促腎上腺皮質(zhì)素釋放因子受體－2缺陷型小鼠及其用途的制作方法

專利名稱：促腎上腺皮質(zhì)素釋放因子受體－2缺陷型小鼠及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及神經(jīng)生物學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)和精神病學(xué)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及對焦慮和促腎上腺皮質(zhì)素釋放因子受體-2缺陷型小鼠的研究。
相關(guān)領(lǐng)域描述促腎上腺皮質(zhì)素釋放因子(CRF)是下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸的關(guān)鍵性的協(xié)調(diào)劑。在對應(yīng)力的應(yīng)答中，下丘腦室旁核(PVN)釋放的促腎上腺皮質(zhì)素釋放因子激活垂體前葉的促皮質(zhì)激素細(xì)胞上的促腎上腺皮質(zhì)素釋放因子受體，導(dǎo)致將促腎上腺皮質(zhì)素(ACTH)釋放到血流中。AVTH進(jìn)而激活腎上腺皮質(zhì)中的ACTH受體而增加糖皮質(zhì)激素的合成和釋放(1)。
CRFR1和CRFR2(CRF的受體)遍布于CNS及外周組織。雖然CRF對CRFR1的親和力比對CRFR2的親和力高，但認(rèn)為尿皮質(zhì)素(urocortin)(一種UCN)(CRF相關(guān)肽)是CRFR2的內(nèi)源性配體，因為它比CRF的親和力幾乎高40倍(2)。CRFR1和CRFR2有約71％氨基酸序列類似，且它們在腦和外周組織中定位不同(3-6)。CRFR1主要在垂體、皮質(zhì)、小腦、菱腦和嗅球中表達(dá)，而CRFR2見于中隔旁側(cè)、下丘腦室內(nèi)側(cè)(VMH)、脈絡(luò)叢和許多外周部位(5，7，8)。CRFR2有一些同種型，其中有一種顯示不結(jié)合任何已知配體(9)。
CRFR1缺陷型小鼠具有降低的HPA軸激素水平、對損傷的應(yīng)激反應(yīng)和降低的焦慮樣表現(xiàn)(10，11)。這些結(jié)果與體內(nèi)用CRFR1特異性拮抗劑得到的那些結(jié)果相一致(12-14)。相反，CRFR2特異性拮抗劑最近還沒有獲得，因為從其1995年克隆以來，對CRFR2的生理功能幾乎沒有多少闡明。UCN可能是CRFR2的內(nèi)源性配體，并顯示出當(dāng)中樞進(jìn)食時是給藥的調(diào)節(jié)劑(15)。因為CRFR2位于下丘腦室內(nèi)側(cè)(攝食調(diào)節(jié)和腹飽滿的中心位置)，尿皮質(zhì)素對這些受體的作用可能影響攝食。另外，外周給予尿皮質(zhì)素會導(dǎo)致低血壓(2，16)，這可能是由于CRFR2在血管系統(tǒng)中的作用引起的(5，8)。
現(xiàn)有技術(shù)的不足是缺少促腎上腺皮質(zhì)素釋放因子受體-2缺陷型小鼠。本發(fā)明滿足了本領(lǐng)域中這一長期存在的需要和愿望。
發(fā)明概述為了剖析CRFR2的發(fā)育和生理作用，本發(fā)明制備了CRFR2突變裸鼠并對其進(jìn)行分析。CRFR2缺陷型小鼠表現(xiàn)出增加的焦慮樣行為和對應(yīng)激反應(yīng)的超敏性HPA軸。CRFR1和CRFR2突變小鼠了提供焦慮和抑郁的有價值的模型，并能進(jìn)一步幫助說明這些疾病的分子機理。對促腎上腺皮質(zhì)素釋放因子信號途徑及其在焦慮和抑郁控制中的作用的研究，可能為有效治療這些疾病提供必需的線索。
因此，本發(fā)明涉及在至少一個促腎上腺皮質(zhì)素釋放因子受體2(CRFR2)的等位基因被破壞的一種非天然性轉(zhuǎn)基因小鼠，所述的小鼠不能從所述的等位基因表達(dá)促腎上腺皮質(zhì)素釋放因子受體2蛋白質(zhì)。較佳地，所述的促腎上腺皮質(zhì)素釋放因子受體2等位基因的外顯子10、11和12的DNA序列已缺失?？捎眯旅顾乜剐曰蚝兄脫Q轉(zhuǎn)基因小鼠的這些DNA序列。這種轉(zhuǎn)基因小鼠對此種置換可以是雜合性或純合性小鼠。在本發(fā)明的實施例中還包括本發(fā)明小鼠與另一品系小鼠之間交配的后代。
本發(fā)明的另一實施例是將CRFR2缺陷型小鼠運用于研究焦慮或抑郁并測試某化合物對焦慮和抑郁的作用。例如，提供一種篩選具有焦慮調(diào)節(jié)活性的化合物的方法，所述的方法包括a)將所述的化合物給予本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因小鼠；b)測試所述小鼠的焦慮相關(guān)行為；和c)比較所述小鼠與本發(fā)明另一種轉(zhuǎn)基因小鼠(未給予所述的化合物)的焦慮樣行為。另外，還提供了一種篩選具有抑郁調(diào)節(jié)活性的化合物的方法，所述的方法包括如下步驟a)將所述的化合物給予本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因小鼠；b)測試小鼠的抑郁相關(guān)行為；和c)比較所述小鼠與本發(fā)明的另一種轉(zhuǎn)基因小鼠(未給予所述化合物)的抑郁樣行為。
本發(fā)明的另一實施例中包括以類似的流程用CRFR2缺陷型小鼠篩選能影響血壓或血管生成的化合物。
本發(fā)明的另一實施例是將CRFR2缺陷型小鼠運用于對PHA軸的生理學(xué)研究，如一種篩選對下丘腦-垂體-腎上腺軸應(yīng)激反應(yīng)有影響的化合物的方法，其包括如下步驟a)將所述的化合物給予本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因小鼠；b)將所述的小鼠置于誘導(dǎo)應(yīng)激的條件中；c)監(jiān)測所述小鼠的皮質(zhì)酮和促腎上腺皮質(zhì)激素的血漿水平；和d)將所述的水平與未被置于所述誘導(dǎo)應(yīng)激條件中的本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因小鼠的相比較。
在本發(fā)明的另一實施例中，通過監(jiān)測促腎上腺皮質(zhì)素和ACTH的血漿水平，可用此小鼠來研究某化合物對HPA軸對應(yīng)激反應(yīng)的影響。
本發(fā)明的另一實施例涉及用本發(fā)明的小鼠來研究促腎上腺皮質(zhì)素釋放因子受體2對其它蛋白質(zhì)如促腎上腺皮質(zhì)素釋放因子和尿皮質(zhì)素的影響。
在本發(fā)明的另一實施例中，用CRFR2缺陷型小鼠來檢驗CRFR1的反應(yīng)不受存在CRFR2的妨礙。
本發(fā)明的另一實施例是對CRFR2刺激或抑制血管生成活性的調(diào)控。
附圖簡述通過參見本申請中包括的附圖的某些實施例可以更詳細(xì)地了解本發(fā)明上述的特征，優(yōu)點和目的也會更清楚。這些圖是說明書的一個組成部分。需要指出的是，附圖是用來說明本發(fā)明的優(yōu)選實施例的，不能視為對本發(fā)明范圍的限制。


