專利名稱：維生素d的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種下式的化合物 其中R1是氫或烷基；R2是氫或烷基；或者R1和R2與C20一起是環丙基；A是 或-C≡C-；R3是烷基，羥基烷基或氟代烷基；和R4是烷基，羥基烷基或氟代烷基。
已經發現式I的化合物誘導對前列腺，乳腺和髓細胞白血病癌癥細胞系增生的抑制。因此，式I的化合物用作治療前列腺癌，乳腺癌，和用于治療白血病的藥物。
還已經發現式I的化合物具有抗雄激素活性。因此，式I的化合物用于治療良性前列腺增生，禿發和前列腺癌。
還發現式I的化合物具有使它們用于治療皮脂腺疾病例如粉刺或皮脂溢性皮炎的活性。
還發現式I的化合物具有使該化合物用于治療骨質疏松癥的活性。
發明的詳細描述如這里使用的，術語“烷基”指具有1-4個碳原子的直鏈或支鏈烷基，例如甲基，乙基，丙基，異丙基，丁基，叔丁基等等。術語“羥基烷基”指在烷基的任何碳原子上具有羥基取代基的烷基。術語“氟代烷基”指在烷基的任何碳原子上被一個，兩個或三個氟原子取代的烷基。
在這里給出的結構式中，各取代基通過下面的標志之一與核心連接楔形實線 指取代基位于分子平面之上楔形虛線 指取代基位于分子平面之下。
優選地，R1是氫和R2是烷基，或者R1是烷基和R2是氫。更優選地，R1是氫和R2是甲基，或者R1是甲基和R2是氫。
優選地，R3和R4獨立地是烷基，羥基烷基或三氟烷基。更優選地，R3和R4獨立地是甲基，羥基甲基或三氟甲基。
優選地，A是 最優選的式I的化合物是1，25-二羥基-16烯-5，6-反-維生素D3。
如下文所述制備式I的化合物，特別參照下面的結構式反應示意圖。
結構式反應示意圖 R5是氫或三甲基甲硅烷基。
在上面的結構式反應示意圖中，其中Ph是苯基，式II的化合物是[3S-(1E，3β，5α)-2-[3，5-二(二甲基乙基)二甲基甲硅烷基]氧基]-2-亞甲基-環己基亞基]乙基]二苯基膦氧化物，其通過與式III的化合物反應而被轉化為式IA的化合物。
該反應在強堿例如烷基鋰(例如丁基鋰)的存在下、在極性的對質子惰性的有機溶劑(例如無水乙醚或更優選地四氫呋喃)中在-60℃至-90℃下進行。
通過在極性有機溶劑(例如乙醚或更優選地四氫呋喃)中與氟化物鹽(例如四丁基氟化銨)反應，去除式IA的化合物的保護基，得到相應的式I的化合物。
如下文實施例1-6所述，或者如實施例7-8所述，制備式II的化合物。
式III的化合物是已知的(例如在美國專利No.5087619)或者可以根據已知方法制備。
通過下面的本領域公知的試驗方法能證明式I的化合物作為用于治療前列腺癌，乳腺癌和用于治療白血病的藥物的有用活性。
下面是選擇使用的材料和應用的方法細胞系.如下保持乳腺癌細胞系(MCF-7)，前列腺癌細胞系(LNCaP)和髓細胞白血病細胞系(HL-60)在含有10％胎牛血清(FCS)的Dulbecco’sModified Eagle Media(DEME)中保持MCF-7細胞；在含有10％FCS的RPMI1640中培養LNCaP和HL-60；所有三種細胞系在含有5％CO2的37℃培養箱中保持。
維生素D3化合物.以10-3M將維生素D3化合物溶解于無水乙醇中作為儲液，其在-20℃下避光儲存。對于體外應用，在DMEM或RPMI培養基中稀釋化合物。對于體內應用，在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中稀釋化合物。一份樣品只使用一次并且將LNCaP細胞胰酶消化。將細胞的洗滌過的單細胞懸浮液計數并且以400微升/孔的體積1×10-3細胞/孔的總量制成24孔平底板。用在40℃平衡過的瓊脂制備飼養層。在該步驟之前，將化合物移入孔中。孵育后計數菌落。所有的實驗對于每個實驗點使用三份平行平板進行至少三次。
