專利名稱：噻吩－乙基硫脲化合物及其在治療hiv中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及有效抑制HIV(包括突變型HIV毒株)的逆轉錄酶抑制劑并可有效治療對多種藥物有抗性的HIV感染。
最近開發的有效的抗逆病毒藥聯合用藥方案已明顯改善HIV和AIDS患者的預后。聯合療法可能是AIDS死亡顯著降低(死亡率和絕對數目降低)的主要因素。最常用的聯合用藥包括兩種核苷類似物加上(或不加)蛋白酶抑制劑。
奈韋拉平是目前唯一的NNI化合物，其一直用于與AZT和/或蛋白酶抑制劑聯合治療HIV。一系列新的有效藥物合劑療法極可能包括與核苷和蛋白酶抑制劑組合的其它NNIs，其作為三種作用的治療以對抗單一藥物治療過程中出現的日益嚴重的抗藥性問題。
不幸的是，病毒的高復制率導致遺傳性變型(突變型)，尤其是當以藥物治療形式引入選擇性壓力時。這些突變型對以前給予患者的抗病毒藥物產生抗藥性。調換藥物或采用聯合療法可以降低或延遲抗性，但由于單一藥物治療或甚至兩種藥物結合治療并不能完全抑制病毒的復制，所以抗藥性病毒毒株終究會出現。三種藥物聯合療法，即應用一(或二)種核苷類似物和二(或一)種靶向RT的NNI，為克服耐藥性問題提供了非常有前途的療法。對這三種作用藥物聯合療法產生抗性的RT突變型毒株很可能起不了作用。
許多突變型毒株對NNI化合物具有耐藥的特性，包括L1001、K103N、V106A、E138K、Y181C和Y188H。尤其是Y181C和K103N突變株是最難治療的，原因是它們對大多數已證實的NNI化合物都具有抗性。
最近，提出的一種采用失效(knock-out)濃度的NNI的方法顯示出非常有前景的結果。該方法主要概念是為防止出現抗藥性毒株，在治療的最初階段，給予高濃度的NNI以將病毒降低到不可檢測的水平。在該方法和三重作用聯合療法中，最適用的理想NNI化合物必須滿足三個標準1)細胞毒性極低，以便能適于高劑量應用；2)效力非常高，以能在病毒有時間產生抗性突變型毒株之前，完全壓制病毒的復制；和3)抑制目前臨床上觀察到的抗藥性突變型毒株的極強抗病毒活性。
目前迫切需要新的NNI方案，該方案可采用抑制最常見的突變型的改進的強效藥物，將RT抑制降低至亞納摩爾濃度，并優選能夠抑制最難對付的突變型。理想的新的抗病毒藥物具有以下所需特性(1)對RT的有效抑制作用；(2)極低的細胞毒性；以及(3)改進的抑制所知的抗藥性HIV株的能力。目前，幾乎沒有具有所有這些所需特性的抗-HIV藥物。
已被美國FDA批準并在美國銷售的兩種HIV RT的非核苷抑制劑(NNI)是奈韋拉平(二吡啶并二氮雜酮衍生物)和delavirdine(雙(雜芳基)哌嗪(BHAP)衍生物，BHAPU-90152)。已開發出的抑制HIV RT的其它有前景的新的非核苷抑制劑(NNIs)包括二氫烷氧基芐氧基嘧啶(DABO)衍生物、1-[(2-羥基乙氧基)甲基]-6-(苯硫基)胸腺嘧啶(HEPT)衍生物、四氫苯并二氮雜(TIBO)衍生物、2’，5’-雙-O-(叔丁基二甲基硅烷基)-3’-螺-5”-(4”-氨基-1”，2”-oxathiole-2”，2’-二氧化物)嘧啶(TSAO)、氧硫雜環己二烯carboxanilide衍生物、喹喔啉衍生物、噻二唑衍生物和苯乙基噻唑基硫脲(PETT)衍生物。
已發現NNIs通過改變RT的構象或移動性，可與多聚酶位置附近的HIV-RT的特定變構位置結合，并干擾逆轉錄，由此導致該酶的非競爭性抑制(Kohlstaedt，L.A.等，Science，1992，256，1783-1790)。
已報道多種與NNIs復合的RT的晶體結構(包括α-APA、TIBO、奈韋拉平和HEPT衍生物)，這些結構信息為旨在與RT具有最大結合親和力的NNI的進一步衍生化提供了基礎。但是，可以獲得的RTNNI復合物的晶體結構的數量很有限。