圖1A-1E顯示了產(chǎn)生CRFR2-缺陷型小鼠、對突變小鼠及其中影響檢測所用的流程。圖1A是CRFR2基因的基因組結(jié)構(gòu)圖示，顯示編碼第5跨膜區(qū)域到第7跨膜區(qū)域末端的一半的外顯子10、11和12的缺失。還顯示了用于同源重組的靶構(gòu)建物。在圖1B中，通過Southern印跡分析分離自野生型(+/+)、雜合型(+/-)和裸突變(-/-)小鼠分離的尾部DNA，檢測到被破壞的等位基因。圖1C顯示了在CRFR2對照(上部)和突變(下部)小鼠中，125I-蛙皮降壓肽結(jié)合的放射自顯影的結(jié)果。注意，在CRFR2突變小鼠中隔旁側(cè)中沒有CRFR2結(jié)合，而CRFR1皮質(zhì)結(jié)合與對照小鼠的類似。圖1D顯示了用蘇木精和曙紅(H&E)染色的腎上腺。注意10X放大倍數(shù)顯示的腎上腺尺寸(上圖)或20X放大倍數(shù)顯示的結(jié)構(gòu)(下圖)沒有差異，C，皮質(zhì)；M，髓質(zhì)；ZG，球狀帶；ZF，束狀帶；ZR，網(wǎng)狀帶；n＝8。圖1E顯示垂體的H&E染色，是固定在肝上進(jìn)行組織切片(上圖)(4X放大倍數(shù))，n＝8。10X放大倍數(shù)，用抗-ACTH抗體(20)(下圖)鑒定垂體促皮質(zhì)激素細(xì)胞，n＝5，P，后葉，I，中葉；A，前葉。垂體或促皮質(zhì)激素細(xì)胞定位或ACTH的表達(dá)水平?jīng)]有觀察到解剖學(xué)差異。
圖2A-2D顯示了突變動物中HPA軸對應(yīng)激的超敏性。*＝相同時間點與野生型對照有顯著性差異，p＜0.01(Scheffe-后hoc檢驗)。用未麻醉的眼眶后眼睛放血得到血漿。圖2A顯示了在700AM受應(yīng)激前ACTH的血漿水平，n＝16。圖2B顯示了700AM和500PM時的皮質(zhì)酮血漿基礎(chǔ)水平，n＝7。圖2C顯示了約束應(yīng)激對ACTH作用的時間過程。圖2D顯示了突變裸鼠在700AM時的皮質(zhì)酮血漿水平與相同時間點的野生型對照存在顯著性差異，n＝7。
圖3A-3B顯示了停止野生型和突變型同窩鼠仔攝食24小時的影響。圖3A顯示，用Scheffe后-hoc檢驗，與野生型一窩鼠仔相比，基礎(chǔ)攝食和停止攝食24小時后突變型小鼠的食物消耗情況(n＝10)，p＜0.001。圖3B顯示了野生型和突變型小鼠的重量，基礎(chǔ)(白色柱)重量和停止攝食后再喂食24小時后的重量(黑色柱)。注意組間基礎(chǔ)體重或再喂食后體重間沒有顯著性差異。
圖4A-4H顯示在上升的加號迷宮(elevated plus maze)和敞開測試中突變型動物的焦慮樣行為增加。圖4A顯示雄性小鼠花費在敞開臂的時間百分比(**，p＜0.005)和訪問這些敞開臂的次數(shù)(*，p＜0.02)突變小鼠的比野生型對照明顯少(對照n＝7，突變＝7，平均值±SEM)。圖4B顯示用雌性小鼠進(jìn)行的與圖4A相同的測試。花費在敞開臂的時間百分比(**，p＜0.03)和訪問這些敞開臂的次數(shù)(*，p＜0.03)突變小鼠的比野生型對照明顯少(對照n＝9，突變＝12，平均值±SEM)。圖4C和4D顯示對照和突變動物之間的運動能力沒有差異(圖4C，雄性小鼠；圖4D，雌性小鼠)，通過總的封閉臂的進(jìn)入數(shù)和總的臂進(jìn)入數(shù)測定。圖4E顯示在明/暗盒實驗中對于花費在盒明亮部分的時間所測定的焦慮樣行為沒有發(fā)現(xiàn)差異。圖4F顯示在明/暗實驗中，對于明亮和黑暗部分變遷的次數(shù)所測定的焦慮樣行為沒有發(fā)現(xiàn)差異。圖4G顯示花費在敞開區(qū)域裝置的內(nèi)部區(qū)域的時間(*，p＜0.05)。圖4H顯示在內(nèi)部區(qū)域發(fā)生的總交叉的存在情況(**，p＜0.01；對照，n＝5；突變，n＝7；平均值±SEM)。
圖5A-5E顯示突變鼠腦中尿皮質(zhì)素和CRF mRNA水平增加。圖5B到5E中，所有數(shù)據(jù)都是經(jīng)Fischer的PLSD后-hoc檢驗的突變和野生型小鼠(n＝3)的平均值±SEM，*，p＜0.05；**，p＜0.01；***，p＜0.005。圖5A顯示20X放大倍數(shù)，嘴側(cè)EW(上圖)中尿皮質(zhì)素mRNA，cAmyg(中圖)中CRF mRNA和下丘腦旁核(下圖)原位雜交(10X放大倍數(shù))得到的銀顆粒。圖5B顯示對銀顆粒的半定量分析，用以確定嘴側(cè)EW中表達(dá)尿皮質(zhì)素mRNA的細(xì)胞數(shù)量。圖5C顯示每個細(xì)胞的尿皮質(zhì)素mRNA的平均光學(xué)密度。圖5D顯示了cAmyg中CRF mRNA的光學(xué)密度。圖5E顯示下丘腦旁核中CRF mRNA的光學(xué)密度。
圖6顯示了野生型(n＝5)和突變型小鼠(n＝3)(黑色柱)對靜脈內(nèi)灌注1.0μg尿皮質(zhì)素的心血管反應(yīng)。發(fā)現(xiàn)突變小鼠對尿皮質(zhì)素的注射明顯沒有反應(yīng)。***p＜0.005。在從UCN灌注的動脈壓恢復(fù)后，CRFR2突變小鼠還接收第二次灌注硝普鈉(在100μl 0.9％鹽水中含0.8μg)(白色柱)。由血壓圖確定平均動脈壓(MAP)。
發(fā)明詳述根據(jù)本發(fā)明，可在本領(lǐng)域技能中采用常規(guī)分子生物學(xué)，微生物學(xué)，和DNA重組技術(shù)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中有充分闡述，參見如，Maniatis，F(xiàn)ritsch & Sambrook，＂分子克隆實驗室手冊(1982)；＂DNA CloningA Practical Approach，＂卷I和II(D.N.Glover編輯，1985)；＂寡核苷酸的合成＂(M.J.Gait編輯，1984)；＂核酸的雜交＂[B.D.Hames & S.J.Higgins編輯(1985)]；＂轉(zhuǎn)錄和翻譯＂[B.D.Hames & S.J.Higgins編輯，(1984)]；＂動物細(xì)胞培養(yǎng)＂[R.I.Freshney編輯(1986)]；＂固定細(xì)胞和酶＂[IRLPress，(1986)]；B.Perbal，＂分子克隆的實用指南＂(1984)。
由此，如果在本文出現(xiàn)，下列術(shù)語的具有如下定義。
本文所用的術(shù)語“cDNA”指基因mRNA轉(zhuǎn)錄的DNA拷貝。
本文所用的術(shù)語“篩選某文庫”指用有標(biāo)記的探針在適當(dāng)?shù)臈l件下來檢驗特定的DNA文庫中是否存在與該探針互補的序列的過程。另外，“篩選某文庫”也可用PCR進(jìn)行。