體內血清鈣水平.將28只8-9周齡雄性Balb/c小鼠豢養在沒有病原體條件下并且喂以標準實驗飲食。隔天(除了周六和周日)用維生素D3化合物或稀釋劑(100微升/小鼠)對每組四只小鼠腹膜內注射3星期。1,25(OH)2-16-烯-5，6-反-D3的劑量是0.1，0.5，1.0和2.0微克。1,25(OH)2D3的劑量是0.1微克/小鼠。對照小鼠注射100微升PBS。通過定量比色檢測測定每周測定血清鈣值。
脈沖暴露實驗.MCF-7細胞在液體培養基中與10-7的1,25(OH)2D3或1,25(OH)2-16-烯-5，6-反-D3孵育不同時間。孵育之后，這些細胞用PBS小心沖洗兩次并且計數活細胞并且制成24-孔板用于軟瓊脂菌落測定，如先前所述。
通過流式細胞計數儀分析細胞周期.對與10-7M的1,25(OH)2D3或1,25(OH)2-16-烯-5，6-反-D3孵育4天的MCF-7細胞進行細胞周期分析。在用50微克/毫升碘化丙錠，1毫克/毫升RNA酶(100單位/毫升)和0.1％NP40染色之前將細胞在冷卻的甲醇中固定過夜。染色之后立即進行分析。所有的實驗至少獨立地進行三次。所有的數據通過斯氏檢驗實驗進行統計學分析。
蛋白質印跡分析.細胞用PBS沖洗兩次，懸浮于溶胞緩沖液(50mMTris pH8.0，150mMNaCl，0.1％SDS，0.5％脫氧膽酸鈉，1％NP40，100微克/毫升苯基甲基磺酰氟，2微克/毫升抑酶肽，1微克/毫升胃酶抑制劑和10微克/毫升亮抑酶肽)中，并且置于冰上30分鐘。4℃下以15000克離心20分鐘之后收集上清液。定量測定蛋白質濃度。通過15％十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠分離所有的溶胞產物，轉移到轉移膜聚二氟乙烯膜上，并且用抗-p27kip1兔多克隆抗體和抗-肌動蛋白鼠單克隆抗體探測。產生印跡。
端粒酶活性.為了測定相對端粒酶活性，進行端粒重復擴增方案(TRAP)測定。對于人端粒酶逆轉錄酶(hTERT)，用苯酚和異硫代氰酸胍的單相溶液從用1,25(OH)2D3或1,25(OH)2-16-烯-5，6-反-D3(10-9，10-8和10-7M)處理4天的HL-細胞分離總RNA。用1微克總RNA和隨機的六堿基引物進行RT-PCR。使用對hTERT基因或GAPDH基因特異性的引物擴增cDNA，后者用作對照物。用于hTERT的引物是5’-CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA-3’(有義)(SEQ ID NO1)，和5’-GGATGAAGCGGAGTCTGGA-3’(反義)(SEQ ID NO2)。熱循環是94℃90秒，接著95℃20秒，68℃40秒，和72℃30秒33個循環。用于GAPDH的引物是5’-CCATGGAGAAGGCTGGGG-3’(有義)(SEQ ID NO3)，和5’-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3’(反義)(SEQ ID NO4)。用于GAPDH擴增的條件是95℃2分鐘；94℃30秒，62℃40秒，和72℃60秒26個循環，接著72℃4分鐘。PCR產物在1％瓊脂糖凝膠上電泳并且用溴化乙錠染色。
維生素D3類似物對克隆測試的作用.在10-11至10-7M維生素D3類似物存在下在軟瓊脂中克隆MCF-7細胞，LNCaP細胞和HL-60細胞。測定劑量反應曲線和抑制50％菌落生成的有效劑量(ED50)。1,25(OH)2-16-烯-5，6-反-D3以劑量依賴方式有效抑制三種細胞系的克隆增殖。1,25(OH)2-16-烯-5，6-反-D3對于LNCaP細胞的ED50是1.4×10-9M，對于MCF-7細胞是4.3×10-9M，對于HL-60細胞是3.0×10-11M，比1,25(OH)2D3更有效大約10-100倍。
體內血清鈣水平.因為高血鈣是維生素D3化合物的主要毒性，1,25(OH)2D3的血鈣效果可與1,25(OH)2-16-烯-5，6-反-D3相比。所有的小鼠在研究的3星期時是存活的。接受0.1微克的1,25(OH)2D3小鼠都是高血鈣，血清鈣水平大約12毫克/dl(正常8.5-10.5毫克/dl)。相反，接受1,25(OH)2-16-烯-5，6-反-D3(0.1-2.0微克/小鼠)的小鼠和對照小鼠(8-9毫克/dl)幾乎具有相同的鈣水平(8-10毫克/dl)。
