專利名稱：膜內在蛋白質的抽提的制作方法
技術領域：
本發明涉及采用不同去污劑切向流過滲濾法，從細菌或含有重組載體的細菌宿主細胞中抽提革蘭陰性菌膜內在蛋白質的方法。
背景技術：
革蘭陰性菌有內膜和外膜。這些膜中所含的蛋白質總體上稱為膜內在蛋白質。可從革蘭陰性菌中抽提獲得相對少量的天然膜內在蛋白質。重組表達技術能使細菌增加表達這些蛋白質。
小規模批量純化這些天然的或重組的膜內在蛋白質涉及一利用離心從細菌細胞裂解液中抽提蛋白質的抽提步驟，接著采用常規的技術進行下游純化。
然而，離心不適用于大規模地抽提這些蛋白質，因為離心是個麻煩的過程。需要一種大規模的抽提方法，以獲得足夠用于經濟生產的大量蛋白質。
因而，需要一種避免使用離心從而更適用于大規模生產的抽提天然或重組革蘭陰性菌膜內在蛋白質的方法。兩種這樣的蛋白質是流感嗜血桿菌的脂化的外膜蛋白質P4和P6。
發明概述因而，本發明的一個目的是發展一種避免使用離心并且更適用于大規模生產的抽提天然或重組革蘭陰性菌膜內在蛋白質的方法。
本發明的另一目的是發展一種選擇性地溶解革蘭陰性菌的內膜和外膜蛋白質的方法。
本發明的又一目的是發展從大腸桿菌抽提脂化形式的重組流感嗜血桿菌外膜蛋白質P4和P6的方法。
通過采用不同去污劑切向流滲濾且避免離心的方法實現本發明下述這些和其它目的。還可采用這些方法連續抽提所需的蛋白質。
對于采用不同去污劑切向流滲濾，分別從細菌或含有重組載體的細菌宿主細胞中抽提得到天然的或重組表達的革蘭陰性菌內膜蛋白質的方法，它包括
(a)裂解發酵培養液中的細菌或含有重組載體的細菌宿主細胞；(b)用不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(a)得到的裂解發酵培養液，其中，所述緩沖液通過滲透去除了胞內和胞外性污染物，并用螯合劑防止蛋白質水解；(c)用去污劑和不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(b)得到的裂解產物，其中，所述去污劑溶解并取出內膜蛋白質，并使用二價陽離子穩定外膜蛋白質，防止它們溶解；和(d)收集(c)步取得的內膜蛋白質。
對于采用不同去污劑切向流滲濾，分別從細菌或含有重組載體的細菌宿主細胞中抽提得到天然的或重組表達的革蘭陰性菌外膜蛋白質的方法，它包括(a)裂解發酵培養液中的細菌或含有重組載體的細菌宿主細胞；(b)用不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(a)得到的裂解發酵培養液，其中，所述緩沖液通過滲透去除了胞內和胞外性污染物，使用螯合劑防止蛋白質水解；(c)用去污劑和不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(b)得到的裂解產物，其中，所述去污劑溶解并去除內膜蛋白質，并使用二價陽離子穩定外膜蛋白質，從而防止它們溶解；(d)用(c)步的緩沖液滲濾從(c)得到的裂解產物，并且用不含去污劑的(c)步的二價陽離子，以降低(c)步的去污劑濃度；(e)用不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(d)得到的裂解產物，并用螯合劑和去污劑溶解和取出外膜蛋白質；(f)收集(e)步取得的外膜蛋白質。
如果需要，在上述步驟之后，可進一步進行以下抽提步驟(g)使用(e)步中除去污劑以外的其余試劑滲濾從(e)得到的裂解產物，以減少去污劑的濃度；(h)用(e)步試劑滲濾從(g)得到的裂解產物；和(i)收集(h)步取得的外膜蛋白質。
對于采用不同去污劑切向流滲濾，從細菌宿主細胞中抽提出流感嗜血桿菌脂化重組外膜蛋白質P4(脂化rP4)的方法，它包括(a)裂解發酵培養液中的細菌宿主細胞；(b)用不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(a)得到的裂解發酵培養液，其中，所述緩沖液通過滲透去除了胞內和胞外性污染物，并用螯合劑以防止蛋白質水解；(c)用去污劑和不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(b)得到的裂解產物，其中，所述去污劑溶解并去除內膜蛋白質，并使用二價陽離子穩定外膜蛋白質，從而防止它們的溶解；(d)用(c)步的緩沖液滲濾從(c)得到的裂解產物，并且使用不含去污劑的(c)步的二價陽離子，以降低(c)帶來的去污劑濃度；(e)用不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(d)得到的裂解產物，用螯合劑和去污劑溶解外膜蛋白質；(f)用不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(e)得到的裂解產物，使用螯合劑和去污劑抽提和取出脂化rP4；和(g)收集(f)步取得的脂化rP4。
如果需要，在上述步驟之后，可進一步進行以下抽提步驟；(h)使用(f)步除去污劑外的其余試劑滲濾從(f)得到的裂解產物，以減少去污劑的濃度；(i)用(f)步試劑滲濾從(h)得到的裂解產物以抽提和取出脂化rP4；和(j)收集(i)步取得的脂化rP4。
如果還需要，在上述步驟之后，還可進一步進行以下抽提步驟(k)使用(f)步除去污劑外的其余試劑滲濾從(j)得到的裂解產物，以減少去污劑的濃度；(l)用(f)步的試劑滲濾從(k)得到的裂解產物以抽提和取出脂化rP4；和(m)收集(l)步取得的脂化rP4。
如果還需要，還可進一步進行脂化rP4抽提的循環。
