修飾的睫狀神經營養因子及其制備方法和使用方法

專利名稱：修飾的睫狀神經營養因子及其制備方法和使用方法
本專利申請是1999年8月13日提交的、美國專利序號為NO.09/373,834的專利的部分繼續，后者是1999年2月26日提交的、PCT申請號為NO.PCT/US 99/04430的專利部分繼續，而1999年2月的申請又是1998年2月27日提交的、美國專利號為NO.09/031,693的專利申請的部分繼續。在這些延續的申請中，引用了多種專利和出版物來作為參考文獻。因此，那些專利和出版物在本發明中是全文引用以作為參考。發明背景本發明涉及到與治療用CNTF相關的多肽，這些多肽在治療神經性的或其他疾病或病癥方面是有效的。
睫狀神經營養因子(CNTF)是體外雞胚胎睫狀神經節神經元存活所必須的一種蛋白(Manthorpe et al.，1980，J.Neurochem.3469-75)。睫狀神經節在解剖學上位于眼腔之中，在外直肌和視神經鞘之間。它容納又支配著睫狀肌和瞳孔括約肌的動眼神經的副交感神經纖維。
在過去的十年里，在CNTF支持睫狀神經節神經元存活的功能之外又發現了CNTF的多種生物效應。人們認為CNTF誘導了圍產期鼠視神經和大腦中雙潛能神經膠質遠祖細胞的分化(Hughes et al.，1988，Nature 33570-73)。此外，還觀察到其促進了雞胚胎脊神經節傳感神經元的存活(Skaper and Varon，1986，Brain Res.38939-46)。此外，CNTF支持了運動神經元、海馬回神經元、presumpathetic脊髓神經元的存活和分化[Sendtner，et al.，1990，Nature 345440-441；Ip，et al.1991，J.Neurosci.113124-3134；Blottner，et al.1989，Neurosci.Lett.108316-320]。
很久前我們就已得知，骨骼肌神經支配在維持肌肉結構和功能上起著關鍵的作用。最近的研究的表明骨骼肌是陽性CNTF作用的靶。特別的，CNTF預防了除神經支配誘導的骨骼肌萎縮(體重降低和肌纖維交叉區減少)和除神經支配的骨骼肌的顫搐和手足搐搦(Helgren et al.，1994 Cell 76493-504)。在這個模型中，人CNTF也產生了一種不利效應，明顯的延緩了體重的增加。這個不利效應也在利用rHCHTF治療ALS的臨床實驗上觀察到。因此，對利用rHCNTF或其他化合物進行治療來講，在去神經支配后對肌肉重量和動物體重進行檢測可分別作為治療效率和不利反應的檢測手段。將從這些測量值獲得的潛能值比率定義為治療指數(T.I)，此處用TD25/ED50表示，因此T.I.值越高治療劑量的化合物越安全。
已經在細菌表達體系中克隆和表達了CNTF，Masiakowski，etal.，在1991的J.Neurosci.
571003-1012的文章中和在1991年4月4日出版的國際出版號為NO.91/04316的出版物中對此有描述，這兩篇文獻在此全文引用以做參考。
已經對CNTF受體(叫做“CNTFα)進行了克隆、排序和表達[seeDavis，et al.，1991 Science 25359-63]。已知CNTF和造血因子是白血病抑制因子(LIF)，他們通過一個共有的信號途徑來作用于神經元細胞，這個共有的信號途徑涉及IL-6信號轉換元件gp130和第二種β-元件(稱作LIFRβ)。相應的，CNTF/CNTF受體復合體可在攜帶有gp130和LIFRβ元件的LIF效應細胞和其他細胞中啟動信號轉導[lp，et al.，1992，Cell 691121-1132].
在人CNTF之外，已經克隆了相應的鼠(StOckli et al.，1989，Nature 342920-923)和兔(Lin et al.，1989，J.Biol.Chem.2658942-8947)CNTF基因，發現他們編碼一種含有200個氨基酸的蛋白，這些基因與人CNTF基因有大約80％同一性。人和鼠重組蛋白可在非常高的水平上表達(可達總蛋白的70％)，并純化至近乎均一。
盡管他們在結構和功能上有很多相似之處，重組人和鼠CNTF在許多方面不同。在支持培養物中的雞胚胎睫狀神經元的存活和軸突生長方面，重組鼠CNTF的生物活性是重組人CNTF生物活性的4倍[Masiakowski et al.，1991，J.Neurochem.571003-1012]。此外，鼠CNTF較人CNTF對人CNTF受體有較高的親和性。
相同大小的人和鼠CNTF在物理特性上有讓人驚訝的區別他們在SDS凝膠中具有不同的遷移率。這種行為差異表明在兩個分子中的一個分子中含有奇異的結構特征，即使在變性狀態下這種特征也是存在的(Masiakowski et al.，1991，J.Neurochem.571003-1012)。
已經廣泛使用通過基因工程方法進行的誘變來闡明重組蛋白功能域的結構組成。在有關于進行缺失和替代誘變的文獻中描述了幾種不同的方法。最成功的是丙氨酸掃描誘變[Cunningham and Wells 1989，Science 2441081-I085]和同族體掃描誘變[Cunningham et al.，1989，Science 2431330-1336]。這些方法幫助鑒定了生長激素的受體結合域，并且產生了對同源受體具有修飾的結合特性的雜交蛋白。
為了更好的理解rHCNTF的物理、生物化學和藥物學特性，在他們相應的重組蛋白的不同生物學和物理特性之上，申請者對人和鼠CNTF基因做了合理的誘變(見Masiakowski，P.，et al.，1991，J.Neurochem.，571003-1012)。申請者發現，63位的氨基酸能很大程度的提高人CNTF對sCNTFα的親和性和其在體外的生物學潛能(Panayotatos，N.，et al.，J.Biol.Chem.，1993，26819000-19003；Panayotatos，N.，et al.，Biochemistw，1994，335813-5818)。
正如共同共決的在1990年8月20日提交的、美國專利申請序列號為NO.07/570,651、題目為睫狀神經營養因子的專利中，以及在1991年4月4日出版的國際出版號為WO 91/04316的出版物中描述的，申請者考慮的CNTF的一個應用就是來治療Huntington疾病(Huntington舞蹈病)，而這兩篇文獻在此處都是全文引用作為參考。Huntington疾病是中樞神經系統的一種可遺傳的變性性病癥。HD的病理學是基底節累進的、無情的退化，而基底節是在大腦深處負責隨意運動和認知行為的整合作用的結構。HD癥狀的出現一般是在成年期，在20到40歲之間。這種疾病特征的臨床表現是舞蹈癥和其他無意識的運動、癡呆和精神癥狀。舞蹈運動包括短暫的、無意識的、不固定的運動，主要影響遠端四肢。患者經常趨向于將這些運動與隨意活動相混合來掩蓋這些運動，然而，HD病人也表現出多種其他的神經不正常，包括張力失常(持續的、不正常的姿勢)、抽搐(習慣性痙攣)、共濟失調(動作失調)以及發音困難(急促不清的發音)。HD患者的癡呆特征為原型的皮層下癡呆。HD患者的臨床癥狀包括精神狀態緩慢和難于集中精力和對多種任務排序。HD病人的行為障礙是多種多樣的，包括人格改變如冷漠和退縮；激動，沖動，偏執狂，抑郁癥，攻擊行為，妄想，精神病等。無情的運動(relentless)、認知和行為退化造成了社會性的和功能性的無能力，最終導致死亡。
HD是常染色體顯性遺傳。估計它在美國的流行程度可達每100,000人中有5-10人，在美國總共有25,000位患者。然而，由于癥狀出現的晚，還有大量的處于危險狀態但又無癥狀的個體存在。攜帶有HD基因的處于危險狀態但又無癥狀的病人的流行程度或許是有癥狀病人的兩倍(W.Koroshetz and N.Wexler，personalcommunication)。因此，適于接受新治療的HD患者群體大約為75,000人。
現在認為，負責HD發病機制的基因位于4號染色體短臂的端粒末端。這些基因編碼一個結構新穎但功能未知的蛋白，現在對基因產物與HD發病機制間的關系并不清楚。
HD造成的主要結構損傷包括喪失尾狀核和殼中(在嚙齒類動物中總稱為紋狀體)所謂的“中等多刺(medium spiny)”神經元。這些神經元包括投射系統，憑借這些投射系統，尾狀核/殼就可投射到位于大腦基底核中的輸出核上。雖然許多中等多刺神經元利用的神經介質也含有神經肽如腦啡肽和P物質，但介質多刺神經元所利用的主要神經介質是γ-氨基丁酸(GABA)。然而，非常清楚的是中間神經元中含有的乙酰膽堿或神經肽生長激素釋放抑制激素或神經肽Y對HD來講是相對無害的，而HD的中間神經元是不利用GABA作為其神經介質的。
與HD中可見的病理和神經化學變化相似的變化可通過在紋狀體中輸注谷氨酸能激動劑來獲得。在適當的條件下輸注喹啉酸可選擇性的缺失中等大小的內部紋狀體神經元，并且不影響大的膽堿能中間神經元，而內部紋狀體神經元是利用γ-氨基丁酸(GABA)作為他們的神經介質的。
在HD中，沒有在其癥狀或神經保護處理方面的成功臨床實驗。然而，現有有用的、經過證實的等級評定儀器以及神經成像技術可對病程和患者功能進行監測。
CNTF受體復合體含有三種蛋白一個可直接結合到CNTF上的特異性確定性α元件，以及2個信號傳導β元件(LIFRβ和gp130)，雖然他們自己本身不能結合到CNTF上，但是他們在對CNTF進行響應時是啟動信號所必需的。CNTFR復合體的β元件比α元件在體內具有更廣泛的分布。正常情況下，CNTFR的3個元件在細胞表面是不結合的；通過首先結合到CNTFRα，然后與gp130結合，最后引入LIFRβ，CNTF誘導了一個完整受體復合體的逐級組裝。當受體復合體組裝的最后一步(β元件的異源二聚作用)完成時，通過活化與β元件相關的非受體酪氨酸激酶(JAK激酶)而啟動了細胞內信號。JAK激酶和位于受體細胞質區域的酪氨酸殘基通過相互磷酸化來進行響應，為STAT蛋白的Src同源區2結構域產生了磷酸酪氨酸停泊位點。在他們的磷酸化作用完成之后，結合的STAT蛋白與受體分離，二聚化，并且轉移到核區，在那里他們結合到DNA上并且活化轉錄(reviewsFrank，D.andGreenberg，M.(1996)Perspectives on developmentalneurobiology 43-18；Stahl，N.and Yancopoulos，G.(1997)Growth factors and eytokines in health and disease 2B，777-809)。Axokine是具有改進的物理和化學特性的CNTF變異分子，它保留有與CNTF受體相互作用和活化CNTF受體的能力(Panayotatos，N.，et al.(1993)J.Biol.Chem.2681 9000-1 9003)。
Ob基因的產物Leptin是脂肪細胞分泌的，它的功能是作為大腦的外周信號來調節進食和能量代謝(Zhang，Y.，et at.(1994)Nature372425-431)。有趣的是，leptin受體(OB-R)是一個含有與gp130相當的相似序列的跨膜受體(Tartaglia，L.，et al.(1995)Cell831263-1271)，并且與CNTF相似，leptin通過JAK/STAT途徑發送信號(Baumann，H.，et al.(1996)Proc.Natl.Aced.Sci.USA938374-8378；Ghilardi，N.，et al.(1996)Proc.Natl.Aced.Sci.USA 936231-6235)。對CNTF和leptin的系統給藥可在下丘腦飽中樞誘導產生tis-11(Gloaguen，I.，et al.(1997)Proc.Natl.Aced.Sci.USA 946456-6461)和STAT3(Vaisse，C.，et al.(1996)Nature Gen.1495-97)，這表明了他們在調節體重和進食行為中的作用。實際上，對人給藥CNTF減少了食物的攝取，從而造成體重下降(Group，A.C.T.S.(1996)Neurology 461244-1249.)。
發明簡述本發明的一個目標是為治療包括，但并不局限于糖尿病和肥胖癥在內的疾病或病癥提供新穎的、與CNTF相關的神經營養因子。在一個優選的實施方案中，將CNTF和相關的分子用于治療非胰島素依賴性糖尿病。
本發明進一步的目標是提供一種鑒定與CNTF相關的因子的方法，除了此處特別描述的，這些因子都具有改進的治療特性。
按照本發明，這些目標以及其他的目標都實現了，人CNTF蛋白的氨基酸替代也提高了提高了其治療特性。在一個實施方案中，在電泳遷移率上的改變可用于開始篩選潛在有用的修飾的CNTF蛋白。
在一個優選實施方案中，用精氨酸(即63Q→R)替代或其他的氨基酸代替了CNTF第63位的谷氨酰胺，這樣就產生了具有改進的生物活性的修飾的CNTF分子。在進一步的實施方案中，與63Q→R突變相結合的rHCNTF變體具有另外三個新穎的特性1)缺失最后的13個氨基酸殘基(稱為ΔC13)來給予rHCNTF更大的溶解性，并且不損害其活性；2)替代17位的單一的半胱氨酸殘基，這樣使得在生理緩沖條件下，在生理pH和溫度條件下rHCNTF能穩定存在，并且不影響rHCNTF的活性；或3)替代氨基酸殘基64W，這樣可改變rHCNTF在體外的生物活性，并且使其在體內的治療指數提高了7倍。
在另一個優選的實施方案中，RG297分子(rHCNTF，17CA63QRΔC13)將63Q→R替代(這給予了更大的分子潛能)與末端13個氨基酸殘基缺失(這在生理條件下給予了更大的溶解性)和17CA替代(這給予了穩定性，尤其是在37℃的生理條件下)結合使用，這樣的分子顯示了動物模型中的rHCNTF 2-3倍的治療指數。
在另外一個優選的實施方案中，描述了一個攜帶有雙重63QR64WA替代的RG242分子，這樣的替代使得分子具有不同的生物潛能譜，并且將治療指數提高了7倍。
在另外一個優選實施方案中，描述了攜帶有雙重63QRΔC13替代的RG29分子，這樣就在生理條件下給予了更大的溶解性。
圖表簡述

圖1-CNTF蛋白序列的對比。A.人、大鼠、兔、鼠和小雞的CNTF蛋白序列(Leung，et al.，1992，Neuron 81045-1053]。黑點代表在人序列中發現的殘基。B.利用修飾的CNTF分子來展示人CNTF氨基酸殘基(點)和大鼠CNTF(展示的殘基)。在左面標明了相應于每個序列的純化的重組蛋白的名稱。
圖2-人、大鼠和其他幾種修飾的CNTF分子在15％的還原性SDS-PAGE凝膠上的遷移率。純化的重組蛋白如標記所示。分子量標記物在M泳道上。
圖3-兩種修飾的CNTF分子的生物活性。A.人CNTF(填充的菱形)，大鼠CNTF(開放的正方形)，以及RPN219(填充的正方形)。B.人CNTF(填充的菱形)，大鼠CNTF(開放的正方形)，以及RPN228(填充的正方形)。在指定的蛋白濃度下生存時，游離的E8睫狀神經元的劑量響應是以在2ng/ml的大鼠CNTF條件下存活的神經元數目的百分數來表示的。每個實驗點表示三次測定的平均值。
圖4-對A)SCG神經元和B)MG87/huCNTFR成纖維細胞的競爭性配體結合。垂直條表示三次測定值的平均值的標準偏差。
圖5-人CNTF和幾種修飾的CNTF分子在15％SDS-PAGE凝膠上的遷移率。重組人CNTF(指定的HCNTF)和幾種修飾的CNTF蛋白的上清液(A)和沉淀物(B)制劑的泳道如圖所示。修飾的蛋白表示的是ΔC13(也叫做RG160)；17CA；ΔC13(RG162)；ΔC13，63QR RG290)和17CA，ΔC13，63QR(RG297)。分子量標記物在M泳道上。在37℃的生理緩沖液中培育0、2、7和14天的蛋白分別如1-4泳道所示。
圖6-在相應于多種CNTF變體增加的濃度條件下，主要的游離E8雞睫狀神經元的存活。大鼠CNTF和rHCNTF的對照濃度響應曲線是利用標準的、未處理的貯存液來獲得的，四種rHCNTF變體RG297、RG290、RG160和RG162的響應曲線也是在相同的條件下獲得的。
圖7-在相應于多種CNTF變體增加的濃度條件下，主要的游離E8雞睫狀神經元的存活。大鼠CNTF和rHCNTF的對照濃度響應曲線是利用標準的、未處理的貯存液來獲得的，rHCNTF變體RG228(也叫做RPN118，并且含有63QR突變)的響應曲線也是在相同的條件下獲得的。
圖8-在相應于多種CNTF變體增加的濃度條件下，主要的游離E8雞睫狀神經元的存活。大鼠CNTF和rHCNTF的對照濃度響應曲線是利用標準的、未處理的貯存液來獲得的，rHCNTF變體RG242(含有突變63QR，64WA)的響應曲線也是在相同的條件下獲得的。
圖9-在對三種濃度規格化為100μg/kg的化合物rHCNTF，RG228和RG242靜脈內(IV)給藥后，大鼠中平均血漿濃度時間曲線。
圖10-在對三種濃度規格化為200μg/kg的化合物rHCNTF，RG228和RG242皮下(SC)給藥后，大鼠中平均血漿濃度時間曲線。
圖11-大鼠肌肉濕重的劑量依賴型營救的對比，(A)hCNTF對RG228；(B)hCNTF對RG297以及(C)hCNTF對RG242。
圖12-hCNTF、RG228、RG242和RG297的體內毒性對比。
圖13-接受神經營養因子處理和羥喹酸注射的大腦的典型Nissl染色區(冠狀平面)。左上方對完整的caudate-putamen(CPu)的觀察。相鄰部分對比觀察經過NGF、BDNF或NT-3處理或羥喹酸注射的大腦區域。在神經營養因子處理的大腦區域中，限定的區域(開放箭頭所指)實際上沒有中等大小的神經元。CPu中的兩條痕跡是插管輸液(c)和羥喹酸注射針(箭頭頂端)留下的。ec，外囊；LV，側室；比例尺＝0.5mm。
圖14-經過CNTF或PBS處理和羥喹酸注射的大腦的典型Nissl染色區(冠狀平面)。左上方對完整的caudate-putamen(CPu)的觀察。右上方對側面caudate-putamen(CPu)進行的更高放大倍數的觀察表明其中有許多中等大小的神經元，其中很多是用箭頭標明。中部和左下部經過CNTF或PBS處理和羥喹酸注射的大腦的左面caudate-putamen(Cpu)。CPu中的兩條痕跡是PBS或CNTF插管輸液(c)和羥喹酸注射針(箭頭頂端)留下的。開放的箭頭表示損傷的中間分界線。中間和右下方對插管側面250um區域在高放大倍數進行觀察，表明在PBS處理的大腦(神經元損失分數＝4)中實際上是完全缺乏中等大小的紋狀體神經元，在CNTF處理的大腦中存在大量的正常出現的神經元(許多存活的神經元是用箭頭標明的；神經元損失分數＝2)。ec，外囊；LV，側室；比例尺＝0.5mm；right比例尺＝30um。