脈沖-照射實驗.為了研究維生素D3類似物對克隆增殖的抑制作用是不是可逆的，進行脈沖暴露實驗。MCF-7細胞接觸1,25(OH)2-16-烯-5，6-反-D3或1,25(OH)2D3不同時間，充分沖洗，制成軟瓊脂板，在培養的第14天計數菌落數。分別接觸1,25(OH)2-16-烯-5，6-反-D3和1,25(OH)2D34天抑制克隆細胞的大約40-30％。
細胞周期分析.測定1,25(OH)2-16-烯-5，6-反-D3和1,25(OH)2D3(10-7，4天)對MCF-7細胞的細胞周期的影響。細胞周期的G0-G1期細胞數目顯著增加(P≤0.05)，S期細胞比例伴隨降低。
蛋白質印跡分析.已知為p21waf1和p27kip1的依賴細胞周期蛋白的激酶抑制劑能抑制細胞周期蛋白激酶的活性，因此減緩細胞通過細胞周期的進程。如蛋白質印跡分析測定的，對照MCF-7細胞組成型地具有中等水平的p21waf1和p27kip1的表達。接觸1,25(OH)2-16-烯-5，6-反-D3(10-7M)一天將p21waf1和p27kip1的表達提高大約3.2-3.5倍，而用1,25(OH)2D3(10-7M)培養則將p21waf1和p27kip1的表達提高大約1.6-1.8倍。MCF-7細胞接觸1,25(OH)2-16-烯-5，6-反-D3(10-7M)三天導致p21waf1和p27kip1的表達分別提高2.8倍和3.4倍，而1,25(OH)2D3(10-7M，3天)則將p21waf1和p27kip1的表達分別提高4.8倍和3.3倍。
檢測維生素D3化合物對HL-60細胞p27kip1表達的劑量依賴性影響。1,25(OH)2D3和1,25(OH)2-16-烯-5，6-反-D3兩者都正調節p27kip1表達，與1,25(OH)2-16-烯-5，6-反-D3(10-9M，4天)孵育之后，表達水平大大提高。當HL-60細胞與10-8-10-7M的1,25(OH)2D3培養時，p27kip1的水平顯著提高。
端粒酶活性.使用TRAP測定評價1,25(OH)2-16-烯-5，6-反-D3和1,25(OH)2D3(10-9-10-7M4天)對端粒酶活性的影響。HL-60細胞與1,25(OH)2-16-烯-5，6-反-D310-9M或10-7M的1,25(OH)2D3培養，端粒酶活性顯著降低。
使用RT-PCR評價維生素D3化合物對HL-60細胞hHERT表達的影響。1,25(OH)2-16-烯-5，6-反-D3和1,25(OH)2D3以劑量依賴方式抑制hHERTmRNA的表達，在10-8M的1,25(OH)2-16-烯-5，6-反-D3和10-7M的1,25(OH)2D3時幾乎完全抑制表達。
通過下面本領域公知的實驗方法能證明式I的化合物作為治療良性前列腺增生的藥物的有用活性。
對閹割的睪丸素刺激的雄性Syrian倉鼠評價1,25(OH)2-16-烯-5，6-反-D3抗雄性激素活性。研究證明1,25(OH)2-16-烯-5，6-反-D3基本上抑制了這些動物的精囊腺和腹前列腺的雄性激素誘導的過度生長，而1,25(OH)2D3在無毒劑量(1微克)時是沒有活性的。
用20微克丙酸睪丸素和1微克1,25(OH)2-16-烯-5，6-反-D3每天對閹割的雄性Syrian倉鼠皮下注射，連續14天。這兩種化合物分別在0.2毫升芝麻油載體中施用。在第15天進行尸體剖檢。取出前列腺和精囊腺，印跡并且稱重。使用斯氏t-檢驗對數據進行統計學意義分析并且表示為刺激反應抑制百分率。
表I閹割的睪丸素刺激的倉鼠的前列腺和精囊腺生長的抑制