對于采用不同去污劑切向流滲濾，從細菌宿主細胞中抽提得到流感嗜血桿菌脂化重組外膜蛋白質P6(脂化rP6)的方法，它包括(a)裂解發酵培養液中的細菌宿主細胞；(b)用不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(a)得到的裂解發酵培養液，其中，所述緩沖液通過滲透去除了胞內和胞外性污染物，并使用螯合劑防止蛋白質水解；(c)用去污劑和不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(b)得到的裂解產物，其中，所述去污劑溶解并去除內膜蛋白質，并使用二價陽離子穩定外膜蛋白質，從而防止它們的溶解；(d)用不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(c)得到的裂解產物，使用螯合劑螯合二價陽離子并防止蛋白質水解，使用去污劑溶解和去除除脂化rP6外的外膜蛋白質；(e)用不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(d)得到的裂解產物，用螯合劑防止蛋白質水解、用去污劑去除其他外膜蛋白質以及用鹽破壞膜/外膜蛋白質復合體；(f)用(e)步試劑(除了去污劑和鹽外)滲濾從(e)得到的裂解產物，以減少去污劑的濃度；(g)用去污劑和不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(f)得到的裂解產物，其中，所述去污劑溶解和去除結合于細胞外膜的其他蛋白質，用螯合劑防止蛋白質水解；(h)用(g)步緩沖液和(g)步螯合劑滲濾從(g)得到的裂解產物，以減少從(g)帶來的去污劑的濃度；(i)用磷酸鹽化合物和去污劑滲濾從(h)得到的裂解產物，以溶解和去除結合于細胞外膜的其他蛋白質；(j)用磷酸鹽化合物滲濾從(i)得到的裂解產物，以降低(i)帶來的去污劑濃度；(k)加熱(j)步的裂解產物，以從膜中取出脂化rP6，同時用磷酸鹽化合物和去污劑滲濾該裂解產物以溶解、抽提和取出脂化rP6；(l)收集(k)步取得的脂化rP6。
如果需要，可修改抽提脂化rP6的方法，在進行(k)步之前濃縮(j)步得到的裂解產物。
附圖的簡短說明
圖1描述了抽提脂化rP4期間取自滲透液流的樣品的SDS-PAGE分析，如下面的實施例1所述。泳道泳道1是Pharmacia低分子量標記物；2是0.1μg脂化rP4標準品；3是0.3μg脂化rP4標準品；4是1μg脂化rP4標準品；5是用裂解緩沖液(10mM Hepes，1mM EDTA)進行滲濾的滲透液；6是用TritonTMX-100進行滲濾的滲透液；7是用TrisTM緩沖液進行滲濾的滲透液；8是用ZwittergentTM3-12緩沖液進行1x滲濾的滲透液；9是用ZwittergentTM3-12緩沖液進行10x滲濾的滲透液。
圖2描述了在脂化rP4的抽提過程中4個試驗的滲透流量，如下面的實施例2所述。流量以升/平方米膜面積/小時(1mh)計。
圖3描述了脂化rP6抽提法第一部分期間取自滲透流液的樣品的SDS-PAGE分析，如下面的實施例3所述。泳道1是標記物12標準品；2是用裂解緩沖液進行滲濾的滲透液；3是用TritonTMX-100進行滲濾的滲透液；4是用TrisTM緩沖液進行滲濾的滲透液；5是用ZwittergentTM3-14進行滲濾的滲透液；6是用ZwittergentTM3-14/0.5M NaCl進行滲濾的滲透液；7是用TrisTM緩沖液進行滲濾的滲透液；8是用Sarcosyl進行滲濾的滲透液。
圖4描述了脂化rP6抽提法第二部分期間取自滲透流液樣品的SDS-PAGE分析，如下面的實施例3所述。泳道1是標記物12標準品；2是用TrisTM緩沖液進行滲濾的滲透液；3是在室溫用ZwittergentTM3-12進行滲濾的滲透液；4是用TrisTM緩沖液進行滲濾的滲透液；5是濃縮步驟的滲透液；6是在55℃用ZwittergentTM3-12進行滲濾的滲透液；7是在55℃用TrisTM緩沖液進行滲濾的滲透液；8是在55℃用ZwittergentTM3-12進行滲濾的滲透液。
發明的詳細描述本發明抽提膜內在蛋白質的方法較其它方法有幾個優點。首先，本發明將澄清和抽提合并在一項操作中。僅采用一步滲濾過程將產物從細胞中抽提出來并與細胞碎片分離。其它的方法通常需要一步抽提操作和第二步澄清操作。第二個優點是膜蛋白質以半純化狀態被抽提出來，這簡化了下游的加工步驟。最后，本發明方法非常容易放大規模，因為所要求的僅僅是膜的表面積隨著細胞的數量成比例地增加。
在開始本發明抽提方法之前，先采用常規的方法在同源或異源細菌宿主細胞中表達從革蘭陰性菌的膜內在蛋白質，或者先分離得到天然的細菌。將發酵培養液通過勻漿器使其裂解，開始抽提過程。在本發明的一個較佳實施例中，勻漿器是一種微流化器(microfluidizer)。
然后采用切向流動滲濾技術裂解的發酵培養液進行不同去污劑抽提。在這個方法中，使用包含確定的截留值或孔徑大小的滲透膜的切向流動系統，按特定的順序加入緩沖液滲濾裂解的細胞。選擇緩沖液的使用順序以首先溶解內膜蛋白質，然后溶解外膜蛋白質。滲濾期間，小于此膜的分子量截留值的較小溶解蛋白質隨著滲透液穿過了膜，而較大的分子和不溶的蛋白質則被保留。
然后改變緩沖液，并加入去污劑以溶解和抽提外膜蛋白質。控制緩沖液和去污劑的加入順序，以選擇性方式抽提所需的外膜蛋白質。然后采用常規方法如離子交換層析純化抽提得到的蛋白質。
因此，本發明的抽提方法可選擇性溶解革蘭陰性菌的內膜和外膜蛋白質。溶解的蛋白質隨著滲透液通過超濾膜，而不溶的蛋白質則被膜所保留。
可使用本發明方法從任何合適的革蘭陰性菌中抽提天然的膜內在蛋白質，這些細菌包括但不限于流感嗜血桿菌(如P4和P6蛋白)、卡他性莫拉菌(Moraxellacatarrhalis，例如UspA1和UspA2蛋白)和B群奈瑟腦膜炎球菌。
采用本發明方法抽提得到的重組膜內在蛋白質可在任何含有一重組載體的合適的細菌宿主細胞中表達，這種表達進而又使該細胞中含有編碼所需重組膜內在蛋白質的核苷酸序列。這些細菌宿主細胞的例子包括但不限于大腸桿菌、沙門菌、志賀菌和枯草桿菌(B.subtilis)。