圖15-神經營養因子處理對紋狀體內注射喹啉酸(QA)誘導的中等大小紋狀體神經元損失的影響。A、B、C、D、E指接受神經營養因子或PBS處理以及喹啉酸注射的組的平均神經元損失分數(±SEM)。每組中接受營養因子處理的大鼠的數目如下NGF＝5；BDNF＝12；NT-3＝10；Ax1＝7；在每個實驗的PBS處理對照組中選用了相等數目的大鼠。統計比較是利用不成對的t-檢驗來進行的。相對于PBS處理對照組，NT-3處理顯著增加(+)了平均神經元損失分數t(17)＝2.75，p＝0.01。相對于PBS處理對照組，CNTF或Ax1處理顯著降低了(-)平均神經元損失分數分別為t(5)＝2.7，p＝0.04和t(13)＝4.2，p＝0.001。
圖16-Ax1處理對紋狀體內注射喹啉酸(QA)誘導的中等大小紋狀體神經元損失的影響。在每個圖的上面都有一個時間線段來指示實驗方案。A.在實驗范例中接受Ax1(n＝6)或PBS(n＝5)處理的組的平均神經元損失分數，除了滲透泵植入時間僅僅為4天，并且在取出泵后注射喹啉酸為期3天，這個實驗范例與圖1的圖例相似。B.在喹啉酸注射3天前和1天后，接受Ax1(n＝6)或PBS(n＝6)每日注射的組的平均神經元損失分數(±SEM)。*unpaired t-檢驗，At(9)＝2.5，p＝0.03；Bt(10)＝2.3，p＝0.04。
圖17-Axokine-15在正常鼠體內的效用。正常的C57BL/6J鼠接受為期6天的每日皮下注射濃度為0.1mg/kg、0.3mg/kg或1.0mg/kg的載體或Ax-15。圖示了Ax-15處理組的體重對載體處理對照組的變化百分數。
圖18-Ax-15在ob/ob鼠體內的效用。正常的C57BL/6J ob/ob鼠接受為期7天的每日皮下注射濃度為0.1mg/kg、0.3mg/kg或1.0mg/kg的載體、leptin(1.0mg/kg)或Ax-15。對經過限食處理和成對飼養的鼠注射0.3mg/kg Ax-15來研究食物攝取減少對體重損失的影響。圖示了Ax-15處理組和leptin處理組的體重對載體處理對照組的變化百分數。
圖19-Ax-15對患有食物誘導的肥胖癥的鼠的影響。將AKR/J鼠置于高脂肪飲食環境中為期7周，然后接受載體，leptin(1.0mg/kg)或濃度為0.03mg/kg、0.1mg/kg、0.3mg/kg或1.0mg/kg的Ax-15處理。對經過限食處理和成對飼養的鼠注射0.3mg/kg Ax-15來研究食物攝取減少對體重損失的影響。圖示了Ax-15處理組和leptin處理組的體重對載體處理對照組的變化百分數。
圖20A和20B-在患有飲食誘導肥胖癥的AKR/J鼠中，Ax-15和飲食限制對血清胰島素和皮質酮水平的影響。圖20A-在利用載體、飲食限制和Ax-15(0.01mg/kg)或僅僅Ax-15(0.1mg/kg)對飲食誘導的ARK/J肥胖鼠進行處理后測定其血清胰島素水平，從而來確定飲食和/或Ax-15處理對與肥胖癥相關的胰島素分泌過多癥的影響。圖20-B-在利用載體、飲食限制和Ax-15(0.01mg/kg)或僅僅Ax-15(0.1mg/kg)對飲食誘導的ARK/J肥胖鼠進行處理后測定其皮質酮水平，從而來確定飲食和/或Ax-15處理對與肥胖癥相關的胰島素分泌過多癥的影響。
圖21-在患有飲食誘導的肥胖癥的鼠中，在引起體重損失方面，1-20-PEG Ax-15(單-20-PEG Ax-15)與未PEG化的Ax-15相比具有4倍的有效性。DIO鼠每周接受皮下注射(*)PBS、Ax-15(0.7mg/kg)或1-20-PEG Ax-15(0.23和0.7mg/kg)，為期13天。每天對動物進行稱重，平均體重變化以基線+/-SEM(n＝6/組)的百分數變化來表示。
圖22-在患有飲食誘導的肥胖癥的鼠中，1-20-PEG Ax-15比未PEG化的Ax-15更有效的降低其食物攝取。DIO鼠每天接受皮下注射(*)PBS、未PEG化的Ax-15(0.7mg/kg)或1-20-PEG Ax-15(0.23和0.7mg/kg)，為期13天。每天對動物進行食物攝取記錄，結果以消費的沉淀的平均克體重+/-SEM(n＝6/組)來表示。
圖23A-23D-圖23A-每天接受Ax-15處理的db/db實驗動物比進行熱量限制的動物顯著增加了體重損失。每天對db/db鼠或他們的heterozygous litter mates(db/？)皮下注射(s.c.)Ax-15(0.1或0.3mg/kg)或載體，為期10天。將一組接受載體處理的實驗動物(成對飼養)的食物攝取限制為與接受最高濃度Ax-15處理的組中的鼠攝取的食物量相同的量。每天記錄平均組體重+/-SEM(n＝12)。圖23B-在db/db鼠中進行為期10天的Ax-15處理對葡萄糖耐受的影響。對接受載體處理(開放的正方形)、pairfed-載體處理(填充的菱形)和Ax-15處理(0.1mg/kg/天，開放三角形；0.3mg/kg/天，填充的三角形)的db/db雄性鼠和年齡匹配的雜合體(age-matchedheterozygous)db/？鼠(填充的圓形)進行了口服葡萄糖耐受實驗。每個點表示至少12只實驗動物+/-SEM的平均值。圖23C-每天低劑量Ax-15處理的db/db鼠顯著引起了顯著的體重損失。db/db鼠每天接受為期10天Ax-15(0.0125，0.025或0.05mg/kg)或載體的皮下注射。每天記錄平均組體重+/-SEM(n＝6)。圖23D-db/db實驗動物接受為期10天的低劑量Ax-15處理對葡萄糖耐受的影響。對接受載體處理(開放正方形)和Ax-15處理(0.0125，0.025或0.05mg/kg)的雄性db/db鼠進行口服葡萄糖耐受實驗。每個點每個點表示至少6只實驗動物+/-SEM的平均值。
圖24-相對于載體處理(開放的正方形)、pairfed載體處理(填充的菱形)，Ax-15處理(0.3mg/kg/天；填充的三角形)對db/db雄性鼠非禁食血清血葡萄糖影響的反應過程。每個點代表最后一次注射14小時后至少6只實驗動物+/-SEM的平均值。
圖25A-25C-對db/db實驗送物進行為期10天的Ax-15處理的生理血結果。圖25A與對照組的載體處理(開放的條狀)、pairfed載體處理(陰影線條狀)和age-matched heterozugous db/？(帶點條狀)鼠相比較，確定了接受為期10天Ax-15(0.1mg/kg/天和0.3mg/kg/天，陰影線條狀)處理的雄性db/db鼠血清中禁食血糖濃度。每個條狀代表至少8只實驗動物的+/-SEM的平均值。圖25B與對照組的載體處理(開放的條狀)、pairfed載體處理(陰影線條狀)和age-matched heterozugous db/？(帶點條狀)鼠相比較，確定了接受為期10天Ax-15(0.1mg/kg/天和0.3mg/kg/天，陰影線條狀)處理的雄性db/db鼠血清中禁食胰島素濃度。每個條狀代表至少8只實驗動物的平均值+/-SEM。圖25C與對照組的載體處理(開放的條狀)、pairfed載體處理(陰影線條狀)和age-matchedheterozugous db/？(帶點條狀)鼠相比較，確定了接受為期10天Ax-15(0.1mg/kg/天和0.3mg/kg/天，陰影線條狀)處理的雄性db/db鼠血清中禁食游離脂肪酸水平。每個條狀代表至少8只實驗動物的+/-SEM的平均值。胰島素耐受檢測數據表明嚴重損害的載體處理對照db/db實驗動物具有提高的胰島素靈敏度。
圖26A-26H-Ax-15處理對db/db鼠弓形神經核的胰島素刺激的磷酸酪氨酸免疫反應性的影響。與載體注射對照組水平(圖26A)相比，在30分鐘的胰島素大丸劑注射(通過頸靜脈，1IU)，Heterozygous(db/？)鼠的免疫染色表明弓形神經核達到磷酸酪氨酸免疫反應染色神經元數目有提高(圖25B)。對胰島素抵抗的/患有糖尿病的鼠(接受過為期10天的載體處理)的胰島素分析揭示了一個基本的高酪氨酸免疫反應染色模式(圖26C)，這個模式在進行胰島素處理(圖26D)之后沒有可檢測到的變化。對db/db鼠為期10天的Ax-15處理減弱了高基底磷酸酪氨酸免疫反應性(圖26E和26G)，并且恢復了胰島素磷酸酪氨酸響應性(圖26F和圖26H)。
圖27A-27B Ax-15處理對db/db鼠肝部胰島素刺激的信號發送的影響。雄性db/db鼠接受為期10天的載體處理(7和8泳道)、pairfed到藥物處理水平的載體處理(泳道1和2)或Ax-15(0.1mg/kg/天，泳道5和6；0.3mg/kg/天；泳道4和5)處理。在接受處理的第11天時，經由門靜脈注射鹽水(-)或1 IU的普通胰島素(+)使其麻醉。將肝臟取出，蛋白提取物利用抗磷酸酪氨酸特異性抗體進行免疫沉淀，然后利用PI-3-激酶的P85調節亞單位的抗血清進行標準的Western印記分析(圖27A)，利用IRS-1特異性抗血清對蛋白提取物進行免疫沉淀，然后利用一種抗磷酸酪氨酸特異性抗體進行Western印記分析(圖27B，上圖)，以及利用IRS-1-特異性抗血清進行蛋白提取物沉淀和Western印記分析(圖27B，下圖)。將非免疫對照免疫沉淀(NI)、非裂解物對照(NL)和p85(C)的3T3-L1裂解物對照作為免疫沉淀和印記對照。
發明詳述本發明涉及到治療人或動物神經性和內分泌疾病和病癥的方法。它部分基于最開始發現重組大鼠CNTF比重組人CNTF能更有效的結合到人CNTF受體上，并且隨后發現能使人CNTF與大鼠CNTF更加相似的氨基酸替代作用可提高修飾的CNTF與人CNTF受體的結合，并且伴隨著生物活性的提高。
在一個優選的實施方案中，人CNTF蛋白的單個氨基酸改變可顯著提高蛋白促進睫神經節和其他神經元的存活與生長的能力。
重組人和大鼠CNTF具有相同數目的氨基酸(199)和相似的分子量(在去除N-末端蛋氨酸后的分子量分別為MW22,798和22,721)。不過，在還原性SDS-PAGE凝膠上，重組人CNTF與分子量為27,500的蛋白的遷移相同，而大鼠CNTF具有預期的遷移率。此外，對于雞睫神經節(CG)神經元來講，人CNTF的活性要比大鼠CNTF活性低4倍，并且大鼠CNTF蛋白比人CNTF蛋白更有效的競爭結合到細胞表面的人或大鼠受體上。
上述的觀察結果使得我們付出努力來檢測CNTF分子上與這些差別相關的區域。這種方法包括利用基因工程方法用相應的大鼠CNTF序列替換人CNTF序列反之亦然。為了達到這樣的目的，我們選取了兩種CNTF共有的并在他們相應的表達載體上是唯一的限制性位點。在必要的時候，在編碼相同蛋白序列的區中的兩個基因中的一個或另一個基因中對這些位點進行基因工程操作。通過這種方法，獲得了每個修飾的蛋白的表達載體， 如圖1所示。在將單獨蛋白純化到至少60％的純度時，就在與人或大鼠中這些蛋白進行比較的情況下確定他們的特性。
由于人和大鼠CNTF的電泳遷移率差異顯著，最開始每個氨基酸替代的影響是通過確定這些變化對蛋白遷移率造成的影響來監測的。正如此處所描述的，電泳遷移率數據表明所有遷移到與大鼠CNTF相同位置的修飾的人CNTF都具有單個氨基酸替代Gln63→Arg(Q63→R)。
隨后，對表現出與大鼠CNTF分子相似遷移率的修飾的人CNTF蛋白進行了生物活性和受體結合檢驗。
CNTF的特征在于其具有支持E8雞胚胎的游離(dissociated)睫狀神經元存活的能力。按照這一標準，純化的重組大鼠CNTF與大鼠天然蛋白具有相同的活性，但其活性卻比重組人CNTF高4倍[Masiakowski，et al.，1991，J.Neurosci.571003-1012 and inInternational Publication No.WO 91/04316，published on April4，1991]。將相同的檢測法用于確定利用上述方法制備的修飾的分子的生物活性。正如此處所描述的，與母體人CNTF蛋白相比較，所有具有Q63→R替代的修飾的CNTGF分子表現出在支持睫神經節神經元存活方面的能力的提高。這些結果表明在電泳遷移率改變和提高的生物學特性之間有著很強的聯系。
在測定CNTF修飾作用的生物學影響之外，通過確定每個修飾對CNTF分子與CNTF受體結合能力的影響也可獲得每個CNTF分子潛在生物學活性的指征。
在一個實施方案中，測定了修飾的人CNTF蛋白與大鼠CNTF競爭結合到大鼠superior頸神經節神經元(SCGs)的能力。正如此處所描述的，與未標記的大鼠CNTF相比，人CNTF置換與這些細胞結合的125I-標記的大鼠CNTF的能力低90倍。然而，此處描述的幾種修飾的人CNTF在置換大鼠CNTF蛋白方面要比人CNTF更強。此處描述的所有具有提高的競爭性結合能力的分子都表現出了改變的電泳遷移率，在這方面分子遷移方式與大鼠CNTF遷移方式相似。
在另一個優選實施方案中，對細胞，如MG87成纖維細胞，進行了基因工程操作來表達人CNTF受體α-元件，并且將這些細胞用于檢測修飾的蛋白與人CNTF受體的結合能力。在與125I-標記的大鼠CNTF競爭性結合到人CNTF受體方面，大鼠CNTF要比人CNTF強12倍。此處描述的幾種修飾的人CNTF分子，包括所有具有與大鼠CNTF而不是人CNTF相似的電泳遷移率的分子，在與125I-大鼠CNTF競爭結合到表達人CNTF受體的細胞方面比人CNTF要強的多。
在另一個實施方案中，一種動物模型可用于評估本發明中修飾的CNTF分子的治療特性，已經證明，這個動物模型在為某些生長因子和其他因子在預防視網膜光感受器變性能力提供指征方面是有用的。如實施例4中所描述的，在一個光誘導的視網膜變性損傷模型中，hCNTF(Gln63→Arg)在預防光感受器變性方面的能力比重組人CNTF高10倍。
因此，按照本發明，在人CNTF蛋白中的特定氨基酸替代可使得修飾的CNTF蛋白與人CNTF受體結合增強，因此，我們預期它們也具有增強的治療特性。
通過在原核和真核表達體系中克隆和表達來制備有利于重復本發明的修飾的CNTF分子，這已經有描述，例如在1991年J.Neurosci第57期1003-1012頁上Masiakowski等。的文章和1991年4月4日出版的、國際出版號為No.WO 91/04316的公開文件中都有描述。可利用多種方法對重組神經營養因子基因進行表達和純化。可將編碼神經營養因子的基因亞克隆到細菌表達載體，例如但并不局限于pCP110中。
重組神經營養因子可通過多種技術進行純化，但這些技術必須能在純化后產生穩定的、具有生物活性的蛋白。例如，但并不局限于，神經營養因子可以可溶性蛋白或包含體的形式從細胞中進行回收，可利用8M鹽酸胍和透析法從這些包含體中定量的提取出蛋白。要想進一步純化這些神經營養因子，就可使用傳統的離子交換層析、疏水相互作用層析、反相層析或凝膠過濾法。
按照本發明，此處描述的修飾的CNTF或其雜種或其變體可用于促進細胞在體內或體外的分化、增殖或存活，而這些細胞可對CNTF進行響應，這些細胞包括CNTF/IL-6/LIF受體家族的表達受體細胞或可表達適當信號傳導元件的細胞，這些信號傳導元件已經有描述，例如在1992年Davis等在Cell第69期的1121-1132頁發表的文章中。突變體或雜種都可拮抗細胞分化和存活。
本發明可用于治療可對CNTF或CNTF/CNTF受體復合體敏感細胞病癥。在本發明的一個優選實施方案中，按照這些方法就可對可表達CNTF/IL-6/LIF受體家族成員的細胞的病癥進行治療。這些病癥的實施例包括但并不局限于涉及下列細胞的病癥白血病細胞、造血干細胞、巨核細胞及其祖細胞、DAI細胞、破骨細胞、成骨細胞、肝細胞、脂肪細胞、腎上皮細胞、胚胎干細胞、腎小球膜(renal mesangial)細胞、T細胞、B細胞等。
相應的，本發明提供了一些方法，這些方法包括對遭受與CNTF相關的神經性或分化病癥或疾病或神經損傷的患者給藥以有效劑量的修飾的CNTF或其雜種或突變體進行治療。修飾的CNTF分子可用于治療Masiakowski等編寫的、1991年4月4日出版的國際出版號為No.WO91/19009的出版物中有關CNTF的疾病和病癥，也可用于治療1991年12月12日出版的、Davis等編寫的、國際出版號為No.WO91/1900的出版物中涉及的CNTF/CNTFR復合體疾病和病癥。這兩本書在此處全文引用作為參考。
這些疾病和病癥包括變性性疾病如視網膜變性，涉及脊髓、膽堿能神經元、海馬回神經元的疾病或病癥，或涉及運動神經元的疾病或病癥如肌萎縮性側索硬化，或涉及那些面部神經的疾病或病癥如貝爾氏麻痹。可以本發明的方法進行治療的其他疾病或病癥包括外周神經障礙、Alzheimer氏病、Parkinson氏病、Huntington舞蹈癥(Huntington疾病或HD)、或由如除神經支配法、慢性廢用、代謝應激和營養不足等引起的肌肉萎縮，或由肌肉營養不良綜合癥、先天性肌病、肌肉炎癥疾病、中毒性肌病、神經外傷、周圍神經病、藥物或毒素誘導的損傷等情況下的肌肉萎縮，或運動神經病、或肥胖癥、糖尿病型肥胖癥或包括但并不局限于非胰島素依賴型糖尿病。
在一個實施方案中，此處描述的CNTF或CNTF相關分子用于治療Huntington病。據推測谷氨酸受體介導的興奮毒性在包括Huntington病在內的多種神經變性性疾病和損傷中起作用。Huntington病主要的神經病理特征是中等大小的、GABA能、紋狀體輸出神經元的大量變形，但是紋狀體中間神經元基本上沒有損失(Acheson， A.&R.Lindsay.，1994，Seminars Neurosci.6333-3410)。正如下面的實施例7中所描述的，申請者利用此處描述的CNTF和其突變體在動物模型上進行了研究，在這個模型中，在Huntington病中觀察到的紋狀體output神經元優先損失和運動障礙在嚙齒類動物和靈長目動物模型中可重復進行，而這些嚙齒類動物和靈長目動物模型是在紋狀體中注射了NMDA谷氨酸受體促進劑、喹啉酸的(DiFigiia，M.Trends Neurosci.，1990，13286-289)。在這些研究中，CNTF和其突變體為暴露于喹啉酸提供了保護。喹啉酸損傷的紋狀體的外觀與死于HD的疾病的外觀很相似，這表明與HD不懈而又相對緩慢的病程相比，喹啉酸雖然造成了急性而嚴重的損傷，但它卻構成了一個適當的動物模型來研究破壞性神經病癥。
到目前為止，利用重組人CNTF(rHCNTF)進行的人類臨床實驗僅僅局限于一些研究，在這些研究中，皮下給藥蛋白來檢驗其在減緩肌萎縮性側索硬化癥(ALS)病程中的效能。這樣的rHCNTF給藥總是伴隨著系統副作用，包括咳嗽、厭食癥和體重損失，并且，在至少一個研究中，接受rHCNTF的病人中超過80％產生了中和抗體，但這些中和抗體的重要性并不清楚。然而，不管抗體形成和副作用等問題產生，在ALS早期有一個患者亞群從rHCNTF給藥中受益，因為相對于具有相似病情的并受安慰劑處理的患者來講，這些患者表現出肺功能損失減少。