***p＜0.001通過下面本領域公知的實驗方法能證明式I的化合物作為用于治療骨質疏松癥的藥物的有用活性。材料和方法動物和處理使用三月齡成年雌性大鼠。對環境適應1周之后，對動物分組稱重并且用幾種濃度的1,25(OH)2-16-烯-5，6-反-D3以1毫升/千克/天管飼法口服處理。給藥第7天，對動物采血并且測定血清鈣水平。化合物制劑將化合物溶解于200標準乙醇中產生100微克/毫升的濃度。對于最高劑量濃度制備芝麻油載體和乙醇化合物溶液，然后37℃下旋轉蒸發去除乙醇。利用劑量分組平均體重計算劑量體積。將溶解于載體中的化合物系列稀釋得到合適的劑量濃度。血清收集和檢測給藥第7天，在乙醚麻醉下通過眼眶穿刺從每一只動物采取血液(1.5毫升)。將血液收集到血清分離機試管中，以2000rpm離心15分鐘，然后將血清分為等份用于鈣測定。通過比色分析測定血清鈣。結果血清鈣水平
血清鈣水平在給藥組正常范圍內，用1,25(OH)2-16-烯-5，6-反-D3處理至多2微克/千克/天。材料和方法動物和處理對三月齡成年雌性大鼠實施兩側卵巢切除術或假手術。對環境適應1周之后，對動物分組稱重并且以1毫升/千克具體濃度管飼法口服處理。利用分組平均體重每周計算劑量體積。手術后17天開始給藥并且持續19天。在第20天，通過吸入二氧化碳對動物實施安死術并且切除左股骨。總股骨骨鈣尸體剖檢時從所有組的動物切除左股骨并且剔除軟組織。對骨進行測量并且在中骨干處切成兩半；然后在去除骨骺之后將遠側部分縱向切為兩半。將骨髓沖洗出來并且通過在5％TCA中浸泡提取鈣。通過鈣比色分析定量測定TCA提取液的鈣含量。以毫克/遠側半股骨(DHF)±血清平均總骨鈣表示數據。血清收集和測定給藥第7天和第18天，在乙醚麻醉下通過眼眶穿刺從每一只動物采取血液(1.5毫升)。將血液收集到血清分離機試管中，以2000rpm離心15分鐘，然后將血清分為等份用于鈣測定。通過比色分析測定血清鈣。統計學分析為了證實卵巢切除術對骨鈣的影響，使用斯氏檢驗比較假手術和ovx載體組。通過一次方差分析(ANOVA)比較ovx載體組，接著當總的效果統計學意義明顯時通過Fisher’s LSD比較各處理組和載體組。
結果調節股骨鈣對體重的影響
對血清鈣水平的影響
我們首先證明式I的化合物作為治療皮脂腺疾病的藥物的有用活性，如本領域公知的下面的試驗方法證明的。
將200微升1,25(OH)2-16-烯-5，6-反-D3溶解于丙二醇，管飼法對Golden Syrian倉鼠每天給藥(每周5天)。在第4周殺死動物，并且對耳朵進行處理，用于組織學評價。通過成像分析在組織學制備的耳朵的橫切片上測定皮脂腺面積。
結果
并且所有檢測的都是來自一只耳朵的總脂質級分(通過有機溶劑提取后稱重殘留的脂質材料)。
結果
式I的化合物可以對需要這樣治療的人口服給藥，用于治療乳腺癌，前列腺癌或白血病。更具體地說，式I的化合物可以以大約1-20微克/天的范圍的劑量對成年人口服給藥用于這樣的治療。
式I的化合物可以對需要這樣治療的人口服給藥，用于治療良性前列腺增生和禿發。更具體地說，式I的化合物可以以大約1-20微克/天的范圍的劑量對成人口服給藥用于這樣的治療。
可以以大約1-20微克/天的劑量對人口服施用式I的化合物用于治療骨質疏松癥。
式I的化合物可以對需要這樣治療的人局部給藥，用于治療禿發。更具體地說，式I的化合物可以以大約5至大約50微克/克局部用制劑/天范圍內的劑量局部給藥用于這樣的治療。
可以以大約1-20微克/天的劑量對人口服施用式I的化合物用于治療皮脂腺疾病。
含有本發明式I的化合物的口服劑量形式可以和藥學可接受的載體材料一起摻入在膠囊，片劑等中。
下面詳細說明可以摻入到膠囊等中的藥學可接受的載體材料粘合劑，例如黃耆膠，金合歡，玉米淀粉，或明膠；賦形劑，例如磷酸二鈣；崩解劑，例如玉米淀粉，馬鈴薯淀粉，藻酸(algenic acid)等等；潤滑劑，例如硬脂酸鎂，甜味劑，例如蔗糖，乳糖或糖精；矯味劑，例如薄荷，冬青樹油或櫻桃木油。可以有各種其它材料作為包衣或者另外改變單位劑量的物理形態。例如，可以用紫膠，糖，或者兩者對片劑包衣。糖漿或酏劑可以含有活性化合物，作為甜味劑的蔗糖，作為保鮮劑的對羥基苯甲酸甲酯和丙酯，染料，和矯味劑，例如櫻桃味或橘子味。
含有本發明的式I的化合物的局部給藥劑量形式包括具有油脂性，可吸收的，水溶性和乳狀液基質的軟膏劑和乳膏劑，例如凡士林，含水羊毛脂，聚乙二醇等等。