不能用該膜抽提具有大的接近膜截留值的單體、多體或凝聚體大小的天然或重組蛋白質。然而，在大腸桿菌中以包涵體形式表達的革蘭陰性菌蛋白質(如淋球菌蛋白或腦膜炎球菌蛋白)也可采用本方法抽提。包涵體比膜的截留值大因而被膜保留，而其它蛋白質則被抽提。然后加入尿素或類似的變性劑溶解該包涵體。然后采用常規方法抽提、復性和純化所需的蛋白質。
本發明的抽提方法是以在大腸桿菌宿主細胞中表達的流感嗜血桿菌P4和P6蛋白的重組形式為例進行描述的。
流感嗜血桿菌的P4蛋白(也稱為e蛋白)的分子量大約為30KD，在美國專利5601831中有所描述，本文納入該文作為參考。天然形式的P4蛋白是脂化的。為了重組表達脂化的P4蛋白，從細菌獲得P4基因，并將其插入適當的表達載體中。在下面的實施例1和2中使用了表達載體pBAD18-Cm〔L.-M.Guzman等人，J.Bacteriol.，177，4121-4130(1995)〕。這個載體含有一阿拉伯糖誘導型啟動子和其它適當的控制元件。然后將該表達載體插入合適的細菌宿主細胞中。在下面的實施例1和2中，宿主細胞是大腸桿菌BLR菌株(Novagen，Madison，WT)。如果使用誘導型啟動子，則加入了誘導物，引起宿主細胞表達所需的蛋白質。在下面的實施例1和2中，誘導物是L-阿拉伯糖。
流感嗜血桿菌的P6蛋白(也稱為PBOMP-1和PAL)的分子量大約為15KD，在美國專利5110908中有所描述。P4蛋白的天然形式是脂化的。然而，先前試圖重組表達脂化的rP4結果是產生低水平的表達。待授權的共同享有的美國臨時專利申請號60/141067描述了一種產生脂化rP6的表達系統。為了重組表達脂化的rP6蛋白，從細菌中獲得P6基因，并將其插入適當的表達載體中。在下面的實施例3和4中再次使用表達載體pBAD18-CM。將這個表達載體插入合適的細菌宿主細胞中，在下面的實施例3和4中，該宿主細胞還是大腸桿菌BLR菌株。如果使用誘導型啟動子，則加入誘導物以引起宿主細胞表達所需的蛋白質。在下面的實施例3和4中，誘導物是L-阿拉伯糖。
在本發明的一個較佳實施例中，滲濾膜購自Millipore(Bedford，MA)。該膜由再生纖維素制成，截留值為1000KD，表面積為0.002m2/克濕重細胞。
任何可溶解蛋白質的去污劑可用于此抽提方法中，包括但不限于ZwittergentTM化合物(如ZwittergentTM3-12和ZwittergentTM3-14)、非離子性TritonTM化合物(如TritonTMX-100)、十二烷基肌氨酸鈉、葡糖苷(如辛基葡糖苷、壬基葡糖苷或十二烷基麥芽苷、膽酸、脫氧膽酸或十二烷基麥芽苷)。在較佳實施例中，對于本文所述的具體步驟，去污劑是ZwittergentTM3-12、TritonTMX-100和十二烷基肌氨酸鈉。
可使用各種化合物作為抽提過程中的緩沖液，只要該化合物不被滲濾膜保留即可。這些緩沖液包括但不限于Hepes、3-(N-嗎啉代)丙磺酸(MOPS)、TrisTM、磷酸鈉和硼酸鈉。在較佳實施例中，對于本文所述的具體步驟，緩沖液是Hepes、TrisTM和磷酸鈉。
在一些抽提步驟中使用了螯合劑，以防止蛋白質水解和/或螯合二價陽離子。較佳的螯合劑是EDTA。二價陽離子在一些抽提步驟中使用到，以穩定或溶解外膜蛋白質。二價陽離子包括金屬離子如Mg2+和Ca2+，Mg2+最佳。氯化鈉是抽提脂化rP6的鹽破壞步驟中優選的鹽。
可修改抽提過程使其包括至少一個使用具有不同截留分子量的滲濾膜的操作，這樣首先使裂解產物通過較大截留分子量的膜，任何再通過較小截留分子量的膜。這樣的膜滲透順序使得能在同一輪滲濾的不同階段(裂解產物)分別純化兩種或多種膜內在蛋白質。
對于采用不同去污劑切向流滲濾，分別從細菌或含有重組載體的細菌宿主細胞中抽提得到天然的或重組表達的革蘭陰性菌內膜蛋白質的方法，它包括(a)裂解發酵培養液中的細菌或含有重組載體的細菌宿主細胞；(b)用不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(a)得到的裂解發酵培養液，其中，所述緩沖液通過滲透去除了胞內和胞外性污染物，并用螯合劑防止蛋白質水解；(c)用去污劑和不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(b)得到的裂解產物，其中，所述去污劑溶解并取出內膜蛋白質，并使用二價陽離子穩定外膜蛋白質，防止它們溶解；和(d)收集(c)步取得的內膜蛋白質。
對于采用不同去污劑切向流滲濾，分別從細菌或含有重組載體的細菌宿主細胞中抽提得到天然的或重組表達的革蘭陰性菌外膜蛋白質的方法，它包括(a)裂解發酵培養液中的細菌或含有重組載體的細菌宿主細胞；(b)用不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(a)得到的裂解發酵培養液，其中，所述緩沖液通過滲透去除了胞內和胞外性污染物，用螯合劑防止蛋白質水解；(c)用去污劑和不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(b)得到的裂解產物，其中，所述去污劑溶解并去除內膜蛋白質，并使用二價陽離子穩定外膜蛋白質，從而防止它們的溶解；(d)用(c)步的緩沖液滲濾從(c)得到的裂解產物，并且使用不含去污劑的(c)步的二價陽離子，以降低(c)步的去污劑濃度；(e)用不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(d)得到的裂解產物，并用螯合劑和去污劑溶解和取出外膜蛋白質；(f)收集(e)步取得的外膜蛋白質。
如果需要，在上述步驟之后，可進一步進行以下抽提步驟(g)使用(e)步中除去去污劑以外的其余試劑滲濾從(e)得到的裂解產物，以減少去污劑的濃度；(h)用(e)步試劑滲濾從(g)得到的裂解產物；和(i)收集(h)步取得的外膜蛋白質。
