現了抗NS3抗體。不過，抗體的濃度明顯低于對照組小母牛的。相反，對照組小母牛(n＝12)在刺激之后14-18天出現了正常的抗體反應，在刺激之后4周達到高峰(圖2)。
以上結果清楚地表明，在亞單位疫苗接種過的小母牛組(n＝10)中，活病毒的復制受到抑制。這是首次報導亞單位疫苗的這種反應。很顯然，針對受感染細胞的推測的CTL反應的早期發生抑制了所述病毒的復制。因此，在接種過的動物中沒有足夠的病毒循環以便通過胎盤并感染胚胎。由亞單位疫苗誘導的中和抗體的濃度用不同的BVDV分離物進行血清中和實驗(SNTs)，以便研究由亞單位疫苗所誘導的中和抗體的濃度，并測定由活病毒刺激所產生的記憶反應。
該實驗的結果示于表10中。正如由圖1所示結果所預料的，在接種過的小母牛組中，在接種之前沒有觀察到抗體反應。不過，在2次接種之后，在與疫苗相關的兩種BVDV分離物(Trangie和Bega)中觀察到了很好的抗E2中和抗體反應(平均效價為1∶1000)。相反，對綿羊BDV分離物(Clover Lane)的中和抗體反應很低(平均效價為1∶50)，即使將來自該病毒的重組E2蛋白摻入所述疫苗中與hsps組合也是如此。不過，由該亞單位疫苗所獲得的中和抗體的濃度，大于在以前的實驗中用失活的完整(Clover Lane)病毒所獲得的濃度(結果未公布)。
在第二次使用疫苗4周后，對異源攻擊病毒Glen Innes進行的SNTs表現出了極高的交叉反應性(平均效價為1∶1200)。這一發現證實，E2蛋白的組合能產生對異源病毒的很好的交叉保護。一種親源關系更遠的BVD病毒Braidwood表現出更低的中和抗體濃度(平均效價為1∶400)，但這與抗這種病毒感染的有效抗體產生相關。
在攻擊之后7天和14天，對從接種過的動物體內收集的血清進行的SNT測定(表10)更為驚人。用亞單位疫苗中的三種病毒的每一種進行測定。結果可以看出，在攻擊之后僅7天在抗E2抗體水平就存在極高的記憶反應。在第7天，Trangie和Bega BVDV病毒的平均SNT在1∶14000-16000范圍內，但在攻擊之后14天升高到異乎尋常的濃度。在攻擊之后14天，抗Trangie的平均效價為1∶180000，有兩只動物的效價高達1∶512000。類似地，在14天抗Bega的平均效價為1∶100000，有3只動物抗Bega的效價為1∶256000。這樣高的效價在“自然感染”的動物上是罕見的。
表10 ＝血清稀釋始于1∶4；結束時為2倍稀釋液 ＝Trangie和Bgea的血清稀釋液始于1∶1000，Clover Lane始于1∶100；結束時為2倍稀釋液表11

在用失活的、完整病毒疫苗或含有重組蛋白的非傳染性亞單位疫苗接種4周之后，比較在牛上測定的針對三種病毒的中和效價。把(φ)Trangie和(BVDV分離物)Clover Lane(BDV分離物)添加到兩種疫苗中。在亞單位疫苗中，Clover Lane E2重組蛋白在體內與熱激蛋白(hsps)結合；(∴)＝Glenn Innes是用于兩種實驗刺激活的病毒)(BVDV分離物明顯不同于所述疫苗病毒。)
因此，可以得出這樣的結論，亞單位疫苗在“啟動”動物對以前未觀察到的活的病毒刺激做出反應方面具有顯著作用。
SNT測定發現了對BDV分離物Clover Lane的強的“啟動”反應(表10)。在用完全不相關的活病毒(BVDV Glen Innes)刺激之后7天，對Clover Lane的SNT表現出1∶1024的效價(從接種之后測得的1∶50提到到這一效價)。對Clover Lane的效價在第14天提高到平均為1∶12000，其中一只動物抗綿羊分泌物的效價為1∶640000。由此提供了該亞單位疫苗能夠對所有澳大利亞牛和綿羊瘟病病毒提供廣譜保護的進一步的證據。這種保護作用遠遠大于用目前失活的完整病毒疫苗所能獲得的保護。
