酶催化的治療活化的制作方法

專利名稱：酶催化的治療活化的制作方法
技術領域：
本發明涉及藥物發現領域，具體地說，涉及前體藥物的設計，所述前體藥物是在病理細胞中超量表達的內源性胞內酶的底物。
背景技術：
在本申請中，各份出版物都注明第一作者和日期，專利號或公布號。各參考文獻的文獻目錄出處可見于本說明中或本申請末尾(就在權利要求書的前面)。這些出版物的公開內容都并入本文作參考從而更詳細地描述本發明涉及的領域狀況。
癌癥是一種全世界最常見的致命的疾病。用抗癌藥物的治療是一種日益重要的選擇，尤其對于手術已不能治愈的系統性惡性腫瘤或轉移癌。遺憾的是，現在能治愈的人癌種類的亞型仍相當少(Haskell，C.M.(1995))，導致每年約600,000人死亡。參見，Cancer Facts&Figures，1999 American Cancer Society。能治愈人癌的藥物的開發進展緩慢，成功限于少數幾種血液惡性腫瘤和更少的幾種實體瘤(Dorr和Van Hoff(1994))。尋找基于疾病機制的療法的進展為未來的成功提供機會(Cobleigh，M.A.等(1999)；以及Roth，J.A.等(1999))。
惡性腫瘤的異質性相對于它們的遺傳學、生物學和生物化學以及原發的或治療引起的對治療的抗性減輕治愈性治療作用。此外，很多抗癌藥物只表現低程度的選擇性，常常引起嚴重的或甚至危及生命的毒性副作用，于是阻止高到足以殺傷全部癌細胞的劑量的應用。因此，探尋具有改良的對治療抗性病理、惡性細胞的選擇性的抗腫瘤劑仍然是藥物開發的中心任務。
癌細胞的特征在于不可控制的生長、去分化和遺傳不穩定性。不穩定性表達自身為異常的染色體數，染色體缺失、重排、損失或正常二倍體數以外的復制(Wilson，J.D.等(1991))。這種基因組不穩定性可能由幾個因素引起。最特性化的一個是增強的基因組可塑性，它是在失去腫瘤抑制基因功能時出現的(例如，Almasan，A.等(1995a)和Almasan，A.等(1995b))。基因組可塑性有助于腫瘤細胞對改變的環境的適應性，從而允許更頻繁的突變，基因的擴增，以及染色體外因子的形成(Smith，K.A.等(1995)和Wilson，J.D.等(1991))。這些特征提供導致更具進攻性的惡性腫瘤的機制，因為它能使腫瘤迅速產生對自然宿主防御機制、生物治療的抗性(參見Wilson，J.D.等(1991)和Shepard，H.M.等(1988))，以及對化療的抗性(參見Almasan，A.等(1995a)和Almasan，A.等(1995b))。
此外，化療劑的臨床適用性可能嚴重受抗藥物的惡性細胞出現的限制。一些細胞機制可能涉及抗藥性，例如，改變藥物的代謝，細胞對活性化合物的不滲透性或加速從細胞消除藥物，改變抑制酶的特異性，增大靶分子的生產，增強細胞毒性損傷的修復，或者通過可選的生化途徑設置抑制反應的旁路。在某些情況下，對一種藥物的抗性可能賦予對其它生化上不同的藥物的抗性。對癌化療的抗性的備選機制經由腫瘤抑制基因的功能損失而出現。這些中最佳特性化的是p53、RB和p16(Funk，J.O.1999；以及Teh，B.T.(1999))。這些基因產品的功能損失導致通常被抗癌藥物靶向的酶(例如，5-氟尿苷酰(“5FU”)/胸苷酸合酶和氨甲蝶呤/二氫葉酸還原酶)的表達抑制(Lee，V.等(1997)；Lenz，H.J.等(1998)；以及Fan，J.和Bertino，J.(1987))。某些基因的擴增涉及對生物治療和化療的抗性。編碼二氫葉酸還原酶的基因的擴增涉及對氨甲蝶呤的抗性，而編碼胸苷酸合酶的基因的超量表達/擴增則涉及對5-氟嘧啶治療的抗性(Smith，K.A.等(1995))。表1歸納了抗生物治療和化療的重要的酶。
表1在癌化療抗性中超量表達的酶

很久以前，人們就認識到抗癌劑的差選擇性，進行了很多嘗試以改善選擇性和允許施用更大的劑量。一種方法是前體藥物的開發。前體藥物是毒理上良性的但在體內可被轉化為治療活性產物的化合物。在某些情況下，通過被抗體送遞到靶細胞的非內源性酶的作用(“ADEPT”或抗體依賴性酶前體藥物療法(美國專利No.4,975,278))或基因導向的作用(“GDEPT”或基因依賴性酶前體藥物療法(Melton，R.G.和Sherwood，R.E.(1996))發生活化。這些技術就它們退出血液和滲入腫瘤的能力來說具有嚴格的限制。參見，Connors，T.A.和Knox，R.J.(1995)。
作為抗腫瘤劑和抗病毒劑開發和測試了一些核苷酸和核苷類似物。例如，5-氟尿嘧啶(5FU)和5-氟脫氧尿苷(5FUdR)已被廣泛用作化療劑，基于它們的在胞內被轉化為胸苷酸合酶(TS)的抑制劑的能力。至于很多其它的酶抑制性化療劑，應用5FU的癌療法通常導致攻擊性抗藥腫瘤細胞(它們難于用這種藥進一步治療)的選擇。(Aschele，C.等(1994)；Mader，R.M.等(1998)；L_nn，U.等(1996)；Paradiso，A.等(2000)；以及Edler，D.等(2000))。
已經特別關注鹵化核苷類似物，例如，(E)-5-(2-溴乙烯基)-2′-脫氧尿苷(BVdU)。這些類別的化合物原來是作為抗病毒劑開發的，基于這一觀察結果，即，它們需要磷酸化成一磷酸核苷酸的形式以便激發出細胞毒性響應，而這種磷酸化作用優選通過皰疹病毒胸苷激酶(TK)來完成。BVdU和相關化合物一致顯示對正常哺乳動物細胞有限的毒性，而它們在殺傷病毒感染的細胞方面都有效(DeClerq，E等(1997))。
在核苷類似物(例如，作為抗病毒劑和抗癌劑的BVDU)的廣泛測試中，一致報導它們對正常細胞和癌細胞具有最小毒性。闡明這些化合物通過病毒胸苷激酶優先磷酸化的結果支持了這些觀察結果，它解釋了這些化合物對哺乳動物細胞的低毒性。所以，還沒有作為抗癌治療劑開發BVdU和相關的核苷類似物(DeClerq，E等(1997))。
發明公開本發明提供了新型化合物，它們選擇性地抑制病理細胞的增殖，所述病理細胞例如是內源性地超量表達一種賦予對生物作用劑和化療劑抗性的靶酶。所述酶作用于本發明的前體藥物化合物從而1)將它轉化為細胞毒素和/或2)釋放毒性副產物。在本發明另一方面，與抗性酶初始反應的產物接著被常規細胞酶(例如，酰基轉移酶、磷酸酶或其它“管家”酶)(Voet等(1995))或常規細胞成分(例如，水)充分活化而從前體藥物釋放毒性副產物。
在一個實施方案中，靶細胞中靶酶的活性大為增強了，是由于腫瘤抑制因子作用的喪失和/或因以前接觸化療而引起的選擇性喪失的緣故。在另一個實施方案中，病理細胞包含靶酶(它是細胞中的感染劑的表達產物)。該表達產物能賦予抗生素抗性。
本發明另一方面包括篩選可被靶酶活化的新前體藥物的檢測。本發明還提供了進行這樣的檢測的試劑盒，它們盛有完成檢測和分析結果所需的試劑和說明書。
本發明進一步提供了一種通過對受治療者送遞本文描述的前體藥物而治療受治療者的方法。本發明的前體藥物可單獨用或者與其它化療藥物或備選的抗癌療法(例如，放射)結合。
本發明又一方面是藥劑的制備，所述藥劑被用于治療患有以表達靶酶的細胞為特征的病理的受治療者。
本發明又一方面是一種鑒定患者的最適療法的方法，即，通過分離表達靶酶的細胞，將該細胞與至少一種本發明的前體藥物接觸，然后鑒別哪一種或多種前體藥物抑制增殖或殺傷所述細胞，于是鑒定受治療者的最適療法。
本發明的前體藥物具有如下結構 或其互變異構體；其中，R12或R13可以相同或不同并且選自下組氧代，OH或NHNH2；其中，如果a是0或1，假定如果a是0，而且R13是氧代，那么，在位置3和4之間存在一個雙鍵，并且R12是NHNH2；或者如果a是0，而且R12是氧代，那么，在位置2和3之間存在一個雙鍵，并且R13是NHNH2；或者如果a是1，那么，R12和R13都是氧代；其中，R1是具有下式的取代基 其中，R2和R3獨自是不飽和的或飽和的烴基；其中，n是0或1～10的整數，而m則是0或1；以及其中，R4選自下組F，Cl，Br，I，CN，SO3H，CO2H，CO2CH2CH3，CO2CH3，SI(CH3)3，CHO，NO2，CF3，CCl3，CH＝C(R15)2或具有如下結構的取代基 其中，Xa和Xb獨自相同或不同并且選自下組Cl，Br，I，以及有效的離去基；其中，Ya、Yb或Yc獨自相同或不同，它們是H或F；其中，Z、Za和Zb獨自相同或不同，它們是O或S；以及其中，R14是H或F，假定，如果R14是F，那么，a是1，而且R12和R13都是氧代；以及其中，Q選自下組物質糖，碳環，以及無環的化合物，或者掩蔽的磷酸酯衍生物或其氨基磷酸酯衍生物。
對圖的簡要描述在

圖1A和1B中應用胸苷酸合酶和化合物NB1011TM的實例圖示了本文描述的概念。圖1A中示出了腫瘤細胞中如何更高水平的TS可導致優先產生毒素。圖1B中示出了NB1011TM至BVdUMP的轉化，接著與TS相互作用而產生核苷酸毒素。
圖2A和2B是闡釋本發明的高流通量篩選的流程圖。
圖3A示出了各種人組織中的相對TS水平。圖3B示出了正常組織和人結腸腫瘤組織之間平均TS mRNA水平的比較。
圖4示出了本發明的呋喃并[2，3-d]嘧啶酮核苷的合成示意圖。下文詳細描述了合成方案。
實施本發明的方式除非另外說明，本發明的實施將應用常規分子生物學、微生物學、細胞生物學、有機化學、藥物化學和重組DNA的技術，這些技術屬于本領域技術范圍。參見例如，Sambrook等，分子克隆實驗指南(MOLECULAR CLONINGA LABORATORY MANUAL)，第2版(1989)；分子生物學中的現有方案(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)，F.M.Ausubel等編輯，(1987)；酶學中的方法(METHODS IN ENZYMOLOGY)系列，Academic Press，Inc.；PCR 2一種實際方法(A PRACTICALAPPROACH)，M.J.MacPherson等編輯(1995)；Spector，D.L.等(1998)細胞實驗指南(CELLSA LABORATORY MANUAL)，Vols I～III，ColdSpring Harbor Press；以及動物細胞培養(ANIMAL CELL CULTURE)，R.I.Freshney編輯(1987)。
本說明書和權利要求書中應用的單數形式的“一個”和“該”包括復數參考物(除非文中另外清楚地敘述)。例如，術語“一個細胞”包括很多細胞，包括它們的混合物。
本文應用的術語“包括”旨在表示組合物和方法包括引用的因素，但不排除其它因素。當用于定義組合物和方法時，“基本上由...構成”應當表示排除任何對組合有重要意義的其它因素。所以，一種基本上包括本文定義的因素的組合物并不排除分離和純化方法中得到的痕量污染物和藥物上可接受的載體，例如，磷酸鹽緩沖鹽水、防腐劑等。“由...構成”應當表示排除比痕量成分更多的其它組分和施用本發明組合物的基本方法步驟。由這些過渡術語的每一個定義的實施方案應屬于本發明的范圍。
術語“超量表達”應當表示是常規水平或者從正常細胞或非病理細胞測定的水平的至少2倍、優選3倍、更優選4倍和最優選5倍或更多的表達。
“組合物”旨在表示活性劑和其它惰性(例如，可檢測的作用劑或標記)的或活潑的化合物或成分(例如，輔助劑)的組合。
“藥物組合物”旨在包括活性劑與惰性或活潑的載體的組合，使組合物適合體外、體內或離體的診斷或治療應用。
本文應用的術語“藥物上可接受的載體”包括任何標準藥物載體(例如，磷酸鹽緩沖鹽水溶液)，水，乳液(例如，油/水或水/油乳液)，以及各種濕潤劑。所述組合物還可包含穩定劑和防腐劑。載體、穩定劑和輔助劑的實例可參見Martin REMINGTON′S PHARM.SCI.，第15版(Mack Publ Co.，Easton(1975))。
“有效量”是足以達到有益的或所需的結果的量。有效量可在一次或多次施藥、敷用或劑量中施用。
“靶”細胞或“病理”細胞包括去分化的、無限增殖化的、腫瘤性轉化的、惡性的、轉移的或轉化的過度增殖細胞。實例包括但不限于癌細胞，例如，肉瘤細胞、白血病細胞、癌細胞或腺癌細胞。具體的癌包括但不限于乳腺癌細胞、肝細胞癌細胞、肝癌細胞、胰腺癌細胞、食管癌細胞、膀胱癌細胞、胃腸道癌細胞、卵巢癌細胞、皮膚癌細胞、前列腺癌細胞和胃癌細胞。
靶細胞或病理細胞超量表達這樣的胞內酶，即，涉及腫瘤抑制基因產物功能的喪失、抗藥性或遺傳不穩定性中的任一項。對一種藥物的抗性也可賦予對其它生化性質不同的藥物的抗性。與旨在產生更多有效的內源性胞內酶的抑制劑的現有技術療法不同，本發明利用與治療抗性疾病細胞和組織(與正常細胞和組織相比)相關的更高酶活性并且不依賴于抑制所述酶。術語“靶酶”被用于本文而定義具有一個或多個上述特征的酶。