對于采用不同去污劑切向流滲濾，從細菌宿主細胞中抽提出流感嗜血桿菌脂化重組外膜蛋白質P4(脂化rP4)的方法，它包括(a)裂解發酵培養液中的細菌宿主細胞；(b)用不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(a)得到的裂解發酵培養液，其中，所述緩沖液通過滲透去除了胞內和胞外性污染物，并用螯合劑防止蛋白質水解；(c)用去污劑和不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(b)得到的裂解產物，其中，所述去污劑溶解并去除內膜蛋白質，并使用二價陽離子穩定外膜蛋白質，從而防止它們的溶解；(d)用(c)步的緩沖液滲濾從(c)得到的裂解產物，并且用不含去污劑的(c)步得到的二價陽離子，以降低(c)帶來的去污劑濃度；(e)用不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(d)得到的裂解產物，用螯合劑和去污劑溶解外膜蛋白質；(f)用不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(e)得到的裂解產物，使用螯合劑和去污劑抽提和取出脂化rP4；和(g)收集(f)步取得的脂化rP4。
如果需要，在上述步驟之后，可進一步進行以下抽提步驟(h)使用(f)步除去污劑外的其余試劑滲濾從(f)得到的裂解產物，以減少去污劑的濃度；(i)用(f)步試劑滲濾從(h)得到的裂解產物以抽提和取出脂化rP4；和(j)收集(i)步取得的脂化rP4。
如果還需要，在上述步驟之后，還可進一步進行以下抽提步驟(k)使用(f)步除去污劑外的其余試劑滲濾從(j)得到的裂解產物，以減少去污劑的濃度；(l)用(f)步的試劑滲濾從(k)得到的裂解產物以抽提和取出脂化rP4；和(m)收集(l)步取得的脂化rP4。
如果還需要，還可進一步進行脂化rP4抽提的循環。
對于采用不同去污劑切向流滲濾，從細菌宿主細胞中抽提得到流感嗜血桿菌脂化重組外膜蛋白質P6(脂化rP6)的方法，它包括(a)裂解發酵培養液中的細菌宿主細胞；(b)用不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(a)得到的裂解發酵培養液，其中，所述緩沖液通過滲透去除了胞內和胞外性污染物，并使用螯合劑防止蛋白質水解；(c)用去污劑和不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(b)得到的裂解產物，其中，所述去污劑溶解并去除內膜蛋白質，并使用二價陽離子穩定外膜蛋白質，從而防止它們的溶解；(d)用不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(c)得到的裂解產物，使用螯合劑螯合二價陽離子并防止蛋白質水解，使用去污劑以溶解和去除除了脂化rP6外的外膜蛋白質；(e)用不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(d)得到的裂解產物，用螯合劑防止蛋白質水解、用去污劑去除其他外膜蛋白質以及用鹽破壞膜/外膜蛋白質復合體；(f)用(e)步試劑(除了去污劑和鹽外)滲濾從(e)得到的裂解產物，以減少去污劑的濃度；(g)用去污劑和不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(f)得到的裂解產物，其中，所述去污劑溶解和去除結合于細胞外膜的其他蛋白質，用螯合劑防止蛋白質水解；(h)用(g)步緩沖液和(g)步螯合劑滲濾從(g)得到的裂解產物，以減少從(g)帶來的去污劑的濃度；(i)用磷酸鹽化合物和去污劑滲濾從(h)得到的裂解產物，以溶解和去除結合于細胞外膜的其他蛋白質；(j)用磷酸鹽化合物滲濾從(i)得到的裂解產物，以降低(i)帶來的去污劑濃度；
(k)加熱(j)步的裂解產物，以從膜中取出脂化rP6，同時用磷酸鹽化合物和去污劑滲濾該裂解產物以溶解、抽提和取出脂化rP6；(l)收集(k)步取得的脂化rP6。
如果需要，可修改抽提脂化rP6的方法，在進行(k)步之前濃縮(j)步得到的裂解產物。
為了更好地理解本發明，給出了下列實施例。這些實施例僅僅是闡述性的，而不是限制本發明的范圍。
實施例實施例1不同去污劑膜抽提脂化rP4從細菌細胞(如大腸桿菌細胞)中抽提脂化的rP4的整個過程涉及顯微流化作用(microfluidization)或細胞裂胞和膜不同去污劑抽提。收集發酵培養液，加入5mMEDTA，以抑制可能的金屬蛋白酶引起的蛋白質降解。然后將該培養液稀釋至低于5％(w/v)的細胞濕重濃度，用高壓微流化器(Microfluidics，Newton，MA)裂解。使用包括表面積為0.002m2/g濕重細胞的1000KD再生纖維素Millipore膜的切向流動系統，按特定的順序加入緩沖液滲濾裂解的細胞。選擇緩沖液加入的順序，以首先溶解內膜蛋白質，接著溶解包括rP4的外膜蛋白質。滲濾期間，小于膜的截留分子量的適當大小的溶解蛋白質通過了膜，而較大的分子和不溶的蛋白質則被保留。滲濾步驟的順序如下(1)用10mM Hepes/1mM EDTA/pH8.0、體積是滯留物體積3倍的溶液滲濾裂解的發酵培養液，以通過滲透去除胞內和胞外性污染物。
(2)用10mM Hepes/1mM MgCl2/1％TritonTMX-100、pH8溶液滲濾該裂解產物5次，溶解和取出膜內在蛋白質。Mg2+離子穩定了外膜，因此，外膜蛋白質在TritonTMX-100中是不溶的。
(3)用10mM/Hepes/1mM MgCl2/pH8溶液滲濾裂解產物3次，以減少TritonTMX-100的濃度。
(4)用50mM TrisTM/5mM EDTA/1％ZwittergentTM3-12/pH8溶液滲濾裂解產物3次，以溶解外膜蛋白質，包括脂化的rP4，然后開始從外膜抽提和收集脂化的rP4。