對三種澳大利亞瘟病病毒進行另外的SNTs。用來自Trangie+Bega+Clover Lane+分離物的兩種不同的疫苗對兩種動物進行接種，并直接進行比較。在第一組，用實驗性失活的完整病毒疫苗進行接種。第二組動物用亞單位疫苗(+hsps)進行接種。在接種第二劑疫苗之后4周，從這兩組的接種過的牛上采集血清。
抗這三種病毒的SNTs的結果如表11所示。對這三種病毒的比較發現，亞單位疫苗所產生的效價比由失活的疫苗所誘導的相應的效價至少高4倍。另外，這兩種疫苗都對完全不相關的BVDV分離物“Braidwood”產生了交叉中和，與失活的疫苗相比(結果未顯示)，在用亞單位疫苗接種4周之后的效價同樣提高了差不多4倍。
因此，通過開發這種亞單位疫苗可以滿足所有牛生產國對范圍更廣的疫苗的需求。亞單位對BVDV向胚胎轉移的影響按上文所述，用三種不同的BVDV-專一性測定(表12)在EMAI測試從懷孕的接種過的小母牛體內獲得的胚胎(n＝7)上采集的組織樣品和從懷孕的對照小母牛體內獲得的胚胎(n＝9)上采集的組織樣品。從所有三種測試可以看出，在從懷孕的接種過的小母牛體內獲得的7個胚胎中的任一個上都沒有BVDV感染。相反，如通過病毒分離和RT-PCR測定所顯示的，在對照組的9個胚胎中有5個受到感染。
因此，可以認為在有最大的可能使病毒轉移到發育中的胚胎的時候，接種能對活的異源BVDV刺激產生100％的保護作用。
表12

(∴)＝信噪比。比例＞2.0在PACE中對胎盤組織是有效的。(Δ)＝有效的E2結果很低。通過高S/N比例和NS3單克隆對陽性組織所證實的結果。(φ)＝在子宮中明顯死亡的胚胎。結果證實胚胎是受到感染的。([)弱的病毒分離陽性-僅有單細胞附著在微量平板上。因此在該死亡的胚胎中病毒的效價較低。通過診斷性RT-PCR證實的結果。
例4亞單位疫苗對澳大利亞綿羊的影響用綿羊對亞單位蛋白進行另外兩種實驗，以便進一步研究所述疫苗的保護作用。進行該實驗是為了與熱激蛋白的結合/不結合的單一病素蛋白相比較，檢驗蛋白的組合(與熱激蛋白結合)在針對用于牛實驗的相同的活的異源瘟病病毒轉移中所提供胚胎保護的作用。盡管用相同的BVDV分離物(Glen Innes)刺激綿羊，其劑量降低到每只綿羊2×105TCID50，或者比用于刺激牛的活的病毒量低50倍。
在上述第一個實驗中包括24只綿羊，用兩種不同的商業化佐劑制劑制備相同的牛亞單位疫苗。分別給2組8只綿羊使用2劑亞單位蛋白，而給8只綿羊注射含有昆蟲細胞但沒有瘟病病毒蛋白的對照制劑。在研究過程中，以與牛亞單位實驗相同的方式對接種過的和對照綿羊的血清抗E2和NS3抗體進行抗體測定。在第二次接種之后立即讓公羊對母羊進行配種。在接種10周之后，在所有的母羊都懷孕以后，用活的異源瘟病病毒(Glen Innes病毒)對其進行刺激。5周之后，將所有母羊宰殺，并收集胚胎進行測定，以便確定是否在其胚胎組織中出現瘟病病毒感染。在胚胎組織中沒有任何可檢測到的瘟病病毒表明沒有病毒從母羊轉移到其胚胎中。這一結果相當于產生了完全保護，并且僅在2組接種過的動物中檢測到(參見下文)。
在圖3和圖4中示出了接種組和對照組綿羊的抗體反應。可以看出，接種過的動物的反應是產生大量抗E2抗體(相當于中和抗體)，在第二次接種疫苗之后2周開始。這一反應與在用相同亞單位疫苗接種過的牛上的抗E2抗體反應相似。不過，值得注意的是，通過ELISA在接種過的綿羊上測出的抗E2抗體的絕對含量(圖3)低于在接種過的牛上測定的相當的含量。與牛一樣，在接種過的綿羊上也有立即出現的記憶反應，在用活的病毒攻擊之后僅7天就測出高水平的抗E2抗體。這是一個好的證據，表明亞單位疫苗接種過的綿羊能在早期產生保護性抗體反應，就像例3中所示的接種過的牛一樣。
