抑制lgE產生的物質和方法

專利名稱：抑制lgE產生的物質和方法
技術領域：
本發明作為一項由國立衛生研究所支助的許可號為No.CA69959和R37AI25904的研究項目在政府的支持下完成。
與相關申請的相互參考本申請要求了于1999年8月27日申請的美國監時申請No.60/151026的優先權。
背景技術：
干擾素被分為不同的兩個組I型干擾素，包括IFNα、IFNβ和IFNω(也被稱作IFNαII)；II型干擾素，以IFN γ為代表(由DeMaeyer等評述，1998)。估計人體內具有至少17個IFNα非等位基因，至少約2或3個IFNβ非等位基因和1個IFN γ基因。
各種IFNα已表現出對各種類型的細胞增殖具有抑制作用。IFNα尤其對治療血液惡性腫瘤如多毛細胞白血病(Quesada等，1984)有用。而且，這些蛋白質還顯示出抗多發性骨髓瘤、慢性淋巴細胞白血病、低級淋巴瘤、卡波西肉瘤、慢性骨髓白血病、腎細胞瘤、膀胱瘤和卵巢癌的活性(Bonnem等，1984；Oldham，1985)。還研究了干擾素和干擾素受體在某些自身免疫和炎癥疾病的致病過程中的作用(Benoit等，1993)。
各種IFNα還對治療各種類型的病毒感染有用(Finter等，1991)。IFNα還顯示出抗人類乳頭瘤病毒感染、乙型肝炎和丙型肝炎感染的活性(Finter等，1991；Kashima等，1988；Dusheiko等，1986；Davis等，1989)。另外，對IFNα和IFNγ的研究表明IFNα和IFNγ可抑制過敏性疾病中IgE的產生(Noh等，1998；Hofstra等，1988；Lack等，1996；Dolen等，1995；Kimata等，1995；Gruschwitz等，1993)。
然而，最明顯地是，各種IFNα的有用性受到其本身毒性的限制干擾素在用于治療癌癥和病毒性疾病的過程中產生嚴重的副作用，諸如發燒、寒戰、厭食、體重下降和疲乏(Pontzer等，1991；Oldham，1985)。這些副作用通常需要(i)將干擾素的劑量降到限制有效治療的水平，或者(ii)解除病人的治療。這種毒性降低了那些對抗病毒和抗增殖有效的蛋白質在減輕人類和動物疾病的治療過程中的有用性。
干擾素-tau(IFNτ)是I型干擾素家族中的一員，但是不同于IFNα和IFNβ，當IFNτ在體外和用于動物體內研究時，在很高濃度下都不具有毒性(Bazer等，1989；Pontzer等，1991；Soos，Johnson，1995；Soos等，1995；Soos等，1997；Khan等，1998)。IFNτ最初被認為是一種由反芻動物如羊和牛胎盤的滋養層細胞產生的妊娠識別激素(Bazer等1991；Godkin等，1982；Imakawa等，1987；Johnson，1994)。據報道已發現了人IFNτ(Whaley等，1994)，但是這一現象還未被證實。因此，目前還不知道是否具有人IFNτ。IFNτ顯示出非常類似于IFNα和IFNβ的抗病毒和細胞抑制特性(Bazer等，1989；Pontzer等，1991；Soos，Johnson，1995)。然而，IFNτ不具有與高濃度的IFNα和IFNβ有關的細胞毒性(Bazer等，1989；Pontzer等，1991)。而且，與給個體施用高劑量的IFNα和IFNβ有關的體重下降和骨髓抑制沒有發生在施用了IFNτ的動物系統中(Soos，Johnson，1995；Soos等，1995；Soos等，1997)。研究表明I型干擾素的N-末端在決定IFN是否具有毒性方面發揮作用(Pontzer等，1994；Subramaniam等，1995)。
已經報道過IFNτ可抑制實驗性變態反應性腦脊髓炎(EAE)(一種用于自身免疫疾病、多發性硬化癥的動物模型)中的體液和細胞應答(Mujtaba等，1998)。已經表明IFNτ抑制淋巴細胞對促細胞分裂素如伴刀豆凝集素A(Con A)和超抗原如SEA和SEB的應答(Soos，Johnson，1995；Soos等，1995；Khan等，1998)。還報道了，也是在EAE模型中，IFNτ和其它I型IFN能夠誘導已被抗原提呈細胞激活的細胞產生IL-10和TGFβ，但不能誘導產生IL-4(Soos，Subramaniam等，1995；Mujtaba等，1998；Mujtaba等，1997)。IFNτ已被建議用于治療人的多發性硬化癥。