假若缺乏給出的結構信息，則必須依賴其它的設計方法來制備活性抑制劑，如PETT和DABO衍生物。其中首次報道的系統合成PETT衍生物的方法之一是分析RT的不依賴于結構性質結構-活性關系導致開發出一些具有明顯抗-HIV活性的PETT衍生物(Bell，F.W.等，J.Med.Chem.，1995，38，4929-4936；Cantrell，A.S.等，J.Med.Chem.，1996，39，4261-4274)。
合成了一系列作用于HIV逆轉錄酶(RT)的NNI結合位置的選擇性苯乙基噻唑基硫脲(PETT)衍生物，并進行了抗人免疫缺陷病毒(HIV)活性的試驗。通過生理實驗及其抗-HIV活性有助于這些PETT衍生物基于結構的設計和合成。某些這類新衍生物比AZT或Troviridine更有活性，它們能在納摩爾濃度下消除HIV的復制，而無明顯的細胞毒性。這些化合物可用于治療HIV感染，并對突變型毒株特別有效，從而將其用于治療對多種藥物有抗性的HIV。
發明概述本發明提供新的噻吩-乙基-硫脲(TET)化合物，作為最新鑒定的HIV逆轉錄酶的非核苷抑制劑(NNI)。本發明的新TET化合物、組合物和方法可用于治療HIV感染，并對抑制多種HIV毒株，包括對多種藥物有抗性的突變型毒株尤其有效。
本發明的TET化合物、組合物和方法可用于抑制逆轉錄酶活性，并抑制多種HIV毒株的復制，包括初次治療(therapy-naive)、抗藥性和對多種藥物有抗性的毒株。尤其是，通過給予本發明的TET化合物(如在藥用組合物中)本發明TET的化合物可用于治療患者的逆病毒感染，如HIV-1感染。
本發明的TET化合物含有噻吩結構，如式I所示。該噻吩可被取代(Rn)或未取代。R1是可被取代或未取代的環部分。該環部分可以是芳環和/或雜環。本發明的一種示例性TET化合物為WH-443，其具有式II中所示的特定結構。 本發明使用的TET化合物和組合物呈現很低的細胞毒性和很高的抗HIV效力。
在以下詳細的說明書和實施例中更全面地說明本發明的特定化合物和方法。
發明詳述定義本發明所用以下術語具有指定的意義“NNI”指非核苷抑制劑。在本發明內容中，定義HIV逆轉錄酶(RT)的非核苷抑制劑。
“突變型HIV”指與野生型相比，具有一或多個突變或改變的氨基酸的HIV毒株。
“對多種藥物有抗性的HIV”指對一種或多種治療用的化療劑具有抗性的一種或多種HIV毒株。
“治療有效量”指給予能提供某些治療效果的劑量，包括，本發明內容中的降低病毒活性或患者中的病毒量，還包括抑制病毒RT活性和/或病毒復制的量。本發明化合物本發明化合物包括用作RT非核苷抑制劑的具有式I的噻吩-乙基-硫脲(TET)化合物 該噻吩化合物可以是取代的或未取代的，例如R可以是H、鹵素、(C1-C12)烷基或烷氧基、氨基、氰基、硝基、羥基等。n的值可以是0-4。R1是環部分，其可被取代或未取代，如苯基、吡啶基、哌啶基、胡椒基、嗎啉基、呋喃基等，還可以是，如環(C3-C12)烷基、環(C3-C12)鏈烯基、異噻唑基、四唑基、三唑基、吡啶基、咪唑基、苯基、萘基、苯并噁唑基、苯并咪唑基、噻唑基、噁唑基、苯并噻唑基、吡嗪基、噠嗪基、噻二唑基、苯并三唑基、吡咯基、吲哚基、苯并噻吩基、噻吩基、苯并呋喃基、喹啉基、異喹啉基、吡唑基等。R1上任選的取代基包括，如，(C1-C3)烷基、(C1-C3)烷氧基、鹵代或羥基。
在一優選實施方案中，R1是吡啶基，任選被一或多個，諸如烷基、烷氧基、鹵素或羥基的取代基取代。更優選，R1是被鹵素(如溴或氯)取代的吡啶基。本發明的一個示例化合物是N-[2-(2-噻吩)乙基]-N-[2-(5-溴吡啶基)]-硫脲(HI-443)，其中R1是被鹵素，溴取代的吡啶基。