活化的或超量表達的和涉及抗藥性的基因產物包括但不限于胸苷酸合酶(TS)(L_nn，U等(1996)；Kobayashi，H.等(1995)；以及Jackman，A.L.等(1995b))，二氫葉酸還原酶(Banerjee，D.等(1995)和Bertino，J.R.等(1996))，酪氨酸激酶(TNF-α，Hudziak，R.M.等(1988))以及多抗藥性(Stülinger，M.等(1994))；Akdas，A.等(1996)；和(Tannock，I.F.(1996))；以及ATP-依賴性多抗藥性相關的蛋白質(Simon，S.M.和Schindler，M.(1994))，并且在某些情況下包括結腸癌和前列腺癌，拓撲異構酶I(Husain等(1994))。
二氫葉酸還原酶(DHFR)的擴增涉及對氨甲蝶呤的抗性，而編碼胸苷酸合酶的基因的擴增則涉及對用5-氟嘧啶治療腫瘤的抗性。與抗藥性相關的基因的擴增可通過修飾的聚合酶鏈反應(PCR)[如Kashini-Sabet等(1988)，美國專利5,085,983中所述]或者通過本文描述的方法來檢測和監控。后天的抗藥性可通過細胞遺傳異常(例如，均勻染色體染色區和雙微體染色體，它們都與基因擴增相關)的檢測來監控。備選的測定法包括直接的或間接的酶活性測定，它們的每一種都與基因擴增相關(例如，Carreras和Santi(1995))；其它方法(例如，聚合酶鏈反應，Houze，T.A.等(1997)或者免疫組織化學(Johnson，P.G.等(1997))。
已證實在某些人腫瘤中，酶谷胱甘肽-S-轉移酶偶爾升高(Morgan，A.S.等(1998))，但還是不包括于本文應用的“靶酶”中，因為它是編碼具有重疊特異性的酶的基因家族中的一員。
總之，本發明的前體藥物基于如下事實而區別于常規治療劑，即，本發明的靶酶通常在病理細胞(與正常細胞相比)中被超量表達、過度積聚或活化。區別本發明與其它方法的最重要原則是(1)本發明描述了關于酶(例如胸苷酸合酶)的底物的合成。超量表達的酶會將前體藥物轉化為毒素(優先在疾病細胞中)。以前的方法大多數依賴于這些酶的抑制劑。抑制劑導致酶的擴增表達，隨后造成對治療的抗性(參見例如，L_nn，U等(1996)；Paradiso，A.等(2000)；以及Edler，D.(2000))。
(2)現有方法還與其它“底物-前體藥物”方法有別，例如，谷胱甘肽-S-轉移酶(參見例如，Morgan，A.S.等(1998))。GST家族的酶以升高的水平響應對細胞的毒性損傷被表達。GST家族的酶具有重疊的底物特異性，這使得難于設計僅僅與在癌細胞中增量表達的一種酶反應的底物(Morgan，A.S.等(1998))。由于本發明的靶酶(例如，胸苷酸合酶、二氫葉酸還原酶和胸苷激酶)相對于它的結構和底物特異性來說是獨特的，所以，容易設計獨特的底物。下文提出了關于胸苷酸合酶的底物的數個實例。
(3)在某些情況下，編碼靶酶(例如，胸苷酸合酶)的基因可能已經歷了突變而給出對抑制劑的抗性(Barbour，K.W.等(1992)和Dicken，A.P.等(1993))但仍能與非抑制劑底物前體藥物進行反應。
(4)這種方法的一個優點是，腫瘤抑制劑功能的喪失對于惡性腫瘤的惡化至關重要。大部分腫瘤細胞已失去了p53、RB或p16腫瘤抑制劑功能之一(Funk，J.O.(1999)；Banerjee，D.(1998)；以及Teh，B.T.等(1999))。這種損失導致抗性酶(例如，胸苷酸合酶)的表達增大，與以前接觸化療無關。本文描述的前體藥物將適用于治療早期惡性腫瘤，以及以前用化療治療的疾病。象GST這樣的酶的底物包括很多與化療無關的化合物(Whalen和Boyer(1998))。
在圖1A和1B中應用胸苷酸合酶和化合物NB1011TM的實例圖示了上文描述的概念。
在一個備選實施方案中，靶細胞通過它對與癌無關的藥物或化合物的抗性而定義。在此情況下，用微生物感染的細胞賦予抗生素(例如，β-內酰胺酶)抗性。生物包括細菌、酵母和寄生蟲(例如，錐蟲)。表2列出了通過這種方法在傳染病中靶向的酶。

本發明的前體藥物選自具有如下結構的化合物的L和D異構體 其中R1是下式的結構部分 但須在化合物I中，n可以是0。
R2是選自下組的二價電子通道(conduit)部分不飽和烴基；包括一個或多個不飽和烴基的芳烴基；以及包括一個或多個不飽和烴基的雜芳基；R3選自下組基 R5可以相同或不同，并且獨自是具有1～10個碳原子的直鏈烷基或支鏈烷基，或者具有3～10個碳原子的環烷基，或者鹵素(例如，F，Cl，Br，I)；或者基 或者基 其中，n是0或1～10的整數，而m則是0或1；其中，R4可以是選自下組的取代基 其中，R8和R9都是低級烷基，而R10則是H或CH3，而且每個X取代基獨自是相同或彼此不同的，它是-Cl，-Br，-I，或其它有效的離去基，但須，當R7是-H，而且m是0時，那么，R4不是鹵素；或者當m是0而且n是0時，那么，R4不是鹵素；其中，每個Y取代基獨自相同或彼此不同，它獨自是-H或-F，而且每個Z取代基獨自相同或彼此不同，它是-O-或-S-。
在一方面，m是0，而R2則是選自下組的芳烴基 在一備選方面，m是0，而R2則是選自下組的雜芳基 其中，J選自下組-O-，-S-，-Se-，-NH-，和-NRALK，而且其中，RALK是具有1～10個碳原子的直鏈或支鏈烷基或具有3～10個碳原子的環烷基。
在一特定方面，R4選自下組 Q選自下組物質糖，碳環，無環化合物及其掩蔽的磷酸酯或氨基磷酸酯衍生物。所述掩蔽的磷酸酯或氨基磷酸酯衍生物在化合物的5′位與Q連接(下文更詳細示出)。例如，Q是選自下組的結構部分
其中，每個R6獨自是相同或彼此不同的，選自下組-H，-OH，-OC(＝O)CH3，F，和其它被保護的羥基；以及R7是氫，磷酸酯基，磷酸二酯基，或在5′位與Q連接的氨基磷酸酯基。
應懂得，雖然沒有明確說明，但本發明的任何前體藥物可以呈任意對映的、非對映的或立體異構的形式，包括D型、L型、α-端基異構形式和β-端基異構形式。
在一個實施方案中，R4是或包含選自下組的化學實體-Br，-I，-O-烷基，-O-芳基，-O-雜芳基，-S-烷基，-S-芳基，-S-雜芳基，-CN，-OCN，-SCN，-NH2，-NH-烷基，-N(烷基)2，-NHCHO，-NHOH，-NHO-烷基，NH2CONHO-，NHNH2，-N3，以及順式鉑氨的衍生物，例如 在一個實施方案中，Q是 其中，R7如上所述，或者更具體地是例如下式的結構 或是具有如下結構的化合物 其中，Rd是芳族取代基。
在一個備選的實施方案中，R7是得自氨基酸(包括例如，二十種天然氨基酸)的氨基磷酸酯基。在一個實施方案中，R7是得自丙氨酸的氨基磷酸酯基。在一個實施方案中，R7是或含如下結構的基 上述基及其制備方法被描述于McGuigan等(1993)和McGuigan等(1996)中。
本發明還提供了具有如下結構的化合物的L-或D-異構體 或其互變異構體，其中，R1是具有下式的取代基 其中，R2和R3相同或不同，獨自是不飽和的或飽和的烴基；其中，R4選自下組F，Cl，Br，I，CN，SO3H，CO2H，CO2CH2CH3，SI(CH3)3，CHO，NO2，CF3，CCl3，C(R5)2；其中，R5選自下組F，Cl，Br，和I；其中，n是0或1～10的整數，而m則是0或1；并且Q如上述定義。
在一方面，m是0，而R2則選自下組 其中，R5獨自相同或不同并且選自下組具有1～10個碳原子的直鏈烷基或支鏈烷基，具有3～10個碳原子的環烷基，CN和鹵素。
在另一方面，R2和R3一起構成一個烯基或炔基，它選自下組基 在另一方面，m是0，而R2則是選自下組的芳烴基 在又一方面，m是0，而R2則是選自下組的雜芳基 其中，J選自下組-O-，-S-，-Se-，-NH-，和-NRALK，而且其中，RALK是具有1～10個碳原子的直鏈或支鏈烷基或者具有3～10個碳原子的環烷基。
就這些實施方案來說，R7如上述定義。
在一個特定的實施方案中，R7是 上述基及其制備方法被描述于Abraham等(1996)。
在一個實施方案中，R7是磷酸酯基或者是或包含具有選自下組的結構的基
上述兩個基的第一個及其制備方法被描述于Freed等(1989)；Sastry等(1992)；Farquhar等(1994)和Farquhar等(1995)。上述兩個基的第二個及其制備方法被描述于Valette等(1996)；以及Benzaria等(1996)。
在一個實施方案中，R7是或包含具有選自下組的結構的基 其中，R是芳族取代基，上述兩個基的第一個及其制備方法被描述于Meier等(1997)。上述兩個基的第二個及其制備方法被描述于Hostetler等(1997)；以及Hostetler等公布的國際專利申請No.WO96/40088(1996)。
在一個實施方案中，R7在Q內形成一個環狀基。下文示出了一個這樣的實施方案及其制備方法(其中，DMTr是4，4′-二甲氧基三苯甲基，Boc是叔-丁氧基羰基，DCC是1，3-二環己基碳二亞胺，而4-DMAP則是4-二甲氨基吡啶)
在一個實施方案中，所述化合物可呈鹽形式，或者呈被保護的或前體藥物形式，或其組合，例如，作為鹽、醚或酯。
在又一個實施方案中，應用下述方法將如上結構進一步改性使它具有硫代磷酸二吖丙啶基而不是磷酸二吖丙啶基。
上述5-取代的嘧啶衍生物的合成可通過本領域熟知的方法進行。例如，用鹵代烷基化合物、鹵代醋酸酯或鹵代烯在Li2PdCl4存在下處理5-氯汞基-2′-脫氧尿苷，導致分別形成(通過有機鈀中間體)5-烷基、5-乙酰基或5-烯衍生物。Wataya等(1979)和Bergstrom等(1981)。嘧啶核苷和核苷酸的C5-改性的另一個實例是C5-反式苯乙烯基衍生物的形成，即，通過用醋酸汞處理未保護的核苷酸，接著，在Li2PdCl4存在下添加苯乙烯或環取代的苯乙烯。Bigge等(1980)。
用汞使嘧啶脫氧核糖核苷三磷酸在嘧啶環的5位衍生化，即，通過在50℃下用醋酸汞在醋酸鹽緩沖液中處理3小時。Dale等(1973)。這樣的處理還應當有望對一磷酸酯的改性有效；也可用酶法將改性的三磷酸酯轉化為改性的一磷酸酯，例如，通過用堿性磷酸酶控制處理，接著純化一磷酸酯。可取代分子性能與汞相似、但具有優選的藥理性能的其它部分(有機的或無機的)。至于合成取代嘧啶的一般方法，參見例如，美國專利Nos.4,247,544；4,267,171；和4,948,882；以及Bergstrom等(1981)。上述方法應當也適合5-取代的嘧啶核苷和核苷酸的衍生物的合成，所述衍生物含除核糖或2′-脫氧核糖以外的糖，例如，2′，3′-二脫氧核糖、阿拉伯糖、呋喃糖、來蘇糖、戊糖、己糖、庚糖和吡喃糖。5-位取代基的一個實例是鹵代乙烯基，例如，E-5-(2-溴乙烯基)-2′-脫氧尿苷酸。Barr，P.J.等(1983)。
備選地，5-溴脫氧尿苷、5-碘脫氧尿苷和它們的一磷酸酯衍生物可從下列公司商購Glen Research，Sterling，VA(USA)，Sigma-Aldrich Corpoation，St.Louis，MO(USA)，MoravekBiochemicals，Inc.，Brea，CA(USA)，ICN，Costa Mesa，CA(USA)和NewEngland Nuclear，Boston，MA(USA)。可商購的5-溴脫氧尿苷和5-碘脫氧尿苷可通過化學法或酶法轉化為它們的一磷酸酯，即，應用可從Glen Research，Sterling，VA(USA)和ICN，Costa Mesa，CA(USA)商購的試劑、通過激酶的作用轉化。可將這些鹵素衍生物與其它取代基結合而產生新的和更有效的抗代謝物。
尿嘧啶的5位的結構被稱為“鏈(tethers)”，因為它們將擬用的離去基(毒性基團)與雜環連接。在通過與人enz，TS的活性位點上的Cys殘基反應使雜環活化時，例如，將一個負電荷從尿嘧啶的6位傳導入鏈。已描述了關于(E)-5-(溴乙烯基)-2′-脫氧尿苷(BVdU)(Barr，P.J.等(1983))和(E)-5-(3，3，3-三氟-1-丙烯基)-2′-脫氧尿苷(TFPe-dUrd)[Wataya等(1979)；Santi(1980)；以及Bergstrom等(1984)]的5′-一磷酸化形式的機制。
毒素和dNMP之間的鏈“間隔基”必須是不飽和的，于是，它可傳導由TS-Cys-巰基攻擊提供的毒素-活化負電荷。在適用于該效用的很多不飽和有機官能團中，乙烯基、烯丙基和炔丙基單元是簡單的、小的和容易合成獲得。乙烯基和烯丙基單元具有的優點是，可呈兩種不可互變的幾何異構體形式之一制備它們。所以，它們可用作由酶活性位點調節的前體藥物的“探針”。另一方面，炔丙基單元具有呈圓柱形對稱這一優點，所以，enz催化的從這類鏈的毒素釋放不依賴于它相對于dUMP的尿嘧啶環的取向(乙烯基和烯丙基分子的情況通常是這樣的)。