通過對CSF或ALS患者進行間歇的、區室化的rHCNTF給藥。申請者的初步實驗表明沒有證據證明系統副作用產生或抗體形成。這些研究包括使用了Medtronic制造且具有CSF采樣側端口的輸液泵(SynchroMed Model 8615/Series DAA)，這個輸液泵是通過標準技術(Penn，et al.，1985，2125-127)在全身麻醉的情況下植入的。這個輸液泵是系到蛛網膜下的導管上，在熒光屏檢查條件下這個導管的端口是置于L1水平的。每周對4個ALS患者每小時給藥濃度為1-8μgrHCNTF，為期48小時，這樣持續1年的時間。這些患者沒有患有在rHCNTF系統給藥時觀察到的那些副作用。患者組中的副作用包括兩名患者坐骨疼痛和1名患者頭疼。在CSF患者中觀察到蛋白和白血球升高。在這項研究中，rHCNTF表現了與輸注到鞘內(intrathecal space)的小分子藥物如氯苯胺丁酸(baclofen)和嗎啡相似的分布和藥物動力學特征。非常不幸，對持續的CNS輸注治療或局部長效制劑給藥來講，rHCNTF太不穩定了，因為它易于通過其完整的半胱氨酸殘基來形成共價二聚體，導致聚集物形成并沉淀。相應的，我們需要穩定的CNTF制劑存在來用于中樞神經系統的直接輸注。
在與Aebischer等合作下，申請人在10位ALS患者體內植入了膠囊包被的BHK細胞，這些細胞可將hCNTF釋放到患者的蛛網膜下隙。這樣在穩定狀態下獲得了6ng/ml的CSF濃度。雖然所有患者主訴虛弱和疲勞，但卻沒有觀察到體重損失、厭食癥和急性響應蛋白活化等癥狀。沒有觀察到CSF腦脊液細胞增多，也沒有觀察到白細胞數量增多。在患者的外周血中檢測不到CNTF。到目前為止，效能檢測的結果還太少，不能對有關效能作出結論。相對于那些通過泵輸注rHCNTF情況，在接受通過植入的、膠囊包被的細胞產生的rHCNTF的患者中沒有觀察到炎癥反應，這表明rHCNTF的泵傳遞后觀察到的變化可能與圍繞這個特定蛋白的劑型和穩定性相關。
相應的，基于動物模型數據，而這些數據可證明CNTF及其變體作為本領域內公認的Huntington病模型中的紋狀體神經元的興奮毒性損傷保護藥物的效能，結合申請者的通過將CNTF或其變體直接傳遞到CNS就可避免在CNTF系統注射時觀察到的副作用和抗體形成的發現，申請者發現了一個有用的方法來治療Huntington病。相應的，申請者的發明考慮通過植入細胞或類似細胞的小囊泡，如可釋放CNTF的脂質體，來將CNTF或其變體直接傳遞到CNS。此外，此處描述的CNTF變體與CNTF相比已經具有了提高的穩定性和溶解性，它們為通過如滲透泵將CNTF傳送到上述的CNS提供了優選的劑型。因為在體溫下溶液中的rHCNTF的不穩定性妨礙了它通過intrathecal或intraventricular輸注進行持續給藥的能力，此處描述的rHCNTF變體優選的用于這種方式給藥，因為它具有提高的穩定性、溶解性和減少的抗原性。
相應的，本發明還考慮到具有提高的溶解性的CNTFG變體可進行治療性應用，在這些應用中時通過利用如滲透泵來傳遞藥物的。重組人CNTF(rHCNTF)在生理緩沖液如pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)中的溶解度是有限的。此外，pH在4.5-8.0之間時的溶解度對培育溫度和時間具有很強的依賴。在5℃時，rHCNTF在PBS中的溶解度是1mg/ml，并且溶液在數小時內是穩定的，但是在37℃持續2小時后的溶解度僅僅為0.1mg/ml，持續48小時后的溶解度為0.05mg/ml。這種有限的溶解度和熱穩定性妨礙了在生理緩沖條件下制備rHCNTF的穩定劑型。在對CNS持續給藥的條件下尤其需要這樣的劑型。
我們發現缺少羧基末端最后13個氨基酸殘基的rHCNTF(rHCNTF，Δ13也叫做RPN160或RG160)保留有完全的生物活性，并且在低溫(5-10℃)下的溶解度至少可達12mg/ml。然而，盡管其又這么高的溶解度，在37℃的PBS溶液中培育幾個小時后仍然有rCNTF，ΔC13析出，即使在0.1mg/ml這樣低的濃度下。
已經確定，rHCNTF和rCNTF，Δ13的熱不穩定性是通過分子間二硫鍵形成啟動的聚集作用的結果，這種熱不穩定性對蛋白濃度和溫度有很強烈的依賴。將人CNTF第17位的半胱氨酸殘基用丙氨酸殘基取代，這樣得到的蛋白在37℃的PBS中培育至少7天后還表現出很高的穩定性并且維持著它們的生物活性。在rHCNTF，63QR突變體中也維持有這樣的特性，這個變體由于精胺酸替代了63位的谷氨酰胺而具有更高的潛能。在一個特定實施例中，rHCNTF，17CA，63QR，ΔC13(也叫做RG297)比rHCNTF表現出了由于63QR替代而產生的更高生物學活性，也表現出了由于ΔC13缺失而產生的更高溶解度和表現出了由于17CA替代而產生的更高穩定性。
本發明考慮了使用治療上有效劑量的、此處描述的CNTF或CNTF變體來治療HD患者。CNTF的有效劑量是指可減緩疾病進程或減少與疾病相關的副作用的劑量。在與沒有進行治療處理的對照組進行比較的條件下，通過比較治療的效果來確定治療的效能。在現場研究(Young et aL，1996，Ann NeuroL 20296-303；Penney and Young，1990，Movement Disorders 593-99)、臨床評定儀器發展(Shoulson and Fahn，1979，Neurology 291-3；Shoulsonal，1989，Quantification of Neurologic Deficit，TL Munsat(ed)Butterworths 271-284.；Feigin et al.，1995，MovementDisorders 10211-214)、和利用計算機X-射線斷層攝影對疾病病程進行的與放射攝影相關的研究(Terrenoe et al.，1977，Neuroradiology 13173475；Bart et al.，1978，Neurology281198-1200；Neophytides et al.，1979，23188-191；Stober etal.，1984，Neuroradiology 2625-28)以及磁共振成像(Graftonet.al.，1992，Arch.Neurol.491161-1167)和正電子發射X射線斷層攝影技術(Harris，et al.，1996，Arch.Neuroh 53316-324)中對HD的臨床病程和自然史進行了廣泛的特性研究。
對Huntington病的臨床評定是通過Shoulson和Fahn發明的HDFunctional Capacity Scale(HDFC)(1979，Neurology 291-3)來進行的。在這個標準中，功能完全的患者為13分，0分表示完全無能(Shoulson et al.，1989，Quantification of NeurologicDeficit，TL Munsat(ed)Butterworths 271-284)。利用這個標準確定的患者的平均病程進度是大約0.65單位/年(Shoulson et al.，1989，Quantification of Neurologic Deficit，TL Munsat(ed)Butterworths 271-284；Feigin et al.，1995，Movement Disorders10211-214)。如果這個標準是完全線性的(一個沒有檢驗的假說)，那么這個病程進度將會與患者有癥狀的HD平均20年的病期很好的對應。HDFC分數可粗略的分為5個臨床階段(Shoulson et al.，1989，Quantification of Neurologic Deficit，TL Munsat(ed)Butterworths 271-284)。
神經成像研究的重點在于神經元損失的總體病理結果和隨后的基底神經節結構萎縮。隨著HD的發展，尾狀神經核收縮，使得側室具有了‘box-car’特征外觀。可以利用″bicaudate指數″對尾狀核萎縮程度進行定量。
磁共振成像與CT可產生相似的指數。然而，一個相對較新的技術，體內NMR分光鏡檢查具有在活體大腦內評估代謝進程的能力。一個初步研究(Jenkins，et al.，1993，Neurology 432689-2695)發現乳酸含量升高，這可能反映了HD患者的大腦中神經元細胞損失或中間代謝缺陷。
利用正電子發射X射線斷層攝影技術(PET)可在活體患者體內進行功能成像。可以利用2-脫氧葡糖(反映突觸活性)或標志選定的神經元群的選擇型放射配體來評定代謝階段的變化。為了確定HD患者的尾狀體大小和葡萄糖代謝變化速率，Grafton等(1992，Arch Neurol.491161-1167)對18位HD患者進行了兩項葡萄糖代謝的正電子發射X-射線斷層成像研究和兩項磁共振成像掃描研究，兩項研究之間時間間隔為42(+/-9)月。在整個研究結束之后，通過基因檢測確定其中7位患者為Huntington病基因陰性，其余患者為Huntington病基因陽性或為舞蹈癥發病。相對于基因陰性組，基因陽性組患者表現出尾狀核每年的葡萄糖代謝率有3.1％的顯著損失(95％confidenceinterval[CI]，-4.64，-1.48)。磁共振成像bicaudate比率每年有3.6％的增加，而磁共振成像bicaudate比率是對尾狀核萎縮的線性測定標準。然而，尾狀核大小的變化率和尾狀核代謝的變化率之間沒有聯系，這表明代謝損失和萎縮是獨立進行的。因此，一系列的正電子發射X射線斷層攝影或磁共振成像產生的損失速率與在臨床評定標準中得到的結果(大約5％/年，vide supra)沒有很達的差別，因此它們是對在癥狀發生前的HD患者中進行實驗性藥理學介入時進行監測的有用手段，在臨床實驗中應該將這些這些癥狀發生前的HD患者群體吸收在內。
在葡萄糖代謝攝影之外，其他的放射配體可用于監測HD中的紋狀體完整性。例如，在HD中損失的內部紋狀體神經元都含有多巴胺受體，所以可將多巴胺受體的配體用于監測HD病程發展。這些研究表明HD患者體內的紋狀體D1D2受體確實是平行減少(Turjanski et al.，1995，Brain118689-696)。
在對紋狀體進行喹啉酸注射治療的靈長目動物進行的PET研究中獲得了相似的代謝和神經化學發現。Brownell等(1994，Exp.Neurol.12541-51)報道，在3個非人靈長目動物的紋狀體喹啉酸損傷之后，可通過多巴胺促進劑處理誘導產生與Huntington病相似的癥狀。通過進行[19F]氟-2-脫氧*D-葡萄糖正電子發射X-射線斷層成像(PET)研究，所有實驗動物的尾狀體在葡糖利用上都表現出了40-50％的長期減少。D1受體的Caudate-putamen攝取速率常數反映出有平均40-48％的神經元損失和減少。利用PET進行的多巴胺重新攝取位點和纖維表明神經元輕微損失區暫時減少，而嚴重破壞的紋狀體區長期減少。這些結果與尸體解剖檢驗所觀察到的行為變化和神經病理學相一致，也與對Huntington病患者進行的臨床研究觀察相似，這些結果可用于附加證明喹啉酸模型，也表明這些測定方法可用于人臨床實驗中。
HD臨床實驗很大程度上限于對精神病和不隨意運動進行的姑息癥狀治療的評定(Shoulson et al.，1981，，Neurology 291-3)。然而，我們要檢驗一個潛在的神經保護藥物。這個實驗涉及使用氯苯胺丁酸，它是一種GABA-B受體拮抗劑，理論上來講，這種藥物會減少紋狀體中皮質紋狀體末端谷胺酸的釋放，從而阻礙HD的病情發展(Shoulson et aL，1989，Quantification of Neurologie Deficit，TL Munsat(ed)Butterworths 271-284)。這個實驗的結果是負面的，因為在實驗進行的30個月中，氯苯胺丁酸處理的患者組的進食情況并不比對照組好。然而，這個實驗為HDFC的使用和合理化提供了支持證據。這個研究的一個重要發現是研究對象內在的病情進展速率僅僅是研究者最初估計的一半。現在這些信息可用于通過評定儀器設計將來的臨床實驗。
目前，我們沒有正在進行的、主要的HD臨床實驗。然而，已經成立了一個臨床實驗組織，Huntington病研究組，其下層基礎部門來替代做HD的臨床實驗。這個研究組正在進行的多個臨床研究選項包括1)利用輔酶Q來增強中間代謝和2)谷胺酸拮抗劑和/或谷胺酸釋放阻滯劑的使用(W.Koroshetz，personal communication)。在歐洲成立了一個類似的研究組，這個研究組通過PET方法來檢驗胎兒紋狀體植入物的效能，也檢驗異種生物瓣膜移植物的使用。
具有有效的臨床評定儀器，并且有相關的放射成像檢測方法來評定HD的疾病病程，結合現有的兩個大的、有組織的multicenter，臨床實驗consortia將會很容易的完成HD臨床實驗。
此處，申請者描述了一種修飾的CNTF分子，稱作Ax-13或Ax-1(命名為rHCNTF，17CA63QRΔC13)，在這個分子中將63Q→R替代(這給予了更大的生物學潛能)與末端13個氨基酸殘基缺失(這在生理條件下給予了更大的溶解性)和17CA替代(給予了穩定性，尤其是在37℃的生理狀態下)進行了結合，這使得它在動物模型上的治療指數比rHCNTF要高2-3倍。然而，當在大腸桿菌中進行表達時，產生的表達蛋白的一部分在C-末端標記有十肽菌素。由于這種情況，Ax-13的純化很困難，并且造成了純化的、未標記的產物的產量較低。當在哺乳動物表達體系中表達時可能不產生十肽菌素標記。此外，十肽菌素標記可能會有助于提高分子的免疫原性，并且也可能引起穩定性問題。
然而，從成本和效率的觀點來看，大腸桿菌表達體系的應用還是優選的。因此，申請者研究發明了一種縮短的CNTF分子，這種分子不僅保留了Ax-13提高的潛能、溶解性和穩定性特征，而且在大腸桿菌中表達時避免了十肽菌素標記問題。正如此處所描述的，申請者已經成功的生產出了一種叫做Ax-15的分子(命名為rHCNTF，17CA63QRΔC15)，它不僅保留有Ax-13改進的特性，還具有在大腸桿菌中表達時具有減少的氨基酸標記附加的優點。因此，這種新分子Ax-15不僅具有更高的產量，而且更易于純化的優點。此外，由于具有顯著減少的細菌氨基酸標記，Ax-15不存在產生那些Ax-13產生的與分子免疫原性和穩定性相關的問題。
因此，本發明的一個目標就是提供改進的、修飾的睫狀神經營養因子分子。明確的講，本發明的一個實施方案是具有Cys17→Ala、GIn63→Arg修飾和末端15個氨基撒殘基缺失的修飾的人睫狀神經營養因子。本發明也提供了編碼本發明的睫狀神經營養因子的單獨的核酸分子。本發明也考慮了一個編碼本發明中的人睫狀神經營養因子的重組DNA分子，可將這個重組DNA分子可操作的連接到一個表達控制序列上和利用重組DNA分子轉化過的宿主細胞中。宿主細胞可以是真核或原核細胞，因此宿主細胞可以是如細菌如大腸桿菌、酵母細胞如Pichia pastoris、昆蟲細胞如Spodoptera fruqiperda或哺乳動物細胞如COS或CHO細胞。這些宿主細胞可用于生產修飾的睫狀神經營養因子的生產方法中，這些生產方法包括(a)生長本發明中的重組DNA分子轉化的宿主細胞，這樣宿主細胞表達DNA分子，產生本發明中的修飾的睫狀神經營養因子，和(b)分離已經表達的，修飾的睫狀神經營養因子。
本發明的主題進一步包括一種包含修飾的睫狀神經營養因子(Ax-15)和載體在內的組合物。
本發明的另一個目標就是提供治療神經系統疾病和病癥的方法，這些方法包括對此處描述的修飾的睫狀神經營養因子Ax-15給藥。需要接受治療的疾病和病癥包括變形性疾病和/或涉及脊髓、運動神經元、膽堿能神經元或海馬細胞的疾病或病癥。此外，疾病治療方法可以是治療包括神經系統損傷在內的神經系統病癥或疾病，這些神經系統損傷起因是由創傷、外科手術、梗塞、感染、惡性腫瘤和暴露于有毒藥物組成的組中的情況之一。本發明還考慮了涉及肌肉萎縮的疾病和病癥的治療方法。
本發明的另一個目標是提供保護紋狀體神經元免于變形的方法，包括對該紋狀體神經元給藥以有效劑量的、此處描述的修飾的睫狀神經營養因子如Ax-15。
本發明的另一個目標是提供誘導哺乳動物體重損失的方法，包括對哺乳動物給藥以此處描述的修飾的睫狀神經營養因子如Ax-15。本發明的一個明確的實施方案涉及誘導人的體重損失。
對Ax-15給藥的方法可用于治療病態肥胖癥或具有遺傳學確定的起源的肥胖癥。此處描述的Ax-15也可用于預防和/或治療人妊娠期或成年期發病的糖尿病的方法中。
上述的涉及對Ax-15給藥的方法可通過選自下組中的任一種Ax-15給藥途徑進行，這個組中的給藥途徑包括靜脈內、肌肉內、皮下、鞘內(intrathecal)、intracerebroventricular和實質內(intraparenchymal)。
此外，可通過能釋放修飾的睫狀神經營養因子的細胞植入物來對Ax-15給藥。
本發明也考慮了神經系統損傷造成的疾病和病癥，其中這些損傷可能是由創傷、外科手術、梗塞、感染、惡性腫瘤和暴露于有毒藥物等造成的。
本發明也提供了藥物組合物，這些藥物組合物包括修飾的CNTF分子或其雜種和變體，正如此處描述的，如包含在含有CNTF受體復合體中的治療性藥物和包含在適當的藥物學載體中的治療性藥物。
包括此處描述的CNTF和修飾的CNTF分子在內的活性成分應該制備到適當的藥物學載體中，通過適當的給藥途徑來進行體內給藥，這些適當的給藥途徑包括，但并不局限于實質內給藥、intraventricular或intracerebroventricular給藥、或通過包括細胞或組織植入物在內的持續釋放植入物給藥，持續釋放植入物給藥在如1996年2月1日出版的、出版號為WO 96/02646的出版物、1995年10月26日出版的、出版號為WO 95/28166的出版物或1995年2月23日出版的、出版號為WO 95/505452的出版物中有描述。
依賴于不同的給藥方式，可將活性成分制備到液體載體如鹽水中，可將其摻入到脂質體、微囊體、多聚體或wax-based并可控制釋放的制劑中。在優選的實施方案中，修飾的CNTF制劑是穩定的，或是以制備成片劑、丸劑或膠囊的形式存在。
藥劑中使用的活性成分的濃度依賴于所需的有效劑量和使用的給藥方式。使用的劑量應該是足以實現活性成分在血漿中進行有效循環血漿濃度。可利用從體外或動物模型檢測體系制得的響應曲線中推測出有效劑量。預期的有效劑量在大約0.001-1mg/天。
實施例實施例1修飾的人CNTF分子的電泳遷移率材料和方法制備修飾的CNTF分子細菌菌株和質粒大腸桿菌K-12 RFJ26是一株能超量生產乳糖操縱子阻遏物的菌株。
攜帶有CNTF基因的表達載體pRPN33和攜帶有大鼠CNTF基因的載體pRPN110幾乎是完全相同的(Masiakowski，et al.，1991，J.Neuresci.571003-1012 and in International Publication No.WO 91/04316，published on April 4，1991.)。
質粒pRPN219的構建中首先是消化含有限制性酶Nhe1和Hind3的pRPN33，并在凝膠上純化得到4081bp的片段。第二步，隨后用167bp Nhe1-Hind3片段來替代編碼部分CNTF基因的更小的片段，167bpNhe1-Hind3片段是利用引物RAT-III-dniH5′ACGGTAAGCTTGGAGGTTCTC3′；和RAT-Nhe-I-M5′TCTATCTGGCTAGCAAGGAAGATTCGTTCA GACCTGACTG CTCTT ACG 3′、通過對大鼠基因的PCR擴增來獲得的。