本發明化合物還包括用作RT非核苷抑制劑的具有式II的噻吩-乙基-硫脲(TET)化合物 該噻吩可被取代或未取代，例如R可以是H、鹵素、(C1-C12)烷基或烷氧基、氨基、氰基、硝基、羥基等。n的值可以是0-4。X可以是S或O。Z可以是-NH-或O。R2是環部分，其可被取代或未取代，如苯基、吡啶基、哌啶基、胡椒基、嗎啉基、呋喃基、噻唑基、2’，3’-二脫氫-2’，3’-二脫氧胸腺嘧啶核苷基(d4T)等，還可以是，如環(C3-C12)烷基、環(C3-C12)鏈烯基、異噻唑基、四唑基、三唑基、吡啶基、咪唑基、苯基、萘基、苯并噁唑基、苯并咪唑基、噻唑基、噁唑基、苯并噻唑基、吡嗪基、噠嗪基、噻二唑基、苯并三唑基、吡咯基、吲哚基、苯并噻吩基、噻吩基、苯并呋喃基、喹啉基、異喹啉基、吡唑基等。R2上任選的取代基包括，如，H、(C1-C3)烷基、(C1-C3)烷氧基、鹵素、-CO-烷基和羥基。
在另一優選實施方案中，R2是噻唑基，其任選被一或多個，諸如烷基、烷氧基、鹵素或羥基的取代基取代。更優選，R2是噻唑基。本發明的一示例化合物是N-[2-(2-噻吩基乙基)]-N’-[2-(噻唑基)]硫脲(DDE530)，其中R2是噻唑基。
優選的式II化合物包括表A中列出的化合物。
表A 本發明化合物優選與多聚酶位點附近的HIV-RT的特定變構位點結合，并例如，通過改變RT構象或移動性干擾逆轉錄。酸式鹽本發明化合物還可以為藥學上可接受的酸加成鹽的形式。可用有機和無機酸形成藥學上可接受的酸加成鹽。
形成鹽的適當酸的實例包括鹽酸、硫酸、磷酸、乙酸、檸檬酸、草酸、丙二酸、水楊酸、蘋果酸、葡糖酸、富馬酸、琥珀酸、抗壞血酸、馬來酸、甲磺酸等。可用常用方法，通過將游離堿形式與足量所需的酸接觸生成單鹽或雙鹽等，制備這些鹽。可通過用堿處理該鹽的形式，再形成游離堿形式。例如，可利用堿的稀釋水溶液。適用于該目的的有氫氧化鈉、碳酸鉀、氨和碳酸氫鈉溶液的稀水溶液。在某些物理性質方面，如極性溶劑中的溶解性，游離堿形式與其對應的鹽形式不同，但對于本發明的目的而言，這些鹽等同于它們對應的游離堿形式。當R是H時，使用過量的堿得到對應的堿式鹽。應用本發明化合物的方法本發明化合物可用于抑制逆病毒的逆轉錄酶活性的方法中。可通過在體外或體內使RT與有效抑制量的本發明化合物接觸，抑制逆病毒的逆轉錄酶。本發明化合物還可抑制逆病毒，尤其是HIV，如HIV-1的復制。病毒的復制如可通過使該病毒與有效抑制量的本發明化合物接觸而抑制。
本發明方法可用于抑制多種HIV毒株(包括突變型毒株)的逆轉錄酶和/或復制，并包括治療患者逆病毒感染(如HIV-1感染)，其通過給予有效抑制量的化合物或式I化合物的藥學上可接受的酸加成鹽。式I化合物或抑制劑優選與藥學上可接受的載體結合進行給藥，并可與特定的轉運劑(包括靶向抗體和/或細胞因子)合并給藥。本發明化合物或抑制劑可與其它抗病毒藥、免疫調節劑、抗體或疫苗聯合給藥。
式I化合物可以以含有常規非毒性藥學上可接受的載體、輔助劑或介質的劑量單位制劑的形式，通過口服、非腸道(包括皮下注射、靜脈內、肌內、腹腔內注射或輸注技術)、吸入噴射、局部、通過粘膜吸收或通過直腸進行給藥。本發明藥用組合物可以是適于口服給藥的混懸劑或片劑、鼻腔噴霧劑、軟膏劑、無菌注射劑，如無菌注射水溶性或油溶性的混懸劑，或者栓劑。在一實施方案中，本發明的TET化合物例如可以以凝膠形式陰道和/或局部給藥，用于防止HIV的異性傳染。
對于口服給藥的混懸液，可根據藥物制劑領域熟悉的技術制備該組合物。該組合物可含有增加松散性的微晶纖維素、作為混懸劑的藻酸或藻酸鈉、作為增粘劑的甲基纖維素以及甜味劑或矯味劑。對于速釋片劑，該組合物可含有微晶纖維素、淀粉、硬脂酸鎂和乳糖或其它本領域熟知的賦形劑、粘合劑、增量劑、崩解劑、稀釋劑和潤滑劑。