IgE免疫球蛋白的產生對于介導變態反應性疾病如過敏性鼻炎、遺傳過敏性皮炎、支氣管哮喘和食物過敏相當重要。通過腹膜內(ip)注射作為變應原的卵白蛋白(OVA)以及作為佐劑的氫氧化鋁而引起的小鼠變應性致敏是一種已很好表征的刺激體內產生IgE的方法(Mancino等，1980；Miguel等，1977；Beck等，1989)。當被OVA免疫的小鼠受到霧化的OVA的攻擊時，這些小鼠在肺的粘膜下層發生炎癥細胞的浸潤 (Kay等，1992；Hamelmann等，1996；Hamelmann等，1997)。IgE能夠刺激肥大細胞釋放出趨化介質，能夠引起巨噬細胞和粒細胞在該位置上的有效積累。并且，由這些細胞產生的另一種炎癥分子可以引起過敏性哮喘。因此，由B細胞產生的變應原特異性IgE對變態反應性疾病的發病起著相當重要的作用。
治療變態反應性疾病的傳統方法由減充血劑和抗組胺組成，這兩種藥物的作用是減輕發生變應性應答后的癥狀。因此，本領域仍然需要一種治療變態反應性疾病的方法，該方法沒有副作用并且能夠阻斷變應性應答，從而在產生癥狀前就能發揮作用。
本發明的概述本發明涉及對患有變態反應性疾病的患者進行治療的新型方法和藥物，所述變態反應性疾病如過敏性鼻炎(allergic rhinitis)、遺傳過敏性皮炎(atopic dermatitis)、支氣管哮喘(bronchial asthma)和食物過敏(food allergy)。本發明的方法包括給患有變態反應性疾病的人施用I型干擾素，如干擾素tau(IFNτ)，或嵌合性IFN(例如，羊IFNτ(1-27)/人IFNαD(28-166))。用藥后，所述干擾素抑制變應原-特異性IgE抗體的產生，而不產生副作用。本發明還涉及可以用于本發明方法的嵌合羊/人IFN。
附圖的主要描述

圖1A和1B表示在OVA-致敏的小鼠體內IFNτ處理抑制產生OVA-特異性IgE抗體。通過腹膜內注射卵白蛋白(OVA)與氫氧化鋁的混合物免疫BALB/C小鼠并在7天后進行加強免疫。免疫后第19天和20天將所述小鼠在霧化的OVA(1％w/v)中暴露20分鐘。從免疫前3天開始每天給小鼠腹膜內注射IFNτ(5×105U/天)或PBS。進行霧化OVA暴露前24小時(圖1A)或后24小時(圖1B)采血。直接進行ELISA來測定OVA-特異性IgE的濃度。每組使用2到3只小鼠，顯示平均的吸光度。從每一稀釋度點值減去利用正常小鼠血清測定的對照吸光度。通過Student’st檢驗，檢查與PBS處理相比，在IFNI處理的所有稀釋度水平下(10,000稀釋度除外)，OVA-特異性IgE抗體產生所受抑制作用的統計學顯著性水平(p＜0.05)。
圖2A-2C表示OVA-免疫的小鼠經PBS或IFNτ處理后的組織學評定。用OVA免疫BALB/C小鼠并在免疫后的第20天暴露于霧化的OVA然后按照上述方法用PBS或IFNτ進行處理。經霧化的OVA處理24小時后，對來源于未被免疫的(圖2A)、經PBS處理的(圖2B)、和IFNτ處理的(圖2C)小鼠的肺進行提取、固定、石蠟包埋、切片和用蘇木精以及曙紅進行炎癥細胞染色。箭頭表示細支氣管的上皮。
圖3表示OVA-免疫的小鼠經PBS或IFNτ處理后血清中的IL-4濃度。按照上面圖1的描述用OVA免疫BALB/C小鼠并暴露給霧化的OVA然后用PBS或IFNτ處理。霧化OVA暴露24小時后采血，進行夾心ELISA以便測定IL-4。每組使用2到3只小鼠，顯示了IL-4的平均含量(ng)。從PBS和IFNτ組水平中減去未免疫小鼠血清中的對照水平。
圖4A和4B表示用IFNτ對OVA-免疫小鼠進行體內處理降低了脾細胞的OVA-刺激程度。按照上述圖1的說明用OVA-免疫BALB/C小鼠并暴露給霧化的OVA然后用PBS或IFNτ進行處理。利用100μg/ml的OVA對脾細胞(5×105細胞/孔)進行72小時的培養，然后利用含氚胸苷對培養物進行脈沖。將PBS處理的脾細胞與BSA和MBP 100μg/ml進行培養(圖4B)。12小時后利用β閃爍計數儀對細胞有關放射性進行計數，由三個實驗中的一個得到的數據被表示為一式四份的孔中的平均cpm±SD。IFNτ處理對OVA所誘導細胞增殖的抑制相對于PBS處理的統計學顯著性水平通過Student’st檢驗來表示(p＜0.001)。