質粒pRPN228的構建方式與質粒pRPN219的構建方式相同，除了167bp替代片段的擴增是利用DNA引物Rat-III-dniH-L-R5′AAGGTA CGA TAA GCT TGG AGG TTC TCT TGG AGT CGC TCT GCC TCA GTCAGC TCACTC CAA CGA TCA GTG 3′和Rat-Nhe-h 5′TCT ATC TGG CTAGCA AGG AAG 3′.來獲得的。
質粒pRPN186、pRPNt87、pRPN188、pRPN189、pRPN192、pRPN218和pRPN222是通過類似的方法或利用圖1中所示的獨特的限制性位點直接交換DNA片段來制備的。
所有質粒的同一性是通過限制性分析和DNA排序來確定的。蛋白質純化正如對大鼠和人CNTF描述(Masiakowski，et al.，1991，J.Neurosc[.571003-1012 and in International Publication No.WO 91/04316，published on April 4，1991)的那樣，對進行蛋白誘導合成、選擇性提取、溶解和從包含體中純化，只是除了在離子交換層析之外偶爾使用凝膠過濾或偶爾使用凝膠過濾代替離子交換層析。此外，利用鏈霉素和過硫酸銨分級分離從細胞裂解物上清液中純化蛋白，隨后進行柱層析，這些都與對其他蛋白進行純化相同(Panayotatos et al.，1989，J，Biol.Chem.26415066-15069)。對所有蛋白進行分離，直至純度至少為60％。對本研究中的酶反應、DNA電泳和其他技術條件進行了詳細描述(Panayotatos，N.1987，Engineering an Efficient Expression System inPlasmidsA practical Approach(Hardy，K.G.ed.)pp 163-176，IRLPress，Oxford，U.K.).結果圖2圖示了人、大鼠和幾種嵌合CNTF分子在還原性SDS-PAGE凝膠上的遷移率。嵌合分子RPN186、RPN189、RPN218和RPN228表現出與大鼠CNTF相當的遷移率，而RPN187、RPN188、RPN192和RPN222表現出與人CNTF相當的遷移率。圖1中這些結果與圖1中這些蛋白排序的交叉參考顯示了所有在第63位(R63)攜帶有精氨酸殘基的蛋白都表現出了大鼠CNTF的遷移率。對RPN228來講，單個氨基酸替代(Q63→R)足以給予人CNTF正常的大鼠遷移率。
圖2也提供了對不同重組蛋白的純度的檢測。通過目視檢查判斷，純度在60％的RPN189到大于90％的RPN228之間。實施例2測定修飾的CNTF的結合活性材料和方法125I-CNTF的制備將溶解在37ul 0.2M、pH8.5的硼酸鈉緩沖液中的大鼠CNTF(28μg)轉移到裝有4mCi，(2,000Ci/mmole；NEN)的125I和試劑(Bolton and Hunter，1973，Biochem J.133529-539)的小瓶中，這些試劑已經在緩慢的氮流中干燥過。在0℃下培育反應45分鐘，隨后在室溫下反應15分鐘，然后加入30ml 0.2M的甘氨酸溶液終止反應。15分鐘之后，將含有0.08％明膠的0.2ml PBS添加到其中，并將這些混合物過Superdex-75柱(Pharmacia)以從二聚或其他多聚衍生物中分離單體CNTF。如利用薄層層析確定的那樣，吸附量一般為20％，比活一般在1,000Ci/mmole左右。在4℃下貯存單體125I-CNTF，并且從制備結束起可使用一星期。為了檢驗結構和構造的同一性，我們將125I-CNTF(大約10,000cpm)與5μg未標記的CNTF混合，并且利用天然凝膠電泳進行分析。通過考馬斯亮藍染色或放射自顯影都可見到一條主要的泳道。125I-CNTF在支持培養物中的E8雞睫狀神經元存活上顯示了與天然CNTF相當的活力。組織培養技術用胰蛋白酶處理得自新生大鼠的頸上神經節(SCG)，使用機械法使其分離，并將其放置在多聚鳥氨酸(30μg/ml)基底上。生長培養基含有含有10％熱滅活的胎牛血清(Hyclone)的Ham營養混合物F12、神經生長因子(NGF)(100ng/ml)、青霉素(50U/ml)和鏈霉素(50μg/ml)。培養條件維持在37℃、濕度95％、空氣中CO2含量為5％。通過在培養的第1和第3天進行araC(10um)處理消除神經節的非神經元細胞。每周喂養培養物3次，并且培養物在兩個周之內常規的用于結合檢驗。
MG87/CNTFR是利用人CNTFα受體基因轉染過的成纖維細胞系(Squinto，et al.，1990，Neuron 5757-766；Davis et al.，1991，Science 25359-63)。結合檢驗直接在細胞單層上進行結合。用含有磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH7.4)、0.1mM桿菌肽、1mM PMSF、1μg/ml白胃素(leupeplin)和1mg/mlBSA的檢測緩沖液沖洗一次培養孔中的細胞。在室溫與125I-CNTF培育2小時后，用檢測緩沖液快速的沖洗細胞兩次，用含有1％SDS的PBS將細胞溶解，并在Packard Gamma Counter上計數。在多于1,000倍的未標記的CNTF存在下對非特異性結合進行確定。與MG87/CNTFR的特異性結合是80-90％。利用GRAPHPAD程序對數據進行分析(ISI，Philadelphia，PA)。結果圖4a圖示了純化的重組人、大鼠和CNTF RPN219與125I-大鼠CNTF在大鼠SCG神經元上的結合的競爭性曲線。大鼠和人CNTF都與125I-大鼠CNTF競爭結合到SCG神經元上，但人CNTF(IC50＝25nM)取代125I-大鼠CNTF的結合的能力要比未標記的大鼠CNTF弱90倍。相反，RPN219與大鼠CNTF的結合能力幾乎相同，當很顯然要比人CNTF(IC50＝0.3Nm)的結合能力要強的多。
在對鼠成纖維細胞進行的競爭實驗中獲得了相似的結果，而實驗用鼠成纖維細胞是經過指導人CNTF受體表達的質粒轉染過的(圖4b)。大鼠CNTF、人CNTF和RPN228都與125I-大鼠CNTF競爭結合到MG87/CNTFR細胞上。人CNTF(IC50＝30nM)的能力要比大鼠(IC50＝2.8nM)弱12倍，而RPN228的能力顯然要比人蛋白(IC50＝5.6nM)的能力要強的多。
圖1中圖示的利用其他修飾的CNTF蛋白進行的競爭結合實驗也表明具有R63的蛋白顯示了大鼠CNTF的生物活性，而具有Q63的蛋白表現了人CNTF的結合特性(數據未給出)。這些結果表明單個氨基酸替代(Q63-7R)足以給予人CNTF特征的大鼠CNTF受體結合特性。實施例3修飾的CNTF分子的生物活性測定材料與方法除了對存活的細胞進行MTT染色之外(Mosmann，T.1983；J.Immunol.Methods 6555-63)，其余都象已有的描述那樣(Masiakowski，et al.，1991，J.Neurosci.571003-1012 and inInternational Publication No.WO 91/04316，published on April4，1991)，在解離過的雞睫狀神經節(CG)神經元培養物上對重組CNTF進行檢測。結果圖3圖示了解離的、富含神經元的E8雞胚胎睫狀神經節培養物對純化的重組人、大鼠和修飾的CNTF蛋白RPN219和RPN228的劑量響應曲線。通過這種檢測方法得知，嵌合蛋白的生物活性與純化的重組大鼠CNTF沒有顯著的不同，但卻明顯的高于重組人CNTF的生物活性。對比圖3中的劑量響應曲線也發現利用RPN219、RPN228和大鼠CNTF獲得的存活神經元的最高水平要高于利用大鼠獲得的存活神經元的最高水平。這些結果表明對大量的神經元來講，象大鼠CNTF一樣，RPN219和RPN228要比人CNTF的活性高。在平行實驗中，對圖1圖示的其他修飾的CNTF蛋白的生物活性進行了檢測。在所有情況下，攜帶有Q63→R替代的修飾的CNTF蛋白表現出了大鼠CNTF的生物活性，而攜帶有Q63的蛋白表現出人CNTF的生物活性(數據未給出)。
總的來講，這些結果表明單個氨基酸替代(Q63→R)足以給予人CNTF大鼠的生物活性。實施例4應用修飾的CNTF來預防光誘導的光感受器損傷選用2-5個月大小的F 344或Sprague-Dawley系的Albino大鼠。在將其暴露于持續的光中之前，將大鼠維持在循環光環境中(12小時開12小時關的籠內，照明度小于25ft-c)。將這些大鼠置于115-200 ft-c(絕大多數大鼠接受的照明度為125-170ft-c)照明度水平的持續光中，為期1或2周，這樣的光是由兩個40瓦的GeneralElectric ″cool-white″熒光燈泡提供的，同時在在距籠子底面60厘米高的地方懸掛有一個白色的反光鏡。在暴露于光的這段時間內，將大鼠置于具有不銹鋼絲條蓋子的透明聚碳酸酯籠子中。
在將大鼠置于光中的前兩天，將大鼠用氯胺酮-賽拉榛(ketamine-xylazine)麻醉，然后intravitreally注射溶解在磷酸鹽緩沖液(PBS)中、濃度為0.1-500ng/ul的大鼠CNTF、人CNTF或修飾的CNTF[hCNTF(Q63→R)]。這些注射是通過在大約位于鋸狀緣和眼睛中緯線之間鞏膜、脈絡膜和視網膜插入32號注射針頭完成的。在這些情況下是對眼睛的上半球進行的注射。
在持續的光照之后，立即將大鼠用過度劑量的二氧化碳殺死，隨后立即對醛混合物進行血管灌注。將眼睛包埋在環氧樹脂中來切成1μm厚的片狀，從而提供沿眼睛垂直經線的整個視網膜切片。通過對光感受器營救的程度進行評估，對光誘導的視網膜變形程度進行了定量，對營救程度的評定是按照0-4+病理學者的營救等級來進行的，其中4+是最高程度的營救，幾乎是正常視網膜的完整性。在與同一只大鼠的對照眼進行的對比基礎上，按照四個等級標準給每個切片的光感受器營救程度打分。這種方法的優點在于不僅考慮了ONL的厚度，而且考慮了光感受器內部和外部部分細微的變形性變化，也考慮了眼內的空間變形性梯度。每個時間點檢查三只眼，用這些數據來制作劑量響應曲線。結果對人、大鼠和hCNTF(Q63→R)的營救程度進行了檢測。數據表明，在營救光損傷模型中的光感受器方面，大鼠和hCNTF(Q63→R)的能力要比重組人CNTF的能力高10倍。
應該這樣理解，雖然本發明在上文中結合優選的特定實施方案進行了描述，這些描述和實施例是為了說明而不是限制本發明的范圍，本發明的范圍是由附加的權利要求所界定的。實施例5材料于方法如前面所描述的，對重組人CNTF突變體進行基因工程操作、在大腸桿菌中表達并且在純度高于90％的情況下進行回收(Masiakowski，et al.，1991，J.Neurosci.571003-1012 and in InternationalPublication No.WO 91/04316，published on April 4，1991；Panayotatos et al.，1993，J.Biol.Chem.26819000-19003)。
5℃下，在PBS中新鮮制備下面的的貯存液rHCNTF.............................................0.5mg/mlRG160(rHCNTF，ΔC13)..........0.5mg/mlRG162(rHCNTF，17CA，ΔC13.........0.5mg/mRG290(rHCNTF，63QR，ΔC13)....................1.2mg/mlRG297(rHCNTF，17CA，63QR，ΔC13).........0.4mg/ml為了確定在37℃、生理緩沖溶液中的rHCNTF和幾種衍生物的穩定性，所以在5℃的PBS中對貯存液進行完全透析，然后用PBS將其稀釋到0.1mg/ml并進行過濾消毒。將這些等份(0.2ml)轉移到0.5ml的聚丙烯離心管中。將這些離心管放置在37℃的培養箱中，并且在指定的時間取出單個管，在室溫下15,000rpm離心3分鐘以從不溶的沉淀中分離可溶的蛋白。將上清液吸入含有等體積2倍蛋白凝膠樣品緩沖液的干凈管中，85℃水浴2分鐘，混合，在-20℃下貯存直到通過15％的SDS-PAGE進行分析。將沉淀物重新溶解在1/10原始體積的水中，與等體積的2倍蛋白凝膠樣品緩沖液混合，然后按照上述步驟進行處理。
在E8雞睫狀神經元上進行的生物活性分析方法和蛋白凝膠電泳方法已經有描述(Masiakowski，et al.，1991，J.Neurosci.571003-1012 and in International Publication No.WO 91/04316，published on April 4，1991；Panayotatos et al.，1993，J.BioI.Chem.26819000-19003)。蛋白凝膠樣品緩沖溶液(2倍)組成為12.5ml pH6.8的TrisHCI-20ml甘油-40ml 10％SDS和5mg溴酚藍/100ml緩沖液。結果在中性pH的生理緩沖溶液中，rHCNTF的溶解度是有限的。此外，在寬領域pH范圍(4.5-8.0)內的溶解度強烈的依賴于培育溫度和培育時間。在5℃時，rHCNTF的溶解度是1.4mg/ml，并且在溶液中蛋白的溶解狀態保持幾個小時。與rHCNTF的有限的溶解度形成鮮明對比，突變體rHCNTF，ΔC13在5℃下至少能濃縮到12mg/ml。然而，盡管具有高溶解度，但在生理狀態的緩沖溶液中、在生理pH和溫度下，rHCNTF，ΔC13具有很強的不穩定性。在37℃下進行培育時，rHCNTF，ΔC13立即就以依賴于其起始濃度的速度從溶液中沉降出來。
為了確定不穩定性的原因，我們以幾種突變體作平行實驗分析了rHCNTF的同一性。圖5圖示說明rHCNTF在37℃的生理緩沖溶液中為期0、2、7和14天的培育(分別為泳道1-4)導致了上清液中的蛋白的逐漸消失，同時沉淀中的蛋白逐漸出現。此外，沉淀中有相當一部分的rHCNTF是48KD的，并且它們的大小與二聚體rHCNTF的大小相對應(圖5，雙箭頭)。在更長的培育時間內，也出現了一小部分更高聚合物。然而，在有二硫鍵還原試劑存在的條件下，將同樣的樣品在同樣的凝膠上進行分析時卻發現48KD蛋白卻轉化為單體rHCNTF，這證明48KD蛋白代表了通過二硫鍵共價連接的rHCNTF二聚體。這些二聚體估計是通過rHCNTF殘基特有的半胱氨酸殘基來形成的。因此，這些結果表明rHCNTF在37℃下的不穩定性是由通過分子間二硫鍵形成啟動的聚合作用引起的。
在對兩個rHCNTF突變體rHCNTF，ΔC13和rHCNTF，63QR，ΔC13進行的實驗中得到了相似的結果，只是rHCNTF，ΔC13在沉淀中出現不溶性聚合物的速度有點慢(圖5)。假定ΔC13缺失給予rHCNTF在生理緩沖溶液中的更高的溶解性，那么rHCNTF，ΔC13提高的穩定性最有可能是其高溶解性的直接結果。
為了進一步檢驗rHCNTF在37℃下的不穩定性是由通過分子間二硫鍵形成啟動的聚合作用引起的可能性，我們利用現有的基因工程方法將17位的特有半胱氨酸殘基用丙氨酸替代。利用這種方法產生的兩個rHCNTF變體rHCNTF，17CA，ΔC13和rHCNTF，17CA，63QR，ΔC13接受15％的非還原性SDS-PAGE分析。圖5表明，即使在37℃下培育14天，也沒有這兩種蛋白二聚化的跡象和聚合物形成，它們仍然是以溶解狀態存在。即使在沉淀中發現了一小部分蛋白，但這在很大程度上代表了在吸出上清液后仍然存留在離心管中的少量可溶性蛋白，有很少量的證據證明有二聚化作用發生。這些結果確定了rHCNTF在37℃下的不穩定性是由通過分子間二硫鍵形成啟動的聚合作用引起的結論，并且證明在其他rHCNTF突變體入RG297中消除自由的-SH功能基團也可產生更大的穩定性。
為了檢驗存留在溶液中的蛋白在37℃培育之后是否仍有生物活性，我們對樣品進行了神經元存活活性分析。圖6圖示了利用標準的、未處理的貯存液制得的大鼠CNTF和rHCNTF以及四種rHCNTF突變體的對照濃度響應曲線，而這些CNTF和其突變體都是在37℃下進行了為期7天的培育的。這些突變體都是經過17CA突變的，RG297和RG162是在他們的正常濃度下進行檢測的，而RG290和RG160是在以對溶液中的蛋白的量進行濃度矯正之后的濃度檢測的。圖6表明，這些化合物展示的濃度響應曲線正是這些蛋白的完全活性形式展示的濃度響應曲線在實驗誤差范圍之內，RG160和RG162表現了與rHCNTF相同的活性，而正如前面所觀察到的(Panayotatos，N.，et al.，1993，J.Biol.Chem.26819000-19003)和圖7中所示的，攜帶有63QR替代的RG290和RG297則顯示了比rHCNTF高4-5倍的活性。因此，在37℃下對rHCNTF和其衍生物進行為期7天的培育沒有造成其生物活性損失，僅僅是由于沉淀后的二聚化作用造成了蛋白損失。實施例6材料與方法蛋白工程和純化-下列rHCNTF突變體是與rHCNTF進行比較的RG228(rHCNTF，63QR)；RG297(rHCNTF，17CA，63QR，ΔC13)RG242(rHCNTF，63QR64WA)如前面所描述適用于rHCNTF的方法，對這些蛋白進行基因工程操作、在大腸桿菌中表達并且在純度高于90％的情況下進行回收(Masiakowski，et al.，1991，J.Neurosci.571003-1012 and inInternational Publication No.WO 91/04316，published on April4，1991；Panayotatos et al.，1993，J.Biol.Chem.26819000-19003)。
生物活性檢驗-在E8雞睫狀神經元上進行生物活性檢測的方法已經有描述(Panayotatos et al.，1993，J.Biol.Chem.26819000-19003)。
藥物動力學測定-對大鼠進行靜脈注射(i.v.)100μg/kg的rHCNTF(n＝1)和RG242(n＝2)以及200μg/kg的RG228(n＝1)。也對大鼠皮下注射(s.c.)200μg/kg的rHCNTF(n＝2)、RG242(n＝2)和RG228(n＝1)。在給藥前收集血液標本，并在給藥后的不同時間收集血液標本，將這些標本進行加工來獲得血漿。利用對嚙齒類動物血漿進行的rHCNTF ELISA法對這些血漿進行分析(D.B.Lakings，et al.DSER 93/DMAP/006，″Dose Proportionality and AbsoluteBioavailability of rHCNTF in the Rat Following SubcutaneousAdministration at EightDose Levels″(Phoenix International Project No.920847)10 November 1993)。