本文所用的術(shù)語“PCR”指Mullis的美國專利No.4,683,195和4,683,202中以及本領(lǐng)域已知的其它改進(jìn)中的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。
本文所述的氨基酸指“L”異構(gòu)形式。但只要該多肽能維持免疫球蛋白-結(jié)合所需的功能特性時，“D”異構(gòu)形式的殘基可替代任何L-氨基酸殘基。NH2指多肽氨基端存在的氨基。COOH指存在于羧基端的游離羧基。為了保證標(biāo)準(zhǔn)多肽名稱，J Biol.Chem，2433552-59(1969)，氨基酸殘基的縮寫是本領(lǐng)域已知的。
需要指出本文所有氨基酸殘基序列都是以左端向右端取向為氨基-端到羧基-端的常規(guī)方向所表示的公式。另外，要指出的是在氨基酸殘基序列起頭或末端的破折號表示結(jié)合于另一個或多個氨基酸殘基序列的肽。
“復(fù)制子”是一種基因元件(如質(zhì)粒、染色體、病毒)在體內(nèi)起到DNA復(fù)制的自主單位作用；即能在其自身的控制下復(fù)制。
“載體”是一種復(fù)制子，如質(zhì)粒、噬菌體和粘粒，另一條DNA節(jié)段可與其結(jié)合，從而引起該結(jié)合節(jié)段的復(fù)制。
“DNA分子”指聚合形式的脫氧核糖核苷酸(腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、或胞嘧啶)，無論是單鏈形式還是雙鏈螺旋形式。這一術(shù)語只指分子的一級和二級結(jié)構(gòu)，并不將它限制于任何特定的三級形式。所以，此術(shù)語本身包括在線性DNA分子(如限制片段)，病毒，質(zhì)粒和染色體中發(fā)現(xiàn)的雙鏈DNA。在論述時，結(jié)構(gòu)按常規(guī)僅給出DNA非轉(zhuǎn)錄鏈的5’到3’方向的序列(即，具有與mRNA同源序列的鏈)。
“復(fù)制起點”指的是參與DNA合成的DNA序列。
DNA“編碼序列”是雙鏈DNA序列，當(dāng)其置于合適的調(diào)控序列的控制下時，在體內(nèi)被轉(zhuǎn)錄并翻譯成多肽。5′(氨基)末端的起始密碼子和3′(羧基)末端的翻譯終止密碼子確定了編碼序列的邊界。編碼序列可包括，但不限于原核序列、來自真核生物mRNA的cDNA、真核生物(如哺乳動物)DNA的基因組DNA序列和甚至合成的DNA序列。聚腺苷酸信號和轉(zhuǎn)錄終止序列通常位于編碼序列的3′端。
轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列是DNA調(diào)控序列，如啟動子、增強子、聚腺苷酸信號、終止子等，提供了編碼序列在宿主細(xì)胞中的表達(dá)。
“啟動子序列”是能在細(xì)胞中結(jié)合RNA聚合酶，并引發(fā)下游(3′方向)編碼序列轉(zhuǎn)錄的DNA調(diào)控區(qū)。為了本發(fā)明的定義，啟動子序列的邊界在其3′端為轉(zhuǎn)錄起始位點，并向上游(5′方向)延伸包括引發(fā)超過背景的可檢測水平的轉(zhuǎn)錄所必需的最小數(shù)目的堿基或元件。在啟動子序列中，可找到一轉(zhuǎn)錄起始位點，和蛋白結(jié)合域(共有序列)，負(fù)責(zé)結(jié)合RNA聚合酶。真核啟動子常常，但不總是含有“TATA”盒和“CAT”盒。原核啟動子含有Shine-Dalgarno序列和-10和-35共有序列。
“表達(dá)控制序列”是控制和調(diào)節(jié)另一DNA序列轉(zhuǎn)錄和翻譯的DNA序列。當(dāng)編碼序列在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列的“控制下”，RNA聚合酶將編碼序列轉(zhuǎn)錄成mRNA，然后翻譯成該編碼序列所編碼的蛋白質(zhì)。
“信號序列”可包括在編碼序列附近。該序列編碼信號肽，該多肽的N-末端，與宿主細(xì)胞聯(lián)系，指引該多肽到細(xì)胞表面或?qū)⒃摱嚯姆置诘脚囵B(yǎng)基中，而且在蛋白離開細(xì)胞前，宿主細(xì)胞將此信號肽切下。可發(fā)現(xiàn)信號序列與各種原核和真核生物天然的蛋白相連接。
本文所用的術(shù)語“寡核苷酸”指本發(fā)明的探針，定義為含有兩和多個，優(yōu)選三個以上脫氧核糖核苷酸的分子。它的確切大小取決于許多因素，這些因素進(jìn)而又取決于該寡核苷酸的最終功能和用途。
本文所用的術(shù)語“引物”指一條寡核苷酸，不論是天然的純化的限制性消化物，或是合成產(chǎn)生的，當(dāng)將其置于引物延伸產(chǎn)物合成的條件下，能作為合成起始點。在存在核苷酸和誘導(dǎo)劑，如DNA聚合酶和合適溫度和pH下，合成的引物延伸產(chǎn)物與一核酸鏈互補。引物可以是單鏈或雙鏈，而且必須足夠長，以在誘導(dǎo)劑存在下引發(fā)所需延伸產(chǎn)物的合成。引物的確切長度將取決于許多因素，包括溫度、引物來源和使用的方法。例如，對于診斷用途，由靶序列的復(fù)雜程度而定，寡核苷酸引物通常含有15-25個或更多的核苷酸，雖然它可含有較少的核苷酸。
本文選擇的引物與具體靶DNA序列的不同鏈“基本上”互補。這意味著引物必須是充分互補，以與它們各自鏈雜交。因此，引物序列不需要反映模板的確切序列。例如，可將非互補的核苷酸片段與引物的5′末端結(jié)合，而引物剩余的序列和該鏈互補。另外，可將非互補堿基或較長的序列分散在引物中，只要引物序列與該序列充分互補或與其雜交，從而形成延伸產(chǎn)物合成的模板。
本文所用的術(shù)語“限制性內(nèi)切酶”和“限制性酶”指能在特定核苷酸序列處或附近切割雙鏈DNA的酶。
用外源或異源DNA“轉(zhuǎn)化”細(xì)胞，當(dāng)這樣的DNA被引入細(xì)胞時。轉(zhuǎn)化的DNA可以或可以不整合(共價連接)入細(xì)胞基因組。在例如原核生物、酵母和哺乳動物細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化的DNA可維持在附加型元件，如質(zhì)粒上。對于真核細(xì)胞，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞是一種其中轉(zhuǎn)化DNA整合在染色體內(nèi)，從而通過染色體復(fù)制被子代細(xì)胞繼承的細(xì)胞。這種穩(wěn)定性可由真核細(xì)胞建立一群含有該轉(zhuǎn)化DNA的子代細(xì)胞的細(xì)胞系或克隆的能力所證實?！翱寺　笔怯梢粋€細(xì)胞或一個祖先通過有絲分裂產(chǎn)生的一群細(xì)胞?！凹?xì)胞系”是能在體外穩(wěn)定生長許多代的一原代細(xì)胞的克隆。
通常，含有啟動子序列的表達(dá)載體是與宿主配合使用的，其中啟動子序列能促進(jìn)插入的DNA片段有效轉(zhuǎn)錄。表達(dá)載體典型的包含復(fù)制起點，啟動子，終止子，以及那些能在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中提供表型選擇的特定基因。被轉(zhuǎn)化的宿主可以按本領(lǐng)域已知的方法發(fā)酵和培養(yǎng)，以達(dá)到最佳細(xì)胞生長。