對于吸入或噴霧給藥，可根據藥物制劑領域熟悉的技術制備該組合物。可采用苯甲醇或其它本領域熟知的適當的防腐劑、增強生物利用度的吸收促進劑、氟烴、增容劑或分散劑，將該組合物制成鹽水中的溶液劑。
對于注射給藥的溶液劑或混懸液，可根據本領域熟悉的技術，采用適當的分散或濕潤劑和懸浮劑，如無菌油類，包括合成的一或二甘油酯，以及脂肪酸，包括油酸，配制該組合物。
對于直腸給藥的栓劑，可通過與適當非刺激性的賦形劑，如可可脂、合成的甘油酯或聚乙二醇，進行混合制備該組合物，這些賦形劑室溫下為固體，但在直腸內液化或溶解釋放出藥物。
在治療或預防逆病毒感染，如HIV感染、AIDS或AIDS相關綜合癥(ARC)中，每日的劑量水平為約0.02-10.0g本發明化合物，每日口服2-5次以上。例如，治療HIV感染，可每日1-4次，按每kg體重約0.1-100mg化合物給予。在一實施方案中，每6小時口服給予患者約100-400mg化合物的劑量。任何具體患者的特定劑量水平和給藥次數是不同的，其依據多種因素變化，包括特定化合物的活性、該化合物的代謝穩定性和作用時間長度、患者的年齡、體重、健康狀況、性別和飲食、給藥方式、排泄率、聯合應用的藥物以及具體癥狀的嚴重程度。
式I化合物可與其它藥物聯合應用于治療HIV感染、AIDS或ARC。例如，可將本發明化合物與有效量的抗病毒劑、免疫調節劑、抗感染藥或疫苗聯合給藥。本發明化合物可在接觸逆病毒(如HIV)的急性或潛伏期之前、期間或之后給藥。與靶向部位的結合本發明化合物可通過使化合物與靶向部位結合，被靶向特定傳遞至需治療的細胞中。用于與本發明化合物結合的靶向部位包括抗體、細胞因子和表達在所治療細胞上的受體配體。
術語“結合物”指與2或多個化合物形成的復合物。
術語“靶向部位”指用于為達到所需活性，能將本發明化合物轉運至特定部位的化合物。靶向部位包括，如，細胞表面存在的能特異性地結合分子的分子。本發明中應用的這些靶向部分包括抗-細胞表面抗原抗體。細胞因子，包括白細胞介素、因子如上皮細胞生長因子(EGF)等，也是已知能結合表達高水平的其受體的細胞的特定靶向部位。
為治療活性而將本發明化合物定靶向給予細胞的特別有用的靶向部位包括與所治療的病毒-感染細胞上存在的抗原或受體結合的那些配體。例如，T-細胞上存在的抗原，如CD48，可被抗體靶向引導。還可應用抗體片段，包括單鏈的片段。在靶向抗病毒治療靶細胞的科學文獻中，已知還有其它的這些配體-受體結合對。制備本發明化合物和靶向部分的結合物的方法是已知的。制備本發明化合物的方法可按流程1和2所示制備本發明化合物。一般地，在室溫下，在乙腈溶劑中，使適當的胺(R1-NH2)與1，1’-硫代羰基-二咪唑或1，1’-羰基-二咪唑反應約12小時，形成硫代羰基或羰基試劑。在一實例中，可用2’，3’-二脫氫-2’，3’-二脫氧胸腺嘧啶核苷(d4T)代替R1-NH2。然后在非質子溶劑如二甲基甲酰胺(DMF)中，在升高溫度如100℃下，將反應產物與取代的或未取代的硫代乙胺縮合一段較長的時間如約15小時。將所需化合物經柱層析純化。流程1 流程2 本發明化合物可按以上說明合成或者通過其它已知的合成方法合成。
實施例還可通過參考以下實施例進一步說明本發明，這些實施例用于說明這些實施方案，并不對本發明作任何限定。
實施例1取代的硫脲化合物的對比最近，我們報導用具有大體積的折疊的(puckered)哌啶基或哌嗪基環置換trovirdine的平面吡啶環，可較好地填充蝴蝶形NNI結合囊(pocket)的空間側翼2區域(Mao等，1998，Bioor.Medicinal Chem.Lett.82213-2218)。這些雜環比芳環在構象上更具柔性，因此通過能更有效地適于不可調和的結合囊，而很可能具有增加的優點，盡管結合中有較大的熵損失。