已采用兩種不同的方法來設計某些基于核苷酸的本發明的前體藥物。一種基于BVdU一磷酸酯的結構，它的特征是直接連接在dUMP的C5上的聚乙烯基取代基末端的離去基/毒素。這是乙烯基鏈法。另一種基于TFPe-dUMP的結構并與第一種相似，但具有一個將離去基/毒素與不飽和單元隔離的亞甲基單元，所以，它包含一個烯丙基或炔丙基單元。這是烯丙基鏈法。
烯丙基鏈法的炔丙基形式的活化機制在5-乙炔基-2′-脫氧尿苷5′-一磷酸酯(EdUMP)和5-(3-羥基-1-丙炔基)-2′-脫氧尿苷5′-一磷酸酯(HOPdUMP)這二者與TS的相互作用中具有一個先決條件[Barr等(1981)；Barr和Robins 1983]。EdUMP是TS(Ki＝0.1TM)的有效抑制劑，可能在活性位點形成基于丙二烯的物質。HOPdUMP(Ki＝3.0 TM)顯示不一般的抑制動力學，這可能是由于在活性位點形成基于累積多烯的物質的緣故。
近期合成了結構與乙烯基鏈法和烯丙基鏈法機制的常見中間體相似的5-亞烷基化5，6-二氫尿嘧啶(Anglada等，1996)。這些被證實是高度親電的。它們的容易與乙醇反應而生成5-(乙氧基甲基)尿嘧啶是添加水而再生有催化能力的TS的先決條件。甚至最近，通過捕集研究證實了由TS產生的難以理解的長C5亞甲基中間體的存在(Barrett等(1998))。
特定的實施方案包括具有如下所示L或D結構的化合物。通過結構和數字標記來鑒別這些化合物。
NB1012- NB1013 NB1020-CF3NB1014 NB1027 NB1016 NB1021NB1017 NB1024R Y＝ Y＝H NB1018NB1022 NB1019N81023- NB102-H NB1025N81026-C8H17- NB102優選的實施方案如下所示一種具有下列結構的化合物 其中，Xd和Xe獨自相同或不同并且選自下組Cl，Br，I，和CN或其核苷類似物。在一更優選的方面，Xd是Cl或Br，而Xe則是H。
一種具有下列結構的化合物 其中，Xf和Xg獨自相同或不同并且選自下組Cl，Br，I，和CN或其核苷類似物。在一優選的實施方案中，Xf和Xg相同，各自是Cl或Br。
一種具有下式結構的化合物 其中，每個X選自下組Cl，Br，I，和CN；或其核苷類似物。在一優選的實施方案中，X是Cl或Br，而在一更優選的實施方案中，X是Br。
一種具有下列結構的化合物 其中，R8是低級直鏈或支鏈烷基，或其核苷類似物。一種具有下列結構的化合物 其中，R8和R9是低級直鏈或支鏈烷基，而R10是H或CH3或其核苷類似物。
一種具有下列結構的化合物 其中，R10是H或CH3；或其核苷類似物。一種具有下列結構的化合物 一種具有下列結構的化合物 或其核苷類似物。一種本文描述的化合物，其中，該化合物具有如下結構 在一方面，R7＝H。在另一方面，R7是具有如下結構的取代基 一種本文描述的化合物，其中，該化合物具有如下結構 其中，R7＝H或者R7是具有如下結構的取代基 一種具有如下結構的化合物 一種具有下列結構的化合物 其中，每個X選自下組CO2Et，Cl，和Br；或其核苷類似物。一種具有下列結構的化合物 或其核苷類似物。
一種具有下列結構的化合物 或其核苷類似物。
所述前體藥物可與載體(例如，藥物上可接受的載體)組合而供體外或體內應用。
本發明還提供了迅速而簡便的篩查檢測，它將能初步鑒定具有至少一些所需特性的新型化合物(見圖2A和2B)。檢測需要至少兩類細胞，第一類是對比細胞，其中，靶酶不被表達或者被低水平表達，例如正常細胞。第二類細胞是測試細胞，其中，靶酶以可檢測水平(例如，高水平)被表達。這類細胞可以是因提高的靶酶水平而被選擇的腫瘤細胞系。也可應用被遺傳修飾而差異表達靶酶或酶(含合適的靶酶物種)的細胞。應用本領域熟知的和描述于Chen，L.等(1996)；Hudziak，R.M.等(1988)；或Carter，P.等(1992)和下文的試驗部分中的方法，用編碼靶酶的多核苷酸轉染宿主細胞是瞬時的或長久的。所述細胞可以是原核的(細菌，例如大腸埃希氏菌(E.coli))細胞或真核細胞。所述細胞可以是哺乳動物細胞或非哺乳動物細胞，例如，小鼠細胞，大鼠細胞，人細胞，引起疾病的真菌(例如，酵母)或寄生物(例如，肺囊蟲屬(Pneumocystis)或利什曼原蟲屬(Leishmania))。
適合插入cDNA的載體是從Stratagene，La Jolla，CA和其他供應商商購的。可通過導入細胞的表達盒的拷貝數或者通過改變啟動子使用率來調節表達量。每個轉染的細胞系中酶的表達水平可通過免疫印跡和溶胞產物中的酶測定(應用以前針對免疫檢測的酶而激發的單克隆或多克隆抗體)來監測(Chen，L.等(1996))。還可按Carreras，C.W.和Santi，D.V.(1995)綜述的或者如下試驗部分中描述的方法進行酶法檢測而測定表達的酶量。
在進一步的方面，可應用多于一種酶來獨立轉導單獨的宿主細胞，于是，可同時比較候選藥物對靶酶的效果與它對其它酶或來自另一物種的相應酶的效果。
在另一個實施方案中，應用第三種靶細胞作對比，因為它接受有效量的本發明前體藥物化合物。該實施方案特別適用于篩查通過胸苷酸合酶活化的新作用劑。在又一方面，建立至少一個另外的試驗細胞體系來測試試驗治療劑與已知療法或作用劑組合的協同潛力。
對本發明來說，成功的候選藥物將阻止生長或殺傷試驗型細胞，但不傷害對比細胞類型。可通過Miller(1992)；Sugarman，B.J.等(1985)和Spector，D.L.等(1998)描述的標準方法，或者應用如下試驗部分中描述的方法來進行生長檢測。
本領域技術人員應懂得，可應用廣泛的篩查而尋找抗生素。例如，來自酵母的胸苷酸合酶可代替人的或酶的大腸埃希氏菌形式。這應當能發現靶向酵母相關的病原體的特定抗真菌抗生素。此外，其它酶也可受這種處理。例如，可選定特異性地靶向傳染劑[例如，卡氏肺囊蟲(Pneumocystis carnii)]的二氫葉酸還原酶活性的前體藥物。將選定對靶酶特異性的這些作用劑，它們可通過應用本文描述的篩查檢測證實不活化天然宿主的酶。對比細胞構建物應包含相應的正常人酶，以便在只存在正常人酶時顯示毒性的缺乏。
圖2A和2B示出了我們如何能進行本發明這個方面的至少一個實施方案。將一種外源基因(例如，編碼TS的人基因)插入宿主細胞，以致表達人TS。“對比細胞”不表達靶酶。在一些實施方案中，可能有必要用靶酶的蛋白質產物補充培養基。
可將候選的前體藥物直接加入細胞培養基中，然后對靶細胞或培養基檢測從候選的前體藥物釋放的標記量(如果前體藥物包含可檢測的標記)。也可通過應用Lasic，D.D.(1996)描述的方法或者與Lewis，J.G.等(1996)描述的細胞轉染劑結合而將前體藥物包裝入脂質體來增強細胞攝取。
一個利用在腫瘤細胞中TS超量表達的前體藥物的備選實施方案是脫氧尿苷氨基磷酸酯，或者與治療放射性核素綴合的其它修飾(本文引述的)。治療放射性核素的一個實例是錸188。該同位素可基本上按Callahan等(1989)描述的那樣合成。它也可商購，例如，得自Mallicrodt Medical BV(荷蘭)。可通過例如由Lin，W.Y.等(1997)描述的方法將所述治療放射性核素與脫氧尿苷或脫氧尿苷5′-氨基磷酸酯或其它衍生物綴合。含放射性核素的脫氧尿苷氨基磷酸酯將優先被吸收入超量表達胸苷酸合酶的腫瘤細胞的DNA，并且通過β和γ輻射的集中放射而引起它們的死亡。備選的放射性核素包括錸-186和其它元素(Troutner，D.A.(1987))。
所述化合物適用于預測一名受治療者將是否適合通過本發明的前體藥物治療，即，將前體藥物送遞到包含需要處理的細胞的樣品，檢測細胞死亡或細胞增殖的抑制。申請人提供了試劑盒供測定病理細胞或患者將是否適合通過這種療法治療(通過提供至少一種本發明的前體藥物和使用說明)。
本發明還提供了一種抑制體外或體內的病理細胞或靶細胞增殖的方法，即，通過送遞有效量本發明的前體藥物至所述細胞。當在體內實施時，所述方法適用于通過對受治療者送遞有效量本發明的前體藥物而治療受治療者以靶細胞為特征的病理狀況。
當所述靶細胞是抗化療藥物的靶細胞時，可進一步修飾所述方法，即，通過接觸或者對細胞或患者施用有效量的藥物(細胞已形成對它的抗性)。由于本發明的前體藥物能逆轉對以前的療法的抗性，隨后用本發明的前體藥物成功治療，所以，施用以前的療法又能抑制腫瘤的生長或轉移。可能出現這種情況的實例包括但不限于當靶細胞表達一種由于通過化療在體內選擇而擴增的酶時，或者當靶酶是在靶細胞中超量表達的內源性胞內酶時。這種酶的一個實例是胸苷酸合酶，已證實它由于以前的化療而被超量表達并且使細胞上具有抗以前的藥物的抗藥性表型。
本發明的前體藥物還可與其它已知療法結合以增強或協同任一個以前的療法或兩個以前的療法或前體藥物的療效。這類以前療法包括但不限于癌化療、放射治療和手術。
當對動物送遞時，所述方法還適用于進一步證實前體藥物的效果。作為動物模型的一個實例，用約105～約109超增殖性癌細胞或本文定義的靶細胞皮下接種幾組裸鼠(Balb/c NCR nu/nu雌性，Simonsen，Gilroy，CA)。當形成腫瘤后，就施用前體藥物(例如，通過腹膜內或靜脈內途徑)。每周兩次用游標卡尺進行腫瘤測量以測定腫瘤二維尺寸的減小。適當的話還可用其它動物模型[Lovejoy等(1997)；Clarke，R.(1996)；以及Pegram，M.D.等(1997)]。
在治療期間，可連續地或斷續地進行單劑量體內施藥。測定最有效的施藥途徑和劑量的方法是本領域技術人員熟知的并且將隨下列因素而變用于治療的組合物、治療目的、受處理的靶細胞和受治療的受治療者。可進行一次或多次施藥，劑量水平和模式由治療醫師選擇。從下文可見合適的劑量配方和施用治療劑的方法。
前體藥物、藥物的組合或者含二者之一的組合物可被用于生產通過常規施藥方法治療人和其它動物的藥劑(例如，藥物組合物中的活性組分)。
所述藥物組合物可通過經口、鼻內、腸胃外或者通過吸入療法施藥，可呈片劑、錠劑、顆粒、膠囊、丸劑、安瓿、栓劑或氣溶膠形式。它們還可呈活性組分在水性或非水稀釋劑中的懸浮液、溶液和乳液，糖漿，粒化物或粉末的形式。除了本發明的化合物以外，藥物組合物還可包含其它藥物活性化合物或本發明的多種化合物。
更具體地說，可通過下列任何合適的途徑為了治療而施用本發明結構式的化合物(本文也稱為活性組分)，包括經口，經直腸，經鼻，局部(包括經皮、氣溶膠、口腔和舌下)，經陰道，腸胃外(包括皮下、肌內、靜脈內和皮內)和肺內。還應懂得，優選的途徑將隨接受者的病況和年齡，以及受治療的疾病而定。
通常，對于上述名稱的化合物的每一種來說，合適的劑量在每天每千克接受者的體重約1～約100mg范圍內，優選在每天每千克體重約1～約50mg范圍內，最優選在每天每千克體重約1～約25mg范圍內。除非另外說明，所有活性組分的重量都以本發明的結構式的母體化合物計算的，對于其鹽或酯，重量應當按比例增大。優選在每天以適當間隔作為兩個、三個、四個、五個、六個或多個子劑量施用所要求的劑量。這些子劑量可呈單元劑型施用，例如，每單元劑型含約1～約100mg、優選約1～大于約25mg、最優選約5～大于約25mg活性組分。應懂得，本發明的化合物和組合物的適當劑量可取決于疾病的類別和嚴重性和病期，并且因不同的患者而變。確定最適劑量通常將涉及針對本發明的治療的任何危險或有害副作用而平衡治療有益的水平。
較理想的是，應當施用前體藥物而在疾病部位實現活性化合物的峰值濃度。這可通過下述方法實現，例如，通過靜脈內注射前體藥物(任選于鹽水中)，或者經口施藥，例如，作為含活性組分的片劑、膠囊或糖漿。可通過連續輸注來保持所要求的前體藥物血液水平，從而在疾病組織內提供活性組分的治療量。考慮了使用有效的組合而提供這樣的治療組合，即，要求每種組分抗病毒劑的總劑量比各種治療化合物或藥物單獨使用時需要的總劑量更低，于是減小不利影響。
雖然可以單獨施用前體藥物組分，但優選將它作為藥物制劑提供，該制劑包含至少一種上文定義的活性組分，以及一種或多種藥物上可接受的載體并且任選包含其它治療劑。各種載體在與制劑的其它組分相容的意義上必須是“可接受的”并且不傷害患者。
適合口服的本發明的制劑可作為下列形式提供，即，離散的單元(例如，膠囊、扁囊劑或片劑)，每單元含預定量的活性組分；作為粉末或顆粒；作為在水性或非水液體中的溶液或懸浮液；或者作為水包油乳液或油包水乳液。所述活性組分還可呈大丸劑、藥糖劑或糊劑提供。