可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法構(gòu)建含有合適轉(zhuǎn)錄和翻譯控制信號的表達(dá)載體。參見如，Sambrook等人，1989，分子克隆實驗手冊(第二版)Cold Spring，Harbor Press，N.Y.所述的技術(shù)。如果轉(zhuǎn)錄控制序列有效地控制了某基因的轉(zhuǎn)錄，該基因及其轉(zhuǎn)錄控制序列就定義為已被“可操縱性連接”。本發(fā)明的載體包括但不限于，質(zhì)粒載體和病毒載體。
本發(fā)明涉及制備CRFR2缺陷型小鼠，用它來研究CRFR2在焦慮和HPA軸環(huán)路中的發(fā)育和生理作用。這通過刪除促腎上腺皮質(zhì)素釋放因子受體2的外顯子10、11和12進(jìn)行。在本發(fā)明中，用新霉素抗性基因盒替代這些序列。這些小鼠可以是CRFR2缺陷的雜合或純合性小鼠或者是與另一品系小鼠雜交的。
本發(fā)明還涉及將CRFR2缺陷型小鼠運用于焦慮或抑郁的研究中，包括測試化合物對焦慮和抑郁調(diào)節(jié)作用的方法。也可用CRFR2來篩選能影響血壓和血管生成的化合物。
本發(fā)明還涉及將CRFR2缺陷型小鼠運用于對下丘腦-垂體-腎上腺(PHA)軸的生理學(xué)研究?？捎么诵∈髞頊y試某化合物對HPA軸對應(yīng)激反應(yīng)的作用。
本發(fā)明還涉及用該轉(zhuǎn)基因小鼠來研究促腎上腺皮質(zhì)素釋放因子受體2對促腎上腺皮質(zhì)素釋放因子、促腎上腺皮質(zhì)素釋放因子受體1、尿皮質(zhì)素和其它CRF和尿皮質(zhì)素受體的分子功能。
另外，還可用本發(fā)明來研究CRFR1在CRFR2陰性條件下的反應(yīng)和活性。以這種方法，可在不受CRFR調(diào)節(jié)的阻礙下研究CRFR1應(yīng)答。
本發(fā)明還涉及用CRFR2活性的促效劑或拮抗劑來刺激或抑制血管生成。能刺激CRFR2活性的促效劑在癌癥治療中可用于抑制血管的生成。
以下的實施例的給出是為了說明本發(fā)明的各種具體實施方案，并不意味著以任何方式限定本發(fā)明。
實施例1CRFR2缺陷型小鼠的產(chǎn)生為了構(gòu)建CRFR2突變裸鼠，從小鼠品系129的基因組DNA文庫分離得到含有CRFR2基因座的基因組克隆DNA。由此克隆構(gòu)建了尋靶載體，將其中編碼起始于第5跨膜區(qū)域到第七跨膜區(qū)域末端的CRFR2基因的外顯子10、11和12用新霉素抗性基因盒置換(圖1A)。用Not I將得到的質(zhì)粒DNA線性化，并電穿孔進(jìn)入J1胚胎干細(xì)胞(ES)中，方法如(10)所述。在0.2mg/ml G418(活性形式)中篩選7-9天后，分別選出新霉素抗性的克隆，并用Southern印跡分析篩選存在CRFR2等位基因被破壞的那些克隆。
將陽性ES克隆注射入C57BL/6胚泡產(chǎn)生嵌合小鼠。將嵌合性雄鼠與嵌合性雌鼠雜交，生成C57BL/6-129混合背景小鼠。用Southern分析自F1幼鼠(表現(xiàn)出雌鼠毛色)收集的尾DNA來檢測遭破壞的等位基因的種系的傳代(圖1B)。
實施例2分析CRFR1和CRFR2在CRFR2缺陷型小鼠中的表達(dá)為了確定靶缺失是否導(dǎo)致CRFR2基因的裸突變，對野生型對照和突變型動物的腦切片進(jìn)行了受體放射自顯影。
在室溫中解凍含有20μm切片的腦組織玻片，并室溫用50mM Tris緩沖液(pH 7.4)洗滌2次10分鐘。然后在含有50mM Tris(pH 7.4)、125I-蛙皮降壓肽、10mM MgCl2、0.1％BSA、和0.05％桿菌肽素的緩沖液中室溫培養(yǎng)60分鐘。蛙皮降壓肽是一種CRF相關(guān)肽，并是CRF受體的促效劑。在與125I-蛙皮降壓肽和1μm冷蛙皮降壓肽接觸的相鄰切片中探測到非特異性結(jié)合。培養(yǎng)后，用加有0.01％Triton X-100的50mM Tris緩沖液，4℃洗滌這些玻片2次，各5分鐘。將這些玻片迅速浸泡在去離子水中、干燥并放置成膜3天。
在突變小鼠中，沒有檢測到腦區(qū)域與CRFR2的特異性結(jié)合，而在皮質(zhì)中保持了與CRFR1的結(jié)合。這些結(jié)果表明CRFR2基因的破壞導(dǎo)致這些小鼠的裸突變。繁殖這些突變型小鼠，并以Mendelian方式使突變等位基因傳代。
實施例3對CRFR2缺陷型小鼠的組織學(xué)分析為了確定CRFR2缺陷型小鼠是否有HPA軸的發(fā)育不全，將10-12周齡雄鼠的垂體和腎上腺切片，并用蘇木精和曙紅(H&E)染色。簡單地說，用4％多聚甲醛(PFA)灌注小鼠。取出組織，4℃后固定過夜，并在30％蔗糖的PBS溶液中冷凍。將組織切片成12μm的厚度，并用蘇木精和曙紅染色。結(jié)果顯示結(jié)構(gòu)或細(xì)胞類型沒有明顯差異(圖1D-1E)。
另外，用抗ACTH抗體染色垂體切成片。將垂體切片，在4％PFA中后固定5分鐘，用PBS漂洗，并如(10)所述用ACTH抗體染色。在野生型和突變型促皮質(zhì)激素細(xì)胞之間沒有觀察到質(zhì)的差異(圖1E)。
實施例4測定CRFR2缺陷型小鼠的皮質(zhì)酮和ACTH水平為了進(jìn)行皮質(zhì)酮和ACTH分析，從單獨關(guān)養(yǎng)的10-12周齡的雄性小鼠采集血漿。收集非麻醉動物眼眶后眼血得到樣品，在籠中干擾30秒。在700AM收集基礎(chǔ)AM樣品。皮質(zhì)酮試驗(ICN Biomedicals，Dosta Mesa，CA)使用5μl血漿，ACTH試驗(Nichols Institute Diagnostics，San Juan Carpistrano，CA)使用50μl血漿(用放射免疫試驗試劑盒作一式兩份測定)。找到了突變和對照動物的ACTH和皮質(zhì)酮的正常基礎(chǔ)水平(圖2A-2B)，這與圖1E(腦中ACTH的水平未受影響)相一致。
實施例5CRFR2缺陷型小鼠中對HPA軸應(yīng)激反應(yīng)的影響為了檢驗HPA軸對應(yīng)激的反應(yīng)，使動物經(jīng)受生理性約束-應(yīng)激一段加長的時間。動物在50ml錐形試管(帶可除去底部的塑料錐形管)中經(jīng)受約束應(yīng)激2、5或10分鐘后立即采集血樣。每只小鼠只放血一次。立即離心血漿樣品，并存儲在-20℃直到進(jìn)行試驗。皮質(zhì)酮試驗(ICN Biomedicals，Dosta Mesa，CA)使用5μl血漿，ACTH試驗(Nichols Institute Diagnostics，San Juan Carpistrano，CA)使用50μl血漿(用放射免疫試驗試劑盒作一式兩份測定)。