首先合成的2個雜環化合物是N-[2-(1-哌啶基乙基)]-N’[2-(5-溴吡啶基)]-硫脲(HI-172)和N-[2-(1-哌嗪基乙基)]-N’[2-(5-溴吡啶基)]-硫脲(Mao等，同上)。當分析抗病毒活性時，這兩個雜環化合物都比trovirdine更有效，在納摩爾濃度下，在人體外周血單核細胞(PBMC)中，可消除NNI-敏感HIV-1毒株HTLVIIIB的復制。但是，與trovirdine不同，這兩個化合物都不能制NNI-抗性的HIV-1毒株(Mao等，1999，Bioorg.Med Chem.Lett.91593-1598)。這些最初的發現證實用體積大(bulky)的環代替trovirdine的吡啶環能產生有用的化合物，但是這些新化合物可能未保留抑制具有RT突變的HIV-1毒株的能力。
為進一步清楚RT-NNIs的構效關系并發現新的、有效的NNIs，我們用8個不同雜環取代基之一代替trovirdine的吡啶環，包括a.雜環胺吡咯烷、1-甲基-吡咯烷、嗎啉、咪唑、吲哚；b.雜環芳基呋喃和噻吩；和c.芳族醛胡椒基。化合物的合成按流程3和4所述合成硫脲和脲化合物。簡單地講，將2-氨基-5-溴吡啶與1，1-硫代羰基二咪唑縮合，得到前體的硫代羰基衍生物。再與適當取代的苯乙胺反應，生成高收率的目標化合物。
更詳細地講，室溫下，將硫代羰基二咪唑(8.90g，50mmol)和2-氨基-5-溴吡啶(8.92g，50mmol)加入到50mL干燥乙腈中。將反應混合液攪拌12小時，過濾沉淀，用冷乙腈(2×25mL)洗滌，真空干燥得到化合物A(11.40g，80％)。向化合物A(0.55eqv)的二甲基甲酰胺(15mL)混懸液中，加入適當的胺(0.50eqv)。將反應混合液加熱至100℃，使其硬化15小時。將反應混合液倒入冰冷的水中，將該混懸液攪拌30分鐘。過濾產物，用水洗滌，干燥，經柱層析進一步純化，得到較高收率的目標化合物。以Trovidine為標準對照品，根據Bell等，J.Med.Chem 1995，384926-9；Ahgren等，1995，Antimicrob.AgentsChemotherapy 391329-1335說明的方法制備。流程3 流程4 a＝1，1’-硫代羰基二咪唑，乙腈，室溫，12小時b＝DMF，100℃，15小時R1見表1中所示。合成化合物的特征鑒定質子和碳核磁共振光譜用自動寬帶探測器的Varian光度計測定。除另有說明，所有NMR光譜都在室溫下在CDCl3中測定。化學位移以相對于標準物四甲基硅烷的每百萬分的份數進行記錄。信號的多重性按如下表示s、d、dd、t、q、m，其分別對應于單峰、雙重峰、兩個雙重峰、三重峰、四重峰和多重峰。UV光譜用Beckmann型#DU 7400紫外/可見(UV/Vis)分光光度計，采用1cm光路吸收池測定記錄。傅立葉變換紅外光譜采用FT-Nicolet型Protege#460儀器記錄。液體樣品的紅外光譜以純液體采用KBr片進行測定。質譜分析采用Finnigan MAT 95儀器或者Hewlett-Packard基質輔助激光吸附(MALDI)光度計#G2025A型測定。后者所用基質為氰基羥基肉桂酸。熔點采用Melt John熔點儀測定，未經校正。元素分析采用AtlanticMicrolabs(Norcross，GA)測定。柱層析采用硅膠(Baker Company提供)進行。洗脫使用的溶劑根據化合物變化，包括以下一種乙酸乙酯、甲醇、氯仿、己烷、二氯甲烷和乙醚。