圖5表示利用I型IFN對脾細胞進行的體外處理可抑制OVA-特異性增殖。通過腹膜內注射OVA與氫氧化鋁的混合物來免疫BALB/C小鼠并且7天后進行加強免疫。在第19天和20天將所述小鼠在霧化的OVA(1％w/v)中暴露20分鐘。采用15000U/ml的各種IFN和含有或不含100μg/ml OVA的培養基將脾細胞(5×105細胞/孔)培養84小時，然后利用含氚胸苷對培養物進行脈沖。12小時后利用β閃爍計數儀對細胞相關放射性進行計數，由三個實驗中的一個得到的數據被表示為一式四份的孔中的平均cpm±SD。Student’s t檢驗顯示，所有IFN處理對OVA特異性脾細胞增殖的抑制相對于OVA致敏的培養基-處理細胞中的OVA特異性脾細胞增殖有統計學顯著性(p＜0.001)。
圖6A-6C表示對來源于經各種IFN或培養基處理的卵白蛋白(OVA)致敏小鼠的脾細胞或人骨髓瘤B細胞的培養上清液中小鼠和人IgE的免疫印跡測定。圖6A包括泳道1對照小鼠IgE；泳道2補加了10％FBS的RPMI 1640；泳道3和4在沒有OVA存在或有OVA存在的條件下分別培養了84小時的未免疫小鼠脾細胞的上清液；泳道5和6在沒有OVA存在或有OVA存在的條件下分別培養了84小時的經PBS處理的OVA致敏小鼠脾細胞的上清液；泳道7和8在沒有OVA存在或有OVA存在的條件下分別培養了84小時的經IFNτ處理的OVA致敏小鼠脾細胞的上清液；圖6B包括泳道1，對照小鼠IgE；泳道2，只含RPMI 1640培養基；泳道3，在沒有OVA存在的條件下的84小時脾細胞培養物；泳道4，5，6和7，在分別有培養基、IFNτ、IFNτ/IFNα嵌合體和IFNαD存在的條件下用OVA培養84小時的脾細胞(5×105細胞/孔)培養物；圖6C包括泳道1，只含RPMI 1640培養基；泳道2，3，4和5，產生IgE的U266BL細胞，其被饑餓過夜，并分別在有培養基、1.0×104U/ml IFNαD，IFNτ/IFNαD嵌合體，和IFNτ存在的條件下以2×105細胞/孔各培養96小時。
圖7表示I型IFN對產生IgE的人骨髓瘤B細胞系U266增殖的抑制。在有1.0×104U/ml的IFNτ，IFNτ/IFNαD嵌合體，IFNαD和培養基存在的條件下以2×105細胞/孔將饑餓過夜的產生IgE的U266BL細胞培養72小時。利用含氚胸苷對培養物進行脈沖，12小時后利用β閃爍計數儀對細胞相關放射性進行計數，由三個實驗中的一個得到的數據被表示為一式四份的孔中的平均cpm±SD。通過錐蟲藍排除試驗測定的細胞存活百分率被標在每一條形圖的上端。各種IFN處理對細胞增殖的抑制相對于培養基-處理對細胞增殖的抑制的統計學顯著性水平通過Student’s t檢驗來表示(p＜0.001)。
圖8表示經IFN處理后的人外周血單核細胞(HPBMC)的代謝活性。HPBMC在不同濃度(250至100,000U/ml)的IFNτ，IFN αD，IFNτ/IFNαD嵌合體存在的條件下培養7天。HPBMC的代謝活性通過按照材料和方法中的描述測定細胞的增殖和存活來評價，在本文中表示為相對于未處理對照的百分比。經羊IFNτ和IFNτ/IFNα嵌合體處理的HPBMC的值與未處理對照無顯著差異，而利用Wilcoxon signed-rank檢驗測定經人IFNα處理的HPBMC的值與未處理對照有顯著性差異(p＜0.05)。
本發明的詳細描述本發明涉及新型的治療和預防方法，該方法治療其中對IgE產生的抑制是有效和有利的的任何疾病，這些疾病包括變態反應性疾病和其它與IgE有關的疾病或狀況。本發明的方法可以治療的疾病包括，但不限于過敏性鼻炎、遺傳過敏性皮炎、支氣管哮喘和食物過敏。在本發明的方法中，對患有臨床上需要抑制IgE產生的狀況的患者施用有效量的含有I型IFN如IFNα、IFNβ、IFNτ或IFNω或嵌合IFN的組合物。
在本發明的一個技術方案中，有效量的IFNτ被施用給患有或易患變應性疾病或其它IgE相關疾病的人或動物。本發明方法所使用的IFN可以來自于任何產生IFN的動物，包括但不限于靈長類動物、羊、牛和其它動物。在本發明的另一個技術方案中，哺乳動物IFN被用于本發明的方法中以便治療患有或易患變應性疾病的或其它需要抑制IgE產生或應答的狀況或疾病的人或動物，所述哺乳動物IFN含有能夠提供IFNτ的低毒性而具有其它I型IFN的生物活性的氨基酸序列。在一個優選的技術方案中，將有效量的含有哺乳動物IFNτ氨基端和人I型IFN羧基端(如來源于IFNα)的嵌合體IFN施用給患有或易患變應性疾病或其它IgE相關疾病的人或動物。更優選地，嵌合體IFN蛋白含有羊IFNτ的1-27位氨基酸殘基和人IFNα的28-166位氨基酸殘基。在一個舉例性的技術方案中，所述IFNα是IFNαD。