與牛一樣，綿羊在接種之后不產生任何NS3抗體(圖4)，證實了該亞單位制劑是一種‘標記疫苗’。在活的病毒刺激接種過的綿羊之后，很明顯的是，在刺激5周之后將這些母羊宰殺16只綿羊中有14只沒有產生任何抗NS3抗體。其余的2只綿羊與在同一時間點上與對照組的未保護過綿羊的抗NS3抗體含量相比，僅產生中等含量的抗NS3抗體(參見圖4)。總之上述結果明確證實，在綿羊中用亞單位疫苗接種，能降低在受到活的BVD病毒刺激之后病毒在母羊體內的復制。因此，在綿羊上所獲得的抗NS3抗體結果證實并擴展了在亞單位疫苗接種過的牛上面所獲得的結果。因此，重要的是要了解綿羊上病毒復制的減弱是否等同于保護了病毒不向接種過的母羊胚胎中的轉移。
胚胎分析結果表明，在兩個接種過的組之間胚胎保護指數沒有差別。因此，改變這兩種疫苗制劑中所使用的佐劑沒有作用。可以對來自這兩組的接種進行綜合，得到來自接種過的母羊的16個胚胎，用于與來自對照的未保護過的母羊的8個胚胎進行比較。對所有結果進行分析發現，總體上講，在接種過的母羊中有56％的完全胚胎保護(9/16的胚胎得到保護)，而在對照母羊中有100％的感染比例(8/8胚胎受到感染)。不過，與從對照母羊上獲得的胚胎相比，在從接種過的母羊上收集到的陽性胚胎中活的瘟病病毒轉移的比例為5/7，這是顯著的降低。這意味著在接種母羊的16個胚胎中僅有2個與對照組胚胎病毒含量相似的胚胎。因此，有87％的接種過的母羊要么沒有病毒的轉移，要么嚴格限制了其轉移。
這一結果表明，亞單位疫苗在綿羊上盡管不如在牛上有效，但仍對接種過的母羊產生高水平的保護作用。這兩個實驗明確表明了該亞單位疫苗制劑的強的保護作用。如下文所討論的，在牛和綿羊上的結果的差異有可能是由于綿羊對牛瘟病病毒刺激的承受能力較低。這是病毒的種間轉移，并且綿羊所具有的其免于通過種間障礙傳播的病毒的方法效果較差。
表13從亞單位接種過的和對照(未保護的)母羊體內收集的胚胎組織病毒含量(50％組織-培養感染劑量-TCID50)

□□組織中病毒含量的統計學上的顯著降低(P＜0.01)備注在來自接種過的母羊的7個胚胎中的病毒含量比來自未保護的母羊的8個胚胎的平均含量幾乎低1000倍。
在亞單位疫苗接種過的母羊的16個胚胎中，有14個要么完全受到保護(9)，要么每克組織的病毒顆粒少于103(5個胚胎)。因此，在接種過的母羊上對病毒胚胎轉移的完全或部分保護＝87％。
用24只綿羊進行的第2次實驗，研究了僅用來自牛瘟病病毒的一種免疫原蛋白的保護作用。將16只綿羊分成2組，每一組8只，用外被糖蛋白的與熱激蛋白(hsps)結合或沒有hsps的瘟病病毒兩種不同制劑進行接種。給另外8只綿羊既不含瘟病病毒蛋白又不含hsps的對照制劑。該實驗方法與前面的實驗方法相同，并且胚胎分析結果表明，將單一的瘟病病毒亞單位糖蛋白摻入疫苗中只能對相同的活的BVD病毒(Glen Innes)向胚胎的轉移產生弱的保護作用。總體上講，在接種的母羊中僅有29％的保護作用，其余71％的胚胎受到感染。不過，值得注意的是，E2糖蛋白與hsps結合的疫苗所產生的保護作用幾乎是不采用hsps的疫苗的兩倍。盡管由于受到保護的胚胎的數量低而使得這一結果不明顯，但其趨勢表明hsps確實具有增強疫苗效力的作用。在對照母羊中同樣有100％的感染比例(7/7)。該實驗清楚地表明，為了產生高水平的保護作用需要來自瘟病病毒的一種以上的蛋白。從牛和綿羊實驗上可以看出，亞單位疫苗的關鍵成分是與熱激蛋白結合的非結構蛋白NS3/NS4A。較小的外被糖蛋白E0的作用還不太清楚，但也有可能起著保護作用。