所合成化合物的特征數據如下所示N-[2-(2-氟苯乙基)]-N’-[2-(5-溴吡啶基)]硫脲(HI-240)收率71％；mp.156-157℃；UV(MeOH)λmax209，256，274，305nm；IR(KBr)ν3446，3234，3163，3055，2935，1672，1595，1560，1531，1466，1390，1362，1311，1265，1227，1169，1136，1089，1003，864，825，756cm-1；1HNMR(CDCl3)δ11.36(bs，1H)，9.47(bs，1H)，8.05-8.04(dd，2H)，7.29-7.24(m，1H)，7.13-7.03(m，3H)，6.87-6.84(d，1H)，4.06-3.99(q，2H)，3.10-3.05(t，2H)，13C(CDCl3)δ179.1，151.7，146.2，141.1，131.2，131.1，128.5，128.4，124.1，115.5，115.2，113.6，112.2，45.8和28.2；19F(CDCl3)δ-42.58 &-42.55(d)；MALDI-TOF質量355(M+1)，計算質量354；分析(C14H13BrFN3S)C、H、N、S；N-[2-(1-pyrolidyl乙基)]-N’-[2-(5-溴吡啶基)]硫脲(HI-230)收率72％，mp.136-138℃；UV(MeOH)λmax203，206，252，277，306nm；IR(KBr)ν3454，3220，3159，3059，2941，2787，1595，1531，1475，1311，1229，1182，1061，1003，864，821，706cm-1；1HNMR(CDCl3)δ11.53(bs，1H)，9.17(bs，1H)，8.19-8.11(d，1H)，7.73-7.69(d，1H)，6.82-6.79(dd，1H)，3.85-3.83(q，2H)，2.79(t，2H)，2.60(bm，4H)，1.81(bm)；13C(CDCl3)δ178.7，151.7，146.5，141.1，113.4，112.7，53.8，53.6，44.9和23.7；MALDI-TOF質量329(M+1)，計算質量328；分析(C12H17BrN4S)，實測值C42.64，H4.80，N16.71；S7.72，Br28.04；N-[2-(1-胡椒基)]-N’-[2-(5-溴吡啶基)]硫脲(HI-257)收率70％，mp.159-162℃；UV(MeOH)λmax209，276nm；IR(KBr)ν3450，3215，3151，3082，3009，2931，1591，1562，1529，1500，1475，1305，1238，1168，1086，1041，933，858，825，794，688cm-1；1HNMR(DMSO-d6)δ11.64(bs，1H)，10.68(bs，1H)，8.17-8.16(s，1H)，7.75-7.72(d，1H)，7.19-7.16(d，1H)，6.91-6.90(s，1H)，6.84-6.83(d，1H)，6.79-6.77(d，1H)，6.01(s，2H)，4.86-4.84(d，2H)；13C(CDCl3)δ178.7，151.3，146.4，144.7，139.7，130.3，119.5，113.5，110.9，106.9，99.7和47.3；MALDI-TOF質量366(M+Na)，計算質量345；分析(C14H12BrN3O2S)C、H、N、S、Br；N-[2-(1-哌啶子基乙基)]-N’-[2-(5-溴吡啶基)]硫脲(HI-172)收率74％，mp.150-152℃；CHCl3∶MeOH(9∶1)中Rf＝0.74；UV(MeOH)λmax306，275和205nm；IR(KBr)ν3155，3077，2935，2850，2360，1591，1525，1465，1319，1226，1095，827和756cm-1；1HNMR(CDCl3)δ11.53(s，1H)，9.72(s，1H)，8.22(s，1H)，7.72-7.68(d，1H)，6.95-6.92(d，1H)，3.84-3.78(q，2H)，2.61-2.57(t，2H)，2.45(bs，4H)，1.