利用non compartment技術來測定血漿濃度。在每個檢測板上都要包括每種化合物的標準曲線，這些標準曲線用于計算在平板上分析的樣品中所含的化合物的量。檢測靈敏度因化合物不同而有小于兩倍的差別。
體內的的毒性和效率測定-在進行外科手術之前，先將體重大約為220g的雄性的Sprague-Dawley大鼠麻醉。在膝蓋部位將右坐骨神經橫切斷，取大小為5mm的片段。在每只實驗動物的左側坐骨神經實施假外科手術。在外科手術后實施第一個部分，對大鼠進行稱重，并且給藥載體(PBS或pH4.5的乳酸鹽/磷酸鹽/D-甘露醇)或待測的rHCNTF化合物，這些化合物都溶解在相同的載體中，并且劑量為0.01-1.0mg/kg，給藥方式為s.c。每天對大鼠稱重和注射，持續1周，然后將它們殺死，并且對它們的比目魚肌進行解剖和稱重。計算每只實驗動物的右(變性的)與左(假的)比目魚肌濕重的比率，以此來評定變性引起的萎縮的程度和每種化合物處理對其預防的程度。為了對毒性進行評定，體重是以載體處理的大鼠體重增加的百分數來計算的。這些載體溶液在肌肉萎縮和體重增加上產生了相似的結果。結果體內的生物活性-為了對rHCNTFZ在體內的生物活性進行特征確定，我們檢測了它在介導主要的解離的E8雞睫狀神經元存活上產生的影響。圖6、7和8中圖示了對濃度逐漸增加的多種CNTF突變體作出響應的神經元存活。攜帶有63QR替代的突變體RG228(圖7)和RG297(他8)顯示了比rHCNTF高4-5倍的活力，而盡管攜帶有63QR替代，突變體RG242仍顯示了比rHCNTF低10倍的活力。因此，在CNTF序列的不同部位引入不同的氨基酸側鏈對體內主要神經元的存活會產生差別很大的影響，相對于rHCNTF，這些影響在活力損失巨大和劇烈增強之間變動。
藥物動力學-對在一系列化合物的體外生物活性和它們的體內藥物學效率之間建立聯系作出努力之前，確定它們在相同動物模型中的絕對生物利用度是有用的。在下面描述的實驗中，與rHCNTF的病因動力學和絕對生物利用度相比較，我們確定了在對RG228和RG242進行i.v給藥后的病因動力學和s.c給藥后的絕對生物利用度。
圖9圖示大鼠中對rHCNTF、RG228和RG242IV給藥后的平均血漿濃度的時間變化曲線，將這三種化合物的濃度都調至標準的100g/kg。在表1中總結了所有的平均藥物動力學參數。
在對大鼠i.v給藥后，RG242的分布相α多少要大于rHCNTF和RG228的分布相α。RG242和RG228的分布相β多少要大于rHCNTF的分布相β。因此RG242分布到體內并從系統循環中清除的速度要快于rHCNTF，而RG228與HCNTF在體內的分布速度相同，而從系統循環中清除時RG228要快些。在RG242濃度時間變化曲線上的區域(AUC)與rHCNTF的相當，這表明這兩種化合物的全身清除率(ClT)大體相同。然而，RG228和RG242的表觀分布體積(Varea)要比rHCNTF小大約兩倍，而表觀分布體積是β和AUC的應變量，這表明這些突變體的分布范圍要窄一些。由于這些實驗中所用的動物數量限制，我們沒有確定這些值的數量差別。然而，這些結果清晰的表明在i.v給藥后，RG228和RG242與rHCNTF在分布動力學和病因動力學上沒有顯著的不同。
在s.c給藥后，相對于rHCNTF，RG228和RG242具有長出2-3倍的吸收相(Ka)(圖10和表2)。RG242的病因相也有點長。相對于i.v.給藥來講，s.c.給藥后RG242較長的表觀末端病因相可能是由于i.v.注射后末端相的不完全特性引起的。總的來講，RG228(13.7％)和RG242(10.9％)的絕對生物利用度與rHCNTF(6.0％)的相當，這是由于在前面的兩個獨立的研究中rHCNTF的絕對生物利用度是14.2％(n＝18)和7.5％(n＝8)(D.B.Lakings，et aL，DSER 93/DMAP/006，″Dose Proportional and Absolute Bioavailability of rHCNTF inthe Rat FollowingSubcutaneous Administration at Eight Dose Levels″(Phoenix International Project No.920847)10 November 1993；D.B.Lakings；et al.，Dose Proportionality and AbsoluteBioavailability of rHCNTF Administered Subcutaneously to Rats.AAPS Ninth Annual Meeting，San Diego，CA，November，1994)。因此，在實驗誤差之內，rHCNTF、RG228和RG242的絕對生物利用度沒有顯著的差別。
體內的毒性和效率-在對照實驗中，比目魚肌變性在7天內造成了肌肉濕重40％損失。這個值是非常準確，并且是可重復的，因為它在多個獨立實驗中的變化僅僅為3％。rHCNTF每日給藥可造成肌肉濕重的劑量依賴性營救，其ED50＝0.12mg/kg，最大影響劑量為0.3mg/kg(Figure 11)。同時，雖然實驗動物在這些實驗過程中繼續增加體重，但它們顯然不能與它們的載體處理對照組實驗動物達到相同的增加程度(p＜0.01；圖12)，尤其是在最大有效劑量時。
在與rHCNTF平行進行的幾個實驗過程中，經確定得知，63QR替代使其體內生物活性有2倍的增加(圖11)，但同時其毒性也有2倍的增加(圖12)。相反，攜帶有額外C17A和ΔC13修飾的RG297表現了2.6倍的生物活性增加，而其毒性與rHCNTF相同。最后，相對于rHCNTF，RG242提高了2.8倍的生物活性，并且毒性有2.4倍的降低了。這些結果在表3中有總結。
將這些化合物的TD25和ED50的比值作為這些化合物的相對治療指數(T.I.)，而在計算時這些化合物TD25和ED50必須標準化為rHCNTF的TD25和ED50。雖然RG228的T.I與rHCNTF相同，但RG297和RG242的T.I.分別比rHCNTF的高2.5和6.8倍。
因此，RG297和RG242具有優于rHCNTF的藥物學特性。在對人進行rHCNTF處理時觀察到體重下降，此時的臨床條件與rHCNTF的藥物學特性有很大的關系。
本領域中的熟練技術人員將會認識到，CNTF氨基酸序列的其他改變也能產生生物學活性分子，這些分子可能具有增強得特性。例如，申請者已經制備了一個用絲氨酸殘基取代17位的半胱氨酸殘基的17CS突變體，這個突變體是生物活性的。申請者還制備了一個生物活性的4倍突變體17CA，ΔC13，63QR，64WA。另外的所有保留有生物活性的CNTF突變體都在表4中列出。
表1.對大鼠靜脈內給藥100μg/kg的rHCNTF、RG228和RG242后的平均藥物動力學參數。
藥物動力學 化合物參數 rHCNTFRG242 RG228*n 1 2 1C0(ng/ml) 726 2,175NCAUC0-∞(ng·min/ml)20,23022,89055,800α(min-1) 0.04920.08560.041t1/2α(min)148 17β(min-1) 0.01060.02000.0176t1/2β(min)653539Varea(ml/kg) 470 220 204ClT(ml/min/kg) 4.9 4.4 3.6*將RG228的值標準化為100μg/kgi.v.劑量，以使其與其他兩種以100μg/kg.劑量給藥的化合物具有比較性C0通過將前兩個血漿濃度外推到零時間使的估計值NC；未計算表2.對大鼠皮下給藥200μg/kg的rHCNTF、RG228和RG242后的平均藥物動力學參數。
藥物動力學 化合物參數rHCNTF RG242RG228n 221Cmax(ng/ml)18 32 50Tmax(min) 30-4530-4560AUC0-∞(ng·min/ml)2,4254,9807,620絕對生物利用度 6.0 10.9 13.7ke(min-1) 0.0133 0.0083 NCt1/2ke(min) 52 82 NCka(min-1) 0.0401 0.0180 0.0102t1/2ka(min) 17 39 68NC；未計算表3.RHCNTF和其衍生物的效率、毒性和治療指數治療 ED50TD25治療指數 相對指數化合物(mg/kg) (mg/kg)(TD25/ED50) IndexrHCNTF 0.12 0.087 0.72 1.0RG2280.0650.047 0.72 1.0RG2970.0450.080 1.78 2.5RG2420.0430.21 4.88 6.8
表4.RHCNTF對E8雞睫狀神經元的生物活性。給出了相對于rHCNTF的潛能單位(1/EC50)，而rHCNTF的潛能單位規定值為100。一個潛能單位定義為表現出相當于1ng/ml rHCNTF的生物活力的交互配體的濃度。
CNTF潛能鼠 500.0人 100.017CS 100.063QA 87.063QN 100.063QH 2.563QE ＜163QK 1.163QR 400.064WA 2.063QR64WA 9.063QR64WF 250.063QR64WH 25.063QR64WQ 10.0實施例7CNTF及其突變體在Huntington病動物模型中的效率背景據猜測，谷氨酸鹽受體介導的興奮毒性在多種神經變性性疾病中發揮了作用，這些疾病包括Huntington病和運動神經元疾病(DiFiglia，M.，1990，Trends Neurosci.13286-289；Rothstein，et al.，1995，J.Neurochem.65643-651)。Huntington病主要的神經病理特征是中等大小的、GABAergic、紋狀體output神經元的大量變形，但是紋狀體中間神經元基本上沒有損失(Albin，et al.，1989，Trends Neurosci.12366-375；Harrington，et al.，1991，J.Neuropathol.Exp.Neurol.
50309)。在Huntington病中觀察到的紋狀體output神經元優先損失和運動障礙在嚙齒類動物和靈長目動物模型中可重復進行，而這些嚙齒類動物和靈長目動物模型是在紋狀體中注射了NMDA谷氨酸受體促進劑喹啉酸(DiFiglia，M.，1990，Trends Neurosci.13286-289)。
在缺少用于HD的遺傳動物模型的情況下，神經科學家繼續依賴急性損傷模型來研究HD的表現型。經典的HD動物模型涉及大鼠紋狀體興奮毒性損傷的產生，而這個損傷是利用NMDA受體的谷氨酸鹽促進劑完成的。在這樣的損傷范例中，直接向紋狀體中注射神經毒素可造成中等大小的內部紋狀體神經元損失，這些中等大小的內部紋狀體神經元可利用γ-氨基丁酸(GABA)來作為它們的神經遞質，只有兩種相對保守的紋狀體中間神經元利用乙酰膽堿和生長激素釋放抑制激素和神經肽Y作為它們的神經遞質。最近的研究已經依賴于向紋狀體內注射喹啉酸。看來這種方法最能如實的重現HD紋狀體的外觀。
Figueredo-Cardenas等。(1994，Exp.Neurol 12937-56)向成年大鼠的紋狀體中注射喹啉酸(QA)，2-4個月后，損傷呈現出多種不同類型的紋狀體投射神經元和中間神經元以及不同紋狀體投射區的紋狀體輸出纖維存活的相對模式。所有類型的投射神經元(etriatopallidal，striatonigral和striato-entopeduncuLar)的核周質都較膽堿能中間神經元的核周質脆弱的多。在投射神經元核周質中有關于有差別的易損性的證據，其中striatonigral神經元看來是最脆弱的。對紋狀體靶區域的免疫標記的紋狀體纖維進行的檢驗表明striato-entopeduneular纖維比striatopaltidal或striatonigral纖維能更好的在紋狀體內QA環境下生存。在對投射神經元和/或它們的輸出纖維叢進行的研究中觀察到的易損性表觀程度，以及在對膽堿能中間神經元進行的研究中觀察到的易損性都與在HD中觀察到的相似。
在例外一個動物模型中，對3-硝基丙酸(3-NP)系統給藥引起了與Huntington病(HD)中觀察到的那些病理學變化類似的病理學變化。雖然在這些動物中觀察到的行為活動減退與在HD的大多數興奮毒性模型中觀察到的活動減退有區別，但許多人認為3-NP提供了一個更好的幼年發病和超前HD模型。3-NP的神經病理學效果包括內部紋狀體膽堿能神經元損失，但許多缺乏大的AchE陽性神經元、含有NADPH-黃遞酶的神經元的最小損傷以及神經膠質浸潤Borlongan et al.，1995，Brain Res.Bull.36549-56)。在3-NP作為HD神經毒性模型方面的研究較少。其可靠性和實用性還有待研究。
最近的研究已經開始探討興奮毒性和Huntington在紋狀體中的作用之間的聯系。對鼠紋狀體注射喹啉酸誘導Huntingtin在許多剩余的神經元，而不是神經膠質細胞中的免疫反應性提高。在興奮毒性攻擊6小時后，這種提高在白質的細胞突和神經元胞體中很明顯。因此，Huntington可能與這些神經元中的興奮毒性緊張有關(Tatter，etal.，1995，Neuroreport61125-1129)。在免疫反應性提高開始后的1-6小時間，1T15 mRNA水平以與一組神經元特異基因相似的方式減少。在24小時后，減少的神經元水平表明神經變性活神經膠質增生沒有激活神經膠質轉錄。1小時和24小時時的mRNA水平強有力的表明1T15轉錄優選的定位于變性的神經元。Carlock et al.，1995，Neuroreport 61121-1124。
紋狀體的興奮毒性損傷也與在HD大腦中觀察到的某些細胞死亡特征類似(Beal et al.，1986，Nature 321168-171)。在HD患者的新生紋狀體中，TUNEL-陽性神經元和神經膠質的分布模式使人聯想到在神經系統正常發育期內的凋亡細胞死亡中觀察到的分布模式；在相同區域內可偶爾檢測到非隨機DNA斷裂。在大鼠紋狀體興奮毒性損傷之后，早期能觀察到核小體間DNA斷裂(編程性細胞死亡的證據)，并且在后期能觀察到隨機DNA斷裂(細胞壞死的證據)。此外，通過EM檢測到損傷大鼠的中等刺狀神經元的壞死輪廓。因此，在HD和興奮毒性動物模型中都有編程性細胞死亡發生。此外，神經元死亡的編程性死亡機制和壞死性死亡機制可同時在興奮毒性損傷大腦的單個瀕死細胞中出現(Portera et al.，1995，J.Neuroscience 153775-3787)。
已經在對多種病況(例如神經膠質瘤、外傷性大腦損傷、Parkinson病、Parkinson′s-Alzheimer′s complex、multisystem萎縮、stiatonigral變性)下的人大腦的初步研究中對Tdt-介導的dUTP-生物素缺刻末端標記(TUNEL)技術進行了研究。利用這種方法，只有Huntington病表現出明顯并持續的標記。Thomas et ah，1995，Experimental Neurology 133265-272)。在喹啉酸注射后c-fos表達迅速增加，并在大鼠大腦中蔓延，但注射后24小時這種情況就消失。然而，DNA斷裂僅僅局限于在紋狀體中，并且在注射后24小時達到最高。這些結果證明了原位切口移位法檢測局部神經病理的靈敏度，這些結果了也說明了c-fos表達與興奮毒性神經元死亡之間的時間和空間關系(Dure et al.，1995，Exp.Neurol.133207-214)。
興奮毒性損傷也用于探討可能的HD治療方法。喹啉酸誘導的興奮毒性紋狀體損傷，一種Huntington病模型，已經用于檢驗成年大鼠中的紋狀體膽堿能神經元和紋狀體GABAergic神經元上的神經生長因子(NGF)的神經保護反應，而這些成年大鼠是已經接受了喹啉酸(150nmol)損傷的。持續一周的每日紋狀體間NGF給藥在對照組水平之上使膽堿乙酰轉移酶信使RNA水平增加了三倍，并且將Trk A信使RNA表達的水平保持在對照組水平。與對膽堿能細胞的保護效應相反，NGF處理沒有能夠緩和喹啉酸誘導的谷氨酸鹽脫羧酶信使RNA水平降低。因此，在Huntington病中變性的紋狀體谷氨酸鹽脫羧酶信使RNA表達的GABAergic神經元對NGF沒有響應。
Frim等(1993，J.Neurosurg.78267-273)將分泌NGF的成纖維細胞植入到喹啉酸損傷的大鼠紋狀體中。他們發現，相對于非NGF分泌成纖維細胞移植，胼胝體內對NGF分泌成纖維細胞的預先移植使得同側紋狀體中隨后的興奮毒性損傷最大十字區面積減少了80％，與沒有進行移植的動物的興奮損傷相比則減少了82％的面積(p＜0.003)。材料與方法營養因子。
在大腸桿菌中制備重組人BDNF、神經生長因子(NGF)和NT-3，以及重組大鼠CNTF，并且按照已有的描述對它們進行定性(Maisonpierre，et al.，1990，Science 2471446-1451；Masiakowski，et a(.，1991，J.Neurochern.571003-1012)。Axokinel(Ax1)指定用于重組人CNTF，進行了下列修飾用丙氨酸替代17位的半胱氨酸，用精氨酸替代63位的谷氨酰胺，以及C-末端13個氨基酸缺失。這些CNTF類似物具有增強的溶解性，在37℃的生理緩沖液中至少可以穩定存在一周，并且與原始人CNTF相比，在體內的活性增強了4-5倍(Panayotatos et al.，1993，J.Biol.Chem.26819000-19003)。
實驗動物的處理。
所有的實驗動物的使用程序嚴格的與動物保護與使用委員會(IACUC)通過的協議相一致。
利用滲透泵進行營養因子傳遞。
利用水合氯醛(170mg/kg)和戊巴比妥(35mg/kg)將體重為250-300g的雄性Sprague-Dawley大鼠麻醉，然后將一個30號滲透泵輸注插管和一個22號導管(分別位5.0和2.2mm長)并排著長期植入大鼠的大腦左半球(相對于前囟點的stereotaxic坐標為AP0.7，ML3.2；在interaural line下incisorbar 3.3mm)。30天后，將這些大鼠再次麻醉，利用塑料管將含有0.1M磷酸緩沖鹽溶液(PBS)(pH 7.4)或重組人NGF(0.9 mg/ml)、人BDNF(1 mg/ml)、人NT-3(1 mg/ml)、大鼠CNTF(0.78 mg/ml)或Ax1(0.4mg/ml)PBS溶液的Alzet微型滲透真空泵2002(2周的工作時限，傳遞速率為0.5ul/hr)連接到輸注插管上，并且進行皮下移植(Anderson，et al.，1995，J.Comp.Neurol.357296-317)。由于輸注插管和塑料管有死體積，營養因子向大腦的傳遞在泵移植1天后開始。正如通過生物測定確定的那樣，神經營養因子在37℃滲透泵中保持12天的完全穩定狀態，并且通過對適當因子的切片進行免疫組織化學染色來保證神經營養因子在紋狀體內的有效傳遞(Anderson，et al.，1995，J.Comp.Neurol.35__Z.7296-317)。滲透泵植入3或4天后，利用配有28號鈍頭針頭的10ul注射器、通過導管對已進行了麻醉的大鼠注射喹啉酸(溶解在1ul pH 7.2的磷酸緩沖液中，濃度為50nmol，用時10分鐘)。