本發明還涉及利用I型干擾素抑制體內和體外IgE產生和細胞增殖的方法。如本文的實例，來源于經卵白蛋白(OVA)免疫的動物的脾細胞通過IFNτ或嵌合IFNτ蛋白可抑制OVA誘導的增殖和IgE的產生。因此，本發明的方法可以被用于抑制動物或人中IgE的產生。本發明的方法還可用于體外抑制IgE產生。
本發明還涉及用于抑制包括細胞增殖和細胞因子產生在內的B細胞和T細胞應答的方法。如本文實施例，I型IFN可以被用于抑制IL-4的產生。細胞因子IL-4在B細胞向IgE產生的同種型轉換中起重要作用。
本發明多肽的生物活性突變蛋白(mutein)以及其它具有與本發明IFN多肽基本相同的抑制IgE的生物活性的分子如片段、肽和變體被認為是在本發明的方法范圍內。例如，具有與天然多肽相比突變體多肽的生物活性和功能沒有發生實質性降低的氨基酸取代、插入或缺失的IFNτ多肽就在本發明的保護范圍內。具體地講，被認為在本發明的保護范圍內的是仍保留了與全長IFN基本相同的生物活性的I型IFN片段。IFN的突變蛋白和片段可以通過利用本技術領域已知的標準技術來制備。例如，技術人員通過利用Bal31外切核酸酶(Wei等，1983)能夠從所述多核苷酸的一端或兩端系統地去除核苷酸以便產生一系列的多核苷酸片段，這些多核苷酸片段被表達時就產生了由該多核苷酸編碼的IFN片段。
本發明的多肽以及含有該多肽的組合物的治療應用可以通過任何現有的或本技術領域的技術人員能預知的合適治療方法和技術來實現。所述多肽可以通過本技術領域已知的任何適當途徑來進行用藥，包括例如口服、腸胃外、皮下或靜脈內的用藥途徑。本發明多肽的用藥可以是能夠由本技術領域的技術人員容易確定的連續用藥或在不同間隔時間用藥。
本發明還涉及嵌合體IFN多肽以及編碼這些多肽的多核苷酸。在一個技術方案中，嵌合體IFN含有羊和人IFN區域。優選地，一種本發明的嵌合體IFN蛋白含有羊IFNτ氨基端和人IFNa羧基端。在一個舉例性的技術方案中，嵌合體IFN蛋白含有羊IFNτ的1-27位氨基酸殘基和人IFNαD的28-166位氨基酸殘基。編碼本發明的嵌合體IFN的多核苷酸序列可以由本技術領域知曉本發明多肽氨基酸序列的技術人員方便地進行構建。正如本技術領域的技術人員可以得知的，由于遺傳密碼的簡并性，可以構建出許多不同的多核苷酸序列。特定核苷酸序列的選擇取決于例如特定表達系統的密碼子用法。
可用于本發明的化合物可以按照制備藥用組合物的已知方法來配制。配制方法已被詳細地記載在許多對于本技術領域的技術人員來說是已知的和容易獲得的文獻資料中。例如，由E.W.Martin編寫的雷明頓制藥科學(Remington’s Pharmaceutical Science) 記載了可以用于本發明的配制方法。總而言之，本發明的組合物將以有效量的生物活性多肽與合適載體混合的方式來配制從而方便和有效地進行所述組合物的用藥。用于本發明方法的組合物還可以是多種形式。這些形式包括，例如固體、半固體和液體的劑型，如片劑、丸劑、粉劑、液體溶液或懸浮液、栓劑、可注射的和可灌輸的溶液，以及噴霧。首選的劑型決定于將要進行的用藥方式和治療應用。所述組合物還優選地包括本技術領域技術人員熟知的、常規的藥學上可接受的載體和稀釋劑。
還可以通過利用脂質體技術、緩釋膠囊、包埋泵和可生物降解容器來進行本發明化合物的用藥。這些遞送方法可以在一段延續的時間內有效地提供均勻的劑量。
與本發明的多肽一起使用的載體或稀釋劑的實例包括乙醇、二甲亞砜、甘油、氧化鋁、淀粉以及等同的載體和稀釋劑。為了提供適合于所需治療方法的配藥施用方法，有利地是，本發明新型藥物組合物可包含總體上占包括載體或稀釋劑在內的組合物總重量大約0.1％至45％，具體地1％至15％的一種或多種多肽。
本文參考或引用的所有專利、專利申請、臨時申請和出版物被全文引入進行參考從而使它們與本說明書的詳細教導一致。
材料和方法干擾素利用一種合成基因構建物(Heeke等，1996)在巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)中表達羊干擾素tau(IFNτ)基因。IFNτ被分泌到培養基中并且通過連續的DEAE-纖維素和羥基磷灰石層析法被純化到由SDS-PAGE和銀染色分析法所測定的電泳級均一度。純化的蛋白具有的比活性是2.9-4.4×107U/mg蛋白，該比活性為測定的抗病毒活性，該活性通過利用MDBK的標準病毒微小噬菌斑減少分析方法來測定。(Pontzer等，1991)。重組人IFNαD來源于BiosourceInternational，Camarillo，CA。所述“人源化的”IFNτ/IFNαD嵌合體蛋白通過利用羊IFNτ的1-27位殘基和人IFNαD的28-166位殘基來構建并且如羊IFNτ所述在巴斯德畢赤氏酵母中進行表達。