片劑可通過壓榨或模壓(任選與一種或多種輔助成分)制備。壓制片劑可這樣制備，即，在合適的機器中對呈自由流動形式的活性組分(例如，粉末或顆粒)進行壓制，所述活性組分任選混有下列組分粘合劑(例如，聚乙烯吡咯烷酮、明膠、羥丙基甲基纖維素)，潤滑劑，惰性稀釋劑，防腐劑，崩解劑(例如，羥基乙酸淀粉鈉、交聯聚乙烯吡咯烷酮、交聯羧甲基纖維素鈉)，表面活性劑或者分散劑。模壓片劑可通過在合適的機器中將惰性液體稀釋劑增濕的粉狀化合物的混合物模壓而制備。片劑可任選被包覆或壓痕，還可被配制成提供緩慢或控制釋放其中的活性組分(應用例如不同比率的羥丙基甲基纖維素以提供希望的釋放分布)。可任選用腸溶包衣包覆片劑從而在腸道部分而不是胃中釋放。
適合在口腔內局部施藥的制劑包括錠劑，它包含處于調味基料(通常是蔗糖和阿拉伯膠或黃蓍膠)中的活性組分；軟錠劑，它包含處于惰性基料(例如，明膠和甘油，或者蔗糖和阿拉伯膠)中的活性組分；以及漱口劑，它包含處于合適的液態載體中的活性組分。
本發明的用于局部施藥的藥物組合物可作為軟膏、乳膏、懸浮劑、洗劑、粉末、溶液、糊劑、凝膠、噴霧劑、氣溶膠或油配制。制劑還可包括膜片或敷料(例如，浸漬了活性組分和任選一種或多種賦形劑或稀釋劑的繃帶或膏藥)。
至于眼或其它外部組織(例如，口和皮膚)的疾病，優選以局部軟膏或乳膏施用所述制劑，所包含的活性組分量例如是約0.075～約20％w/w，優選約0.2～約25％w/w，最優選約0.5～約10％w/w。當配制成軟膏時，所述前體藥物可與石蠟或水混溶性軟膏基料一起施用。也可用水包油乳膏基料將前體藥物組分配成乳膏。
如果需要的話，乳膏基料的水相可包含例如，至少約30％w/w多元醇，即，具有兩個或多個羥基的醇，例如，丙二醇、1，3-丁二醇、甘露糖醇、山梨糖醇、甘油和聚乙二醇及其混合物。可能希望局部制劑包含一種這樣的化合物，即，它增強前體藥物組分透過皮膚或其它受感染區的吸收或滲透。這樣的皮膚滲透增強劑的實例包括二甲亞砜和相關的類似物。
本發明的乳液的油相可按已知方式由已知組分構成。雖然該相可能僅僅包含乳化劑(或者稱為“emulgent”(乳化劑))。但希望它包含至少一種乳化劑與脂肪或油或者與脂肪和油二者的混合物。優選的是，包括親水性乳化劑與親脂性乳化劑(它起穩定劑作用)。還優選既包含油又包含脂肪。同時，含有或不含穩定劑的乳化劑構成所謂的乳化蠟，而這種蠟與油和/或脂肪一起構成所謂的乳化軟膏基料，它形成乳膏制劑的油性分散相。
適用于本發明的制劑的乳化劑和乳液穩定劑包括吐溫60、司盤80、十六醇十八醇混合物、肉豆蔻醇、一硬脂酸甘油酯和十二烷基硫酸鈉。
對制劑來說，合適的油或脂肪的選擇基于達到所需的美容特性，因為活性化合物在可能用于藥物乳劑中的大部分油中的溶解度很低。所以，乳膏應當優選是不油滑的、不污染的和可洗掉的制品，它具有合適的稠度以免從管或其它容器內滲出。可應用直鏈或支鏈的、單烷基酯或二元烷基酯，例如，二異己二酸酯，硬脂酸異十六醇酯，椰子脂肪酸的丙二醇二酯，肉豆蔻酸異丙酯，油酸癸酯，棕櫚酸異丙酯，硬脂酸丁酯，2-乙基己基棕櫚酸酯或者被稱為“Crodamol CAP”的支鏈酯混合物，優選的酯是最后那三種。這些酯可根據所需的性能而單獨用或組合用。還可應用高熔點脂質(例如，白色軟石蠟和/或液體石蠟)或者其它礦物油。
適合對眼局部施藥的制劑還包括滴眼劑，其中，活性組分被溶于或懸浮于合適的載體(特別是前體藥物組分的水性溶劑)。這種制劑中前體藥物組分優選以約0.5～約20％w/w、有利的是約0.5約～10％w/w、特別是約1.5％w/w的濃度存在。
供直腸施藥的制劑可作為栓劑提供，它包含合適的基料，該基料包括例如，可可脂或水楊酸鹽。
適合陰道施藥的制劑可作為栓劑、塞子、乳膏、凝膠、糊劑、泡沫或噴射制劑提供，除前體藥物組分之外，它還包含本領域技術人員已知的合適的載體。
適合經鼻施藥的制劑(其中，載體是固體)包含粗粉末，它的粒徑例如在約20～約500微米范圍內，將它按嗅的方式施藥，即，通過鼻通道從靠近鼻的盛粉末容器迅速吸入。用于作為例如噴鼻劑、滴鼻劑施藥或者利用噴霧器通過氣溶膠施藥的合適的制劑(其中，載體是液體)包括前體藥物組分的水性或油性溶液。
適合腸胃外施藥的制劑包括水性和非水的等滲無菌注射液，它可包含抗氧化劑，緩沖劑，抑菌劑和溶質(溶質使制劑與預期的接受者的血液是等滲的)；以及水性和非水的無菌懸浮液，它們可包含懸浮劑和增稠劑，以及脂質體或其它微粒體系(設計它們而將化合物導向血液成分或者一個或多個器官)。制劑可呈單元劑量或多劑量密封容器(例如，安瓿和小瓶)提供，可在凍干條件下貯存，只需就在使用前添加無菌液態載體(例如注射用水)。可從以前描述類型的無菌粉末、顆粒和片制備臨時注射溶液和懸浮液。
應懂得，除了上文特別提及的組分之外，本發明的制劑還可包含本領域常見的關于所述制劑的其它作用劑，例如，適合口服的那些可包含這類另外的作用劑，例如，增甜劑、增稠劑和調味劑。
本發明的結構式的前體藥物和組合物還可呈獸醫制劑形式提供，它可通過本領域常規方法制備。
如下實施例旨在闡述但不是限制本發明。
原料和方法核苷ECTA化合物的合成上述5-取代的嘧啶核苷的合成可通過本領域熟知的、上文簡要描述的方法進行。
在一個實施方案中，本發明涉及四類化合物。每一類由給出的尿嘧啶堿(uricil base)或改性的尿嘧啶堿(modified uricil base)的結構定義。這些類是ECTA化合物，其中，1)所述堿是尿嘧啶的呋喃橋嘧啶酮衍生物；2)所述堿是6-氟尿嘧啶；3)所述堿是4-腙取代的尿嘧啶衍生物；4)所述堿是尿嘧啶。尿嘧啶或改性尿嘧啶衍生的堿被用于合成在5位被毒性離去基取代的化合物(在該5位通過“電子通道鏈”(electron conduit tether)連接，包括在電子通道和毒性離去基之間合適的間隔基)。ECTA化合物可以是未磷酸化的，5′一磷酸酯，5′磷酸二酯或者5′被保護的(“掩蔽的”)脫氧尿苷或可比的備選碳水化合物部分的衍生物(如下所述)。被保護的5-取代脫氧尿苷一磷酸酯衍生物是這樣的化合物其中，磷酸酯部分通過連接合適的化學保護基而被封阻了。5-取代脫氧尿苷一磷酸酯衍生物的保護可改善溶解性，有利于細胞滲透，有利于穿過血-腦屏障，并且防止細胞的或胞外的磷酸酶的作用(否則它會導致磷酸酯基的失去)。在另一個實施方案中，5-取代尿嘧啶或尿苷衍生物被施用到含核苷激酶活性的細胞，其中，5-取代尿嘧啶/尿苷衍生物被轉化為5-取代尿苷一磷酸酯衍生物。尿苷衍生物還可被改性以增大它們的溶解性，細胞滲透性，和/或穿過血-腦屏障的能力。
胸苷酸合酶對5-取代尿苷一磷酸酯衍生物的作用能釋放連接到嘧啶環的5位(“離去基”)的取代基。釋放的取代基就能(固有地或者在與其它細胞成分反應后)起毒素或細胞增殖的抑制劑的作用。用炔丙基鏈(propargvl tethers)合成ECTA化合物炔丙醇和烯丙醇裝備的2′-脫氧尿苷的合成簡單易懂。文獻中報導了很多這些和其它密切相關的衍生物，甚至將一些與TS聯系研究。例如，研究了5-炔基-dUMPs[包括5-(3-甲氧基-1-丙炔基)和5-(3-羥基-1-丙炔基)]作為TS抑制劑(Barr，和Robins(1981))，已證實它們中的一些結合入TS-缺乏癌細胞的DNA(Balzarini，J.等(1985))。
5-汞尿苷(Ruth，J.L.等(1978))和5-碘尿苷(Robins，M.J.等(1981))都容易與烯烴和炔烴在鈀催化劑存在下縮合而給出C5鏈接的尿苷。后一條途徑更常用[Robins，M.J.等(1982)，Asakura，J.等(1988)和(1990)]。已實現了被保護的5-碘-2′-脫氧尿苷與叔丁基二甲基甲硅烷基炔丙基醚[Graham等(1998)；De Clercq等(1983)]、甲基炔丙基醚[Tolstikov等(1997)]和甚至炔丙醇自身[Chaudhuri等(1995)和Goodwin等(1993)]的高產率縮合。還可通過甲基丙烯酸酯基的DIBAL-H還原(它自身是從用于BVdU的合成的相同Heck反應產生的)得到通過后一個反應引入的3-羥基-1-丙炔基取代基(Cho，Y.M.等(1994))。這些鈀催化的反應如此通用以致它們可被用于使基于很長的、復雜的官能化炔丙基的鏈與5-碘-2′-脫氧尿苷縮合[Livak等(1992)和Hobbs(1989)]。基于(Z)-烯丙基的鏈是通過炔丙基母體在Undiar催化劑上的部分氫化而產生的[Robins，M.J.等(1983)]，而基于(E)-烯丙基的鏈則最好通過(E)-三丁基甲錫烷基化乙烯的Heck偶合來制備(Crisp(1989))。
嚴密地按文獻方法，制備了叔丁基二甲基甲硅烷基炔丙基醚裝備的3′，5′-二-O-保護的2′-脫氧尿苷[Graham等(1998)，以及De Clercq等(1983)]，并且將它的一部分[已轉化為相應的(Z)-烯丙基醚(Robins和Barr(1983))]還原。由于TBAF-介導的TBDMS基的除去產生氧陰離子(它可被就地官能化)，所以，這些TBDMS-保護的炔丙基-和(Z)-烯丙基鏈接的核苷將作為某些毒性基團裝備的靶的方便母體。至于(E)-烯丙醇裝備的核苷，已知的0-四氫吡喃基醚衍生物是通過文獻報導的(E)-三丁基甲錫烷基化乙烯的Heck偶合來制備(Crisp(1989))。 應用兩步文獻方案[Phelps等(1980)以及Hsiao和Bardos(1981)]，將炔丙基醇以及(E)-和(Z)-烯丙基醇轉化成它們相應的二氮丙啶基氨基磷酸酯或硫代氨基磷酸酯，以致5′-一核苷酸形式的TS處理將分別釋放細胞抑制藥TEPA或ThioTEPA的活性代謝物(Dirven等(1995))。 呋喃橋嘧啶酮的合成呋喃橋嘧啶酮的合成始于C5炔丙醇裝備的2′-脫氧尿苷的合成。然后從上述0-四氫吡喃基醚衍生物形成呋喃橋嘧啶酮化合物。合成是這樣繼續進行的，即，通過炔丙基鍵的第二個碳原子與連接在嘧啶環C4位的氧反應而生成熒光呋喃橋嘧啶酮，可輕易將它從反應混合物分離。這樣的化合物為通過特定的電子通道、間隔基和毒性離去基的各種組合合成ECTA化合物提供了又一基礎。

呋喃并[2，3-d]嘧啶酮核苷是通過2′，3′-二-O-對-甲苯甲酰或2′，3′-二-O-乙酰-5-碘-2′-脫氧尿苷與1-(四氫吡喃氧基)-2-丙炔在已知促進這些熒光化合物生成的條件[Robins，M.J.等(1983)]下縮合而制備的[“合成δ-氨乙基吡唑的新方法”，Jones，R.G.和Mann，M.J.(1953)]。堿催化的碳水化合物保護基的除去給出6-(四氫吡喃-2-基氧基甲基)-取代的雙環核苷，它或者經歷標準酸化THP基水解(TFA于CH2Cl2中)或者被區域選擇性地5′-氨基磷酸化(通過用于制備BVdU-PA和5FUdR-PA的相同操作)。氨基磷酸化后，THP基可通過酸解除去(如圖4中所示)。基于呋喃橋嘧啶酮的TS ECTA化合物可利用與將毒性離去基連接到C5炔丙基尿苷化合物的羥基上的那些方法相似方法(如上文關于TEPA和硫代TEPA衍生物的合成解釋的那樣)將毒性R4離去基連接到呋喃2-甲醇上。展望了本領域技術人員明白的各種備選的毒性離去基。此外，還展望了對R2電子通道組分的長度和成分以及對R3間隔單元的成分的修飾。
基于呋喃橋嘧啶酮的TS ECTA化合物還可包含各種修飾的“Q”部分。很多5-取代的2′-脫氧尿苷不是人TK的底物，但有趣的是，發現5-(4-羥基-1-丁炔基)-2′-脫氧尿苷例外(Barr，P.J.等(1981))。ECTA化合物可具有連接到備選的碳水化合物基上的游離5′羥基、5′一磷酸酯基或5′氨基磷酸酯基。一種合成這樣的氨基磷酸酯化合物的新方法是這樣進行的，即，將2-脫氧3′-羥基，5′-羥基未保護的核苷酸與氯化二氧磷基(phosphochloridate)在HCl清除劑存在下反應。在一個優選的實施方案中，所述氯化二氧磷基包括磷取代基，它得自例如丙氨酸這樣的氨基酸。例如，所述氯化二氧磷基可以是苯基-L-甲氧基丙氨酸氯化偶磷(phosphorochloridate)。基于C6氟尿苷和C4腙(hydozone)的化合物在與dUMP的正常TS反應中往嘧啶C5-C6雙鍵添加中性硫羥是按放熱反應進行的(3～9kcal/mol；參見Les，A.等(1998)的綜述)。6位TS活性氫的備選取代基能促進與酶形成巰基(sulfydryl)鍵，它經過活性人TS半胱氨酸(與L.casei的cys-198同源的)，所述取代基包括氟。所述嘧啶環其它位置上的這類取代基也能促進底物與TS之間的反應。例如，尿嘧啶上的4-腙取代(如Les，A.等(1998)所描述的)促進與TS的硫羥的形成。重要的是，生成的核苷酸-硫羥(TS)中間體以釋放改變的核苷酸的方式重排(它可通過水解而被動地進行)。 以前從未報導在C6位引入氟，不過它可按Krajewskas和Shugar(1982)的合成描述來合成，它描述了一些6取代的尿嘧啶和尿苷類似物的合成。