洗劑是液體制劑并且有含有研細的物質的單一溶液或含水制劑或水醇(hydroalcoholic)制劑不同形式。洗劑可以含有懸浮劑或分散劑，例如纖維素衍生物，例如乙基纖維素，甲基纖維素等等；明膠或樹膠，其在水，醇，甘油等等載體中摻入活性成分。
凝膠是通過將活性成分的溶液或懸浮液在載體載體中制成凝膠而制備的半固體制劑。使用凝膠劑，例如羧基聚亞甲基將可以是含水或無水的載體凝膠化，并且使用堿，例如氫氧化鈉和胺，例如聚乙烯可可胺(polyethylenecocoamine)中和至適當的凝膠稠度。
這里使用的術語“局部”指使用摻入到合適的藥物載體中的活性成分，并且在炎癥部位施用以發揮局部作用。因此，局部用組合物包括其中通過直接接觸皮膚外部施用化合物的那些藥物形式。局部劑量形式包括凝膠劑，乳膏劑，洗劑，軟膏劑，粉末劑，氣霧劑和通過將式I的化合物與已知的藥物局部載體材料混合獲得的其它常規的對皮膚施藥的形式。
提供下面的實施例進一步描述本發明，但是不管在哪方面都不是對本發明的限制。
實施例1 (2R，3S，5S，7S)-2-[5，7-二[1，1-二甲基乙基]二甲基甲硅烷基]氧基]-4-亞甲基-1-氧雜螺[2，5]辛烷-2-甲醇乙酸酯氬氣下向磁子攪拌的50毫升二甲基甲酰胺中的18.5克(0.0523摩爾)的(2R，3S，5S，7S)-5-羥基-4-亞甲基-7-[(1，1-二甲基乙基)二甲基甲硅烷基氧基]-1-氧雜螺[2，5]辛烷-2-甲醇乙酸酯(Y.Kiegiel，P.M.Wovkulich和M.R.Uskokovic，四面體快報(Tetrahedron Letters)32，p.6057-6060(1991))和6.8克(0.099摩爾)的咪唑的溶液加入9.8克(0.065摩爾)的叔丁基二甲基甲硅烷基氯。將該反應混合物攪拌5小時，用5毫升水中止反應，攪拌30分鐘并且倒入400毫升水中。然后用2×500毫升己烷和2×500毫升乙醚萃取。合并有機層，用300毫升水洗滌，用硫酸鈉干燥并蒸發。在硅膠柱上層析分離，得到22.31克(92％)的標題化合物，為無色油狀物。
實施例2 [3S-(1E，3β，5α)-2-[3，5-二(二甲基乙基)二甲基甲硅烷基]氧基]-2-亞甲基-環己基亞基]乙醇乙酸酯向安裝有氬氣導管，機械攪拌器和溫度計的3升3頸瓶中加入500毫升四氫呋喃并且在干冰丙酮浴中冷卻到-60℃。在保持溫度低于-60℃的同時分批加入43.23克(0.108摩爾)無水六氯化鎢，然后保持溫度低于-45℃下快速滴加己烷中的1.6M正丁基鋰200毫升(大約5分鐘)。用冰水浴代替干冰丙酮浴使溫度達到5℃。顏色從藍色變為土黃色至亮紅黑色。5℃下30分鐘之后，經30分鐘快速滴加50毫升己烷中22.31克(0.04884摩爾)(2R，3S，5S，7S)-2-[5，7-二[(1，1-二甲基乙基)二甲基甲硅烷基]氧基]-4-亞甲基-1-氧雜螺[2，5]辛烷-2-甲醇乙酸酯。4小時之后，用2升己烷稀釋反應混合物，通過硅膠濾餅過濾，用3×500毫升己烷-乙酸乙酯9∶1洗滌，并蒸發。殘余物在75克硅膠柱上層析分離，得到22.56克粗產物。通過中壓硅膠柱進行層析，用100∶1二氯甲烷-乙酸乙酯混合物洗脫，得到17.42(80.1％)標題化合物和少量的相應的1Z差向異構體。
實施例3 [3S-(1E，3β，5α)-2-[3，5-二(二甲基乙基)二甲基甲硅烷基]氧基]-2-亞甲基-環己基亞基]乙醇乙酸酯(E-差向異構體)和[3S-(1E，3β，5α)-2-[3，5-二(二甲基乙基)二甲基甲硅烷基]氧基]-2-亞甲基-環己基亞基]乙醇乙酸酯(Z-差向異構體)