(5)用50mM TrisTM/5mM EDTA/pH8溶液滲濾裂解產物3次。此步不使用ZwittergentTM3-12，因為ZwittergentTM化合物不像較小的化合物(如氯化鈉)那樣容易地通過截留分子量為1000KD的膜；此步起著降低膜中ZwittergentTM濃度的作用，否則步驟(4)的ZwittergentTM濃度會減少下面的步驟(6)和(8)通過膜的流速。
(6)用50mM TrisTM/5mM EDTA/1％ZwittergentTM3-12/pH8溶液滲濾裂解產物2次，以繼續從外膜抽提和收集脂化的rP4。
(7)用50mM TrisTM/5mM EDTA/pH8溶液滲濾裂解產物2次，以繼續降低ZwittergentTM濃度。
(8)用50mM TrisTM/5mM EDTA/1％ZwittergentTM3-12/pH8溶液滲濾裂解產物2次，以繼續從外膜抽提和收集脂化的rP4。
(9)用50mM TrisTM/5mM EDTA/pH8溶液滲濾裂解產物2次，以再次減少ZwittergentTM的濃度。
在滲濾步驟中，跨膜壓力維持在大約5psi，流量維持在150升/m2膜面積/小時(lmh)。滲濾過程在室溫中進行。滲透流量的范圍為30-40lmh，這對于該抽提方法的實際應用和大規模生產應是足夠高的。
抽提期間，在不同點采集用于分析的樣品，通過SDS-PAGE評估不同滲濾步驟對蛋白質抽提的影響。加入酒精沉淀樣品，離心，然后以SDS樣品制備緩沖液中重新溶解至原始體積的20％。這種制備樣品的方法濃縮了樣品并減少樣品的TritonTM或ZwittergentTM3-12濃度。這兩種物質會干擾SDS與樣品的結合，并降低對凝膠條帶的分辨。將10μl各樣品加樣到Novex(Encinitas，CA)10％丙烯酰胺凝膠上，然后在125V電壓下電泳60-90分鐘。
圖1顯示了抽提脂化的rP4期間取自滲透液的樣品的典型SDS-PAGE分析。脂化的rP4在這些凝膠上以大約30KD的分子量運行。該凝膠顯示了滲濾期間一些污染蛋白質被裂解緩沖液(泳道5)和含有TritonTMX-100的緩沖液(泳道6)去除。在這些滲濾步驟中損失的脂化rP4很少。在使用ZwittergentTM3-12的滲濾步驟中，脂化的rP4以部分純化的狀態被抽提(泳道8)。在最后的ZwittergentTM3-12滲濾步驟中，滲透液中存在非常少的脂化的rP4(泳道9)。這表明大多數溶解的脂化rP4已通過滲透被回收。其它試驗顯示，抽提完成后在滯留物中不溶的脂化rP4非常少(數據未給出)。通過Western分析發現ZwittergentTM3-12抽提的30KD條帶是脂化的rP4(數據未給出)。
實施例2脂化rP4的另一種抽提法本實施例給了由脂化rP4的其他四種抽提方法得到的數據。在各個操作中，首先將5mM EDTA加到重組大腸桿菌發酵培養液中，以抑制可能的金屬蛋白酶引起的蛋白質降解。然后將該發酵培養液的濕細胞濃度調整到10％，通過Microfluidics微流化器裂解。然后將此細胞裂解液分成含有500g細胞的等量份，-70℃冷凍。
將500克等份的裂解大腸桿菌發酵培養液移出-70℃，放到溫度不超過40℃的水浴中解凍。然后將該細胞裂解液稀釋到5％的細胞濕重。然后如實施例1所述采用切向流動滲濾法將此5％細胞裂解液進行不同去污劑抽提。僅在步驟(4)中有輕微的差別，在該步驟中，滲濾了2次而不是3次。
將抽提期間不同點采得的樣品作SDS-PAGE分析，得到了與圖1所示可比較的結果(數據未給出)。計算出4輪中各輪回收的脂化rP4的量。在抽提之前和之后通過SDS-PAGE凝膠電泳然后使用光密度計掃描測定細胞裂解液中的脂化rP4的百分比。這個數據表明，抽提前后細胞裂解液中脂化rP4蛋白質平均減少了78％(以克計)。這個數據還表明，抽提合并物中脂化rP4蛋白質的總回收與細胞裂解液的比是18％。
其結果列在表1中表1
圖2闡述了此滲濾方法的再現性。監測了抽提過程中4次運行的滲透液流量。整個過程中流動速率相似，證明該抽提方法是可控制的和可再現的。
為了純化抽提得到的脂化rP4，將含有脂化rP4的細胞裂解液通過由DEAESepharoseTMFast Flow柱和SP SepharoseTMFast Flow柱(Pharmacia&Upjohn，Piscataway，NJ)組成的串聯離子交換柱。用另外的平衡緩沖液洗滌層析柱，然后從流程(process stream)中移去DEAE柱。然后用20柱體積的平衡緩沖液洗滌SP柱，隨后用NaCl梯度洗脫，得到純化的脂化rP4 30K蛋白質。用濃度為20mM的NaCl洗脫脂化rP4蛋白質的純化凝集形式(形式I)。用濃度為140mM的NaCl洗脫脂化rP4蛋白質的凝集和非凝集形式的混合物(形式II)。
然后將形式II的脂化rP4 30K蛋白質進行受控制的緩慢冷卻處理，使其轉變為更凝聚的形式I狀態。可分別純化兩種純化形式，然后保存，或者可分別純化然后合并。轉變方法如下(1)獲得脂化rP4形式II的無菌過濾等份；(2)慢慢冷凍至-6℃。
實施例3不同去污劑膜抽提脂化rP6抽提脂化rP6的方法與抽提脂化rP4的方法類似。但是，滲濾過程需要更多步驟，因為脂化rP6與肽聚糖緊密結合在一起。用10mM EDTA處理表達脂化rP6的大腸桿菌細胞發酵培養液，然后在進行均質化之前先將其稀釋成細胞濕重/體積為10％以下。然后用高壓微流化器裂解細胞，在室溫下使用跨線流通膜過濾裝置按順序用緩沖液進行滲濾。測定了允許有效質量的溶解蛋白質的轉運通過膜的最小膜面積大約是0.002m2/g細胞濕重。尺寸小于此膜1000KD截留分子量的溶解蛋白質與滲透液一起通過了膜，而較大的分子和不溶解蛋白質則被保留。滲濾的步驟如下(1)以體積為滯留物3倍的10mM Hepes/1mM EDTA/pH8.0(裂解緩沖液)滲濾裂解的發酵培養液，以通過滲透去除胞內和胞外性污染物。