通過每日注射來進行營養因子傳遞如上文所述，將一根22號導管(長2.2mm)長期植入已經麻醉的大鼠的左腦半球中(stereotaxic坐標為AP 0.5，ML 3.0)。1周后，利用Hamilton注射器、通過導管向麻醉的大鼠每日注射Ax1(質量0.4μg，體積1ul，用時10分鐘)或載體。在喹啉酸注射前連續3天和喹啉酸注射后1天注射Ax1，喹啉酸的注射如上文所描述的那樣進行。
組織學方法和分析在喹啉酸注射后第8或9天開始收集在4％多聚甲醛中灌注固定的大腦，并且在冠狀平面上切下一塊40微米厚的、用硫堇染過色的切片。在每個實驗中，由一個不清楚處理條件的研究者來評估一系列Nissl染色切片的1/12，并按照下列標準對中等的紋狀體神經元的相對損失進行等級鑒定0(沒有神經元損失)，1(有但卻微小的神經元損失)。2(中等程度的神經元損失)，3(嚴重但不是完全的神經元損失)，4(在喹啉酸處理的區域內的中等大小的神經元完全損失)。當遇到神經元損失在兩個等級中間的情況時，可給出兩個最近相鄰分數的平均值。在利用BDNF和NT-3進行的實驗中，兩個獨立觀察者對42只大鼠中的40只給出的神經元損失分數在0-0.5點(相關系數＝0.8；p＝0.0001)。
在利用CNTF進行的實驗中，也通過對切片中的神經元計數來評估神經元損失，而這些切片是通過將0.5mm的突出部分壓進輸注導管而制得的。對每個切片來講，是通過在處理過的紋狀體內選擇7個區，每個區的體積為0.4×0.4mm，然后將每個區沿垂直線橫切成10×10個樣品小格，這樣來對神經元進行計數。第一個區在紋狀體的中心稍微側偏一點，在典型的喹啉酸誘導損傷的中心(也即在輸注插管的緊頭部)。其余的6個區是從第一個區處進行對角線選取的，兩個區在dorsomedial方向，兩個區在ventromedial方向，并且在dorsolateral和ventrolateral方向各有一個區。為了控制切片厚度可能的變化，在紋狀體的兩面對7個區的等效部位取樣(每7個區大約有600個神經元)。并且神經元的存活是以處理過的面上的神經元數量與未處理面上的神經元數量的百分比來表示的。實際神經元計數結果(CNTF處理和PBS處理組的神經元損失分別為31％和61％)表明，它與對神經元損失評價體系的數據進行回歸分析(Spearman等級相關系數＝0.82，p＜0.05)得到的結果緊密吻合(平均神經元損失分數分別為1.67和3.25)。
利用unpaired t-檢驗對實驗組和它們的對照組間的差別進行評定。結果在一系列的實驗中，利用滲透泵(額定傳送速率人NGF，10.8μg/天；人BDNF或NT-3，12.0μg/天；大鼠CNTF，9.4μg/天)向紋狀體內輸注神經營養因子3或4天后，向成年大鼠左紋狀體中注射喹啉酸(50nmol)。這種劑量的喹啉酸對在所有紋狀體神經元中占90％以上的中等大小紋狀體output神經元來說是有毒的，但膽堿能中間神經元和微白蛋白/GABAergic中間神經元的紋狀體群在很大程度上沒有受到影響(Qin，et al.，1992，Experimental Neurology 115200-211；Figueredo-Cardeeas，et al.，1994，Exp.Neuro[.12937-56)。對在喹啉酸注射后8-9天收集的大腦Nissl染色切片進行顯微鏡分析，結果表明在BDNF-、NGF或NT-3處理的大腦中沒有明顯的中等大小紋狀體神經元貧乏(圖13)。在另外一組實驗中，BDNF或NGF輸注后7天進行喹啉酸注射時沒有觀察到明顯的神經元貧乏。
形成鮮明對比的是，CNTF處理的大鼠組的神經元存活相對于單用載體處理的大鼠組有顯著提高(圖14)，這與通過神經元計數得到的平均存活百分數(±SEM)分別為69±17％和29±11％(unpaired t-檢驗，t(5)＝2.12，p＝0.04)或通過半定量神經元損失分數評定得到的結果(圖15)一樣。CNTF處理過的大腦中存活的神經元完全散布于受到喹啉酸注射影響的紋狀體區域。
假定CNTF產生了正面影響，利用一種多肽CNTF受體促進劑Axokine 1(Ax-1)(24)進行了類似的實驗。正如在CNTF給藥后觀察到的那樣，Ax-1(4.8μg/天)輸注造成了暴露于喹啉酸的中等大小紋狀體神經元顯著貧乏(圖15)。這樣的結果支持了CNTF受體介導機制可有效的保護紋狀體神經元免遭NMDA受體介導的興奮毒性這個結論。
在沒有對行為或健康，象已經指出的，例如體重產生明顯的負面影響的情況下就可實現CNTF或Ax-1的神經保護作用。CNTF或Ax-1處理沒有顯著影響實驗結束時測定的體重(unpaired t-檢驗)。在CNTF實驗中，營養因子處理組和載體處理組的平均體重分別為369±20g和331±15g，(p＝0.21)；在Ax-1實驗中它們分別為431±26g和453±14g，(p＝0.44)。
另外進行了兩個實驗來確定是否在神經營養因子給藥結束后CNTF受體配體的神經保護作用仍然存在，也通過其來確定在間歇傳送低劑量的營養因子時這些處理方法是否是有效的。在第一個實驗中，對大鼠持續3天紋狀體內注射Ax-1(4.8μg/day)或載體，然后取出滲透泵結束傳送。然后將喹啉酸注射到紋狀體中，持續3天(圖16A)。在第二個實驗中，在紋狀體內注射喹啉酸前3天內和注射后1天對大鼠進行每日Ax-1(0.4μg/天)或載體注射(圖16B)；因此這些大鼠僅僅接受了總共1.6μg Ax-1。在這兩個實驗中，Nissl染色切片的顯微鏡分析表明，Ax-1處理的大腦中中等大小紋狀體神經元的顯著貧乏與在CNTF或Ax-1持續輸注一段時間的實驗中觀察到的神經元貧乏程度(圖16)相當。討論由于紋狀體中90％以上的神經元是中等大小的投射神經元、膽堿能投射神經元、GABAergic投射神經元、striatonigral投射神經元和striatopallidal投射神經元(Graybiel，A.M.，1990，TINS13244-254)，所以現有的結果表明CNTF或CNTF受體促進劑處理保護了紋狀體output神經元免遭興奮毒性損傷。因此，CNTF是首批純化的、能保護紋狀體output神經元的營養因子之一，而這些營養因子是在Huntington病的成年動物模型上進行了藥理學應用的。在其他進行了特性研究的因子中，有報道說，只有利用堿性成纖維細胞生長因子進行的處理能減小對成年大鼠和新生大鼠進行N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)和丙二酸注射誘導的紋狀體損傷的面積(Nozaki，et al.，1993，J.Cereb.Blood Flow Metab.13221-228；Kirschner，et al.，1995，J.Cereb.Blood Flow Metab.15619-623)。雖然在紋狀體附近植入的NGF分泌成纖維細胞表現出能保護大鼠的中等大小紋狀體神經元免遭喹啉酸損傷(Frim，et al.，1993，NeuroReport4367-370；Emerich，et al.，1994，Exp.Neurol.130141-150)，但是我們利用純化的NGF處理這些神經元沒有收到任何存活促進效果，這與早期的幾項研究相一致(Davies，et al.，1992，Neurosci.Lett.140161-164；Venero，et al.，1994，Neuroscience61257-268；Kordower，et al.，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA919077-9080).這個發現表明NGF不是NGF分泌成纖維細胞提供的神經保護的唯一介體。然而，象以前的報道所說的那樣，我們確實觀察到大的、暗黑的染色，估計在NGF處理過的大腦中膽堿能神經元更顯著(Davies，et al.，1992，Neurosci.Lett.140161-164；Kordower，et al.，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA919077-9080；Perez-Navarro，et al.，1994，Eur.J.Neurosci.6706-711).高親和性NGF受體TrkA在紋狀體的表達僅僅局限于膽堿能中間神經元(Steininger，et al.，1993，Brain Res.612.330-335)，這與NGF在這些神經元上的選擇性反應中的發現相一致，而BDNF和NT-3的高親和性受體(TrkB和TrkC)是通過多種中等大小的紋狀體神經元來表達的(Altar，et al.，1994，Eur.J.Neurosci.61389-1405)。BDNF和NT-3(與NGF不同)促進了體內胚胎output神經元、GABAergic output神經元和紋狀體output神經元的存活和顯型分化(Mizuno，et al.，1994 Dev.Biol.165243-256；Ventimiglia，et al.，1995，Eur.J.Neurosci).此外，這些神經營養因子能保護體內特定的神經元群免遭谷氨酸毒性(Lindholm，et al.，1993，Eur.J.Neurosci.51455-1464；Shimohama，et al.，1993，Neurosci.Lett.16455-58；Cheng，et al.，1994，Brain Res.64056-67).然而，BDNF或NT-3輸注沒有表現出能保護體內的紋狀體output神經元免遭NMDA受體介導的興奮毒性，雖然腦內輸注相當劑量的BDNF或NT-3在紋狀體和大腦的其他部位引發了明確的生物學效應(Lindsay，et al.，1994，TINS 17182-190)。可利用體內神經元類型(紋狀體神經元對海馬回神經元，皮質神經元對小腦神經元)、神經元發育階段的差異(成年期對胚胎期)或glutamatergic突出input的存在體內和體外研究結果間的差異。
可通過對中等大小的紋狀體神經元的直接作用來產生CNTF受體配體表現的神經保護效應，因為紋狀體的CNTF受體元件(CNTFRα，CNTFRβ，CNTFRγ)有足夠的mRNA表達(Ip，et al.，1993，Neuron1089-102；Rudge，et al.，1994，Eur.J.Neurosci.6693-705).潛在的機制可能包括谷氨酸受體功能和表達的修飾，從而使得神經元具有針對glutamatergic刺激的修飾的靈敏度，或使得神經元具有提高的能力來調節胞液鈣離子濃度，而鈣離子濃度增加被認為是啟動神經保護過程的一個重要步驟(Choi，D.W.，1988，Neuron 1623-634)。CNTF作為谷氨酸受體拮抗劑來阻斷喹啉酸的毒性是不可能的，因為CNTF不組阻斷體內谷氨酸的毒性效應(Mattson，et al.，1995，J.Neurochem.651740-1751)。
在另一方面，CNTF受體可間接通過紋狀體的其他組分來進行潛在的作用。例如，在暴露于喹啉酸之前消除紋狀體中的黑質和皮質輸入就可顯著減少紋狀體神經元的損失(DiFiglia，M.，1990，Trends Neurosci.13286-289；Buisson，et al.，1991，Neurosci.Lett.131257-259)在表明在誘導細胞死亡時要求外源毒素和內源神經遞質共同作用。因此，glutamatergic或dopaminergic突觸的突觸傳遞減少可能保護紋狀體神經元免遭喹啉酸注射造成的損傷。雖然星形膠質細胞不能在體內正常表達可檢測到的CNTFRα(Ip，et al.，1993，Neuron 1089-102)，但是星形膠質細在經過大腦損傷活化后或在體外細胞種就能表達所有的CNTF受體元件(Rudge，et al.，1994，Eur.J.Neurosci.6693-705)。此外，在暴露于星形膠質細胞中10-48小時后，CNTF傳遞就能活化星形膠質細胞，這可由神經膠質原纖維酸性蛋白和其mRNA量增多表明(Levison，et al.，1995，Soc.Neurosci.Abst.21497；Winter，et al.，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA925865-5869).不管CNTF是進行直接還是間接活化，星形膠質細胞就可通過增強的興奮性氨基酸扣押或通過釋放保護神經元的物質來提高神經元的存活。
在本研究中，通過CNTF受體介導的作用來免遭興奮毒性損傷的紋狀體神經元群與在Huntington病中選擇性消失的神經元類型相同(Albin，et al.，1989，Trends Neurosci.1-2366-375)。有人提出，在興奮毒性刺激和Huntington病基因增強的表達之間具有潛在的聯系(Carlock，et al.，1995，NeuroReport 61121-1124；Tatter，et al.，1995，NeuroReport 61125-1129)。雖然有大量的、旨在確定Huntington病致病機理研究正在進行，但現有的證據已明確的表明了NMDA受體介導的興奮毒性在其中的作用(DiFiglia，M.，1990，Trends Neurosci.13286-289)。實施例8Axokine蛋白的PEG化我們已經知道蛋白的PEG化可通過提高穩定性和生物利用度、降低免疫原性來提高它們在體內的前能。已經知道特定蛋白的特性是可以通過聚乙二醇(PEG)多聚物附著來進行調整，聚乙二醇多聚物可增加蛋白的流體動力學體積，因而就可通過腎過濾來減低其清除率(見如Clark，R.，et al.，1996，J.Biol.Chem.27121969-21977)。我們已經通過Ax-13和聚乙二醇(PEG)的共價交聯制得了PEGylatedAxokine。我們也發明了一種方法以便將不同形式PEGylatedAxokine與未進行修飾的分子分離。在生理pH下，PEGylated Ax-13具有比unPEGylated Ax-13好的溶解性和穩定性。已經證明Pegylation可大大提高藥物動力學特性，我們也期望它能類似的提高其他Axokine分子的特性。
這些研究中選用的是在大腸桿菌中表達并進行純化后的Ax-13。從Shearwater Polymers購得20kD mPEG-SPA，從Sigma購得Bicine，并從Novex，CA購得Tris-甘氨酸預制凝膠。進行了一個小型的反應研究來確定反應條件。最終濃度為0.6mg/ml的20kD mPEG-SPA在pH8.1的4℃無胺緩沖液中與Ax-13反應。選用了不同的PEG與蛋白的摩爾比和兩個反應時間。通過添加大量過量的主胺來停止反應。反應產物利用還原性SDS-PAGE進行分析。主要的修飾蛋白分子量大約為60KD。也可觀察到更高程度修飾的更高分子量泳道。在這些研究基礎之上，我們選擇了PEG與蛋白的比率為4的過夜反應。
4℃下，0.6mg/ml Ax-13與20kD mPEG-SPA在pH8.1的Bicine緩沖液種進行反應。通過添加大量過量的主胺來停止反應。反應產物在低鹽緩沖液中稀釋并過離子交換柱。柱子用低鹽緩沖液沖洗，然后進行氯化鈉梯度洗脫。更高交聯程度形式的分子(利用SDS-PAGE獲得的表觀分子量為＞66KD)與未經修飾的Ax-13在離子交換柱上有很好的分離，而這些更高交聯程度形式的分子是分子量大約為60KD的獨特的修飾蛋白。對與60KD泳道相對應的片段進行了生物測定。我們注意到在與60KD帶相對應的片段中有一條很微弱的未經修飾的Ax-13泳道。為了確定生物測定結果沒有受到這種物質的顯著影響，我們利用分子大小排阻層析(SEC)來進行進一步的純化，這種方法對60KD帶和Ax-13進行了基線分離。對純化的Ax-13進行生物測定，生物測定結果與利用沒有進行SEC之前物質進行的生物測定結果沒有區別。實施例9構建Ax-15表達質粒pRG643質粒pRG632是一個高拷貝質粒，它能編碼氨芐青霉素抗性以及編碼在3′到終止密碼子間含有特有的Eag I限制性酶識別序列的CNTF-C17A，Q63R，ΔC13(此處也指Ax1或Ax-13)。對包含在ΔC15內的187 bp BseR I-Eagl DNA片段進行PCR擴增，利用質粒pRG632構建了CNTF突變體C17A，Q63R，ΔC15(命名為Ax-15)。編碼BseR I位點的5′-引物{ΔC15-5′(5′-CCAGATAGAGGAGTTAATGATACTCCT-3′)}和編碼Ax-15基因C-末端的3′引物ΔC15-3′{(5′-GCGTCGGCCGCGGACCACG CTCATTACCCAGTCTGTGA GAAGAAATG-3′)}在Gly185處終止，隨后是兩個終止密碼子和一個Eagl限制性酶識別序列。將這個DNA片段用BseR I和Eag I消化，并且結合到pRG632中的相同位點。最終的質粒pRG639可編碼Ax-15(人CNTF C17A，Q63R，ΔC15)。然后將ΔC15突變體作為一個339 bp Hind III-Eag I DNA傳遞到pRG421中的相同位點，而pRG421是一個編碼卡那霉素抗性和人CNTFC17A，Q63R，ΔC13的高拷貝表達質粒。最終形成的質粒pRG643可在lacUV5啟動子的轉錄控制下編碼Ax-15基因，并且賦予卡那霉素抗性。通過序列分析對Ax-15基因的DNA序列進行確定。實施例10Ax-15蛋白的小規模表達和純化含有質粒pRG639大腸桿菌菌株RFJ141在LB培養基上生長，通過添加1％的乳糖(w/v0就可誘導Ax-15蛋白的表達。通過離心對誘導生成的細胞進行收集，將收集到的細胞重新懸浮在pH 8.3的20mMTris-HCI、pH8.35mM EDTA和1mM DTT中，并將他們在10,000psi下通過French pressure cell來裂解。將細胞裂解物進行離心，然后將沉淀重新懸浮在8M鹽酸胍、50mM pH 8.3的Tris-HCI、0.05mMEDTA中，然后利用5倍體積的50mM pH 8.3的Tris-HCI和0.05mMEDTA(Buffer A)進行稀釋，隨后利用Buffer A.對其進行透析。將透析物過Buffer A平衡過的Q-瓊脂糖柱。利用含在10倍柱體積的緩沖液中的0-1M氯化鈉對Ax-15蛋白進行線性梯度洗脫。收集含有Ax-15蛋白的片段，并在通過添加氫氧化鈉保持pH8.3的情況下向其中緩慢添加固體(NH4)2SO4使(NH4)2SO4濃度達到1M。利用含有0.5M(NH4)2SO4的緩沖液A沖洗柱子，并利用逐漸降低的(NH4)2SO4濃度線性梯度洗脫Ax-15蛋白。收集含有Ax-15蛋白的洗脫液，利用pH 8.3的5mM NaPO4進行透析，然后通過超濾進行濃縮。濃縮液在利用。pH8.3的5mM NaPO4平衡過的Sephacryl S-100柱上進行分級分離。