免疫前96小時，IFNτ以5×105U/小鼠。每天的劑量進行腹膜內(ip)用藥并且從此以后每天持續用藥維持一個月。對照鼠使用PBS。小鼠的免疫采用在100μl總體積中被5mg氫氧化鋁凝膠沉淀的10μg卵白蛋白(OVA)(Sigma，St.Louis，MO)對BALB/C小鼠進行腹膜內免疫。氫氧化鋁凝膠是按照已述方法制備的(Revoltella等，1969；Warner等，1968)。初始免疫后7天采用同樣的方案再次對該小鼠進行免疫。免疫后的第19天和20天將所述小鼠暴露給由PBS中的1％OVA(w/v)霧化的OVA。利用Parils Jet+霧化器和壓縮機(Pari RespiratoryEquipment，Inc.，Midlothian，Virginia)進行20分鐘的霧化。小鼠被圈養在動物資源中心(Animal Resource Center)(弗羅里達大學)，并且所有試驗動物的使用都得到公共機構的動物飼養和使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC))的批準。組織學評價從氣管內給已被暴露給霧化OVA的OVA-免疫小鼠的肺灌注4％的多聚甲醛溶液。所述肺被固定在同樣的溶液中2-3天，然后將肺樣品包埋在石蠟中并切片。接著用蘇木精和曙紅將所述樣品染色。并且用玻片制備來源于同樣小鼠的血涂片，利用“LEUKOSTAT”染色試劑盒(FisherScientific，Pittsburgh，PA)將所述玻片染色以便進行分化白血細胞的計數測定。總共評估了150個白血細胞。增殖的分析從經PBS或IFNτ處理小鼠免疫后21天取出的脾細胞在有OVA存在的條件下于含10％FBS的RPMI 1640培養基中以5×105細胞/孔培養72至84小時。在另一種分析方法中，將PBS-處理的小鼠脾細胞在有OVA和各種IFN(10,000至15,000U/ml)存在的條件下以5×105細胞/孔培養72至84小時。所述培養物用[3H]-胸苷(1.0uCi/孔；Amersham，Indianapolis，IN)進行脈沖并在12小時后利用細胞收集器將培養物收集到濾紙盤上。細胞相關放射性通過利用β-閃爍儀來進行定量并以cpm表示活性。利用U266BL骨髓瘤B細胞進行的增殖分析是按照以下方式進行的在RPMI 1640培養基中將細胞培養過夜，然后在含4％FBS的RPMI 1640中以10,000至15,000U/ml的各種IFN培養4×105細胞/孔。所述培養物被培養72-84小時后用[3H]-胸苷對細胞進行脈沖，并在12小時后收集細胞。細胞相關放射性通過利用β-閃爍儀進行定量并以cpm表示活性。從患者外周血中分離的U266BL細胞系(一種產生IgE的骨髓瘤)提供了一種可用于評估IFNτ對IgE生成細胞所產生的直接作用的體系(Nilsson等，1970)。該細胞系使得人們能夠研究IFNτ對具有不間斷IgE合成的B細胞的作用。酶聯免疫吸附分析OVA被懸浮在結合緩沖液(0.1M碳酸鹽/重碳酸鹽，pH9.6)中并以2μg/孔的濃度被吸附到96-孔塑料組織培養板的孔底上并于4℃下過夜，然后蒸發干燥。所述板用封閉緩沖液，含5％奶粉的PBS處理2小時以便封閉非特異性結合，然后用含有0.05％Tween 20的PBS清洗三遍。將從經IFNτ-處理的或PBS-處理的BALB/C小鼠或未被免疫的(未接觸抗原的)小鼠身上取到的血清以各種稀釋度加到孔中并于室溫下培養3小時。徹底清洗后，加入兔抗小鼠IgE抗體(Accurate，NY)。在加入1∶1000稀釋度的與辣根過氧化物(HRP)綴合的山羊抗兔免疫球蛋白(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway NJ)前將板清洗三遍。在加入底物溶液(0.002M鄰苯二胺二鹽酸鹽，0.012％H2O2，0.05M檸檬酸鈉，0.05M檸檬酸)后，在490ηm下通過ELISA平板計數器(BioRad，Richmond，CA)監測染色的形成，用2M H2SO4終止反應。