(2)用10mM Hepes/1mM MgCl2/0.2％TritonTMX-100溶液滲濾裂解產物2次，以溶解和取出內膜蛋白質。Mg2+離子穩定了外膜，因此，外膜蛋白質不溶解在TritonTMX-100中。
(3)用50mM TrisTM/5 mM EDTA/0.2％ZwittergentTM3-14溶液滲濾裂解產物3次，以溶解和去除其它的外膜蛋白質(但不包括rP6)。EDTA螯合步驟(2)中的Mg2+離子，并防止蛋白質水解。
(4)用50mM TrisTM/5mM EDTA/0.5M NaCl/0.2％ZwittergentTM3-14滲濾裂解產物3次，以溶解和去除其他蛋白質。此步驟的緩沖液中加入NaCl，以破壞膜蛋白質和膜之間的離子性相互作用。進行這一步是因為脂化rP6是肽聚糖結合脂蛋白，鹽起著去除膜/外膜蛋白復合體中的膜結合蛋白質(不包括脂化的rP6)的作用(脂化的rP4不這樣結合，因而在抽提rP4時不進行這一步驟)。繼續以滯留物3倍體積的50mM TrisTM/5mM EDTA滲濾，以降低滯留物中ZwittergentTM的濃度。
(5)用50mM TrisTM/5mM EDTA/0.2％十二烷基肌氨酸鈉滲濾裂解產物3次，去除其他膜結合蛋白質(但不包括脂化的rP6)，然后用50mM TrisTM/5mM EDTA滲濾3次，減少滯留物中十二烷基肌氨酸鈉的濃度。
(6)用10mM磷酸鈉/0.2％ZwittergentTM3-12滲濾裂解產物3次，去除其他膜結合蛋白質(但不包括脂化的rP6)，然后用10mM磷酸鈉滲濾3次，減少滯留物中ZwittergentTM3-12的濃度。
(7)將裂解產物濃縮到其原體積的20％，然后55℃用10mM磷酸鈉/0.2％ZwittergentTM3-12滲濾3次，溶解脂化的rP6，通過滲透收集該蛋白質。滲濾之前進行濃縮，以增加滲透液中脂化rP6的濃度。55℃繼續用體積為其余滯留物3倍的10mM磷酸鈉滲濾，減少滯留物中ZwittergentTM3-12的濃度。進行這個加熱步驟是因為〔如上述步驟(4)〕脂化的rP6是一種肽聚糖結合脂蛋白，加熱可從膜/膜蛋白復合體中取出脂化的rP6(脂化的rP4不這樣結合，因而在抽提rP4時不進行這一步驟)。最后，55℃用滯留物3倍體積的10mM磷酸鈉結束滲濾。
滲濾期間，跨膜壓力維持在大約10psi，流量維持在大約120-180lmh。所有的滲濾過程在室溫中進行，除了最后的55℃抽提步驟外，因為該步驟在較高溫度進行可溶解脂化的rP6。滲透液流量范圍為30-50lmh，這對于該抽提方法的實際應用和大規模生產應是足夠高的。
抽提期間，采取自不同的點的樣品作SDS-PAGE分析，以評估不同滲濾步驟對蛋白質抽提的效果。如實施例1所述制備樣品和進行凝膠電泳。
圖3和4顯示了脂化rP6抽提期間取自滲透液樣品的典型SDS-PAGE分析。脂化的rP6以大約15KD在這些凝膠上運行。該凝膠顯示了滲濾期間一些污染蛋白質被裂解緩沖液(圖3，泳道2)和含有不同去污劑的緩沖液(圖3，泳道5和6；圖4，泳道3)所去除。在這些滲濾步驟中脂化的rP6的損失很少。在最后55℃ZwittergentTM3-12滲濾期間，脂化的rP6以部分純化的狀態被抽提得到(圖4，泳道6)。在第二次55℃ ZwittergentTM3-12滲濾步驟結束時，滲透液中的脂化rP6非常少(圖4，泳道8)。這表明大多數溶解的脂化rP6已通過滲透被回收。其它實驗也顯示滲濾過程完成后滯留物中殘留的不溶解的脂化rP6非常少(數據未給出)。Westem分析顯示，ZwittergentTM3-12/55℃抽提物的15KD條帶是脂化的rP6(數據未給出)。
重復上述方法，以從另一大腸桿菌發酵培養液中抽提脂化的rP6。SDS-PAGE分析得到與圖3和4類似的結果(數據未給出)，且Western分析也顯示ZwittergentTM3-12/55℃抽提物的15KD條帶是脂化的rP6(數據未給出)。
實施例4脂化rP6的另外抽提法這個實施例所給的數據得自脂化的rP6的3次另外抽提步驟。在各步驟中，使用實施例3中所述的方法從重組大腸桿菌發酵培養液中抽提得到脂化的rP6。
其結果列在表2中表2
權利要求
1.一種通過不同去污劑切向流滲濾，從細菌或含有重組載體的細菌宿主細胞中抽提得到天然或重組表達的革蘭陰性菌內膜蛋白質的方法，其特征在于，該方法包括(a)裂解發酵培養液中的細菌或含有重組載體的細菌宿主細胞；(b)用不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(a)得到的裂解發酵培養液，其中，所述緩沖液通過滲透去除了胞內和胞外性污染物，并用螯合劑防止蛋白質水解；(c)用去污劑和不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(b)得到的裂解產物，其中，所述去污劑溶解并取出內膜蛋白質，并使用二價陽離子穩定外膜蛋白質，防止它們溶解；和(d)收集(c)步取得的內膜蛋白質。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，(a)步的裂解發生在微流化器中；在(b)步中，緩沖液選自Hepes、3-(N-嗎啉代)丙磺酸(MOPS)、TrisTM、磷酸鈉和硼酸鈉；在(c)步中，緩沖液選自Hepes、MOPS、TrisTM、磷酸鈉和硼酸鈉，去污劑選自ZwittergentTM化合物、非離子性TritonTM化合物、十二烷基肌氨酸鈉、葡糖苷化合物、膽酸鹽化合物和十二烷基麥芽苷，二價陽離子選自Mg2+和Ca2+。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，在(b)步中，緩沖液是Hepes，螯合劑是EDTA；在(c)步中，緩沖液是Hepes，去污劑是TritonTMX-100，二價陽離子是Mg2+。