-78℃攪拌下向465毫升無水THF中加入64.3克(160毫摩爾)WCl6(藍色溶液)，接著加入337.5毫升1.43M正丁基鋰己烷溶液(以內部溫度不超過-20℃的速度)。使混合物溫熱至室溫。滴加65毫升THF中24.5克(53.6毫摩爾)(2S，3R，5S，7S)-2-[5，7-二[(1，1-二甲基乙基)二甲基甲硅烷基]氧基]-4-亞甲基-1-氧雜螺[2，5]辛烷-2-甲醇乙酸酯溶液，并且將混合物攪拌4小時。用600毫升戊烷稀釋混合物，并且通過4厘米硅膠床過濾，用己烷/EtOAc(19∶1)洗滌，減壓下蒸發揮發物之后得到27克粗二烯混合物。通過層析進一步純化，用己烷/EtOAc(25∶1)洗脫，得到21.6克(91％)2∶3 Z/E二烯混合物(標題化合物)，通過硅膠層析將其分離(己烷/EtOAc40∶1)。Z-二烯1H NMRδ0.052(s，6H)，0.06(s，6H) 0.87(s，9H)，0.89(s，9H)，1.74-1.90(m，2H)，2.04(s，3H)，2.20(dd，J＝6.0，12.8Hz，1H)，2.41(d，J＝11.1Hz，1H)4.19(m，1H)，4.42(m，1H)，4.61(dd，J＝7.3，12.1Hz，1H)，4.68(dd，J＝7.3，12.1Hz，1H)，4.80(s，1H)，5.20(s，1H)，5.47(t，J＝7.2Hz，1H).[α]D25＝+1.2°(c＝0.4，EtOH).分析計算值C23H44O4Si2C，62.27；H，10.01；實測值C，62.55，H，10.33.E-二烯1H NMRδ0.046(s，3H)，0.057(s，3H)，0.065(s，6H)，0.88(s，9H)，0.89(s，9H)，1.77(ddd，J＝3.1，9.4，11.9Hz，1H)，1.89(m，1H)，2.09(s，3H)，2.31(dd，J＝2.0，15.2Hz，1H)，2.39(dd，J＝6.3，15.2Hz，1H)，4.21(br s，1H)，4.50(m，1H)，4.58(dd，J＝7.2，12.9Hz，1H)，4.65(dd，J＝7.2，12.9Hz，1H)，4.95(s，1H)，4.99(s，1H)，5.69(t，J＝7.2Hz，1H).[α]D25＝+8.0°(c＝0.5，EtOH).分析計算值C23H44O4Si2C，62.67；H，10.06；實測值C，62.42，H，10.01.
實施例4 [3S-(1E，3β，5α)-2-[3，5-二(二甲基乙基)二甲基甲硅烷基]氧基]-2-亞甲基-環己基亞基]乙醇氬氣下向磁子攪拌的100毫升甲醇中的10.84克(0.0246摩爾)的[3S-(1E，3β，5α)-2-[3，5-二(二甲基乙基)二甲基甲硅烷基]氧基]-2-亞甲基-環己基亞基]乙醇乙酯的溶液加入3.5克氫氧化鈉顆粒，并且將該反應混合物在氬氣下攪拌3小時。減壓蒸發得到50毫升體積，用500毫升水稀釋，用2×500毫升己烷-乙醚1∶1萃取。有機層用水洗滌，用硫酸鈉干燥并蒸發。得到9.80克(100％)的標題化合物，為白色固體。
實施例5 1R-(1α，3β，5E)-[[-2-氯代亞乙基)-4-亞甲基-1，3-環己烷二基]二(氧)二(1，1-二甲基乙基)二甲基硅烷氬氣下，經2分鐘向在冰-丙酮浴中冷卻至2℃的攪拌的150毫升二氯甲烷中6.67克(0.050摩爾)的N-氯代琥珀酰亞胺溶液滴加4毫升(0.055摩爾)的二甲硫。形成白色沉淀。0℃下30分鐘之后，用干冰-丙酮浴代替冰-丙酮浴，并且將反應混合物溫度調節到-20℃。加入60毫升二氯甲烷中9.8克(0.0246摩爾)的[3S-(1E，3β，5α)-2-[3，5-二[[(1，1-二甲基乙基)二甲基甲硅烷基]氧基]-2-亞甲基-環己基亞基]乙醇溶液。15分鐘之后，移去冷卻浴，將反應混合物攪拌50分鐘，然后轉移到含有500毫升水的分液漏斗中。用2×350毫升己烷萃取。有機層用500毫升水洗滌，用硫酸鈉干燥并且蒸發，得到10.49克粗產物，為黃色液體。通過急驟層析法純化，得到純的標題化合物，為無色油狀物。
NMR(CDCl3)δ0.03(s，3H)，0.05(s，3H)，0.07(s，6H)，0.87(s，9H)，0.89(s，9H)，1.70-1.94(m，2H)，2.34(m，2H)，4.13(m，2H)，4.28(m，1H)，4.53(m，1H)，5.00(m，1H)，5.03(m，1H)，5.78(tm，J＝8Hz，1H).