為了測定血液中的IL-4，從PBS或IFNτ處理的小鼠身上采集血清樣本并在結合了兔抗小鼠IL-4多克隆抗體(BiosourceInt.，Camarillo，CA)的96-孔板中孵育。清洗后，加入25μg/ml的大鼠單克隆抗小鼠IL-4的生物素化抗體并培養1小時。培養和清洗后加入1∶1000稀釋度的綴合HRP的抗生物素蛋白，按照上述方法監測底物顏色的生成。IL-4 ELISA的檢測極限是7ng/ml。蛋白質印跡將IFN或培養基處理的OVA-致敏脾細胞和U266BL骨髓瘤B細胞的培養上清液分別以10μg/泳道的量加樣到15％和10％SDS-PAGE READY凝膠上(BioRad，Richmond，CA)，在100伏特的電壓下跑膠。過夜轉移到硝酸纖維素膜上，然后用配制在pH7.5的Tris緩沖鹽水，0.1％Tween 20中的5％牛奶將所述膜封閉1小時。用1∶1000稀釋度的偶聯到HRP上的山羊抗人IgE(Biosource Int.，Camarillo，CA)或兔抗小鼠IgE(Accurate，NY)溫育免疫印跡膜。小鼠IgE印跡在清洗三次后進一步用綴合了HRP的抗兔Ig(Amersham PharmaciaBiotech，Piscataway，NY)溫育1小時。印跡被清洗后通過膜顯影進行分析。IFN的毒性分析通過在有各種濃度IFNτ、IFNαD和嵌合IFNτ/IFNαD存在的條件下將HPBMC培養7天來進行利用人外周血單核細胞(HPBMC)的毒性分析。HPBMC的代謝活性利用 WST-1(Boehringer-Mannheim，Indianapolis，IN)來評估，該評估方法是依據活細胞中線粒體脫氫酶的酶活性測定細胞增殖以及存活力。
下面是對實現本發明的方法進行說明的實施例。這些實施例不應被理解為對本發明的限制。除了另有說明，所有百分比都是指重量百分比，所有溶劑混合物的比例都是指體積比。實施例1 IFNτ抑制小鼠中的OVA-特異性IgE抗體的產生如圖1A所示，注射(ip)OVA-氫氧化鋁前開始每天注射5×105單位的IFNτ結果阻斷了超過50％的IgE產生。甚至該阻斷一直持續到所述小鼠受到霧化OVA的攻擊(圖1B)。因此，在通過注射OVA對小鼠進行免疫和吸入OVA進行刺激的條件下，IFNτ抑制了OVA特異性IgE抗體的產生。實施例2 經IFNτ處理的小鼠的炎癥細胞浸潤被減弱OVA免疫的小鼠在用IFNτ處理后采用霧化OVA進行攻擊以便確定IFN處理是否抑制炎癥細胞向肺部的浸潤。IFNτ對細胞浸潤的抑制如圖2所示，其中比較了未接觸抗原的(圖2A)、PBS處理的(圖2B)和IFNτ處理的(圖2C)小鼠的肺切片。PBS處理小鼠的細支氣管內側的上皮組織完整性的破壞(圖2B)相對于IFNτ處理小鼠的保護性(圖2C)是明顯的。評估經IFNτ和PBS處理的(對照)小鼠的細支氣管和血管周圍的嗜酸性細胞、嗜堿性細胞和淋巴細胞的浸潤情況。很明顯，與PBS處理小鼠相比，經IFNτ處理的小鼠的細支氣管更少發生細支氣管周圍粒細胞聚集，前者為64％，后者為20％(表I)。表I.IFNτ減弱了OVA-誘導的炎癥細胞向細支氣管的浸潤肺切片粒細胞聚集 淋巴細胞聚集處理 (％氣管(Airways))(％氣管)PBS 64±6.0 78±7.0IFNτ20±7.0 34±3.0未接觸抗原 00
血涂片嗜酸性細胞 嗜堿性細胞 嗜中性細胞 單核細胞 淋巴細胞％) (％) (％)(％) (％)PBS 11±5.0 6.0±1.020±0.710±1.458±6.0IFNτ 2.5±0.71.5±0.715±1.45.0±1.4 72±8.0未接觸抗原 0.2±0.30.5±0.719±1.410±0.771±4.0*按照材料和方法部分中描述的方法在OVA免疫前3天開始每天以5×105U的IFNτ處理(ip)小鼠。
計算出具有細支氣管周圍聚集物的氣管并除以每一切片中檢測到的細支氣管總數。通過血涂片的差示白細胞計數被表示為細胞類型的百分數。對細支氣管周圍粒細胞和淋巴細胞聚集物的抑制的統計學顯著性通過IFNτ處理相對于PBS處理的x2試驗來表示(p＜0.001)。IFNτ處理對嗜酸性細胞(p＜0.05)和嗜堿性細胞(p＜0.1)的抑制相比于PBS處理的統計學顯著性通過Student’s t檢驗來表示。