64-1.48(m，6H)；13C(CDCl3)δ178.1，151.8，146.3，140.8，113.5，112.6，56.1，54.0，43.0，26.3和24.3；MALDI-TOF上測得質量343.5；準確質量343；分析(C13H19BrN4S)C、H、N、S、Br；N-[2-(1-甲基-2-吡咯烷基乙基)]-N’-[2-(5-溴吡啶基)]硫脲(HI-206)收率56％，CHCl3∶MeOH(9∶1)中Rf＝0.34；UV(MeOH)λmax307，276，256和207nm；IR(KBr)ν 3207，2944，2782，2360，1591，1467，1307，1226，1093和825cm-1；1HNMR(CDCl3)δ11.18(s，1H)，8.80(s，1H)，8.22(s，1H)，7.74-7.70(d，1H)，6.75-6.72(d，1H)，3.82-3.72(q，2H)，3.61-3.54(m，1H)，3.14-3.04(t，2H)，2.34(s，3H)，2.19-1.60(m，6H)；13C(CDCl3)δ178.9，146.9，140.8，113.3，112.2，64.2，57.2，43.4，40.7，32.4，30.5和22.2；MALDI-TOF上測得質量343.6；準確質量343；分析(C13H19BrN4S)實測值C45.49，H5.58，N16.32，S9.34，Br23.28；N-[2-(5-溴吡啶基)]-N’-[2-(2-咪唑乙基)]硫脲(HI-436)收率44％；mp104-107℃；UV(MeOH)λmax208，275，305nm；IR(KBr)ν3490，3228，3097，2944，2618，1592，1529，1502，1463，1301，1267，1228，1199，1095，937，862，827，784，750，661，595 cm-1；1HNMR(DMSO)δ11.12(bs，1H)，10.13(bs，1H)，7.82-7.81(d，1H)，7.41-7.38(dd，1H)，7.33(s，1H)，6.80-6.77(d，1H)，6.61(s，1H)，4.89(bs，1H)，3.76-3.69(q，2H)，2.73-2.68(t，2H)；13C NMR(DMSO)δ178.3，151.4，144.8，139.8，134.0，133.9，116.2，113.4，111.1，44.2，25.4；MALDI-TOF實測值327.6；N-[2-(5-溴吡啶基)]-N’-[2-(2-噻吩基乙基)]硫脲(HI-443)收率40％；mp160-161℃；UV(MeOH)λmax 260，276，306nm；IR(KBr)ν3218，3151，3087，2935，2873，1594，1552，1531，1332，1297，1265，1224，1188，1134，1089，1076，1006，833，811，784，742，688，582，503cm-1；1HNMR(CDCl3)δ11.45(bs，1H)，10.40(bs，1H)，8.03(s，1H)，7.68-7.64(dd，1H)，7.20-7.19(d，1H)，7.08-7.04(dd，1H)，6.99-6.95(m，1H)，6.91(s，1H)，4.04-3.97(q，2H)，3.24-3.20(t，2H)。