化學促進在嘧啶堿的C4位取代是本領域技術人員熟知的。文獻描述的實例包括Wallis等(1999)；Negishi等(1996)，Barbato等(1991)，Barbato等(1989)和Holy等(1999)。這些合成方法還能實現取代的組合，例如，在嘧啶環的C4和C5位(Pluta等(1999))或者在嘧啶環的C2和C4位(Zeid等(1999))。

在本發明另一個實施方案中，ECTA化合物是通過往C6氟尿苷堿或C4腙改性的嘧啶添加備選的電子通道、間隔基部分和毒性離去基而合成的。上述關于合成基于2，脫氧尿苷的ECTA化合物的方法又可用于這類分子的合成。核苷苯基甲氧基丙氨酰氨基磷酸酯的合成McGuigan，C.等(1993)和McGuigan，C.等(1994)最先報導了氨基磷酸酯作為核苷酸的磷酸酯前體藥物的應用。這些作者證實了，抗病毒的2′，3′-二脫氧核苷衍生物的氨基磷酸酯衍生物(例如d4T)在胸苷激酶缺乏的細胞中保持它們的抗病毒活性。進一步的研究證實了，氨基磷酸酯基在細胞內被水解成磷酸酯基[McGuigan，C.等(1996)；Balzarini，J.等(1996)；以及Saboulard等(1999)]。氨基磷酸酯是通過2′，3′-二脫氧核苷與苯基甲氧基丙氨酰氯化偶磷(PMPC)反應而合成的。
由于只存在一個羥基，所以，這些反應通常平穩地進行。在存在多于一個羥基的化合物中，可能需要被適當保護的核苷。由于2′-脫氧核苷的5′-OH基比3′-OH基的位阻作用小得多，所以，PMPC的選擇性氨基磷酸化可能在小心控制的條件下進行。BVdU和5FUdR都與PMPC在N-甲基咪唑的存在下在無水CH2Cl2中縮合而給出相應的氨基磷酸酯。在兩種情況下，輕易應用柱色譜法在硅膠上分離所需的產物與原料。將合成示意圖歸納如下。

如下實施例旨在闡述而不是限制本發明。
實施例1和2具有炔丙基鏈的ECTA化合物的合成應用上述一般合成操作，合成了二-吖丙啶-1-基-次膦酸3-[2-脫氧尿苷-5-基]-丙-2-炔基酯，通過1H NMR分析而獲得如下結果1HNMR((CD3)2SO)因噪音而變得復雜。特征δ 8.28(d，1，H6)，6.10(假-t，1，H1′)，5.26(m，同D2O互換，1，3′-OH)，5.13(m，同D2O互換，1，5′-OH)，4.81(q或dd，2，炔丙基-CH2)，4.24(m，1，H3′)，3.57(m，2，5′-CH2)，2.15-2.0(m，8，氮丙啶-CH2)。
還合成了二-吖丙啶-1-基-膦基硫代酸(phosphinothioicacid)3-[2-脫氧尿苷-5-基]-丙-2-炔基酯，通過1H NMR分析而獲得如下結果1H NMR((CD3)2SO)因噪音而變得復雜。特征δ8.29(d，1，H6)，6.10(假-t，1，H1′)，5.22(m，同D2O互換，1，3′-OH)，5.10(m，同D2O互換，1，5′-OH)，4.88(q或dd，2，炔丙基-CH2)，4.31(m，1，H3′)，3.52(m，2，5′-CH2)，2.15-2.0(m，8，氮丙啶-CH2).
實施例3～8呋喃橋嘧啶酮的合成應用上述一般合成操作，合成了下列化合物。
實施例33-(2-脫氧-β-D-呋喃核糖基)-6-(四氫吡喃-2-基氧基甲基)呋喃并[2，3-d]嘧啶-2(3H)-酮。
1H NMR((CD3)2SO)δ8.80(s，1，H4)，6.74(s，1，H5)，6.16(假-t，1，H1′)，5.27(d，同D2O互換，1，3′-OH)，5.12(t，同D2O互換，1，5′-OH)，4.72(m，1，THP-H2)，4.56(q，2，CH2OTHP)，3.92(m，1，H4′)，3.64(m，2，5′-CH2)，2.40(m，1，H2′a)，2.03(m，1，H2′b)，1.68和1.50(m，8，THP).
二-TMS衍生物的低分辨質譜(DCI-NH3)，m/z 323(B+TMS+H+)，511(MH+)，583(M+TMS+).
實施例43-(2-脫氧-β-D-呋喃核糖基)-6-(羥甲基)呋喃并[2，3-d]嘧啶-2(3H)-酮。
1H NMR((CD3)2SO)δ12.0(bs，1，OH)，8.24(s，1，H4)，6.53(s，1，H5)，5.51(假-t，1，H1′)，4.42(m，2，CH2OH). 低分辨質譜-(DCI-NH3)，m/z 167(B+2H+)，184(B+NH4+).
實施例51-[6-(四氫吡喃-2-基氧基甲基)呋喃并[2，3-d]嘧啶-2(3H)-酮-3-基]-2-脫氧-β-D-呋喃核糖-5-基苯基甲氧基-L-丙氨酰氨基磷酸酯。1H NMR((CD3)2SO)因非對映體的存在而變得復雜。特征δ8.62和8.59(各個s，各個1，H4)，7.4-7.1(m，5，PhO)，6.61和6.60 (各個s，各個1，H5)，6.25(m，1，H1′)，4.56(q，2，炔丙基-CH2)，3.56和3.54(各個s，各個3，CO2Me)，2.0(m，1，H2′b)，1.22(m，3，丙氨酰-α-Me).低分辨質譜(DCI-NH3)，m/z 167(B+2H+)，184(B+H++NH4+-THP).
實施例61-[6-(羥甲基)呋喃并[2，3-d]嘧啶-2(3H)-酮-3-基]-2-脫氧-β-D-呋喃核糖-5-基苯基甲氧基-L-丙氨酰氨基磷酸酯。1H NMR(CDCl3)因非對映體的存在而變得復雜。特征δ8.5(s，1，H4)，7.4-7.1(m，5，PhO)，6.36和6.30(各個s，各個1，H5)，6.23(m，1，H1′)，3.67和3.65(各個s，各個3，CO2Me)，2.69(m，1，H2′a)，2.10(m，1，H2b)，1.35(m，3，丙氨酰-α-Me).低分辨質譜(DCI-NH3)，m/z 525(MH+)，595(MNH4+).
實施例7按如下所示的標準醚合成法制備了5-(3-羥基-1-丙炔基)-2′-脫氧尿苷的4-硝基苯基醚衍生物。 實施例85-[3-(4-硝基苯氧基)-1-丙炔基]-2′-脫氧尿苷。在氬氣氛中，用4-硝基苯酚(696mg，5mmol)、三苯膦(787mg，3mmol)和偶氮二羧酸二異丙酯(590L，3mmol)處理預先干燥的5-(3-羥基-1-丙炔基)-2′-脫氧尿苷(Robins，M.J.等(1983))(565mg，2mmol)于40mL無水THF中的溶液，將反應混合物加熱到60℃直至溶液清亮，再繼續加熱1h。使混合物冷卻到23℃，然后將它蒸發到SiO2上，通過色譜法純化(應用MeOH/CH2Cl2作為洗脫劑)給出107mg(13％)所需的醚產品mp 112-118℃.1H NMR((CD3)2SO)δ11.65(s，同D2O互換，1，NH)，8.29(s，1，H6)，8.24(d，J＝9.3Hz，2，m-ArH)，7.23(d，J＝9.3Hz，2，o-ArH)，6.09(假-t，1，H1′)，5.17(s，2，炔丙基-CH2)，4.22(m，1，H3′)，3.80(m，1，H4′)，3.59(m，2，5′-CH2)，2.13(假-t，2，2′-CH2).per-三甲基甲硅烷基化物質的低分辨質譜(DCI-NH3)，m/z547[M(TMS)2H+]，565[M(TMS)2NH4+]，620[M(TMS)3H+].
實施例95-(4-乙酯基-1，3-丁二烯基)-2′-脫氧尿苷(a)5-(甲酯基乙烯基)-2′-脫氧尿苷-3′，5′-二(四氫-2H-吡喃-2-基)醚(I)在50℃下攪拌5-(甲酯基乙烯基)-2′-脫氧尿苷(3.0g，9.6mmol)、3，4-二氫-2H-吡喃(22mL，21.3mmol)和對-甲苯磺酸吡啶噁(PPTS，0.242g，0.96mmol)于二甲基甲酰胺(DMF，5mL)中的漿狀液達18h。真空濃縮(浴液溫度45℃)形成的溶液而給出稠密的淡黃色油。將該油溶于EtOAc，濾出固體。再次濃縮溶液。通過柱色譜法(應用50～75％EtOAc/己烷作為洗脫劑)在硅膠上純化獲得的油，給出3.81g(85％)無色油狀純產品。
(b)5-(3-羥基丙-1-烯基)-2′-脫氧尿苷-3′，5′-二(四氫-2H-吡喃-2-基)醚(II)將(I)(3.5g，7.27mmol)于CH2Cl2(14mL)中的溶液在干冰/丙酮浴中冷卻到-78℃。在2h中滴加二異丁基氫化鋁(DIBAL-H)的甲苯(1.0M，24mL，24.0mmol)溶液，而將溫度保持在-78℃。在-78℃下將溶液又攪拌2h，滴加MeOH(2.5mL)而破壞任何過量的DIBAL-H。在約20min內將反應混合物用插管通入30％檸檬酸溶液(50mL)、冰(25g)和EtOAc(30mL)的混合物中。進行相分離，用EtOAc(2×25mL)萃取水相，用飽和NaHCO3(20mL)和鹽水(20mL)洗滌合并的有機相，在MgSO4上干燥，濃縮而給出3.288g(100％)無色油。
(c)5-(3-氧代丙-1-烯基)-2′-脫氧尿苷-3′，5′-二(四氫-2H-吡喃-2-基)醚(III)在水冷卻下，往上述獲得的粗(II)(1.988g，4.4mmol)的CH2Cl2(9mL)溶液中添加固體重鉻酸吡啶噁(PDC，1.82g，4.8mmol)。攪拌該懸浮液，同時滴加醋酸(0.4mL)。撤去水浴，在室溫下將反應混合物攪拌1h。通過硅酸鎂載體片(2×2.5cm)過濾粗產品，用35mL EtOAc洗滌硅酸鎂載體。將獲得的棕色溶液濾過另一個硅酸鎂載體柱(3.5cm直徑×2.5cm高)。濃縮濾液而給出1.273g(64％產率)很亮的棕色油。
(d)5-(4-乙酯基-1，3-丁二烯基)-2′-脫氧尿苷-3′，5′-二(四氫-2H-吡喃-2-基)醚(IV)將(乙酯基亞甲基)三苯基正膦(0.32mg，0.92mmol)加到粗醛(III)(0.344g，0.77mmol)的溶液中。溶液變暗，變成鐵銹色。1h后，通過薄層色譜法判斷(III)被完全消耗了。蒸發溶劑，通過柱色譜法(用35～45％EtOAc/己烷作為洗脫劑)在硅膠上純化粗產品。獲得無色油狀純產品(0.310g，78％產率)。
(e)5-(4-乙酯基-1，3-丁二烯基)-2L脫氧尿苷(V)將5-(4-乙酯基-1，3-丁二烯基)-2′-脫氧尿苷-3′，5′-二(四氫-2H-吡喃-2-基)醚(IV)(0.637g，1.22mmol)溶于MeOH(1.5mL)，添加PPTS(0.049g，0.16mmol)。在50℃下將溶液攪拌7.5h，在室溫下放置一夜。生成白色沉淀。將反應混合物冷卻到0℃，過濾而給出純的(V)白色固體(0.188g)。濃縮濾液，在硅膠上進行色譜處理(用50～100％EtOAc/己烷作為洗脫劑)又給出0.180g產品。產品的總產量是0.368g(86％)。
1H NMR(DMSO-d6)1.22(3H，t，J＝7Hz)，2.17(2H，br t，J＝5.5Hz)，3.55-3.75(2H，m)，3.81(1H，m)，4.12(2H，q，J＝7Hz)，4.25-4.28(1H，m)，5.19(1H，t，J＝4.8Hz)，5.27(1H，d，J＝4.1Hz)，5.98(1H，d，J＝14.5Hz)，6.14(1H，t，J＝6.3Hz)，6.75(1H，d，J＝14.5Hz)，7.18-7.30(2H，m)，8.30(1H，s)，11.56(1H，s)．實施例105-(4-甲酯基-1，3-丁二烯基)-2′-脫氧尿苷(Va)通過鼓泡通入氮氣15min將三乙胺(3.9mL，28.2mmo1)于二 烷(12mL)中的溶液脫氣。添加醋酸鈀(0.60g，0.26mmol)和三苯膦(0.183g，0.70mmol)，在70℃下將溶液加熱20min而給出深棕色溶液。添加5-碘-3′-脫氧尿苷(5.0g，14.1mmol)和2，4-戊二烯酸甲酯(2.5g，22.3mmol)，將混合物回流加熱15h。真空蒸發溶劑和揮發性組分，將殘余物在水(15mL)和EtOAc(15mL)之間分配。進行相分離，用EtOAc萃取水相兩次(每次10mL)。用鹽水洗滌合并的有機相并濃縮。將殘余物溶于MeOH(15mL)，使它冷卻到室溫。通過過濾收集形成的固體，用少量MeOH洗滌，真空干燥而給出0.38g棕色粉末。
1H NMR(DMSO-d6)2.17(2H，t，J=6.4Hz)，3.55-3.70(2H，m)，3.66(3H，s)，3.82(1H，q，J＝3.6Hz)，4.27(1H，m)，5.18(1H，t，J＝4.9Hz)，5.26(1H，d，J＝4.5Hz)，5.99(1H，d，J＝14.4Hz)，6.14(1H，d，J＝6.4Hz)，6.74(1H，d，J＝14.8Hz)，7.20-7.35(2H，m)，8.30(1H，s)，11.56(1H，s).