例5瘟病病毒的多表達系統為提高亞單位瘟病病素疫苗的商用存活力，必需在重組桿狀病毒中表達多于一種蛋白。這樣省去了單一蛋白表達所固有的耗時、昂貴的培養系統。為達到以下目的，即將最初的亞單位制備所用的6種不同的表達體系降低到最多為兩種培養物，我們研究了遺傳工程化的桿狀病毒多表達載體的可性能。
商業化的Multiple Transfer Plasmid pBAC4x-1是從Novagen購買的(目錄號70045-3)，并將兩種BVD病毒的4個不同的基因組區成功地插入該質粒。按以下順序將來自澳大利亞病毒Trangi和Bega的E1/E2片段以及來自Trangi病毒的截短的NS3片段和來自相同病毒的殼體/E0片段插入所述質粒的4個多限制位點上，使TC/E0和BE1/E2受桿狀病毒P10啟動子的控制，而TE1/E2和TNS3/NS4A受桿狀病毒多角體啟動子的控制。隨后證實所有4個基因組片段都處在正確的方向上，得到了含有4種不同BVDV蛋白的正確遺傳信息的轉移質粒。
在克隆到一系列噬菌斑分析之前，通過用pBAC4x-1轉移質粒轉染構建重組桿狀病毒。在克隆過程的每一階段對所制備的重組桿狀病毒進行檢測，以便證實其是否能在Sf9昆蟲細胞培養物高水平表達所有四種蛋白。有一種重組病毒在通過三輪噬菌斑純化和在Sf9培養物中進行三次克隆病毒的傳代之后表現出穩定的高水平表達所有四種蛋白。通過用特定的單克隆抗體滴定測定四種蛋白中每一種的表達水平。在表14中示出了在上清液和細胞中蛋白含量的結果。可以看出，所有四種蛋白在單一培養系統中都以很高的含量產生，每一種滴定的終止點在1∶64至1∶4096范圍內。表14.通過限制稀釋克隆三次并在Sf9細胞中傳代三次的多蛋白表達桿狀病毒。重組桿狀病毒是穩定的并且能夠以高水平表達所有蛋白。

為了進一步研究該多表達系統是否適用于疫苗生產，同樣對用重組4X-蛋白感染過的Sf9細胞進行熱激(43℃10分鐘)。然后在該培養物中生產蛋白，并在第4天確定適合于摻入疫苗中的蛋白的最終產量。與在不進行熱激處理的培養物中生產的產量進行比較。下面的表15提供了分析來自每一種培養物的上清液和細胞的收獲物中蛋白含量的結果表15.從多表達系統的上清液和細胞中收獲的E2、E0和NS3蛋白的滴定終點水平。培養物在27.5℃下生長4天，并對一種培養物進行熱激，以便使瘟病病毒蛋白與hsps結合。顯示了有/沒有hsps的對比含量。

值得注意的是，在含有多蛋白表達重組瘟病病毒的熱激培養物中，蛋白的產量不受熱激處理的影響。因此，桿狀病毒不會降低蛋白產量并且在該系統中大量蛋白與hsps結合是可能的。因此，該系統非常適用于疫苗生產目的。
作為另一個例子，構建了第二個Multiple transfer plasmid，它含有編碼其他瘟病病毒蛋白的cDNA，即Trangie E1/E2、Clover LaneE1/E2和Clover Lane NS3/NS4A，并選擇性地編碼Clover LaneE2/Bega E0。認為，這些額外的蛋白可以拓寬亞單位疫苗的保護作用，以便覆蓋由本領域的BVDV分離物所表現出的更寬的抗原多樣性的范圍。具體地講，包括來自Clover Lane分離物的兩種邊界病病毒(PDV)蛋白可以拓寬其保護作用，以便與含有6種蛋白的原始亞單位疫苗匹配。這樣僅對兩種培養物進行短時間的熱處理就能產生6種與hsps結合的瘟病病毒蛋白。可以用與例3所述相同的方法，在牛身上測試其在防止活的瘟病病毒向發育中的胚胎轉移方面的效力。