在約束后10分鐘對照動物的ACTH水平達(dá)到頂峰。相反，突變動物的ACTH水平顯著升高，僅在約束應(yīng)力作用后2分鐘就達(dá)到高峰(圖2C)。類似地，在約束后2分鐘突變動物的皮質(zhì)酮水平也明顯升高，而對照動物的水平在約束后5分鐘才增加(圖2D)。這些結(jié)果表明突變小鼠HPA軸對應(yīng)激有超敏反應(yīng)性。
實施例6CRFR2缺陷型小鼠對食物缺乏敏感由于CRFR2在VMH中很豐富，而且已有的研究表明尿皮質(zhì)素有降低食欲作用，故測定了突變和野生型幼鼠的基礎(chǔ)攝食和體重增加。
測定單獨關(guān)養(yǎng)的12-16周齡雄性幼鼠的基礎(chǔ)攝食。每天在0900稱重小鼠和它們的食物顆粒。在食物缺乏的實驗中，將對照和匹配的突變型同窩仔鼠各自關(guān)養(yǎng)，并確定它們的基礎(chǔ)攝食和體重。在1200開始不給小鼠食物24小時，但任意給水。在停止給食后，稱重小鼠，并給予預(yù)稱重的飼料顆粒。然后每2個小時稱重飼料顆粒直到關(guān)燈(1800)。在第二天上午對飼料顆粒和小鼠再次稱重。記錄停止給予飼料過程中體重的減輕、以及在停止給飼料后的24小時食物的總消耗和體重的增加。CRFR2突變(mut)雄性小鼠與野生型(wt)對應(yīng)同窩仔鼠的基礎(chǔ)攝食和體重增加相類似(24小時基礎(chǔ)食物消耗wt＝4.3±0.24g，mut＝4.6±0.23g；體重wt＝21.7±0.66g，mut＝21.2±0.50g；n＝10，平均值±SEM)。
為了確定應(yīng)力刺激是否改變突變動物的攝食，停止給予對照和突變小鼠食物24小時，然后再喂食，測定它們的攝食和體重變化。停給飼料的結(jié)果顯示在停給飼料后24小時突變小鼠的攝食顯著減少(圖3A)。在停給飼料后24的小時突變小鼠消耗的飼料水平是野生型小鼠的75％。但突變型和野生型小鼠的體重在停給飼料或再喂食后都沒有顯著的差異(圖3B)。
實施例7評估CRFR2缺陷型小鼠在上升的加號迷宮中的焦慮樣行為由于CRFR1突變小鼠表現(xiàn)出抗焦慮樣行為(10)，用三種不同的測試示例以類似試驗分析了CRFR2突變小鼠。在第一個測試示例中，用上升的加號迷宮(EPM)評估對照和突變動物。在該實驗中使用了22-24周齡之間的雄性和雌性小鼠。將野生型同窩出生的幼鼠作為對照。將動物分組關(guān)養(yǎng)，并保持在規(guī)律性的明/暗(600AM開燈，600PM關(guān)燈)條件中，并在測試前1周隔天進(jìn)行。
用黑色有機玻璃制成加號迷宮(plus maze)裝置，有兩個敞開的臂(30×5cm)和兩個相同尺寸的封閉臂(墻高30cm)。它距地面高30cm。這些臂連接于一中心廣場(5×5cm)，因此迷宮形成一個加號。在此裝置上安置的25瓦燈為敞開的臂提供6勒克斯光水平。所有測試都是在明亮-黑暗循環(huán)中的明亮?xí)r期進(jìn)行的。在行為測試前1個小時，讓小鼠習(xí)慣實驗室的條件，并以5分鐘的間隔分別測試各個對象。
將各只小鼠置于中心平臺并面對敞開臂，開始測試。進(jìn)入敞開和封閉臂的次數(shù)和在迷宮各區(qū)域所花費的時間為行為分?jǐn)?shù)。臂的進(jìn)入定義為四只爪子都進(jìn)入該臂。將進(jìn)入封閉臂的次數(shù)作為在加號迷宮中運動活性的指數(shù)。固定在該裝置上部的照相機使得能在安置在隔壁房間的視頻監(jiān)視器上觀察動物的行為。在測試結(jié)束時，將進(jìn)入次數(shù)和在敞開臂上花費的時間分別表達(dá)為占臂進(jìn)入總次數(shù)的百分比和占總測試時間的百分比。以平均值±平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差表示結(jié)果。用Student t檢驗分析自EPM測試得到的行為參數(shù)。
結(jié)果顯示雄性和雌性CRFR2突變小鼠比野生型對照小鼠花費在進(jìn)入加號-迷宮裝置的敞開臂的時間少，且頻率也低。發(fā)現(xiàn)雄性和雌性小鼠進(jìn)入敞開臂的百分比有顯著的影響(圖4A和4B)。焦慮樣行為的增加不是由改變的運動活性引起的，因為兩組間在封閉臂中的總體活動和臂進(jìn)入總數(shù)上沒有差異(圖4C和4D)。這些結(jié)果表明CRFR2突變小鼠表現(xiàn)出顯著增加的焦慮樣行為。
實施例8評估CRFR2缺陷型小鼠在明/暗盒中的焦慮樣行為還分析了CRFR2缺陷型突變小鼠和對照小鼠在明/暗盒中的焦慮樣行為。將長方形、有機玻璃盒分成兩個區(qū)室，一個涂成白色(28.5cm×27cm)，另一個涂成黑色(14.5×27.0cm)。用紅色有機玻璃蓋覆蓋的黑色區(qū)室內(nèi)的光密度為8勒克斯，白色區(qū)室內(nèi)為400勒克斯，兩區(qū)室通過一個位于分隔中心地面水平的開口(7.5cm×7.5cm)相連通。所有測試都在循環(huán)中的黑暗時期進(jìn)行，即在1900和2100間。各只動物測試10分鐘，將其置于白色區(qū)域的中央，記錄其在這兩個區(qū)室間移動的次數(shù)和在白色區(qū)域花費的時間。固定在該裝置上部的照相機使得能在安置在隔壁房間的視頻監(jiān)視器上觀察動物的行為。
明/暗盒得到的結(jié)果表明CRFR2突變小鼠花費在盒明亮部分的時間和在盒明亮與黑暗區(qū)室間的轉(zhuǎn)移次數(shù)與對照小鼠的相同(圖4E和4F)。在本實驗中這兩組間沒有顯著性差異。
實施例9評估CRFR2缺陷型小鼠在敞開區(qū)域測試中的焦慮樣行為還分析了CRFR2突變小鼠和對照小鼠在敞開區(qū)域裝置中的焦慮樣行為。此敞開區(qū)域裝置是由在底部涂成16個方塊(12×12cm)(外部12個，內(nèi)部4個)的白色有機玻璃盒(50×50×22cm)組成的。照向底部中央的燈向底部提供了120勒克斯的照明。在明亮-黑暗循環(huán)的黑暗期進(jìn)行測試，室內(nèi)的背景噪聲恒定為52dB。將各只小鼠置于裝置的中央，開始進(jìn)行10分鐘的測試。由視頻記錄器定量測定花費在內(nèi)部方塊中的時間(秒)、走動(穿過的方塊數(shù))、排便(糞團(tuán)量fecalboli)、直立(rearing)和梳理皮毛(grooming)(秒)所花費的時間。以走動次數(shù)的百分比表達(dá)穿過內(nèi)部方塊的次數(shù)。敞開區(qū)域測試的結(jié)果表明CRFR2突變小鼠比野生型小鼠花費在內(nèi)部方塊的時間少且穿過的頻率低(圖4G和H)。在兩組的走動、起立、排便或梳理皮毛上沒有差異(沒有顯示數(shù)據(jù))。
實施例10CRFR2缺陷對其它基因表達(dá)的影響由于在HPA軸的組成中未檢測到明顯的解剖學(xué)缺陷(圖1D和1E)，突變動物在應(yīng)力和行為反應(yīng)中的變化就可能是由于CRF信號途徑中其它成分基因表達(dá)的變化引起的。為了研究這種可能性，用原位雜交檢驗UCN、CRF和CRFR1mRNA的表達(dá)。