濃縮上述濾液，在硅膠上進行色譜處理(用60～100％EtOAc/己烷作為洗脫劑)，又給出0.70g產品(棕色泡沫)。合并的產量是1.08g(22.6％)。
實施例115-(4-羧基-1，3-丁二烯基)-2′-脫氧尿苷(VI)方法I將5-(4-乙酯基-1，3-丁二烯基)-2′-脫氧尿苷(V，來自實施例1)(0.449g，1.28mmol)溶于2N NaOH(3mL)，在25℃下攪拌。20min后，形成沉淀，TLC表明原料完全被消耗。將混合物冷卻到0℃，用2N HCl酸化到pH1。濾出生成的米色固體，用水洗滌，真空干燥，給出0.225g(54％)產品。
1H NMR(DMSO-d6)2.12-2.19(2H，m)，3.50-3.70(2H，m)，3.75-3.85(1H，m)，4.24-4.29(1H，m)，5.19(1H，t，J＝4.8Hz)，5.27(1H，d，J＝4.2Hz)，5.80-5.95(1H，m)，6.14(1H，t，J＝6.4Hz)，6.60-6.75(1H，m)，7.15-7.25(2H，m)，8.26(1H，s)，11.56(1H，s)，12.16(1H，br s).
合并濾液和洗滌液，蒸發至干。將生成的粘性黃色固體溶于MeOH，形成白色沉淀。濾出固體而給出另外的0.200g產品。
方法II還可從5-(4-甲酯基-1，3-丁二烯基)-2′-脫氧尿苷(Va)(按實施例2中的方法制備的)以與上述可比的產率制備標題化合物。
實施例125-(4-溴-1E，3E-丁二烯基)-2′-脫氧尿苷(VIIa)和5-(4-溴-1E，3Z-丁二烯基)-2′-脫氧尿苷(VIIb)往5-(4-羧基-1，3-丁二烯基)-2′-脫氧尿苷(VI)(0.200g，0.62mmol)于DMF(1mL)的溶液中添加KHCO3(0.185g，1.84mmol)，在25℃下將混合物攪拌20min。滴加N-溴丁二酰亞胺(0.117g，0.65mmol)于DMF(0.3mL)中的溶液。在添加過程中平穩地析出氣體(CO2)。在25℃下將形成的棕色懸浮液攪拌2h，此時TLC顯示(VI)被完全消耗。往懸浮液中添加水(10mL)，用EtOAc萃取(2×15mL)形成的溶液。將萃取液在MgSO4上干燥，真空蒸發溶劑而給出黃色固體(178mg，80％產率)，1H NMR表明，它包含兩種異構體的混合物。通過半制備HPLC(反相C18柱)分離(應用20％乙腈水溶液作為流動相)粗產品，給出下列異構體5-(4-溴-1E，3Z-丁二烯基)-2′-脫氧尿苷保留時間10.5分鐘；1H NMR；(DMSO-d6)2.11-2.18(2H，m)，3.50-3.70(2H，m)，3.80(1H，distorted q，J＝3.5Hz)，4.25(1H，brs)，5.08(1H，br s)，5.25(1H，br s)，6.15(1H，t，J＝6.5Hz)，6.40(1H，d，J＝7Hz)，6.53(1H，d，J＝15.6Hz)，6.83(1H，dd，J＝7，10Hz)，7.39(1H，dd，J＝10，15.6Hz).
5-(4-溴-1E，3E-丁二烯基)-2′-脫氧尿苷保留時間15.1分鐘；1H NMR(DMSO-d6)2.12-2.16(2H，m)，3.50-3.70(2H，m)，3.80(1H，q，J＝3.2Hz)，4.26(1H，m)，5.13(1H，br s)，5.25(1H，br s)，6.14(1H，t，J＝6.5Hz)，6.36(1H，d，J＝15.6Hz)，6.67(1H，d，J＝13.1Hz)，6.84(1H，dd，J＝11，13.1Hz)，7.04(1H，dd，J＝11，15.6Hz).
實施例13應用實施例11中提及的方法(方法II)，可以相似方式獲得如下化合物5-(4-氯-1，3-丁二烯基)-2′-脫氧尿苷(應用N-氯丁二酰亞胺代替步驟B中的N-溴丁二酰亞胺)；5-(4-碘-1，3-丁二烯基)-2′-脫氧尿苷(應用碘化鈉中的碘代替N-溴丁二酰亞胺)。
實施例145-(2-溴乙烯基)-2′-脫氧尿苷苯基N-甲氧基-L-丙氨酰氨基磷酸酯苯基N-甲氧基-L-丙氨酰氯化偶磷將L-丙氨酸甲酯氫氯化物(245.8g；1.76mol)置于12L三頸圓底燒瓶(裝有機械攪拌器和溫度計)中，接著添加4.0L二氯甲烷。在室溫下將混合物攪拌15分鐘。往混合物中添加二氯磷酸苯酯(phenylphosphodichloridate)(370.0g；1.76mol)，在室溫下繼續攪拌15分鐘。將燒瓶置于干冰浴中，繼續攪拌20分鐘直至形成均勻的懸浮液。
在強烈攪拌下將新鮮蒸餾的三正丁胺(626.5g；3.38mol)滴加(～90min)到反應混合物中，以致燒瓶內的溫度保持在～0℃。撤去浴液，在室溫下繼續攪拌6小時。通過旋轉式蒸發器蒸發幾部分混合物而將溶液濃縮到～2.84L，在氬氣氛中密封混合物并在-20℃貯存。通過磷NMR分析產品純度是85％，估測苯基甲氧基丙氨酰二氧磷基氯化物的濃度為～0.5M。
實施例155-(2-溴乙烯基)-2′-脫氧尿苷苯基N-甲氧基-L-丙氨酰氨基磷酸酯(NB1011)在氬氣氛中進行反應。將5-(2-溴乙烯基)-2′-脫氧尿苷(BVdU)(204g；612mmol)置于裝有機械攪拌器的3L三頸圓底燒瓶中。將燒瓶置于冰水浴中，應用加液漏斗在15min內添加1600mL(～800mmol)苯基甲氧基丙氨酰二氧磷基氯化物試劑，強烈攪拌反應混合物，接著，在5分鐘內用注射器添加100mL N-甲基咪唑。5分鐘后，混合物變清亮，10分鐘后，撤去冰水浴，使混合物暖至室溫(同時繼續攪拌)。通過反相HPLC監測反應，在3小時中反應完全。通過添加100mL甲醇猝滅反應，將混合物蒸發成油，重溶于6L二氯甲烷，通過800g硅膠。在裝柱過程中使BVdU-PA的主要部分(在本文被稱為“NB1011”)通過柱，最后流過5L5％甲醇的二氯甲烷溶液完全洗脫NB1011。合并含NB1011的全部級分，蒸發成油，將殘余物溶于4L醋酸乙酯，用水(2×2L)萃取混合物。用硫酸鈉干燥有機層，過濾，用醋酸乙酯(3×300mL)洗滌。蒸發合并的濾液和洗滌液而產生淺白色泡沫；總重量～540g通過兩次硅膠色譜法(分別應用0～5％MeOH的CH2Cl2溶液和10％MeOH的CH2Cl2溶液作為洗脫液)純化粗產品。產品(＞98％純度)的產量是64g。
實施例16應用實施例15中描述的方法，制備了下列核苷的苯基N-甲氧基-L-丙氨酰氨基磷酸酯1. 5-(4，4-二溴-1，3-丁二烯基)-2′-脫氧尿苷，2. 5-(2-氯乙烯基)-2′-脫氧尿苷，3. 5-三氟甲基-2′-脫氧尿苷，4. 5-(4-乙酯基-1，3-丁二烯基)-2′-脫氧尿苷，5. 5-(4-甲酯基-1，3-丁二烯基)-2′-脫氧尿苷，6. 5-(4-溴-1E，3E-丁二烯基)-2′-脫氧尿苷，7. 5-(4-溴-1E，3Z-丁二烯基)-2′-脫氧尿苷，8. 5-(三甲基甲硅烷基乙炔基)-2′-脫氧尿苷，9. 5-(乙炔基)-2′-脫氧尿苷，10. 5-(1-癸炔基)-2′-脫氧尿苷，11. 3-(2′-脫氧-β-D-呋喃核糖基)-2，3-二氫呋喃并[2，3-d]嘧啶-2-酮，12. 3-(2′-脫氧-β-D-呋喃核糖基)-6-辛基-2，3-二氫呋喃并[2，3-d]嘧啶-2-酮。衍生物本文公開的上述化合物的鹽、酯和醚都在本發明的范圍內。本發明的前體藥物的鹽可得自無機或有機酸和堿。酸的實例包括鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、富馬酸、馬來酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水楊酸、琥珀酸、對甲苯磺酸、酒石酸、醋酸、檸檬酸、甲磺酸、乙磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸和苯磺酸。其它酸(例如草酸)雖然本身不是藥物上可接受的，但也可用于制備適用作獲得本發明的化合物及其藥物上可接受的酸加合鹽的中間體的鹽。堿的實例包括堿金屬(例如鈉)氫氧化物、堿土金屬(例如鎂)氫氧化物、氨和式NW4+的化合物(其中，W是C1-4烷基)。
鹽的實例包括醋酸鹽、己二酸鹽、藻酸鹽、天冬氨酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、硫酸氫鹽、丁酸鹽、檸檬酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、環戊烷丙酸鹽、digluconate、十二烷基硫酸鹽、乙磺酸鹽、富馬酸鹽、flucoheptanoate、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽(hemisulfate)、庚酸鹽、己酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基乙磺酸鹽、乳酸鹽、馬來酸鹽、甲磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、煙酸鹽、草酸鹽、雙羥萘酸鹽(palmoate)、果膠酸鹽(pectinate)、過硫酸鹽、phenylproprioate、苦味酸鹽、新戊酸鹽、丙酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、甲苯磺酸鹽和十一酸鹽。鹽的其它實例包括本發明化合物的陰離子與合適的陽離子[例如，Na+、NH4+和NW4+(其中，W是C1-4烷基)]化合生成的鹽。
就治療用途來說，本發明化合物的鹽將是藥物上可接受的。然而，藥物上不可接受的酸和堿的鹽也可用于，例如，制備或純化藥物上可接受的化合物。
通過本發明方法鑒別的前體藥物或化合物的酯包括通過2′-，3′-，和/或5′-羥基的酯化獲得的羧酸酯(即，-O-C(＝O)R)，其中，R選自(1)直鏈或支鏈烷基(例如，正丙基、叔丁基或正丁基)，烷氧基烷基(例如，甲氧基甲基)，芳烷基(例如，芐基)，芳氧基烷基(例如，苯氧基甲基)，芳基(例如，苯基，任選被例如鹵素、C1-4烷基或C1-4烷氧基或氨基取代)；(2)磺酸酯，例如，烷基磺酰(例如，甲磺酰)或芳烷基磺酰；(3)氨基酸酯(例如，L-纈氨酰或L-異亮氨酰)；(4)膦酸酯以及(5)一磷酸酯，二磷酸酯或三磷酸酯。磷酸酯可被例如C1-20醇或其活性衍生物或者被2，3-二(C6-24)酰基甘油進一步酯化。在這樣的酯中，除非另外說明，存在的任何烷基部分有利地含1～18個碳原子，優選1～6個碳原子，更優選1～4個碳原子。在這樣的酯中存在的任何環烷基部分有利地含3～6個碳原子。在這樣的酯中存在的任何芳基部分有利地包括苯基。本發明的來蘇-呋喃糖基(lyxo-furanosyl)前體藥物衍生物的實例包括例如，具有被化學保護的羥基(例如，具有O-乙酰基)的那些，例如，2′-O-乙酰基-來蘇-呋喃糖基；3′-O-乙酰基-來蘇-呋喃糖基；5′-O-乙酰基-來蘇-呋喃糖基；2′，3′-二-O-乙酰基-來蘇-呋喃糖基和2′，3′，5′-三-O-乙酰基-來蘇-呋喃糖基。
本發明的化合物的醚包括甲基醚、乙基醚、丙基醚、丁基醚、異丁基醚和仲丁基醚。
在進一步的實施方案中，所述底物可能不與嘧啶或葉酸酯化學相關，而是基于合理藥物設計的已知參數合成的。參見Dunn，W.J.等(1996)。
下文提供的實施例中或者由Barr，P.J.等(1983)描述了對產品(例如，當反應產物是dUMP的溴乙烯基衍生物的抗代謝物時)的化學檢測。對細胞中的核苷和一磷酸的量的檢測該檢測是用化合物NB1011進行的。然而，本領域技術人員應懂得，容易修改下述方法而用于本發明的前體藥物。