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1.一種生產含有與異源抗原性多肽結合的熱激蛋白(hsp)的免疫原性組合物的方法，該方法包括(a)在一種細胞中表達所述抗原性多肽，該細胞受到過一種刺激，這種刺激能導致在該細胞中誘導熱激反應；和(b)從所述細胞或培養介質中回收與一個或多個hsps結合的抗原性多肽。
2.如權利要求1的方法，其中，所述細胞是非哺乳動物細胞，而所述hsp是非哺乳動物hsp。
3.如權利要求2的方法，其中，所述細胞是非哺乳動物真核細胞，而所述hsp是非哺乳動物真核hsp。
4.如權利要求3的方法，其中，所述細胞是昆蟲細胞，而所述hsp是昆蟲hsp。
5.如上述權利要求中任一項的方法，其中，所述抗原性多肽是病原生物的抗原，或其片段或衍生物。
6.如權利要求5的方法，其中，所述病原生物是病毒或細菌。
7.如權利要求6的方法，其中，所述病毒是瘟病病毒。
8.如權利要求7的方法，其中，所述病毒是牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)。
9.如上述權利要求中任一項的方法，其中，所述抗原性多肽是通過以下方式在所述細胞中表達的將編碼所述抗原性多肽的多核苷酸導入所述細胞，所述多核苷酸可操作地連接于能夠指導所述多肽在所述細胞中表達的控制序列上。
10.如權利要求9的方法，其中，所述多核苷酸是病毒或病毒載體的一部分。
11.如權利要求10的方法，其中，所述細胞是昆蟲細胞，而所述病毒或病毒載體是桿狀病毒或桿狀病毒載體。
12.一種含有免疫原性復合體的組合物，該復合體包括通過權利要求1-11中任一項的方法獲得的與異源抗原性多肽結合的熱激蛋白(hsp)。
13.一種含有與異源抗原性多肽結合的源于非哺乳真核生物的熱激蛋白(hsp)的組合物，該組合物能夠在動物或人體內誘導對所述抗原性多肽的免疫反應。
14.如權利要求13的組合物，其中，所述hsp是昆蟲hsp。
15.如權利要求13或14的組合物，其中，所述抗原性多肽是病原生物的抗原，或者其片段或衍生物。
16.如權利要求13-15中任一項的組合物，其中，所述病原生物是病毒或細菌。
17.如權利要求16的組合物，其中，所述病毒是瘟病病毒。
18.如權利要求17的組合物，其中，所述病毒是牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)。
19.一種組合物，含有與熱激蛋白結合的瘟病病毒抗原。
20.一種藥用組合物，含有免疫原性劑量的權利要求12-19中任一項的組合物和可以藥用的載體或稀釋劑。
21.一種在動物體內誘導針對一種病原體的免疫反應性的方法，該方法包括以下步驟給動物服用有效治療劑量的如權利要求20的藥用組合物。
全文摘要
提供了一種生產含有與異源抗原性多肽結合的熱激蛋白(hsp)的免疫原性復合體的方法,該方法包括:(a)在一種細胞中表達所述抗原性多肽,該細胞受到過一種刺激,這種刺激能導致在該細胞中誘導熱激反應;和(b)從所述細胞或培養介質中回收與一個或多個hsps結合的所述抗原性多肽。還提供了一種免疫原性組合物,該組合物含有與異源抗原性多肽結合的源于非哺乳真核生物的熱激蛋白(hsp),該組合物能夠在人或動物體內誘導對所述抗原性多肽的免疫反應。
文檔編號C07K14/005GK1382153SQ00814551
公開日2002年11月27日 申請日期2000年8月18日 優先權日1999年8月19日
發明者A·D·尚農, C·A·L·S·科拉科, M·J·弗羅斯特 申請人:新南威爾士省農業及水土保持部長