4.一種通過不同去污劑切向流滲濾，從細菌或含有重組載體的細菌宿主細胞中抽提得到天然或重組表達的革蘭陰性菌外膜蛋白質的方法，其特征在于，該方法包括(a)裂解發酵培養液中的細菌或含有重組載體的細菌宿主細胞；(b)用不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(a)得到的裂解發酵培養液，其中，所述緩沖液通過滲透去除了胞內和胞外性污染物，并用螯合劑防止蛋白質水解；(c)用去污劑和不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(b)得到的裂解產物，其中，所述去污劑溶解并去除內膜蛋白質，并使用二價陽離子穩定外膜蛋白質，防止它們溶解；(d)用(c)步的緩沖液滲濾從(c)得到的裂解產物，并且使用(c)步不含去污劑的二價陽離子，以降低(c)步的去污劑濃度；(e)用不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(d)得到的裂解產物，并用螯合劑和去污劑溶解和取出外膜蛋白質；(f)收集(e)步取得的外膜蛋白質。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，(a)的裂解發生在微流化器中；在(b)步中，緩沖液選自Hepes、MOPS、TrisTM、磷酸鈉和硼酸鈉；在(c)步中，緩沖液選自Hepes、MOPS、TrisTM、磷酸鈉和硼酸鈉，去污劑選自ZwittergentTM化合物、非離子性TritonTM化合物、十二烷基肌氨酸鈉、葡糖苷化合物、膽酸鹽化合物和十二烷基麥芽苷，二價陽離子選自Mg2+和Ca2+；在(d)步中，緩沖液選自Hepes、MOPS、TrisTM、磷酸鈉和硼酸鈉，二價陽離子選自Mg2+和Ca2+；在(e)步中，緩沖液選自Hepes、MOPS、TrisTM、磷酸鈉和硼酸鈉，去污劑選自ZwittergentTM化合物、非離子性TritonTM化合物、十二烷基肌氨酸鈉、葡糖苷化合物、膽酸鹽化合物和十二烷基麥芽苷。
6.如權利要求3所述的方法，其特征在于，在(b)步中，緩沖液是Hepes，螯合劑是EDTA；在(c)步中，緩沖液是Hepes，去污劑是TritonTMX-100，二價陽離子是Mg2+；在(d)步中，緩沖液是Hepes，二價陽離子是Mg2+；在(e)步中，緩沖液是TrisTM，螯合劑是EDTA，去污劑是ZwittergentTM3-12。
7.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法還包括(g)使用(e)步除去污劑外的其余試劑滲濾從(e)得到的裂解產物，以減少去污劑的濃度；(h)用(e)步試劑滲濾從(g)得到的裂解產物；和(i)收集(h)步取得的外膜蛋白質。
8.一種通過不同去污劑切向流滲濾，從細菌宿主細胞中抽提得到流感嗜血桿菌脂化重組外膜蛋白質P4(rP4)的方法，其特征在于，該方法包括(a)裂解發酵培養液中的細菌宿主細胞；(b)用不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(a)得到的裂解發酵培養液，其中，所述緩沖液通過滲透去除了胞內和胞外性污染物，并使用螯合劑防止蛋白質水解；(c)用去污劑和不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(b)得到的裂解產物，其中，所述去污劑溶解并去除內膜蛋白質，并使用二價陽離子穩定外膜蛋白質，防止它們溶解；(d)用(c)步的緩沖液滲濾從(c)得到的裂解產物，并且使用不含去污劑的(c)步二價陽離子，降低(c)步的去污劑濃度；(e)用不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(d)得到的裂解產物，用螯合劑和去污劑溶解外膜蛋白質；(f)用不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(e)得到的裂解產物，用螯合劑和去污劑抽提和取出脂化rP4；和(g)收集(f)步取得的脂化rP4。
9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，(a)的裂解發生在微流化器中；在(b)步中，緩沖液選自Hepes、MOPS、TrisTM、磷酸鈉和硼酸鈉；在(c)步中，緩沖液選自Hepes、MOPS、TrisTM、磷酸鈉和硼酸鈉，去污劑選自ZwittergentTM化合物、非離子性TritonTM化合物、十二烷基肌氨酸鈉、葡糖苷化合物、膽酸鹽化合物和十二烷基麥芽苷，二價陽離子選自Mg2+和Ca2+；在(d)步中，緩沖液選自Hepes、MOPS、TrisTM、磷酸鈉和硼酸鈉，二價陽離子選自Mg2+和Ca2+；在(e)步中，緩沖液選自Hepes、MOPS、TrisTM、磷酸鈉和硼酸鈉，去污劑選自ZwittergentTM化合物、非離子性TritonTM化合物、十二烷基肌氨酸鈉、葡糖苷化合物、膽酸鹽化合物和十二烷基麥芽苷；在(f)步中，緩沖液選自Hepes、MOPS、TrisTM、磷酸鈉和硼酸鈉，去污劑選自ZwittergentTM化合物、非離子性TritonTM化合物、十二烷基肌氨酸鈉、葡糖苷化合物、膽酸鹽化合物和十二烷基麥芽苷。
10.如權利要求9所述的方法，其特征在于，在(b)步中，緩沖液是Hepes，螯合劑是EDTA；在(c)步中，緩沖液是Hepes，去污劑是TritonTMX-100，二價陽離子是Mg2+；在(d)步中，緩沖液是Hepes，二價陽離子是Mg2+；在(e)步中，緩沖液是TrisTM，螯合劑是EDTA，去污劑是ZwittergentTM3-12；在(f)步中，緩沖液是TrisTM，螯合劑是EDTA，去污劑是ZwittergentTM3-12。
11.如權利要求8所述的方法，其特征在于，該方法還包括(h)使用不含去污劑的(f)步試劑滲濾從(f)得到的裂解產物，以減少去污劑的濃度；(i)用(f)步試劑滲濾從得到(h)的裂解產物，抽提和取出脂化rP4；和(j)收集(i)步取得的脂化rP4。