將處于補加了10％FCS和抗生素的RPMI培養基中的細胞系MCF7(乳腺癌細胞系)；MCF7TDX(Tomudex抗性乳腺癌細胞系)和H630R10(5-FU抗性結腸癌細胞系，得自Dr.S.Copur，YaleUniversity，參見Copur，S.等(1995))以每個皿750,000個細胞的量鋪板于100mm培養皿中，在37℃下培養一夜。往每個培養皿中添加100μM BVdU，使細胞在37℃下繼續生長2天。此后，吸出培養基，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)將細胞洗滌兩次。然后，在每個培養皿中添加1ml PBS，將培養皿置于-80℃冷凍機中。通過冷凍/融化操作(重復兩次)使細胞破裂。旋轉(13,000rpm，10分鐘)使形成的懸浮液中的細胞渣沉降，使上清液流過離心過濾裝置(Centrifugal FilterDevice)(Centrifree，30,000截止，Amicon)通過在20℃的SorvallSuper T21離心機(Rotor SL-50-T，1,912g)上以5,000rpm離心30分鐘而脫除蛋白質。將流過的液體濃縮至100μl的體積，注射到HPLC柱(Adsorbosphere HS，C18，5μm，4.6mm×150mm，Alltech)上。應用乙腈于水中的梯度(含三氟乙酸)分析樣品。檢測300nm處的峰(BVdU衍生物的最大吸收值)，以300nm處的峰面積表達化合物的量。化合物的鑒定是通過將它們的保留時間和譜與真實標準物的比較而進行的。AlamarBlue細胞增殖檢測該檢測是用化合物NB1011和本發明的前體藥物進行的。將指數生長的細胞轉移到384孔平底組織培養板上。將所有類型的細胞以每孔500個細胞的密度鋪板于25μL完全培養基(RPMI 1640+10％胎牛血清+抗生素/抗真菌劑)中。24小時(0天)后，一式三份添加25μL含10-3～10-10M劑量范圍的所述化合物的完全培養基。藥物接觸時間是120小時(5天)，此后，檢測生長抑制。往每孔添加5μL氧化還原指示劑(alamarBlue)(10％v/v)。在37℃下培養4小時后，監測熒光(535nm激發和595nm發射處)。結晶紫細胞增殖抑制檢測該檢測是用化合物NB1011和本發明的前體藥物進行的。通過結晶紫方法[Sugarman，B.J.等(1985)；以及Antelman，D.等(1995)]測定了試驗化合物阻止細胞增殖的能力。
將化合物溶于二甲亞砜至1M的濃度。必要的話，用DMEM細胞培養基進一步稀釋它們，接著，置于96孔微量滴定板的第一批孔中。對靶細胞系一式三份測試每個濃度。測試了1μM～3000μM的化合物濃度。將細胞與化合物保溫72小時，洗滌所述板，用甲醇固定細胞，用結晶紫按Sugarman，B.J.等(1985)；以及Antelman，D.等(1995)的方法染色。細胞系中TK和TS水平的蛋白質印跡分析應用人正常結腸上皮細胞類型CCD18co(得自ATCC，Manassas，VA)，抗5-FU的結腸腺癌細胞系H630R10(得自Dr.S.Copur，YaleUniversity，參見Copur，S.等(1995))，以及HER2-轉染的乳腺癌細胞系(Pegram，M.D.等(1997))進行了蛋白質印跡試驗。將細胞溶于RIPA緩沖液(50mM Tris-HCl，pH7.5，150mM NaCl，0.5％TritonX-100，0.1％SDS以及0.5％脫氧膽酸、鈉鹽和蛋白酶抑制劑)。通過應用BCA-200蛋白質分析盒(得自Pierce，Rockford，IL)測定蛋白質濃度。用12％SDS-PAGE溶解10μg各細胞系的蛋白質。將分離的蛋白質轉移到PVDF膜(得自Amersham，England)上，接著，用人胸苷酸合酶單克隆初級抗體和抗微管蛋白單克隆抗體(由NeoMarkers，Fremont，CA生產的)進行免疫印跡分析。將辣根過氧化物酶聯綿羊抗小鼠Ig用作次級抗體(Amersham)。利用ECL加試劑盒(Amersham)檢測免疫反應性。定量分析相應于胸苷酸合酶的帶，通過圖象分析(Molecular Dynamics Storm)正常化成微管蛋白的帶。細胞系中TS mRNA的RT-PCR分析應用RT-PCR定量分析了不同細胞系中人胸苷酸合酶轉錄物的表達水平。設計了用于擴增人胸苷酸合酶和B-肌動蛋白的寡核苷酸引物如下胸苷酸合酶有義引物(序列號1)5′-GGGCAGATCCAACACATCC-3′(相應于胸苷酸合酶cDNA序列的堿基208～226，基因庫登記號X02308)，反義引物(序列號2)5′-GGTCAACTCCCTGTCCTGAA-3′(相應于堿基564～583)，β-肌動蛋白有義引物(序列號3)5′-GCCAACACAGTGCTGTCTG-3′(相應于β-肌動蛋白基因序列的堿基2643～2661，基因庫登記號M10277)和反義引物(序列號4)5′-CTCCTGCTTGCTGATCCAC-3′(相應于堿基2937～2955)。
應用Rneasy微型試劑盒(得自Qiagen，Valencia，CA)從細胞分離總的RNAs。為了監測可能的DNA污染，設計了擴增β-肌動蛋白的引物以跨越外顯子4/內含子5/外顯子5連接。基因組DNA模板產生313bpβ-肌動蛋白片段，而cDNA模板則產生210bp產物。
用SuperScript前置放大系統(Gibco/BRL，Gaithersburg，MD)進行了逆轉錄反應。用3μg總的RNA(于20μl緩沖液的體積內)按生產商的方案進行逆轉錄反應。
PCR反應是在含下列物質的48μl體積內進行的3μl來自逆轉錄反應的cDNA混合物，3mM MgCl2，50mM KCl，20mM Tris-Cl(pH8.4)，各0.2mM dNTP、0.4TM胸苷酸合酶有義和反義引物，以及3單位TaqDNA聚合酶(得自Promega，Madison，WI)。在94℃下將反應混合物保溫3min，接著，循環10次在94℃下1min保溫、在58℃下1min保溫、然后在72℃下1min保溫。循環10次后，添加處于2μl中的人β-肌動蛋白引物以達到0.2μM的最終濃度，使最終反應體積為50μl。繼續進行PCR反應至總計28次循環，接著在72℃下進行7min保溫。
通過電泳將5μl PCR產物溶于2％瓊脂糖凝膠，接著，用SYBR Gold核酸凝膠染色劑(得自Molecular Probes，Eugene，Oreg.)染色。定量分析相應于胸苷酸合酶的DNA帶，通過Molecular Dynamics Storm正常化成β-肌動蛋白的帶。RNA印跡分析RNA印跡得自Invitrogen(Carlsbad，CA)，將它與克隆化TS cDNA探針雜交。將雜交信號對作為管家轉錄物的核糖體蛋白質S9正常化。乳膏正常化信號與正常組織對比物相比增強至少2倍，就認為腫瘤超量表達TS mRNA。人胸苷酸合酶的克隆、表達和純化為了在大腸埃希氏菌中表達，將完全人TS ORF亞克隆入T7啟動子表達載體pET28a(Novagen，Inc.)。生成的質粒載體編碼作為含六個組氨酸接著是凝血酶切割位點的重組融合蛋白的人TS的合成。該融合蛋白為人TS的氨基端添加共20個額外的氨基酸。為了生產重組蛋白質，將人TS表達載體導入大腸埃希氏菌株BL21(DE3)(一種在乳糖操縱基因的控制下在染色體中插入T7 RNA聚合酶基因的菌株)。
應用金屬螯合親合樹脂(Novagen，Inc.)純化人TS-poly-His融合蛋白。蛋白質純化之后是在10％SDS聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳。應用Pierce BCA蛋白質檢測法測定蛋白質濃度。從500ml大腸埃希氏菌培養物回收約10mg人TS融合蛋白。當用銀染色法觀察時，只有相應于人TS的帶是明顯的。通過用抗TS單克隆抗體TS106(NeoMarkers)進行蛋白質印跡而證實人TS帶的鑒定。胸苷酸合酶(TS)活性檢測應用Wahba等(1961)的分光光度分析測定TS活性。在此分析中，通過測定340nm處的吸光度增大(隨著dUTP轉化為dTTP，當輔因子5，10亞甲四氫葉酸被氧化成二氫葉酸時產生該現象)而監測TS活性。通過這種方法制備的酶具有0.5～0.65個單位/mg蛋白質的比活。一個單位被定義為每分鐘生產一微摩爾dTMP。該值與Pedersen-Lane，J.等(1997)報導的相似。TS前體藥物代謝的胞內產物的測定重要的是測定TS前體藥物代謝的胞內產物以便核實提出的活化和作用機制并確定屬于候選治療劑的作用劑。一個關于芳基磷酸二酯酰胺化物的胞內代謝的可接受觀點涉及，酶促轉化為羧酸，磷酸一酯酰胺化物至5′-單磷酰核苷的分子內重排。參見，Valette等(1996)。然而，這個機制不大可能描述所有基于氨基磷酸酯的前核苷酸的胞內加工。例如，提出了一個關于芳基磷酸一酯酰胺化物加工的不同機制，一個涉及通過氨基磷酸酯水解物(hydrolate)將氨基磷酸酯簡單直接轉化為一磷酸酯物質，參見McIntee等(1997)和Fries等(1995)。不管未掩蔽核苷一磷酸酯的機制如何，該檢測法將測定細胞內的胞內一磷酸酯至細胞毒性化合物的TS轉化的產物。
將細胞與一定量引起高TS表達細胞系(在72H檢測中，上文)的50％生長抑制的前體藥物化合物一起保溫。應用了低TS表達細胞和高TS表達細胞(例如，CCD18co與H630R10)。進行時程研究，其中，按McIntee，E.J.等(1997)描述的方法加工處理過的細胞。用60％甲醇水溶液在-20℃下溶解細胞，通過離心除去粒狀的殘余物。將上清液干燥，在-20℃下貯存。先后通過RP-HPLC和LC-MS估測等分樣以確定氨基磷酸酯至一磷酸酯的胞內轉化，還保證通過胸苷酸合酶轉化一磷酸酯。利用純化的胸苷酸合酶確證底物活性該檢測測定了未來TS酶制劑的比活以保障這類制劑隨時間的活性，從而確定屏蔽合適的活性的化合物是否在體外反應條件下滅活TS酶。
為了確定當將前體藥物化合物與純化的重組TS酶一起保溫時產生了什么反應產物，應用了與TS活性檢測中所用的相似條件而在體外產生反應產物。然后通過GC-質譜分析這些反應產物以鑒定生成的實際分子。
結果在數個腫瘤細胞系和初級腫瘤中高度表達TS應用上述定性RT-PCR測定了在正常人腦、心臟、腎、脾、肝、結腸、肺、小腸、胃肌肉、睪丸、卵巢、子宮、前列腺、甲狀腺、唾腺、腎上腺、皮膚、外周血淋巴細胞、骨髓和人結腸和配對的人正常組織中的胸苷酸合酶表達水平。設計了β-肌動蛋白的引物以跨越外顯子4/內含子5/外顯子5連接而監測可能的DNA污染。因此，以相對TS mRNA水平示出圖3中報告的結果。圖3A示出了多種正常人組織中的相對TS mRNA水平。圖3B是正常人結腸組織和腫瘤人結腸組織之間的平均TS mRNA的比較。
按上述方法測定了各種培養的正常細胞系和腫瘤細胞系中的胸苷酸合酶(TS)蛋白質水平。通過蛋白質印跡分析測定了蛋白質水平；結果如下所示。
表3人正常細胞和腫瘤細胞中的TS蛋白質水平細胞株描述 TS水平1NHOST 骨，成骨細胞 51NPRSC 前列腺，基質 98CCD18co 結腸上皮，成纖維細胞 100WI38 肺，胚性的 150DET551皮膚，成纖維樣的，胚性的 177MRC9 肺，成纖維樣的，胚性的 211NHDF 皮膚，成纖維細胞 224NHLF 肺，成纖維細胞 236平均 156±2421.胸苷酸合酶(TS)-TS水平是通過應用蛋白質印跡分析測定的，量化的表達水平以相對于細胞株CCD18co的值表示。2.標準誤差腫瘤細胞(≥4X TS)細胞株 描述 TS水平1H630/TDX 結腸，癌，TDX2抗性671HCTC(+) 結腸，癌，增大的TS 1276MCF7/TDX 乳腺，腺癌，TDX2抗性 1980H630R10 結腸，癌，5-FU3抗性 2305平均1558±35421.胸苷酸合酶(TS)-TS水平是通過應用蛋白質印跡分析測定的，量化的表達水平以相對于細胞株CCD18co的值表示。2.Tomudex3. 5-氟尿嘧啶4.標準誤差在細胞中測定的BVdUMP和BVdU的量用BVdU處理的每個細胞系MCF7、MCF7TDX和H630R10的溶胞產物中存在的BVdUMP或BVdU的量都以相應的300nm處HPLC峰的面積表示。注意，這些化合物在300nm處的消光系數都相同，所以，峰面積的比較能直接比較形成的量。