按(36)所述的方法進(jìn)行原位雜交。簡單地說，將組織切片(20μm)在4％多聚甲醛中固定，以PBS漂洗，浸泡在乙酸酐中，用一系列梯度乙醇脫水，在氯仿中脫脂，并再次脫水。然后在55℃的潮濕培養(yǎng)箱中，使玻片與35S-標(biāo)記的核糖探針(50％去離子的甲酰胺雜交混合物中)雜交過夜。培育后，室溫邊振蕩邊用1X SSC洗滌這些玻片30分鐘，37℃用20μg/ml RNase(Promega)處理30分鐘，室溫在1X SSC緩沖液中漂洗30分鐘，65℃邊振蕩邊用0.1X SSC洗滌20分鐘3次，室溫以0.1X SSc漂洗30分鐘，用系列梯度乙醇脫水，風(fēng)干，并置于Kodak超感光膜(Eastman Kodak，Rochester，NY)上3天。
膜顯影后，將載玻片浸泡在NTB2液態(tài)核乳膠(Eastman Kodak；用水1∶1稀釋)中，曝光10天，進(jìn)行照片加工，用蘇木精染色計數(shù)，并蓋上蓋玻片。用影像分析系統(tǒng)Image Pro Plus(Media Cybernetics，Silver Spring，MD)分析載玻片。在PVN和cAmyg的分析中，用圓形工具(面積＝3022像素)來測定各切片的平均光密度，從而比較各動物相同的PVN和cAmyg區(qū)域相匹配切片的解剖學(xué)圖。表達(dá)尿皮質(zhì)素的EW細(xì)胞胞體太分散以至于不能用標(biāo)準(zhǔn)光密度方法分析。因此，使用這些參數(shù)，通過預(yù)先確定的除非陽性細(xì)胞和背景銀顆粒處的顏色和細(xì)胞大小，讓計算機來測定在所指定的表達(dá)最小光密度的EW中的細(xì)胞數(shù)。然后計算由計算機確定為尿皮質(zhì)素mRNA陽性的各個細(xì)胞的光密度。再比較各切片的平均光密度和細(xì)胞數(shù)。
如圖5A所示，在動眼神經(jīng)副核(Edinger Westphal)(EW)的嘴側(cè)區(qū)域中尿皮質(zhì)素mRNA明顯增加，突變動物中每個細(xì)胞中的尿皮質(zhì)素mRNA(圖5C)密度和細(xì)胞表達(dá)的數(shù)量都增加。顯示在突變裸鼠的扁桃體(amygdala)中央核(cAmyg)，CRF mRNA明顯增加(圖5A & 5D)。在基本未受應(yīng)激作用動物的PVN中沒有檢測到CRF mRNA顯著變化(圖5A & 5E)。突變和野生型小鼠之間腦或垂體腺前葉的CRFR1 mRNA表達(dá)模式和水平?jīng)]有差異(沒有顯示數(shù)據(jù))。這些結(jié)果表明CRFR2突變型小鼠的cAmyg中的CRF mRNA和動眼神經(jīng)副核(EW)嘴側(cè)中的尿皮質(zhì)素mRNA的表達(dá)水平增加。
實施例11評估CRFR2突變小鼠在UCN反應(yīng)中出現(xiàn)低血壓已有報道顯示對外周注射尿皮質(zhì)素的反應(yīng)中出現(xiàn)低血壓(2)。另外，已將CRFR2定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞(5，8)，而且還假設(shè)其負(fù)責(zé)尿皮質(zhì)素的血管舒張作用。為了測試此假設(shè)，用尿皮質(zhì)素注射CRFR2突變和對照小鼠，并測定它們的血壓變化。
檢驗了用異氟麻醉的小鼠對靜脈內(nèi)灌注尿皮質(zhì)素和硝普鈉(一種血管擴張劑)的心血管反應(yīng)(野生型n＝5；突變n＝3)。采用軟化的拉制成～0.4mm外徑的無菌PE-10管裝配用于記錄血壓的動脈導(dǎo)管。暴露股動脈，植入灌滿肝素鹽水(500U/ml)的此動脈導(dǎo)管，并用手術(shù)線和組織膠(Vetbond)固定。將該導(dǎo)管連接于一血壓轉(zhuǎn)換器(Statham)，并在Gould pen-記錄儀上顯示動脈血壓脈沖。然后在外頸靜脈中植入另一導(dǎo)管，用于靜脈內(nèi)灌注藥物。完成插管步驟后30分鐘灌注藥物。將靜脈導(dǎo)管與灌滿藥物的針筒相連。在0.5-1.0分鐘內(nèi)完成灌注。野生型和突變型小鼠接收相同劑量的尿皮質(zhì)素(在200μl 0.9％鹽水中含0.1μg)和鹽水(作為對照)。
參考在Sprague Dawley大鼠相應(yīng)研究中所得到的數(shù)據(jù)，從初步實驗確定所用的劑量(2)。為了驗證突變小鼠缺少對尿皮質(zhì)素注射的心血管反應(yīng)不是由于小鼠喪失了血管舒張的能力，在尿皮質(zhì)素灌注動脈壓恢復(fù)后，突變小鼠又接收了第二次硝普鈉(在100μl 0.9％鹽水中含0.8μg)的灌注。從血壓圖確定了平均動脈壓(MAP)。
靜脈內(nèi)灌注尿皮質(zhì)素(0.1μg)導(dǎo)致對照小鼠明顯的抑制性反應(yīng)(-28.3±2.0mm Hg)(圖6)。在整個記錄過程中動脈壓保持下降(90-120分鐘)。顯示相反，突變小鼠表現(xiàn)出對尿皮質(zhì)素不產(chǎn)生可測定的反應(yīng)[只有一只突變小鼠的動脈壓顯示出極小的和瞬間降低，這很可能是由于注射壓力本身所致(圖6)]。為了驗證突變小鼠的周圍血管系統(tǒng)在對其它刺激的反應(yīng)中能夠血管舒張，將硝普鈉(NP)(作為一氧化氮的供體能導(dǎo)致血管舒張)給予突變型小鼠。如圖6(白色柱)所示，在對硝普鈉(-30.0±5.0mmHg)注射的反應(yīng)中持續(xù)觀察到迅速和強烈的抑制反應(yīng)。在本實驗的過程中，突變型(76mmHg)和野生型小鼠(74mmHg)之間在麻醉下的基礎(chǔ)MAP沒有顯著差異。
實施例12CRFR2對血管生成的影響對CRFR2突變小鼠的器官進(jìn)行的組織學(xué)分析顯示CRFR缺陷型小鼠的一些器官(包括腦、垂體和腎上腺)的血管生成明顯增加(沒有顯示數(shù)據(jù))。這表明CRFR2可能作為血管生成的直接調(diào)節(jié)劑起作用。因此為了調(diào)節(jié)疾病時的血管生成可采用作為CRFR2的促效劑或拮抗劑的配體。一個實例是癌癥，癌細(xì)胞生長必須血管生成增加。通過刺激CRFR2的活性，可用促效劑來抑制血管生成，從而阻礙癌細(xì)胞的生長。
實施例13
CRDR2缺少對焦慮和應(yīng)激影響的總結(jié)本文的結(jié)果表明CRFR突變裸鼠表現(xiàn)出應(yīng)激-敏感和焦慮樣表型。雖然基礎(chǔ)攝食和體重增加正常，但突變小鼠對食物停止給予的反應(yīng)是在食物停止給予的應(yīng)激后重新喂食過程中消耗較少的食物。雖然這可能是代謝的作用，因為在實驗過程中突變和對照動物沒有顯示出在體重增加或減少上有差異，但可能是食物停止給予的應(yīng)激改變了動物的焦慮狀態(tài)，從而降低了它們的食欲或影響了它們的代謝。突變小鼠還顯示還表現(xiàn)出對約束應(yīng)激的迅速HPA反應(yīng)，這再次表明這些動物對應(yīng)激更敏感。在約束10分鐘后觀察到突變小鼠ACTH水平的降低可能是小鼠下丘腦上更迅速的糖皮質(zhì)素負(fù)反饋的結(jié)果，因為突變小鼠比對照小鼠更早顯示出更高的類固醇水平。因此，不能排除導(dǎo)致突變小鼠腎上腺活化有第二種機制的可能性。綜合來看，雖然其它生理解釋可能也參與突變小鼠對應(yīng)激反應(yīng)中的HPA軸速率的增加或進(jìn)食反應(yīng)的變化，但以上進(jìn)食和HPA軸的結(jié)果表明CRFR2突變小鼠對應(yīng)激的超敏性。