12.如權利要求11所述的方法，其特征在于，所述方法還包括(k)使用不含去污劑的(f)步試劑滲濾從(j)得到的裂解產物，以減少去污劑的濃度；(l)用(f)步試劑滲濾從(k)得到的裂解產物，抽提和取出脂化rP4；和(m)收集(l)步取得的脂化rP4。
13.一種通過不同去污劑切向流滲濾，從細菌宿主細胞中抽提得到流感嗜血桿菌脂化重組外膜蛋白質P6(rP6)的方法，其特征在于，該方法包括(a)裂解發酵培養液中的細菌宿主細胞；(b)用不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(a)得到的裂解發酵培養液，其中，所述緩沖液通過滲透去除了胞內和胞外性污染物，并用螯合劑防止蛋白質水解；(c)用去污劑和不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(b)得到的裂解產物，其中，所述去污劑溶解并去除內膜蛋白質，并使用二價陽離子穩定外膜蛋白質，防止它們溶解；(d)用不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(c)得到的裂解產物，使用螯合劑螯合二價陽離子防止蛋白質水解，使用去污劑溶解和去除除脂化rP6外的外膜蛋白質；(e)用不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(d)得到的裂解產物，用螯合劑防止蛋白質水解、去污劑去除其他外膜蛋白質以及用鹽破壞膜/外膜蛋白質復合物；(f)用不含去污劑和鹽的(e)步試劑滲濾從(e)得到的裂解產物，以減少去污劑的濃度；(g)用去污劑和不被滲濾膜保留的緩沖液滲濾從(f)得到的裂解產物，其中，所述去污劑溶解和去除結合于細胞外膜的其他蛋白質，使用螯合劑防止蛋白質水解；(h)用(g)步緩沖液和(g)步螯合劑滲濾從(g)得到的裂解產物，以降低(g)步的去污劑濃度；(i)用磷酸鹽化合物和去污劑滲濾從(h)得到的裂解產物，溶解和去除結合于細胞外膜的其他蛋白質；(j)用磷酸鹽化合物滲濾從(i)得到的裂解產物，以降低(i)步的去污劑濃度；(k)加熱(j)步的裂解產物，以從膜中取出脂化rP6，同時用磷酸鹽化合物和去污劑滲濾該裂解產物以溶解、抽提和取出脂化rP6；(l)收集(k)步取出的脂化rP6。
14.如權利要求13所述的方法，其特征在于，(a)的裂解發生在微流化器中；在(b)步中，緩沖液選自Hepes、MOPS、TrisTM、磷酸鈉和硼酸鈉，二價陽離子選自Mg2+和Ca2+；在(c)步中，緩沖液選自Hepes、MOPS、TrisTM、磷酸鈉和硼酸鈉，去污劑選自ZwittergentTM化合物、非離子性TritonTM化合物、十二烷基肌氨酸鈉、葡糖苷化合物、膽酸鹽化合物和十二烷基麥芽苷，二價陽離子選自Mg2+和Ca2+；在(d)步中，緩沖液選自Hepes、MOPS、TrisTM、磷酸鈉和硼酸鈉，去污劑選自ZwittergentTM化合物、非離子性TritonTM化合物、十二烷基肌氨酸鈉、葡糖苷化合物、膽酸鹽化合物和十二烷基麥芽苷；在(e)步中，緩沖液選自Hepes、MOPS、TrisTM、磷酸鈉和硼酸鈉，鹽是鈉鹽，去污劑選自ZwittergentTM化合物、非離子性TritonTM化合物、十二烷基肌氨酸鈉、葡糖苷化合物、膽酸鹽化合物和十二烷基麥芽苷；在(f)步中，緩沖液選自Hepes、MOPS、TrisTM、磷酸鈉和硼酸鈉；在(g)步中，緩沖液選自Hepes、MOPS、TrisTM、磷酸鈉和硼酸鈉，去污劑選自ZwittergentTM化合物、非離子性TritonTM化合物、十二烷基肌氨酸鈉、葡糖苷化合物、膽酸鹽化合物和十二烷基麥芽苷；在(h)步中，緩沖液選自Hepes、MOPS、TrisTM、磷酸鈉和硼酸鈉；在(i)中，去污劑選自ZwittergentTM化合物、非離子性TritonTM化合物、十二烷基肌氨酸鈉、葡糖苷化合物、膽酸鹽化合物和十二烷基麥芽苷；在(k)步中，去污劑選自ZwittergentTM化合物、非離子性TritonTM化合物、十二烷基肌氨酸鈉、葡糖苷化合物、膽酸鹽化合物和十二烷基麥芽苷。
15.如權利要求14所述的方法，其特征在于，在(b)步中，緩沖液是Hepes，螯合劑是EDTA；在(c)步中，緩沖液是Hepes，去污劑是TritonTMX-100，二價陽離子是Mg2+；在(d)步中，緩沖液是Hepes，螯合劑是EDTA，去污劑是ZwittergentTM3-14；在(e)步中，緩沖液是Hepes，螯合劑是EDTA，鹽是鈉鹽，去污劑是ZwittergentTM3-14；在(f)中，緩沖液是TrisTM，螯合劑是EDTA；在(g)步中，緩沖液是TrisTM，去污劑是十二烷基肌氨酸鈉，螯合劑是EDTA；在(h)步中，緩沖液是TrisTM，螯合劑是EDTA；在(i)步中，去污劑是ZwittergentTM3-12，磷酸鹽是磷酸鈉；在(j)中，磷酸鹽是磷酸鈉；在(k)步中，去污劑是ZwittergentTM3-12。
16.如權利要求13所述的方法，其特征在于，在進行步驟(k)之前先濃縮(j)步的裂解產物。
全文摘要
描述了采用不同去污劑切向流滲濾,從細菌或含有重組載體的細菌宿主細胞中抽提得到革蘭陰性菌膜內在蛋白質的方法。該方法與其它方法相比有一些優點。首先,本發明將澄清和抽提過程合并在一項操作中。從細胞中抽提產物,接著僅采用一連續滲濾過程將其與細胞碎片分開。其次,膜蛋白質以半純化狀態被抽提,這簡化了下游的加工步驟。第三,本發明基于規模化,因為所要求的僅僅是膜的表面積隨著細胞的數量成比例地增加。
文檔編號C07K1/34GK1358196SQ00809425
公開日2002年7月10日 申請日期2000年6月20日 優先權日1999年6月25日
發明者S·拉科蒂亞, M·R·比爾 申請人:美國氰胺公司