實施例6 [3S-(1E，3β，5α)-2-[3，5-二[[(二甲基乙基)二甲基甲硅烷基]氧基]-2-亞甲基-環己基亞基]乙基]二苯基膦氧化物向安裝有氬氣導管，溫度計和機械攪拌器的1升3口燒瓶中加入100毫升新蒸餾的無水四氫呋喃中10.26克(0.0246摩爾)的1R-(1α，3β，5E)-[[-2-氯代亞乙基)-4-亞甲基-1，3-環己烷二基]二(氧)二(1，1-二甲基乙基)二甲基硅烷溶液，并且在干冰-丙酮浴中冷卻至-65℃。在30分鐘內加入0.5M二苯基磷化鉀的四氫呋喃溶液，直到保持紅色需要60毫升。-65℃下攪拌1小時之后，加入10毫升水并且移去冷卻浴。將反應脫色。然后快速加入200毫升二氯甲烷，接著加入200毫升含有10毫升30％過氧化氫的水溶液。1小時之后，加入13.5克亞硫酸鈉，100毫升溴和200毫升二氯甲烷。充分振蕩之后，分離各相，水相用200毫升二氯甲烷洗滌。有機相用200毫升溴洗滌。合并的有機層用硫酸鈉干燥，過濾并蒸發，得到16.33克粗產物。該粗產物通過中壓(硅膠G-60)層析純化，得到12.54克(87％)的標題化合物，為白色結晶。
NMR(CDCl3)δ0.02(s，3H)，0.07(s，6H)，0.08(s，3H)，0.84(s，18H)，1.76(m，2H)，2.98-3.15(m，2H)，4.06(m，1H)，4.37(m，1H)，4.53(m，1H)，4.72(m，1H)，4.79(m，1H)，7.45(m，6H)，7.72(m，4H).
實施例7 E-(3S，5R)-[3，5-二-(叔丁基-二甲基-甲硅烷基氧基)-2-亞甲基環己基亞基]乙酸甲酯(Ro 65-8821)用UV燈照射100毫升己烷中4.45克(0.01043摩爾)的Z-(3S，5R)-[3，5-二-(叔丁基-二甲基-甲硅烷基氧基)-2-亞甲基環己基亞基]乙酸甲酯(X)(A.Mowrino等，四面體快報)(Tetrahedron Letters)38，p.4713-4716(1997)的溶液3小時。蒸發，得到4.25克(95.5％)標題化合物，為無色油狀物。NMR(CDCl3)δ0.06(s，3H)，0.07(s，9H)，0.85(s，9H)，0.89(s，9H)，1.76(m，1H)，1.84(m，1H)，2.70(m，1H)，3.36(m，1H)，3.70(s，3H)，4.26(m，1H)，4.58(m，1H)，5.07(m，2H)，5.91(brs，1H).
實施例8 [3S-(1E，3β，5α)-2-[3，5-二-[[(1，1-二甲基乙基)二甲基-甲硅烷基]氧基]-2-亞甲基-環己基亞基]乙醇-78℃下，向100毫升甲苯中4.25克(0.00996摩爾)的E-(3S，5R)-[3，5-二-(叔丁基-二甲基-甲硅烷基氧基)-2-亞甲基環己基亞基]乙酸甲酯的溶液滴加25毫升1.2M二異丁基鋁氫化物(0.03摩爾)并且將反應混合物攪拌1小時。加入5毫升甲醇之后，使反應混合物溫熱至室溫。然后用150毫升2M鉀-鈉酒石酸鹽水溶液稀釋并且劇烈攪拌。分離有機相，用硫酸鈉干燥并且蒸發至干。通過急驟層析法純化粗產物，用己烷-乙酸乙酯8∶2洗脫，得到2.8克(70％)標題化合物，為無色蠟狀固體。NMR(CDCl3)δ0.05(s，3H)，0.07(s，9H)，0.88(s，9H)，0.91(s，9H)，1.74(m，1H)，2.06(m，1H)，2.26(dm，J＝13.6Hz，1H)，2.40(dd，J＝13.6，5.2，1H)，4.30-4.11(m，3H)，4.53(m，1H)，4.98(m，1H)，5.00(m，1H)，5.80(tm，J＝7Hz，1H).