實施例11Ax-15蛋白的大規模表達和純化在含有20μg/ml卡那霉素的微量鹽葡萄糖培養基中培養可在lac啟動子調控(pRG643)下表達Ax-15蛋白的、卡那霉素抗性重組大腸桿菌菌株RFJ141，使其濃度達到30-35 AU550(550nM下的光吸收)的中等濃度。通過添加IPTG(硫代半乳糖苷)至1.0mM的濃度來誘導Ax-15蛋白的表達，并且此后發酵持續8小時。在IPTG誘導后Ax-15蛋白是以不溶包含體形式表達的。在誘導后，收集細胞，對細胞糊進行濃縮，并且通過AGT 500,000molecular weight cut off(mwco)中空纖維滲濾(ACG Technologies，inc.)將緩沖液換為20mM Tris、1.0mMDTT、5.0mM EDTA、pH 8.5。將冷凍(0-10℃)的細胞糊懸浮液重復通過連續流動的、高壓(＞8,000psi)Nifo Soavi勻漿器來使細胞破裂，包含體從收獲的細胞中釋放出來。利用冷凍的(4-8℃)、連續轉動的高速(＞17,000xG)Sharpies離心機(source)對勻漿物進行離心來回收包含體。在含有1.0mM DTT的8.0M鹽酸胍中提取包含體。將Ax-15蛋白/鹽酸胍溶液稀釋到含有50mM Tris-HCI、1.0mM DTT、0.05mM EDTA、pH8.0-8.3的緩沖液中，通過AGT 5,000mwco hollowfiber filters(ACG Technologies，Inc.)對稀釋緩沖液進行滲濾。在進行層析法純化之前，將含有重新折疊的Ax-15蛋白的最終溶液通過Microgon 0.22um空心纖維濾器(ACG Technologies，Inc.)進行過濾。實施例12重折疊的Ax-15的柱層析純化將上述過濾后的Ax-15蛋白溶液加到16.4 L DEAE Sepharose(Pharmacia)濃度為10.9mg/ml的柱上，并且用50L含有50mMTris、1.0mM DTT和0.05mM EDTA、pH 8.0-8.3的緩沖液進行沖洗。在相同的緩沖液中，Ax-15蛋白是在120mM NaCI濃度梯度處從層析柱上洗脫下來。收集那些在峰的上升部分超過以前確定的最大280nM吸收標準40％和那些在峰的下降部分超過20％的洗脫液，將他們冷凍保存(-30℃)或用于下一步的純化。通過逐步添加固體硫酸銨來將收集的Ax-15蛋白洗脫液中的硫酸銨濃度調節到1.0M，維持pH8.0-8.3。將此溶液濾過0.22um Sartorious capsule filter，然后加到12.5L苯基瓊脂糖HP(Pharmacia)濃度為8.24mg/ml的柱上，并且用55L溶解在含有0.05mM EDTA、pH 8.0-8.3的50mM Tris緩沖液中的.1.0M硫酸銨沖洗。在利用體積為12L、含在相同緩沖液中的250mM硫酸銨沖洗之后，Ax-15蛋白在125mM硫酸銨、Tris緩沖液洗脫梯度中洗脫下來。收集那些在峰的上升部分超過以前確定的最大280nM吸收標準100％和那些在峰的下降部分超過20％的洗脫液。同時將洗脫液按1∶4的比例稀釋到不含鹽的50mM Tris、pH 8.0-8.3緩沖液中，以此來降低他們的傳導性。稀釋液進行冷凍保存(-30℃)或用于下一步的純化。將收集的疏水相互作用層析(HIC)物質濃縮到25L，并且利用5,000 mwco AGT hollow fiber filter(ACG Technologies，Inc.)對pH 8.0-8.3的5.0mM磷酸鈉緩沖液進行滲濾。在sulfylpropyl fast flow(SP FP)瓊脂糖層析前，立即通過逐步添加濃縮的磷酸(85％)將其pH調整到7.0-7.2。將pH調節過的收集物加到7.7L SP FF瓊脂糖(Pharmacia)濃度為9.0mg/m層析柱上，并且最少用25L pH 7.0的5.0mM磷酸鈉緩沖液沖洗。Ax-15蛋白在體積為77.0L的5.0mM磷酸鈉、130mM NaCI、pH 7.0-7.2梯度中洗脫下來。同時將洗脫液按1∶5的比例稀釋到不含鹽的10.0mM磷酸鈉、pH 9.0-9.2緩沖液中，以此來降低他們的傳導性并提高其pH。收集那些在峰的上升部分超過以前確定的最大280nM吸收標準20％和那些在峰的下降部分超過20％的洗脫液。收集液進行冷凍保存(-30℃)或用于下面的步驟。將收集的SP FF瓊脂糖Ax-15蛋白進行濃縮，并且通過5,000mwco AGT hollow fiber filter(ACG Technologies，Inc.)對pH8.0-8.3的5.0mM磷酸鈉緩沖液進行滲濾。將收集物(24.66g)濃縮到≤5.0L。將濃縮過、滲濾過的Ax-15蛋白加到50LS-100Sephacryl(Pharmacia)sizing column上，用250L pH 8.0-8.3的5.0mM磷酸鈉緩沖液洗脫。收集那些在峰的上升部分超過以前確定的最大280nM吸收標準40％和那些在峰的下降部分超過40％的峰物質。將收集的Ax-15蛋白濾過0.22um的Millipak濾膜，并在配制和進行藥物制劑前將濾液在-80℃下保存。Ax-15的氨基酸序列如下所示。另外，一種大腸桿菌可產生在起始丙氨酸之前含有蛋氨酸的Ax-15氨基酸序列。
9 19 29 3949 59** ** ** ** * * **AFTEHSPLT PHRRDLASRS IWLARKIRSD LTALTESYVK HQGLNKNINL DSADGMPVAS69 79 89 99109119** ** ** ** ** **TDRWSELTEA ERLQENLQAY RTFHVLLARL LEDQQVHFTP TEGDFHQAIH TLLLQVAAFA129139149159169179** ** ** ** ** **YQIEELMILL EYKIPRNEAD GMPINVGDGG LFEKKLWGLK VLQELSQWTV RSIHDLRFIS*SHQTG蛋氨酸+10 20 30 40 50 60** ** ** ** ** **MAFTEHSPLT PHRRDLASRS IWLARKIRSD LTALTESYVK HQGLNKNINL DSADGMPVAS70 80 90100110120** ** ** ** ** **TDRWSELTEA ERLQENLQAY RTFHVLLARL LEDQQVHFTP TEGDFHQAIH TLLLQVAAFA130140150160170180** ** ** ** ** **YQIEELMILL EYKIPRNEAD GMPINVGDGG LFEKKLWGLK VLQELSQWTV RSIHDLRFIS*SHQTG實施例13利用Ax-15治療肥胖癥動物模型正常鼠正常的(8周)C57BL/6J鼠是得自Taconic。對鼠進行每天的皮下注射載體或Ax-15。這些鼠的體重每天都在增加，并且在第3天和第4天間確定24小時內的食物攝取量。
ob/ob鼠作為在6號染色體上單基因突變的結果，ob/ob鼠產生了一種截短的、非功能性的基因產物(Leptin)。這些鼠飲食過量、胰導功能亢進并顯著的肥胖。
C57BL/6J ob/ob鼠得自Jackson實驗室，并且在12-14周大小時進行實驗。這些鼠每天接受載體、Ax-15和Leptin的皮下注射。Pair-fed組也給予接受Ax-15(0.3mg/ml)處理的動物的平均食物消費量(g)。這些鼠的體重每天都增加，并且在第3天和第4天間確定24小時內的食物攝取量。在第8天，將實驗鼠殺死，并且進行尸體分析。
患有飲食誘導的肥胖癥(DIO)的鼠已經證明，AKR/J鼠易于患有通過增加身體脂肪含量方式進行的飲食誘導的肥胖癥。對于這種飲食性肥胖癥，如人肥胖癥來講，雖然對基因環境(飲食)相互作用沒有完全的了解，但是基因型是多基因的。
AKR/J鼠得自Jackson實驗室，并且在10-12周齡的時候接受高脂肪飲食(45％脂肪；研究用飲食)。在這樣的飲食進行7周后開始所有的實驗。這些鼠每天接受載體、Ax-15和Leptin的皮下注射。Pair-fed組也給予接受Ax-15(0.1mg/ml)處理的動物的平均食物消費量(g)。這些鼠的體重每天都增加，并且在第3天和第4天間確定24小時內的食物攝取量。在第8天，將實驗鼠殺死，收集血清用于胰島素和皮質酮檢驗。試劑在上述實驗開始就制備了重組人Ax-15，并從R & D Systems購得Leptin。結果正常鼠在正常鼠中，Ax-15以一種劑量依賴的方式減輕了正常鼠的體重。在6天里，接受0.1mg/kg、0.3rng/kg和1mg/kg劑量處理動物分別損失了大約4％、11％和16％的體重(Figure 17).。
ob/ob鼠在對ob/ob鼠進行Ax-15處理后，他們的體重產生了與劑量(0.1mg/kg-3mg/kg)相關的減少(圖18)。在0.1mg/kg-3mg/kg的劑量范圍內，體重有8-25％的降低。接受特定的Ax-15劑量(0.3mg/kg)的pair-fed鼠表現了與接受前述Ax-15劑量的鼠相同的體重損失，這表明食物攝取是體重降低的主要原因。
Leptin也可有效降低ob/ob鼠的體重。在1mg/kg劑量時，在7天內leptin使體重降低了6％，其過程與給藥0.1mg/kg Ax-15(figure 18)幾乎相同。
尸體分析表明，與pair-fed對照組一樣，Ax-15和leptin處理顯著減少了總的身體脂肪(表5)。相對于載體給藥組，這些組中都有很少但不顯著的瘦體重損失。僅僅接受限食處理的鼠(pair-fed)與載體對照組在脂肪/瘦體重比率上沒有區別。這表明他們損失的脂肪和瘦體重相同。然而，Ax-15和leptin處理的鼠表現出優選的身體脂肪損失，這可通過脂肪/瘦體重比率的降低反映出來(表5)。
DIO鼠Ax-15以劑量依賴方式降低了DIO鼠的體重。在一周之內，接受0.1mg/kg、0.3mg/kg和1mg/kg劑量處理動物分別損失了大約14％、26％和33％的體重(Figure 19)。相對于Ax-15處理的效果和pair-fed對照組鼠，在這兩組中有小但顯著的區別，這表明在Ax-15處理組中降低的食物攝取可能是，雖然不是唯一的體重損失原因。實際上，Ax-15處理顯著減輕了DIO鼠中與胰島素功能亢進相關的肥胖癥，然而僅僅減少食物攝取卻沒有收到這樣的效果(圖20A)。此外，Ax-15處理沒有提高皮質酮的水平，而皮質酮升高是限食的普遍結果(圖20B)值得注意的是對Ax-15以相同的劑量范圍(0.1-1mg/kg)給藥時，DIO鼠相對于正常鼠損失了超過兩倍的體重(見圖17)飲食誘導的肥胖癥動物對Ax-15的高敏感性表明肥胖癥可以調節Ax-15的效率，從而使得肥胖癥在正常化之后Ax-15并不引起體重的持續損失。
DIO鼠是leptin抗性的，在每天注射leptin的動物中沒有觀察到體重損失(1mg/kg；圖19)。
我們的結論如下1.Ax-15以劑量依賴方式引起正常鼠的體重損失。
2.Ax-15以劑量依賴方式引起ob/ob鼠的體重損失。對ob/ob鼠來講，Ax-15(0.1mg/kg)在引起體重損失方面與Leptin(1mg/kg)是等效的。Ax-15和Leptin處理，而不是pair-fed，優選的減少總脂肪，而不是瘦體重。
3.Ax-15在飲食誘導的鼠中以劑量依賴方式引起體重損失，而Leptin是無效的。Ax-15處理減輕了DIO鼠與胰導功能亢進相關的肥胖癥；但在pair-fed鼠中沒有觀察到其效用。此外，Ax-15鼠在DIO鼠中比在正常鼠或ob/ob鼠中更有效的誘導體重的損失。總起來講，我們的結果表明了Ax-15在治療Leptin抗性肥胖癥，如II型糖尿病相關的肥胖癥方面的一個特定應用。
4.在Leptin抗性鼠模型中，Ax-15在減少體重上的有效性表明Ax-15也可有效減少那些Leptin抗性或對Leptin不敏感的肥胖癥患者的體重。
表5ob/ob鼠的尸體分析結果脂肪g Lean mass g FatLean mass載體 平均34.77 4.797.26sem 1.41 0.24Pair-fed to Ax-15 0.3mg/kg 29.36 4.037.280.93 0.07Ax-15 0.1mg/kg 30.22 4.386.90.59 0.13Ax-15 0.3mg/kg 26.77 4.036.640.66 0.08Ax-15 1mg/kg 23.29 3.356.950.87 0.12Ax-15 3mg/kg 233.5 6.570.53 0.12Leptin 1mg/kg28.89 4.736.110.89 0.1實施例14PEG化Ax-15申請者已經通過將不同長度和類型的聚乙烯醇鏈與Ax-15多肽分子共價交聯制得了幾種不同的PEG化Ax-15分子。申請者也發明了多種純化方法來將PEG化形式的Ax-15與未修飾的Ax-15分子分離開來。材料與方法利用大腸桿菌(上文)制得的、純化的Ax-15用于這些研究。從Shearwater Polymers，AL購得了利用胺特異末端基團功能化的不同分子量的PEG鏈，從Sigma，MO購得了Bicine，以及從Novex，CA購得了Bis-Tris預制凝膠。進行小規模的反應研究來檢驗不同的反應條件。選用了不同的反應條件，下面的條件是可變的1.Ax-15蛋白濃度0.6mg/ml-6.0mg/ml。
2.PEG/Ax-15蛋白摩爾比直至30∶13.溫度4℃至室溫此外，在應用了醛化學的例子中，選用了不同濃度的還原性試劑(如購自Aldrich Chemicals，Milwaukee，WI的sodiumcyanoborohydride)來還原Schiff堿。通過添加遠遠超過1M貯液的pH 7.5的Tris-HCI來終止反應，而貯液室購自Life Technologies，Gaithersburg，MD.。一般來講，用于調節蛋白濃度的pH 7.5、50 mMTris-HCI是在μM范圍之內的。
對于純化來講，反應產物一般是用低鹽緩沖液來稀釋，并且進行離子交換柱層析。柱子用低鹽緩沖液沖洗，用溶解在15mM Bicine緩沖液中的0-300mM NaCI梯度洗脫，而洗脫液要流過裝有購自Pharmacia，Piscataway，NJ的Q-HP陰離子交換樹脂柱。我們觀察到在未修飾的Ax-15和與結合有不同數量的PEG鏈相對應的pegylated形式之間有很好的分離。對離子交層析柱的不同收集液進行濃縮，并通過標準預備的分子大小排組層析來進一步純化。在許多情況下，將兩種相近形式的PEG Ax-15蛋白收集到一起，并且當作一個樣品來處理(例如，標明為PEG 5K(3，4)-20胺-Ax 15的樣品主要包含通過20胺連接結合有3或4鏈分子量大約為5KD PEG分子的樣品)。
通過下列方法中的任一種或所有方法對反應產物和純化樣品進行分析1.在還原性和非還原性條件下的SDS-PAGE2.分析用離子交換層析法3.分析用分子大小排阻層析一開始，在SDS-PAGE凝膠上的泳道的模式基礎之上，指出了樣品中結合到Ax-15分子上的鏈的數量。在已公開的技術(Karr，L.J.et.al.，Methods in Enzymology 228377-390(1994))之上，通過游離氨基檢測法或通過偶聯到MALLS(多角度激光散射)體系上的、依次配備有UV、RI(屈光指數)和MALLS檢測器的分析用分子大小排組層析柱來檢測主要的氨基以便對其數量進行確認。光散射是大分子質量和濃度的一個函數。為了確定分子量。將蛋白樣品注射到凝膠過濾柱中，流出物依次利用即時光散射檢測器和屈光指數和/或UV檢測器來進行檢測。光散射檢測器是購自Wyatt Technology Corporation(Santa Barbara，CA)MiniDawn激光散射檢測器。這種儀器可從三個不同角度檢測靜態光。即時光散射檢測器或UV檢測器用于測定蛋白濃度。在蛋白的dn/dc(dn＝屈光指數變化；dc＝濃度)或消光系數基礎之上，利用Astra 4.7軟件(Wyatt Technology Corporation，Santa Barbara，CA)來計算蛋白濃度。SEC-MALLS體系液用于檢測PEGAx-15制劑的純度和分子量。
在下列的體內實驗中檢測了多種PEG Ax-15分子。實施例15利用PEG Ax-15來治療肥胖癥的體內實驗已經證明，AKR/J鼠易于患有通過增加身體脂肪含量方式進行的飲食誘導的肥胖癥。對于這種飲食性肥胖癥，如人肥胖癥來講，雖然對基因環境(飲食)相互作用沒有完全的了解，但是基因型是多基因的。下面進行的實驗是為了檢驗PEG Ax-15在患有飲食誘導的肥胖癥的實驗動物模型中對體重和食物攝取的影響。在本實驗中描述的特定分子叫做1-20-PEG Ax-15，這僅僅是通過上述方法制備得到的并在體內實驗中進行檢測的許多PEG化Ax-15分子中的一個。這個分子是20KDPEG通過20胺連接的單PEG化分子。表6展示了多種Pegylated Ax-15制劑體內活性的對比。 實驗步驟從10周齡開始對雄性AKR/J鼠(The Jackson Laboratory，BarHarbor，Mb.)進行高脂肪飲食飼養(含有45％脂肪能量)。到17周齡時，這些鼠比飼養以正常飲食的同窩鼠重30％，這些鼠叫做飲食誘導的肥胖癥(DIO)鼠。每組包括6只DIO鼠的四組鼠接受每周皮下注射載體(PBS)、非PEG化Ax-15(0.7mg/kg)或1-20-PEG Ax-15(0.23或0.7mg/kg)。在治療期間，每天記錄和24小時飲食的檢測數據，持續13天。結果1-20-PEG Ax-15處理以劑量依賴方式減輕了DIO鼠的體重(圖21)。在0.7mg/kg劑量條件下，1-20-PEG Ax-15引起了接近32％的體重損失，而相同劑量的非PEG化Ax-15僅僅減輕了8％的體重。此外，體重損失與食物攝取的減少緊密相連，在高劑量處理(0.7mg/kg 1-20-PEG Ax-15)組中觀察到食欲的最大損失(圖22)。在這個處理組中食欲抑制時間也最長(圖22)。這些發現說明PEG化將Ax-15在DIO鼠體重損失方面效率提高了4倍(圖22)。因此，Ax-15 PEG化可允許低劑量和低頻率給藥。實施例16利用Ax-15來治療非胰島素依賴性糖尿病(NIDDM)背景非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM或II型糖尿病)影響了大約5％的人口，它的特征在于提高了血糖的濃度，這種提高主要是由于在外周組織中對胰島素作用的抗性產生的。NIDDM是最普遍的代謝疾病中的一種，是由環境因素和基因因素共同決定的。為揭開特定NIDDM易患基因的分子同一性所做的努力導致了對幾種異常的鑒定，這有助于個體小亞群中的疾病的治療。然而，NIDDM最普遍的、最新出現的形式涉及的基因的分子同一性仍然沒有得到鑒定。