而且，經PBS處理的小鼠有78％的肺細支氣管發生淋巴細胞浸潤，而IFNτ處理的情況只發生了34％的浸潤。另外，對小鼠血進行的差示計數表明IFNτ處理的小鼠與PBS處理組相比具有較低水平的嗜酸性細胞和嗜堿性細胞，而與PBS處理的或未接觸抗原的(未被免疫的)小鼠相比，嗜中性細胞、單核細胞和淋巴細胞的水平沒有明顯的差別。因此，該數據表明當暴露給霧化的OVA變應原時，IFNτ處理抑制了炎癥細胞向OVA致敏-小鼠的肺部的浸潤。實施例3-經IFNτ-處理的小鼠的IL-4水平低于對照小鼠經過霧化OVA暴露后，測定經PBS、IFNτ處理的小鼠或未被免疫(未接觸抗原的)小鼠血清中的IL-4濃度，所述霧化OVA暴露是在免疫后20天進行的。以前已經表明IL-4可能是誘導B細胞中的IgE同種型轉換所必需的(Lanzavecchia等，1984；Coffmann，Carty等，1986；Coffmann，Ohara等，1986；Rothman等，1988)。如圖3所示，IFNτ-處理組中的IL-4濃度比PBS-處理組中的IL-4濃度低一半多。實施例4-體內IFNτ-處理抑制OVA特異性脾細胞增殖
OVA免疫后20天，從未被免疫(未接觸抗原的)小鼠和PBS-或IFNτ-處理的OVA-免疫小鼠身上取出脾以便測定IFNτ處理對由OVA誘導的增殖的抑制效果。將脾細胞在有OVA存在的條件下培養84小時，然后評估增殖情況。如圖4所示，與PBS處理的對照小鼠相比，在IFNτ-處理的小鼠的脾細胞中觀察到的響應OVA的增殖明顯更低。由于牛血清白蛋白(BSA)和髓鞘堿性蛋白(MBP)不激活脾細胞(圖4插圖)，所以所述增殖活性對于OVA是特異的。因此，變應原-致敏小鼠的體內IFNτ處理抑制了響應變應原的細胞增殖。實施例5 OVA-致敏的脾細胞的體外IFN處理抑制了OVA-特異性脾細胞增殖為了測定各種IFN對預先致敏的細胞的作用，采用各種IFN對OVA致敏的脾細胞進行體外處理。OVA免疫后20天并且在霧化OVA處理后，取出脾并用各種I型IFN培養84小時，然后評估其增殖情況。除了羊IFNτ，還檢測了人IFNαD和嵌合體IFNτ/IFNαD對由OVA誘導的增殖的作用。該嵌合體作為一種可以用于人類治療目的的潛在“人源化的”IFNτ而檢測。如圖5所示，IFNτ和IFNaD抑制了OVA特異性脾細胞的增殖。而且，IFNτ/IFNαD嵌合體也具有抑制作用，其中所述嵌合體含有羊IFNτ的1-27位氨基酸殘基和人IFNαD的28-166位氨基酸殘基。因此，采用I型IFN體外處理OVA致敏的脾細胞抑制了細胞增殖。實施例6 I型IFN抑制小鼠和人的IgE產生對從在圖4和圖5中進行的增殖分析實驗中得到的培養上清液進行IgE抗體的免疫印跡檢測。如圖6A所示，在含有PBS處理的脾細胞并在有OVA存在的條件下培養的培養物中檢測到了IgE。在經IFNτ處理的小鼠的脾細胞上清液中很少或沒有IgE。免疫印跡檢測OVA致敏小鼠脾細胞的體外IFN處理的培養上清液中的IgE，結果表明，相對于培養基對照，所有I型IFN抑制了IgE的產生(圖6B)。然而，嵌合體IFNτ/IFNαD蛋白和嵌合體IFNαD蛋白是比IFNτ更好的抑制劑。
為了檢測IFN是否對人IgE生成B細胞直接進行作用，采用I型IFN培養U266BL人骨髓瘤細胞系，該細胞系組成性產生IgE抗體。采用包括嵌合體IFNτ/IFNαD在內的各種IFN處理前，先使細胞饑餓過夜。在用IFN培養96小時后，收集上清液并通過免疫印跡測定IgE的濃度。如圖6C所示，IFN處理組中的IgE濃度低于培養基對照。因此，I型IFN可抑制U266BL人骨髓瘤細胞和OVA-特異性小鼠B細胞產生IgE抗體。實施例7-IFN抑制人IgE生成骨髓瘤細胞的增殖將U266BL骨髓瘤細胞在有10,000U/ml的IFN存在的條件下培養72小時，然后測定其增殖情況。所有IFN抑制細胞增殖大約50％或更多，其中IFNαD的抑制作用最強而IFNτ的抑制作用最低(圖7)。對存活性進行了測定，表明與IFNτ(80％的存活性)和IFNτ/IFNαD嵌合體(75％的存活性)相比，IFNαD的毒性最強(67％的存活性)。IFNτ/IFNαD嵌合體對增殖的抑制作用比IFNτ強，但不如IFNαD強。因此，具有不同毒性水平的I型IFN可抑制人IgE-產生細胞系U266BL的增殖。實施例8-IFNτ/IFNαD嵌合體對人外周血單核細胞(HPBMC)沒有毒性比較IFNτ/IFNαD嵌合體與重組羊IFNτ和重組人IFNαD對HPBMC的毒性。用各種濃度的IFN(250至100,000U/ml)處理HPBMC 7天后，依據存活細胞中的線粒體脫氫酶酶活性測定毒性。如圖8所示，與在任何濃度下都沒有顯示出毒性的羊IFNτ和IFNτ/IFNαD嵌合體相比，人IFNαD在1,000至100,000U/ml濃度下具有毒性。因此，如同IFNτ一樣，IFNτ/IFNαD嵌合體缺少與人IFNαD有關的毒性。