實施例91，25-二羥基-16烯-5，6-反-維生素D3
-78℃下，氬氣下滴加1.6M正丁基鋰己烷溶液0.83毫升(0.00133摩爾)處理10毫升無水四氫呋喃中的796毫克(0.00137摩爾)[3S-(1E，3β，5α)-2-[3，5-二[[(1，1-二甲基乙基)二甲基甲硅烷基]氧基]-2-亞甲基-環己基亞基]乙基]二苯基膦氧化物。氬氣下經10分鐘向這樣獲得的紅色溶液滴加5毫升四氫呋喃中280毫克(0.000803摩爾)[3aR-[1(R*)，3aα，7aβ]]-1-[1，5-二甲基-5-[(三甲基甲硅烷基)氧基]己基]-3，3a，5，6，7，7a-六氫-7a-甲基-4H-二氫茚-4-酮溶液。該反應混合物在78℃下攪拌90分鐘，然后通過加入40毫升1∶1的2NRochelle鹽和2N KHCO3中止反應，使溫熱至室溫。用3×100毫升乙酸乙酯萃取。用3×水/鹽水洗滌有機層，硫酸鈉干燥并且蒸發至干。通過在40毫米×6”硅膠柱上急驟層析法純化粗產物，用己烷-乙酸乙酯40∶1洗脫，得到278毫克三甲硅烷基化標題化合物和140毫克起始酮。
氬氣下用1.9克(1.9毫摩爾)1M四丁基氟化銨的四氫呋喃溶液處理8毫升無水四氫呋喃中278毫克(0.000389摩爾)的該三甲硅烷基化中間體的溶液17小時。用6毫升水中止反應并且攪拌30分鐘。真空蒸發四氫呋喃之后，用3×100毫升乙酸乙酯萃取殘余溶液。有機層用4×水/鹽水洗滌層，硫酸鈉干燥并且蒸發至干。通過在硅膠柱上急驟層析法純化，用1％三乙胺∶乙酸乙酯溶液(300毫升)預洗滌；用乙酸乙酯進行洗脫。得到152毫克結晶標題化合物。從四氫呋喃∶甲酸甲酯(0.3∶7)中重結晶的樣品具有95℃-100℃的熔點。[α]D25+160.5度(EtOH，c＝0.20)。λ最大272/3nm(ε20600)。
實施例10軟明膠膠囊制劑I
制備方法1.將BHT和BHA懸浮于Miglyol 812。溫熱至大約50℃，并且攪拌直到溶解。2.50℃下將1,25(OH)2-16-烯-5，6-反-D3溶解于步驟1的溶液中。3.將步驟2的溶液冷卻到室溫。4.將步驟3的溶液裝入軟明膠膠囊。注意所有的制備步驟在氮氣下避光進行。
實施例11軟明膠膠囊制劑I
制備方法1.將二-α-維生素E懸浮于Miglyol 812中。溫熱至大約50℃，并且攪拌直到溶解。2.50℃下將1,25(OH)2-16-烯-5，6-反-D3溶解于步驟1的溶液中。3.將步驟2的溶液冷卻到室溫。4.將步驟3的溶液裝入軟明膠膠囊。注意所有的制備步驟在氮氣下避光進行。
序列表<110>霍夫曼-拉羅奇有限公司<120>維生素D3類似物<130>20472<140><141><150>U.S60/143413<151>1999-07-12<160>4<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述hTERT的引物(反義)<400>1cggaagagtg tctggagcaa<210>2<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述hTERT的引物(反義)<400>2ggatgaagcg gagtctgga<210>3<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述GAPDH的引物(有義)<400>3ccatggagaa ggctgggg<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述GAPDH的引物(反義)<400>4caaagttgtc atggatgacc
權利要求
1.下式的化合物 其中R1是氫或烷基；R2是氫或烷基；或者R1，R2與C20一起是環丙基；A是-C≡C- 或-CH2-CH2-；R3是烷基，羥基-烷基或氟代烷基；和R4是烷基，羥基烷基或氟代烷基。
2.根據權利要求1的化合物，其中R1是氫和R2是烷基，或者R1是烷基和R2是氫。
3.根據權利要求2的化合物，其中R1是氫和R2是甲基，或者R1是甲基和R2是氫。
4.根據權利要求3的化合物，其中R3和R4獨立地是烷基，羥基烷基或三氟烷基。
5.根據權利要求4的化合物，其中R3和R4獨立地是甲基，羥基甲基或三氟甲基。
6.根據權利要求5的化合物，其中A是
7.根據權利要求6的化合物，其是1，25-二羥基-16-烯-5，6-反-維生素D3。
全文摘要
本發明公開了式(I)的化合物,其中R
文檔編號C07C401/00GK1360572SQ00810222
公開日2002年7月24日 申請日期2000年7月6日 優先權日1999年7月12日
發明者安德魯·戴維·巴超, 伯納德·邁克爾·亨尼西, 米蘭·拉多耶·烏斯科科維奇 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司