C57BL/KsJ db/db(db/db)鼠是NIDDM的動物模型中研究的最好的一個。這些鼠是胰島素抗性的，并且也表現出多種代謝和激素異常，如大規模的肥胖、飲食過度和低能量消耗(Kodama，H.，et al.，1994Diabetotogia 37739-744)。與在患有NIDDM的人中一樣，在db/ab鼠中也是由減少的葡萄糖代謝的內環境調控，高血漿葡萄糖水平和延遲的葡萄糖消失突出說明了這一點，這是通過口服葡萄糖耐受性檢驗(OGTT)得出的評價結果。已知系統給藥睫狀神經營養因子(CNTF)可減少缺乏功能性leptin(ob/ob鼠)或leptin受體(db/db鼠)的鼠的肥胖癥(Gloaguen，I.et el.，1997，Proc Natl Acad Sci946456-6461)。我們利用這種模型進行的研究表明Ax-15處理對食物攝取和體重調節(下文有詳述)上有戲劇性的效果，并且在葡萄糖耐受上也有戲劇性的效果，而后者是不能單單歸因于體重損失的。與pair-fed糖尿病鼠和載體處理的糖尿病鼠相比，對實驗動物進行為期10天的Ax-15處理以一種劑量相關的方式顯著提高了口服葡糖耐受性(下文有詳述)。這說明實驗動物在以一種胰島素依賴方式或非胰島素依賴方式處理葡萄糖大丸劑注射上的能力有了提高。重要的是，在Ax-15處理過的鼠中，空腹血漿葡萄糖水平和胰島素水平(下文有詳述)顯著降低到接近正常的、非糖尿病水平。由于在NIDDM中空腹血清胰島素水平和胰島素抗性之間有很強的聯系，所以這些結果說明Ax-15處理在實驗模型中顯著降低了胰島素抗性。相對于載體處理對照db/db鼠，Ax-15處理過的鼠中游離脂肪酸水平有顯著的降低(下文有詳述)。
這些結合數據表明Ax-15處理提高了對葡萄糖的處理和對胰島素的敏感性，這些不能歸因于減少的食物攝取和隨后的體重損失。在生物化學水平上，已知胰島素信號包括由胰島素結合到其細胞表面受體上引發的級聯反應，隨后是自磷酸化作用和受體酪氨酸激酶活化，這使得胰島素受體底物的酪氨酸磷酸化作用(IRSs)(Avruch，J.，1998，Molecular Cell Biochem 18231-48)。雖然胰島素在神經末梢區域的絕大多數作用被認為是通過其受體介導的，但弓狀核中的神經元表達胰島素受體和已知IRSs也是已知的(Baskin，D.G.，et al.，1993，Reg Peptides 48257-266；Schwartz，M.W.，et al.，1992，Endocr Rev 13387-414)。在與雜和體同窩鼠(db/？)進行對比的情況下，我們對db/db實驗動物弓狀核中p(tyr)(pTyr)染色蛋白的評定意外的揭示了蛋白，或許是IRSs的組成性活化作用。在這些實驗中，檢測用Ax-15都減輕了這種畸變，這表明在這些區域修復了對胰島素信號途徑的正常信號傳導。
胰島素另外一個已有詳細說明的作用是IRSs與磷酸肌醇(PI)3-激酶調節亞基的結合，已經證明磷酸肌醇(PI)3-激酶調節亞基對多種胰島素作用是必需的(葡萄糖運輸、蛋白質合成以及糖原合成)(Shepard，P.R.，et al.，1996，J.Mci Endocr 17175-184.)。目前已知的經由胰島素刺激的PI3激酶是I型異源二聚體p85/p110催化性PI3激酶。p85亞單位作為一個銜接子連接著p110催化亞單位和適當的信號復合體。所有形式的銜接子亞單位都包含有結合到IRS-1、IRS-2和生長因子受體上的酪氨酸磷酸化基序上的SH2結構域(見Shepard，ibid.)。在對Ax-15處理過的db/db鼠肝臟細胞進行的分析中發現，胰島素在提高p85相關的p(Tyr)蛋白對胰島素作出響應方面的能力有所恢復。這些結合結果表明Ax-15處理能(1)提高db/db鼠處理葡萄糖的能力以及(2)對個體組織的評定表明了對胰島素的敏感性的提高。
本發明的目的是對一種修飾的CNTF，Ax-15對NIDDM模型中db/db鼠的糖尿病病情產生的影響進行定性。實驗步驟(1)實驗動物在一個屋子中飼養6-8周齡的雄性db/db C57BL/KsJ鼠(Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME)溫度維持在69-75℃，每天光照12小時。所有的實驗動物的使用程序嚴格的與動物保護與使用委員會(IACUC)通過的協議相一致。從第10周開始，對鼠進行個體飼養，接受標準的鼠食(Purina Mills，Richmond，tN)ad libitum，并可以自由飲水。對Pair-fed實驗鼠每天提供所有報道中的最高劑量Ax-15處理組中的鼠消費的食物的平均量。每天大約在相同時間每日注射Ax-15(0.1和0.3rog/kg，s.c.)和載體(10mM磷酸鈉，0.05％Tween 80，3％PEG 3350，pH 7.5的20％蔗糖)。每天記錄實驗鼠體重，并且每天收集從尾靜脈流入毛細管中的血樣。為了進行口服葡萄糖耐受性檢驗(OGTT)，所有實驗鼠必需禁食18-20小時，并且大約在1000左右開始對尾部放血以進行基線測定。尾部放血后，通過喂食針頭(VWR，Plainfield，NJ)對實驗動物給藥89mg溶解在0.2ml蒸餾水(-2.2g/kg體重)中的D-葡萄糖(Sigma，St.Louis，MO)。在葡萄糖給藥后20、60和210分鐘從尾部抽取血液。在按照前面敘述的對血糖、胰島素、游離脂肪酸和甘油三酯(Linco ResearchImmunoassay，St Charles，MO)進行檢驗之前將血清在-20℃下貯存(Tonra，J.R.，et al.，1999，Diabetes 48588-594)。(2)組織取樣、勻漿和免疫沉淀在實驗的不同組中，對鼠進行研究來檢查Ax-15處理對受體信號元件的效用。在上述的對Ax-15進行的給藥次數和劑量之后(參看上文)，分離肝臟組織并速凍以進行隨后的分析。組織樣品(100mg)在置于冰上的緩沖液A(1％NP-40，50mM Hepes pH 7.4，150mM NaCI，1mMEDTA，30mM磷酸鈉，50mM氟化鈉，0.5mM原釩酸鈉，5μg/ml抑肽酶，5μg/ml白胃素，1mm PMSF)中，在14,000g下離心10分鐘。在4℃下，利用5ul抗p(tyr)抗體(4G10)或偶聯到蛋白A瓊脂糖(Upstate Biotechnology，NY)上的抗IRS-1抗體來免疫沉淀裂解物蛋白(2mg)，過夜。利用緩沖液A沖洗免疫沉淀物3次，并且在65℃下加熱大約5分鐘。在6％或8％預制凝膠上對蛋白樣品進行SDS-PAGE分析，并通過Trans Blot系統(Hoeffer
Transblotter，Pharmacia，NJ)轉移到氮纖維素薄膜(Novex，CA)上。在室溫下，利用5％BSA(對于4G10印記)或3％BIotto/0.5％BSA對氮纖維素薄膜進行阻斷，為時至少1小時，然后在4℃下與主要抗體培育過夜。使用的抗體包括抗p(tyr)4G10(1∶5000；UpstateBiotechnology Inc)、抗IRS-1和p85(New England Biolabs，BeverLey，MA)。(3)免疫組織化學有待進行免疫組織化學評定的實驗動物要進行4％多聚甲醛的經心灌注，并將大腦取出，冷凍直至處理前。在弓狀核水平區域切下40μm的一個切片，用KPBS(鉀緩沖鹽溶液，pH7.2)，并在室溫下阻斷20分鐘(溶解在KPBS中的4％正常血清/0.4％Triton X100/1％牛血清白蛋白，Fraction V，Sigma)。在4℃下，自由漂動的切片與做1∶1000稀釋的鼠抗p(tyr)抗體(4G10)培育過夜以檢測p(tyr)蛋白，沖洗，然后與在緩沖液(KPBS/0.02％Triton X-100/1.0％ BSA)中做1∶1500稀釋的生物素化的馬抗鼠抗體共培育，隨后與抗生物素蛋白過氧化物酶(在PBS中做1∶500稀釋；Vector Elite Kit，VectorLaboratories，Burlington，CA)共培育，這兩次培育都是在室溫下，為時60分鐘。在每個步驟中間，切片要用PBS完全沖洗，通過二氨基聯苯胺(Sigma St Louis，MO)反應將與組織相連的過氧化物酶固定在明膠包被的載波片上，脫水并加蓋玻片使之可進行觀察。結果(1)對db/db實驗動物進行每日Ax-15處理比能量限制顯著引起了體重損失。對db/db鼠或他們的雜合同窩鼠每天進行Ax-15(0.1或0.3mg/kg)或載體注射(s.c.)，為期10天。對以組載體治療動物(pair-fed)的飲食限制為最高劑量Ax-15處理組的鼠的飲食量。圖23展示了實驗結果。每天報道平均組體重+/-SEM(n＝12)。Ax-15(0.1 & 0.3m/kg/天，為期10天)外周給藥顯著減少了食物攝取并以劑量依賴的方式減輕了體重(BW)。對最高劑量的檢測來講，對BW的效用要大于能量限制引起的效用(c.f pairfed vehicle db/db；PF)，并且它與附睪脂肪量(25％)和肝臟質量(35％)有關，但對肌肉質量沒有產生影響。
(2)對db/db實驗動物為期10天的Ax-15出對葡萄糖耐受產生的影響。對接受載體處理(開放正方形)、pair-fed載體處理(填充菱形)和Ax-15處理(0.1mg/kg/天，開放三角形；0.3mg/kg/天，填充三角形)的db/db雄性鼠和年齡相當的雜合db/？鼠(填充圓形)進行了口服葡萄糖耐受性檢驗(OGTT)。圖24展示了這個實驗的結果。每個點代表至少十二只實驗動物+/-SEM。相對于載體處理組的水平，他們的空腹血漿葡萄糖(65％)、胰島素(53％)和NEFA(23％)水平都有下降。口服葡萄糖耐受性檢驗表明在葡萄糖耐受性方面有一種劑量依賴性的提高，曲線內的區域與PF和載體對照組有顯著的不同。
(3)對db/db實驗動物進行低劑量Ax-15處理引起實驗動物體重的顯著損失。對實驗動物每天注射(s.c.)Ax-15(0.0125，0.025或0.05mg/kg)或載體，為期10天。每天報道平均組體重+/-SEM(n＝6)。正如圖23C中所示，實驗動物體重以一種劑量依賴方式減輕。
(4)db/db實驗動物的低劑量Ax-15處理對實驗動物葡萄糖耐受性的影響體。對接受載體(開放正方形)和Ax-15處理(0.0125，0.025或0.05mg/kg)的db/db雄性鼠進行口服葡萄糖耐受性檢驗(OGTT)。每個點代表至少6只實驗動物+/-SEM.的平均值。正如圖23D所示，血漿葡萄糖濃度以劑量依賴性方式降低，0.05m/kg劑量時限食了血漿葡萄糖濃度的最大降低。
(5)Ax-15處理的效用的時間變化。相對于載體處理(開放正方形)、pair-fed載體處理(填充菱形)，Ax-15處理(0.3mg/kg/天；填充三角形)對db/db雄性鼠非禁食血清血糖的影響的時間變化。每個點代表在最后注射14小時后至少6只實驗動物+/-SEM。正如圖24總所示，相對于載體處理或pair-fed載體處理鼠，第3天的Ax-15顯著降低了非禁食血清血糖。
(6)對db/db實驗動物進行為期10天的Ax-15處理產生的生理后果。圖25A-25C展示了實驗結果，這個實驗時設計來對db/db實驗動物進行為期10天Ax-15處理產生的生理后果進行評價的。圖25A相對于對照組、載體處理組(開放條狀)、pair-fed載體處理(陰影線條狀)組鼠以及年齡相似的雜合db/？鼠(點狀)相比，對進行了為期10天Ax-15(0.1mg/kg/天和0.3mg/kg/天，陰影形條狀)處理的db/db雄性鼠血清的空腹血糖濃度進行了確定。每個條代表了至少8只實驗動物的平均值+/-SEM。圖25B相對于對照組、載體處理組(開放條狀)、pair-fed載體處理(陰影線條狀)組鼠以及年齡相似的雜合db/？鼠(點狀)相比，對進行了為期10天Ax-15(0.1mg/kg/天和0.3mg/kg/天，陰影形條狀)處理的db/db雄性鼠血清的空腹胰島素濃度進行了確定。每個條代表了至少8只實驗動物的平均值+/-SEM。圖25C相對于對照組、載體處理組(開放條狀)、pair-fed載體處理(陰影線條狀)組鼠以及年齡相似的雜合db/？鼠(點狀)相比，對進行了為期10天Ax-15(0.1mg/kg/天和0.3mg/kg/天，陰影形條狀)處理的db/db雄性鼠血清的空腹脂肪酸水平進行了確定。每個條代表了至少8只實驗動物的平均值+/-SEM。
(7)Ax-15處理對db/db鼠弓狀核中胰島素刺激的p(tyr)免疫反應性的影響。對雜合(db/？)鼠進行的免疫染色表明，相對于載體注射組的水平(圖26A)，在為時30分鐘的胰島素大丸劑給藥(1IU，經由頸靜脈)后，弓狀核的p(tyr)免疫反應染色神經元數量有所增長(圖26B)。這個結果反映出弓狀核神經元可能表達胰島素受體和其底物(例如IRS-1)，這兩種物質在胰島素結合后都進行了磷酸化。對胰島素具抗性的/患有糖尿病的db/db鼠(載體處理10天)進行的分析揭示了一個在胰島素處理后(25D)具有檢測不到的變化的組成性高p(tyr)免疫活性染色模式(Figure 26C)。對db/db鼠進行的為期10天的Ax-15處理減少了高基底部1p(tyr)反應性(圖26E和26G)并保留了胰島素p(tyr)的敏感性(Figure 26F and 26H)。
(8)Ax-15處理對db/db鼠肝臟中胰島素刺激的信號的影響。圖27A-27B展示了實驗結果，這些實驗時設計來評價Ax-15處理對db/db鼠肝臟中胰島素刺激的信號的影響的。對雄性db/db鼠進行了為期10天的載體(7和8泳道)、pairfed到藥物處理水平(1和2泳道)或Ax-15(0.1mg/kg/天，泳道5 & 6；0.3mg/kg/天，泳道4 &5).處理。在第11天利用戊巴比妥和從門靜脈注射鹽水(-)或1IU普通胰島素，使動物麻醉。1分鐘后將肝臟取出，利用抗p(tyr)特異性抗體4G10對蛋白提取物進行免疫沉淀，隨后利用一種抗血清對p85調節亞基PI3-激酶進行標準的Western blot分析(圖27A)；利用IRS-1特異性抗血清對蛋白提取物進行免疫沉淀，緊接著利用抗p(tyr)特異性抗體進行標準的Western blot分析(圖27B，上部)以及利用一種IRS-1-特異性抗血清(圖27B，底部)對蛋白提取物進行免疫沉淀。以與免疫沉淀和印記對照組相同的方法對非免疫對照免疫沉淀(NI)、無裂解物對照(NL)以及p85的3T3-L1裂解物對照(C)進行的電泳。
對Ax-15處理過的鼠外周組織的胰島素作用分析顯示了增強的特定底物(IRS-1)的酪氨酸磷酸化作用，也增強了與p(tyr)相關的PI3激酶對急性i.v.胰島素大丸劑的響應。在CNS的弓狀核水平進行的免疫組織化學評定表明Ax-15處理降低了升高的基底部p(tyr)水平并保留了胰島素刺激的p(tyr)，而這種升高的p(tyr)水平在載體處理的db/db中可觀察到。這些數據表明，在對缺乏leptin受體的功能性長型(即db/db)的實驗動物進行Ax-15處理后，提高了外周葡萄糖耐受性，并保留了外周和中樞的胰島素依賴性信號級聯反應。
這些結果表明Ax-15具有在由體重損失單獨引起的效用過程中和其效用之上使葡萄糖代謝正常化的能力，也暗示了CNTF或其變體在患有異常葡糖代謝如胰導功能亢進、低血糖或糖尿病，尤其是II型糖尿病或非胰島素依賴型(NIDDM)糖尿病的病人葡糖代謝正常化中的有效性。
雖然前述的發明的許多細節是通過圖示和例解的方式來描述的，其目的是給以清晰的理解，按照本發明的教義，對于本領域中的普通熟練技術人員來講，本發明很容易理解的，并且在不偏離附加權利要求的前提下可對其做特定的變動與修改。
權利要求
1.修飾的睫狀神經營養因子Ax-15在一種藥劑的制造中的應用，而這種藥劑用于哺乳動物糖尿病的治療。
2.權利要求1中的應用，其中的糖尿病是非胰島素依賴性糖尿病或妊娠期糖尿病。
3.權利要求1或2中的應用用于減輕胰島素抗性或提高胰島素敏感性。
4.修飾的睫狀神經營養因子Ax-15在一種藥劑的制造中的應用，而這種藥劑用于降低哺乳動物血清中的游離脂肪酸。
5.修飾的睫狀神經營養因子Ax-15在一種藥劑的制造中的應用，而這種藥劑用于哺乳動物內分泌系統疾病和失調的治療。
6.修飾的睫狀神經營養因子Ax-15在一種藥劑的制造中的應用，而這種藥劑用于在防治哺乳動物非胰島素依賴性糖尿病和妊娠期糖尿病發生。
7.前述任一權利要求中的應用，其中該哺乳動物是人。
8.前述任一權利要求中在藥劑制造方面的應用，這些藥劑是通過選自靜脈內、皮下、肌肉內、鞘內(intrathecal)、intracerebroventricular、intraperitoneal以及實質內(intraparenchymal)給藥的藥物傳遞途徑來給藥的。
9.權利要求8中的應用，其中的給藥是通過植入可釋放Ax-15的細胞來實現的。
10.前述任意權利要求中的應用，其中的Ax-15是PEG化的。
11.治療哺乳動物糖尿病的方法，包括對哺乳動物給藥以包含在載體中的修飾的睫狀神經營養因子Ax-15。
12.權利要求11中的方法，其中的糖尿病是非胰島素依賴性糖尿病或妊娠期糖尿病。
13.降低哺乳動物胰島素抗性的方法，包括對哺乳動物給藥以包含在載體中的修飾的睫狀神經營養因子Ax-15。
14.提高哺乳動物胰島素敏感性的方法，包括對哺乳動物給藥以包含在載體中的修飾的睫狀神經營養因子Ax-15。
15.降低哺乳動物血清游離脂肪酸水平的方法，包括對哺乳動物給藥以包含在載體中的修飾的睫狀神經營養因子Ax-15。
16.治療內分泌系統疾病和病癥的方法，包括對哺乳動物給藥以包含在載體中的修飾的睫狀神經營養因子Ax-15。
17.預防哺乳動物妊娠期糖尿病和非胰島素依賴型糖尿病發生的方法，包括對哺乳動物給藥以包含在載體中的修飾的睫狀神經營養因子Ax-15。
18.包括包含在載體中的修飾的睫狀神經營養因子Ax-15的組合物，其可用于治療哺乳動物糖尿病。
19.包括包含在載體中的修飾的睫狀神經營養因子Ax-15的組合物，其可用于降低哺乳動物血清中游離脂肪酸水平。
20.包括包含在載體中的修飾的睫狀神經營養因子Ax-15的組合物，其可用于治療哺乳動物內分泌系統疾病和失調。
21.包括包含在載體中的修飾的睫狀神經營養因子Ax-15的組合物，其可用于預防哺乳動物妊娠性糖尿病和非胰島素依賴性糖尿病發生。
全文摘要
在制備用于治療糖尿病,尤其是用于治療非胰島素依賴性糖尿病mellitus或妊娠性糖尿病的藥劑中使用了修飾的睫狀神經營養因子Ax－15。
文檔編號C07K14/435GK1387568SQ00814294
公開日2002年12月25日 申請日期2000年7月27日 優先權日1999年8月13日
發明者S·J·維甘德, M·W·斯萊曼, P·D·拉姆伯特 申請人:里珍納龍藥品有限公司