下表4示出了2天處理后測定的細胞內BVdUMP和BVdU的水平。將細胞在含100μm BVdU的完全培養基中培養。制備了溶胞產物，測定BVdUMP和BVdU的水平。
表4

上表表明，BVdU能滲透全部三種細胞，但似乎BVdUMP在MCF7和MCF7TDX細胞系中最突出。在H630R10細胞系中出現小的轉化。
在一個單獨的試驗中，用MCF7TDX和H630R10細胞溶胞產物催化無細胞體系(添加了作為磷酸鹽供體法的ATP)中的BVdU磷酸化。這證實了MCF7TDX細胞溶胞產物中此反應高得多的速率(和H630R10細胞溶胞產物相比)。可制備如(Look，K.Y.等(1997))所述那樣制備的腫瘤溶胞產物，并在此檢測中用來與BVdU(或其它備選的核苷)確定給定的患者是否是核苷與氨基磷酸酯療法的候選者。
這些結果表明，在MCF7TDX細胞中，BVdU可被磷酸化而產生相應的一磷酸酯(后續TS反應的底物)，而在H630R10細胞中，這樣的磷酸化顯然比MCF7TDX中的更慢。值得一提的是，MCF7TDX是乳腺腫瘤細胞系。已有報導在乳腺腫瘤細胞中，發現了具有與人其它組織的TK不同特性的TK(Madec，A.等(1997))。該TK可能導致BVdU磷酸化。基于上述結果，預計核苷(例如，BVdU)可能特別適用于治療某些類別的癌(包括乳腺癌)，其中，BVdU可被磷酸化。此外，上述試驗方法能使應用如下方法體外確定對給定類別的癌施用BVdU或其它核苷的可行性。如果可獲得組織樣品，就可用BVdU在體外處理細胞，于是，就可監測BVdUMP的可能形成。如果記錄了BVdUMP的形成，必定將這類腫瘤看作適合成功的核苷處理(與氨基磷酸酯衍生物相比)。
表5對正常細胞和腫瘤細胞的Alamar Blue細胞毒性檢測

表6對正常細胞和腫瘤細胞的結晶紫檢測

表5和6中的編號表示下文所示的結構。應用alamarBlue檢測的測試結果示于表5中，而來自基于結晶紫的檢測的結果則示于表6中。MCF7-TDX來自MCF7乳腺腫瘤細胞，是經過在Tomudex(TS的直接抑制劑)存在下在細胞培養物中選擇的。這樣的選擇通常導致TS的高胞內水平(Freemantle，S.J.等(1995))。同樣，H630R10是來自H630結腸癌細胞的5FU(氟代嘧啶)抗性結腸癌上皮細胞系。參見，Copur，S.等(1995)。HT1080，#12是纖維肉瘤腫瘤細胞系，它經過誘導入HT1080腫瘤細胞中的轉基因表達高TS水平。用于這些檢測中的正常細胞系包括CCD18co(正常結腸上皮)和Det551(正常皮膚)。
表5和6中的數據表明，大多數化合物作為氨基磷酸酯和核苷是活潑的。一個例外是NB1026TM，它作為氨基磷酸酯具有很小的可檢測活性，不過作為核苷(NB1025TM)是活潑的。該結果表明，NB1026TM可能不像NB1011TM那樣被活化。關于核苷(特別是BVdU、NB1020TM(ClVdU)和NB1024TM)的細胞毒性結果令人意外，因為文獻啟示了，5-取代的化合物(例如，BVdU)不被人細胞有效地一磷酸化，除非它們表達病毒胸苷激酶。參見，Balzarini，J.等(1985)和De Clerq，E.等(1997)。這些作者提出了，一旦被皰疹病毒編碼的TK磷酸化，5-取代的核苷酸衍生物就能結合到TS酶上并將它滅活。表4～6的結果首次闡明了，至少一些腫瘤細胞可能具有異常的胸苷激酶活性，即，能磷酸化與BVdU相似的5-取代的尿苷分子，以及本文示出的其它核苷。某些腫瘤細胞也可能具有異常高的量，或者形成正常TK酶(Suki，S.等(1995)；以及Romain，S.等(1995))，導致將核苷低而充分活化成它們相應的一磷酸酯。
上述測試的化合物NB1024TM包含兩種異構體的混合物，即，5-(4-溴-1E，3E-丁二烯基)-2′-脫氧尿苷(VIIa)(異構體2)，以及5-(4-溴-1E，3Z-丁二烯基)-2′-脫氧尿苷(VIIb)(異構體1)。這兩種化合物是通過半制備HPLC(反相C18柱)應用20％乙腈水溶液作為流動相如前述那樣(實施例12)分離的。然后，通過結晶紫法測定每一種分離的化合物阻止細胞增殖的能力。結果示于表7中。這兩種異構體顯示與Z異構體顯著不同的活性，表明與E異構體相比明顯更大的生長抑制活性。
表7.NB1024異構體的細胞毒性活性

前兩種細胞系(TS HT1080#12和MCF7TDX)表達高水平的TS，而其它兩種(CCD18co和Det551)則是正常細胞。
雖然參照其特定的實施方案詳細描述了本發明，但本領域技術人員應懂得，可對其進行各種改變和修飾而不偏離它的精神和范圍。
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1.一種具有如下結構的化合物 或其互變異構體；其中，R12或R13可以相同或不同并且選自下組氧代，OH或NHNH2；其中，如果a是0或1，假定如果a是0，而且R13是氧代，那么，在位置3和4之間存在一個雙鍵，并且R12是NHNH2；或者如果a是0，而且R12是氧代，那么，在位置2和3之間存在一個雙鍵，并且R13是NHNH2；或者如果a是1，那么，R12和R13都是氧代；其中，R1是具有下式的取代基 其中，R2和R3獨自是不飽和的或飽和的烴基；其中，n是0或1～10的整數，而m則是0或1；以及其中，R4選自下組F，Cl，Br，I，CN，SO3H，CO2H，CO2CH2CH3，CO2CH3，SI(CH3)3，CHO，NO2，CF3，CCl3，CH＝C(R15)2或具有如下結構的取代基 其中，Xa和Xb獨自相同或不同并且選自下組Cl，Br，I，以及有效的離去基；其中，Ya、Yb或Yc獨自相同或不同，它們是H或F；其中，Z、Za和Zb獨自相同或不同，它們選自O和S；以及其中，R14是H或F，假定，如果R14是F，那么，a是1，而且R12和R13都是氧代；以及其中，Q選自下組物質糖，碳環，以及無環的化合物，或者掩蔽的磷酸酯衍生物或其氨基磷酸酯衍生物。
2.權利要求1的化合物，其中，Q是選自具有如下結構的取代基 其中，Ra和Rb獨自相同或不同并且選自下組Br，Cl，F，I，H，OH，OC(＝O)CH3，和被保護的羥基；以及其中，R7在Q的5′位與Q連接，并且選自下組氫，磷酸酯基，磷酸二酯基或氨基磷酸酯基；而且其中，所述化合物可以呈任意對映的、非對映的或立體異構的形式，包括D型、L型、α端基異構形式和β端基異構形式。
3.權利要求2的化合物，其中，Q是
4.權利要求1的化合物，其中，m是0，而R2則選自下組基 其中，R5獨自相同或不同并且選自下組具有1～10個碳原子的直鏈烷基或支鏈烷基，具有3～10個碳原子的環烷基，CN和鹵素。
5.權利要求1的化合物，其中，R2和R3一起構成一個烯基或炔基，它選自下組
6.權利要求1的化合物，其中，m是0，而R2則是選自下組的芳烴基
7.權利要求1的化合物，其中，m是0，而R2則是選自下組的雜芳基 其中，J選自下組-O-，-S-，-Se-，-NH-，和-NRALK-，而且其中，RALK是具有1～10個碳原子的直鏈或支鏈烷基或者具有3～10個碳原子的環烷基。
8.權利要求2的化合物，其中，R7是
9.權利要求2的化合物，其中，R7是
10.權利要求2的化合物，其中，R7選自下組
11.權利要求2的化合物，其中，R7選自下組 或者具有如下結構的化合物 其中，Rd是芳族取代基。
12.權利要求1的化合物，其中，R4選自下組
13.一種具有如下結構的化合物 其中，Xd和Xe獨自相同或不同并且選自下組Cl，Br，I，和CN；或其核苷類似物。
14.權利要求13的化合物，其中，Xd是Cl或Br，而Xe則是H。
15.一種具有如下結構的化合物 其中，Xf和Xg獨自相同或不同并且選自下組Cl，Br，I，和CN；或其核苷類似物。
16.權利要求15的化合物，其中，Xf和Xg相同，各自是Cl或Br。
17.一種具有下式結構的化合物 其中，每個X選自下組Cl，Br，I，和CN；或其核苷類似物。
18.權利要求17的化合物，其中，X是Cl或Br。
19.權利要求18的化合物，其中，X是Br。
20.一種具有如下結構的化合物 其中，R8是低級直鏈或支鏈烷基；或其核苷類似物。
21.一種具有如下結構的化合物 其中，R8和R9都是低級直鏈或支鏈烷基，而R10是H或CH3；或其核苷類似物。
22.一種具有如下結構的化合物 其中，R10是H或CH3；或其核苷類似物。
23.一種具有如下結構的化合物
24.一種具有如下結構的化合物 或其核苷類似物。
25.權利要求1的化合物，其中，該化合物具有如下結構
26.權利要求25的化合物，其中，R7＝H。
27.權利要求25的化合物，其中，R7是具有如下結構的取代基
28.權利要求1的化合物，其中，該化合物具有如下結構
29.權利要求28的化合物，其中，R7＝H。
30.權利要求28的化合物，其中，R7是具有如下結構的取代基
31.一種具有如下結構的化合物
32.一種具有如下結構的化合物 其中，X選自下組CO2Et，Cl，和Br；或其核苷類似物。
33.一種具有如下結構的化合物 或其核苷類似物。
34.一種具有如下結構的化合物 或其核苷類似物。
35.一種組合物，它包含權利要求1～34的化合物，以及一種載體。
36.權利要求35的組合物，其中，所述載體是藥物上可接受的載體。
37.一種篩查治療劑的方法，它包括(a)將含靶細胞的樣品與權利要求13～34的任意化合物接觸；(b)將靶細胞的單獨樣品與可能的治療劑接觸；和(c)比較樣品對細胞增殖或細胞殺傷的抑制作用。
38.權利要求37的方法，其中，所述靶細胞的特征在于對化療藥物的抗性。
39.權利要求37的方法，其中，所述靶細胞的特征在于表達一種作為通過化療而體內選擇的結果而被擴增的靶酶。
40.權利要求37的方法，其中，所述靶酶是在靶細胞中被超量表達的內源性胞內酶。
41.權利要求13～34的任意化合物在制備用于治療或抑制病理細胞增殖的藥劑中的應用。
42.一種抑制病理細胞增殖的方法，它包括，將所述細胞與有效量權利要求13～34的任意化合物接觸。
43.權利要求42的方法，其中，所述病理細胞抗化療藥物。
44.權利要求42的方法，其中，所述病理細胞表達一種作為通過化療而體內選擇的結果而被擴增的靶酶。
45.權利要求44的方法，其中，所述靶酶是在靶細胞中被超量表達的內源性胞內酶。
46.權利要求45的方法，其中，所述酶是胸苷酸合酶。
47.一種治療以受治療者的靶細胞增殖為特征的病理的方法，它包括，對受治療者施用權利要求13～44的任意化合物。
48.權利要求47的方法，其中，所述靶細胞抗化療藥物。
49.權利要求47的方法，其中，所述靶細胞表達一種作為通過化療而體內選擇的結果而被擴增的酶。
50.權利要求49的方法，其中，所述靶酶是在靶細胞中被超量表達的內源性胞內酶。
51.權利要求50的方法，其中，所述酶是胸苷酸合酶。
52.權利要求48的方法，它進一步包括，在逆轉了對以前的化療的抗性后，將所述細胞與以前的化療接觸。
全文摘要
本發明提供了新型底物化合物,它們選擇性地抑制病理細胞的增殖,所述病理細胞例如是內源性地超量表達賦予生物作用劑和化療劑抗性的靶酶。所述酶作用于底物化合物從而:1)將它轉化為細胞毒素和/或2)釋放毒性副產物。在一個實施方案中,靶細胞中靶酶的活性大為增強了,是由于腫瘤抑制因子作用的喪失和/或因以前接觸化療而引起的選擇性喪失的緣故。在另一個實施方案中,病理細胞包含靶酶,該靶酶是細胞中的感染劑的表達產物。本發明進一步提供了一種治療受治療者的方法,該方法通過對受治療者送遞本文描述的前體藥物。本發明的前體藥物可單獨用或者與其它化療藥物或備選的抗癌療法(例如,放射)結合。
文檔編號C07H19/073GK1390227SQ00812073
公開日2003年1月8日 申請日期2000年7月21日 優先權日1999年7月22日
發明者H·M·謝帕德, M·F·錢, M·P·格羅茲克 申請人:新生物生物公司