在EPM和敞開領(lǐng)域測試中突變小鼠也表現(xiàn)出焦慮樣行為的增加。然而，在明/暗盒實驗中這些小鼠表現(xiàn)出類似水平的焦慮樣行為。雖然在許多動物的焦慮測試中證明了藥物的敏感和特異性，但有時觀察到作業(yè)差異(17，18)。在明/暗中的表現(xiàn)可能有差異，這種作業(yè)更多的與對新奇(neophobia)的反應(yīng)而不是與探查相關(guān)(19)，而EPM中的表現(xiàn)則是由厭惡環(huán)境的探查而決定。測試過程中明亮條件也明顯影響動物測試中檢測抗焦慮或焦慮作用的能力(17)。CRFR2突變小鼠測試結(jié)果的這種特點表明與探查厭惡環(huán)境(而非新環(huán)境)相關(guān)的激動情緒增高。用CRFR2突變小鼠得到的結(jié)果提示行為測試中的這些差異可能解釋小鼠中所檢測到的焦慮樣行為的差異。
實施例14cAmyg中CRF的增加對焦慮的可能影響cAmyg中CRF mRNA的增加可以解釋突變小鼠焦慮樣行為和HPA軸敏感性的增加，因為該核表達(dá)CRFR1(8)且在應(yīng)激信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)中起主要作用(20)。另外，含有豐富的CRFR2的中隔顯示能調(diào)節(jié)扁桃體的活性(21-23)，且該核的病變導(dǎo)致約束的應(yīng)激后ACTH分泌降低(24-27)。已顯示扁桃體的病變會封阻CRF-誘導(dǎo)的焦慮(20)以及中隔損傷導(dǎo)致的情感過強(21)。此神經(jīng)途徑可以解釋在CRFR1缺陷型小鼠中觀察到的焦慮樣行為的減少，和在CRFR2缺陷型小鼠中觀察到的焦慮樣行為的增加。因此，CRFR2突變小鼠為焦慮樣行為受體調(diào)節(jié)提供了新機制的證據(jù)。在應(yīng)激過程中隔旁側(cè)中的CRFR2可能調(diào)節(jié)了扁桃體的活性，且缺少CRFR2時未受阻斷的扁桃體的活性可能導(dǎo)致焦慮樣行為的增加。
中隔旁側(cè)中的CRFR2也可能在對應(yīng)激的HPA反應(yīng)中起PVN作用的抑制劑功能。由于突變小鼠的中隔旁側(cè)中缺乏CRFR2，應(yīng)激誘導(dǎo)的PVN活化可能發(fā)生得更迅速。另外，CRFR2是未受應(yīng)激動物的PVN中表達(dá)的主要CRF受體，而僅在應(yīng)激條件下的PVN中發(fā)現(xiàn)CRFR1(28，29)。因此，在缺乏CRFR2時，可以改變應(yīng)激過程中對PVN活性的局部影響。
實施例15在嘴EW中UCN mRNA的增加導(dǎo)致焦慮的可能機制嘴EW中尿皮質(zhì)素mRNA的增加可能是導(dǎo)致突變小鼠焦慮樣行為增加的第二個機制，因為當(dāng)靜脈內(nèi)注射時尿皮質(zhì)素已顯示能誘導(dǎo)焦慮樣行為(30)。也不能排除對焦慮樣行為增加的其它解釋，如自主神經(jīng)系統(tǒng)敏感性的增加(31-33)。先前用反義寡核苷酸作的研究發(fā)現(xiàn)關(guān)于CRFR2在焦慮和行為中作用的相抵觸結(jié)果，雖然這些報告說注射CRFR1反義寡核苷酸的確顯示出焦慮樣作用(34，35)。
實施例16CRFR2裸鼠和自主神經(jīng)系統(tǒng)的敏感性也不能排除對焦慮樣行為增加的其它解釋，如自主神經(jīng)系統(tǒng)敏感性的增加(31-33)。先前用反義寡核苷酸作的研究發(fā)現(xiàn)關(guān)于CRFR2在焦慮和行為中作用的相抵觸結(jié)果(34，35)，雖然這些報告顯示注射CRFR1反義寡核苷酸的焦慮樣作用，但沒有研究報道過對注射CRFR2反義寡核苷酸得到的一致性發(fā)現(xiàn)。雖然反義寡核苷酸注射方法提供了潛在的希望，但其依舊在研究中，因為蛋白質(zhì)水平的降低不能取代該靶的完全消除(如在敲除動物中所實現(xiàn)的那樣)。
實施例17UCN對血管舒張的影響突變裸鼠中CRFR2的缺失可以證明尿皮質(zhì)素對血管舒張的影響。突變小鼠對靜脈內(nèi)注射尿皮質(zhì)素不起反應(yīng)，而野生型小鼠顯示出平均小動脈壓的明顯降低。注射硝普鹽導(dǎo)致突變小鼠血管舒張，從而證明缺少對尿皮質(zhì)素的反應(yīng)不是由于突變鼠血管系統(tǒng)生理上喪失擴張的能力，而是特異性缺乏CRFR2。這些結(jié)果支持了如下假設(shè)通過血管內(nèi)皮細(xì)胞(5，8)中的CRFR2的作用，尿皮質(zhì)素對低血壓(2，16)發(fā)生影響，因為CRFR2突變小鼠顯示出對尿皮質(zhì)素不起反應(yīng)。雖然在UCN引發(fā)的血管舒張很可能發(fā)生在生理刺激下不是最近知曉的，尿皮質(zhì)素對脈管系統(tǒng)中CRFR2的作用可能成為高血壓藥物開發(fā)中令人感興趣的靶標(biāo)。
結(jié)論總之，這些結(jié)果表明CRFR2缺陷型小鼠表現(xiàn)出增加的焦慮樣行為和對應(yīng)激反應(yīng)的超敏性HPA軸。CRFR1和CRFR2突變型小鼠提供了有價值的焦慮和抑郁模型，可能進(jìn)一步有助于弄清這些疾病的分子機理。對CRF信號傳遞途徑及其對焦慮和抑郁控制作用的研究可以提供有效治療這些疾病所需的線索。
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本領(lǐng)域技術(shù)人員將不難領(lǐng)會，本發(fā)明很適合實施其目的，獲得所述結(jié)果和優(yōu)點。本文中所述的本發(fā)明實施例和所附帶的方法、程序、處理、分子和具體化合物僅是優(yōu)選實施例的代表，是示范性的，對本發(fā)明的范圍不起任何限制作用。本領(lǐng)域技術(shù)人員可作出改變和其它用途，這些都包括在權(quán)利要求范圍所限定的本發(fā)明范圍中。
權(quán)利要求
1.一種非天然的轉(zhuǎn)基因小鼠，其特征在于，所述小鼠有至少一個促腎上腺皮質(zhì)素釋放因子受體2(CRFR2)的等位基因被破壞，導(dǎo)致所述小鼠不表達(dá)所述等位基因的促腎上腺皮質(zhì)素釋放因子受體2蛋白質(zhì)。
2.如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因小鼠，其特征在于，所述促腎上腺皮質(zhì)素釋放因子受體2等位基因的外顯子10、11和12的DNA序列缺失。
3.如權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)基因小鼠，其特征在于，所述的DNA序列被新霉素抗性基因盒置換。