應當理解本文中記載的實施例和技術方案僅僅是為了說明，任何修改或改動對于本技術領域的技術人員來說都是顯而易見的，并且都屬于本申請的實質內容和范圍，也屬于所附權利要求的保護范圍。
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權利要求
1.一種減弱或抑制IgE產生的方法，所述方法包括施用有效量的I型干擾素，或其生物活性突變蛋白、片段、變體或肽。
2.一種如權利要求1所述的方法，其中所述I型干擾素選自IFNα、IFNβ、IFNτ和IFNω。
3.一種如權利要求2所述的方法，其中所述I型干擾素是IFNτ。
4.一種如權利要求1所述的方法，其中所述I型干擾素是含有選自IFNα、IFNβ、IFNτ和IFNω的至少兩種IFN的部分的嵌合體IFN。
5.一種如權利要求4所述的方法，其中所述嵌合體IFN含有哺乳動物IFNτ氨基端和除IFNτ之外的人I型IFN的羧基端。
6.一種如權利要求5所述的方法，其中所述哺乳動物IFNτ氨基端來源于選自靈長類、羊和牛的哺乳動物。
7.一種如權利要求5所述的方法，其中所述的嵌合體IFN含有羊IFNτ的從大約1至大約27位的氨基酸殘基和人IFNα的從大約28至大約166位的氨基酸殘基。
8.一種如權利要求7所述的方法，其中所述的IFNα是IFNαD。
9.一種如權利要求1所述的方法，其中所述I型干擾素被施用給需要減弱或抑制IgE產生的人或動物。
10.一種如權利要求1所述的方法，其中所述的減弱或抑制IgE產生是通過抑制B-細胞分泌IgE或抑制B-細胞增殖來實現的。
11.一種如權利要求9所述的方法，其中所述I型干擾素通過選自口服、腸胃外用藥、皮下用藥和靜脈內用藥的途徑來進行施用。
12.一種如權利要求11所述的方法，其中所述人或動物患有或易患IgE相關疾病。
13.一種如權利要求12所述的方法，其中所述IgE相關疾病是選自過敏性鼻炎、遺傳過敏性皮炎、支氣管哮喘和食物過敏的過敏性疾病。
14.一種如權利要求1所述的方法，其中所述I型干擾素是在體外施用。
15.一種如權利要求1所述的方法，其中所述的I型干擾素與藥學上可接受的載體或稀釋劑進行配制。
16.含有嵌合體I型干擾素或其生物活性突變蛋白、片段、變體或肽的組合物，其能夠減弱或抑制IgE產生，其中所述嵌合體IFN含有選自IFNα、IFNβ、IFNτ和IFNω的至少兩種IFN的部分。
17.如權利要求16所述的組合物，其中所述的減弱或抑制IgE產生是通過抑制B-細胞分泌IgE或抑制B-細胞增殖來實現的。
18.如權利要求16所述的組合物，其中所述的嵌合體IFN含有哺乳動物IFNτ氨基端和除IFNτ之外的人I型IFN羧基端。
19.如權利要求18所述的組合物，其中所述哺乳動物IFNτ氨基端來源于選自靈長類、羊和牛的哺乳動物。
20.如權利要求18所述的組合物，其中所述的嵌合體IFN含有羊IFNτ從大約1至大約27位的氨基酸殘基和人IFNα從大約28至大約166位的氨基酸殘基。
21.如權利要求20所述的組合物，其中所述的IFNα是IFNαD。
22.如權利要求16所述的組合物，其中所述的嵌合體IFN是重組產生的，并在巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)中進行表達。
23.一種編碼權利要求16所述嵌合體IFN的多核苷酸。
24.一種減弱或抑制IL-4產生的方法，該方法包括使免疫細胞與I型干擾素或其生物活性突變蛋白、片段、變體或肽接觸。
全文摘要
本發明涉及用于治療過敏性疾病如過敏性鼻炎、遺傳過敏性皮炎、支氣管哮喘和食物過敏患者的新型方法和物質。本發明的方法包括給過敏性疾病患者施用干擾素tau(IFNτ)或嵌合體IFN(羊IFNτ(1－27)/人IFNαD(28－166))。用藥后,IFNτ和嵌合體IFN可抑制IgE抗體的產生而沒有毒副作用。本發明還涉及可以用于本發明方法的嵌合體羊/人IFN。
文檔編號C07K19/00GK1376165SQ00813481
公開日2002年10月23日 申請日期2000年8月25日 優先權日1999年8月27日
發明者H·M·約翰遜, M·G·姆吉塔巴 申請人:佛羅里達大學