4.如權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)基因小鼠，其特征在于，所述小鼠對所述的置換是雜合性小鼠。
5.如權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)基因小鼠，其特征在于，所述小鼠對所述的置換是純合性小鼠。
6.權(quán)利要求3所述的小鼠與另一品系小鼠之間交配的后代。
7.一種篩選具有焦慮調(diào)節(jié)活性的化合物的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步驟a)將所述的化合物給予權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)基因小鼠；b)測試所述小鼠的抑郁相關(guān)行為；c)將所述小鼠的焦慮樣行為與未給予所述化合物的權(quán)利要求5所述的另一種轉(zhuǎn)基因小鼠的焦慮樣行為。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，用選自以下的方案測試所述小鼠的焦慮上升的加號迷宮、明/暗盒和曠場測試。
9.一種篩選具有抑郁調(diào)節(jié)活性的化合物的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步驟a)將所述的化合物給予權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)基因小鼠；b)測試所述小鼠的抑郁樣行為；c)將所述小鼠的抑郁樣行為與未給予所述化合物的權(quán)利要求5所述的另一種轉(zhuǎn)基因小鼠的抑郁樣行為作比較。
10.一種篩選能控制血壓的化合物的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步驟a)將所述的化合物給予權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)基因小鼠；b)測試所述的小鼠的血壓變化；c)將所述的小鼠的血壓變化與另一種小鼠的血壓變化相比較，其中所述的另一種小鼠選自未給予所述化合物的權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)基因小鼠和給予所述化合物的野生型小鼠。
11.一種篩選影響血管生成的化合物的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步驟a)將所述的化合物給予權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)基因小鼠；b)測試所述的小鼠血管生成的變化；c)將所述的小鼠血管生成變化與另一種小鼠血管生成的變化相比較，其中所述的另一種小鼠選自未給予所述化合物的權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)基因小鼠和給予所述化合物的野生型小鼠。
12.一種篩選對下丘腦-垂體-腎上腺軸對應(yīng)激反應(yīng)有影響的化合物的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步驟a)將所述的化合物給予權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)基因小鼠；b)將所述的小鼠置于誘發(fā)-應(yīng)激的環(huán)境中；c)監(jiān)測所述小鼠的皮質(zhì)酮和促腎上腺皮質(zhì)激素的血漿水平；d)將所述的水平與那些未置于誘發(fā)-應(yīng)激環(huán)境中的權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)基因小鼠的水平相比較。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述的誘發(fā)-應(yīng)激的環(huán)境是理性約束-應(yīng)激。
14.一種確定CRFR2對第二種蛋白質(zhì)作用的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步驟a)將能影響第二種蛋白質(zhì)的促效劑給予權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)基因小鼠；b)對第二種蛋白質(zhì)進(jìn)行試驗，所述試驗選自蛋白質(zhì)表達(dá)試驗和蛋白質(zhì)活性試驗；和c)將所述的轉(zhuǎn)基因小鼠得到的試驗結(jié)果與給予相同促效劑的野生型小鼠得到的結(jié)果相比較。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述的第二種蛋白質(zhì)選自促腎上腺皮質(zhì)素釋放因子、促腎上腺皮質(zhì)素釋放因子受體1、尿皮質(zhì)素、促腎上腺皮質(zhì)素受體和尿皮質(zhì)素受體。
16.用權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)基因小鼠來研究促腎上腺皮質(zhì)素釋放因子受體1的反應(yīng)，其特征在于，所述的反應(yīng)不受CRFR2存在的阻礙。
17.一種增加靶組織或個體中血管生成的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步驟將CRFR2抑制劑給予所述的組織或個體。
18.一種抑制靶組織或個體中血管生成的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步驟將能刺激CRFR2活性的促效劑給予所述的靶組織或個體。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述的方法用于治療癌癥。
全文摘要
本發(fā)明提供了促腎上腺皮質(zhì)素釋放因子受體2缺陷的轉(zhuǎn)基因小鼠。CRFR2突變小鼠對應(yīng)激有超敏性,并表現(xiàn)出焦慮樣行為增加。突變小鼠具有正常的基礎(chǔ)攝食和體重增加,但在停止給予食物后表現(xiàn)出攝食減少。靜脈內(nèi)給予UCN對該突變小鼠沒有作用,但能降低正常動物的動脈壓。CRFR2的缺陷導(dǎo)致動眼神經(jīng)副核的嘴側(cè)中的尿皮質(zhì)素mRNA顯著增加,扁桃體中央核中的CRF mRNA顯著增加。這些結(jié)果證明與CRFR1突變小鼠相反,CRFR2突變小鼠對應(yīng)激的敏感性增加并表現(xiàn)出焦慮樣行為。
文檔編號C07K14/72GK1371243SQ00811991
公開日2002年9月25日 申請日期2000年7月14日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月15日
發(fā)明者李國芬, T·L·貝爾, G·W·史密斯, W·韋爾 申請人:研究發(fā)展基金會