13C NMR(CDCl3)δ179.1，151.7，145.1，140.6，140.1，126.2，124.8，123.3，113.8，111.5，46.1，28.4；N-[2-(5-溴吡啶基)]-N’-[2-(3-吲哚基乙基)]硫脲(HI-442)收率44％；mp208-209℃；UV(MeOH)λmax222，274，305nm；IR(KBr)ν3351，3207，3147，3079，3035，2915，2869，2840，1591，1556，1531，1465，1421，1328，1299，1230，1189，1105，1004，950，906，860，831，752，644，588，509cm-1；1HNMR(CDCl3)δ11.30(bs，1H)，10.32(bs，1H)，10.20(bs，1H)，7.81(d，1H)，7.65-7.58(m，2H)，7.41-7.39(d，1H)，7.16-7.11(t，2H)，7.05-7.00(t，2H)，4.06-4.00(q，2H)，3.15-3.11(t，2H)；13C NMR(CDCl3)δ178.4，151.6，144.9，139.8，135.7，126.4，122.0，120.6，117.9，117.7，113.5，111.1，111.0，110.7，45.4，23.7；N-[2-(5-氯吡啶基)]-N’-[2-(2-咪唑基乙基)]硫脲(HI-446)收率56％；mp175℃；UV(MeOH)λmax209，274，307nm；IR(KBr)ν3494，3226，3089，2944，2620，1598，1556，1531，1465，1390，1311，1267，1230，1197，1110，1008，937，864，827，784，752，663，621，597，507，474cm-1；1HNMR(CDCl3)δ11.38(bs，1H)，10.40(bs，1H)，7.99-7.98(t，1H)，7.72-7.68(dd，1H)，7.7.56-7.52(dd，2H)，7.13-7.10(d，1H)，6.86(s，1H)，4.02-3.96(q，2H)，2.98-2.94(t，2H)；13C NMR(CDCl3)δ178.4，151.2，142.5，137.2，133.9，123.2，112.9，44.2，25.5；N-[2-(5-溴吡啶基)]-N’-[2-(2-呋喃基甲基)]硫脲(HI-503)收率44％；mp187-188℃；UV(MeOH)λmax209，276，307nm；IR(KBr)ν3216，3155，3083，3037，2921，1594，1550，1529，1463，1307，1228，1176，1135，1093，1006，968，864，817，719，568cm-1；1HNMR(DMSO)δ11.50(t，1H)，10.86(bs，1H)，8.32-8.31(d，1H)，7.99-7.95(dd，1H)，7.60(t，1H)，7.17-7.14(d，1H)，6.42-6.35(m，2H)，4.87-4.85(d，2H)；13C NMR(DMSO)δ179.8，152.5，151.0，146.3，142.7，141.7，114.8，112.3，110.8，107.8，41.6；N-[2-(5-溴吡啶基)]-N’-[2-(4-嗎啉子基乙基)]硫脲(HI-276)收率43％；mp159-160℃；UV(MeOH)λmax207，275，306nm；IR(KBr)ν3209，3153，3079，3025，2942，2852，2807，1592，1562，1533，1465，1334，1299，1228，1199，1143，1112，1018，943，912，862，831，727，700，507cm-1；1H NMR(CDCl3)δ11.52(bs，1H)，9.24(bs，1H)，8.25(s，1H)，7.76-7.72(dd，1H)，6.89-6.82(t，1H)，3.87-3.75(m，6H)，2.69-2.55(m，6H)；13C NMR(CDCl3)δ178.6，151.7，146.5，141.1，113.5，112.8，67.2，55.9，53.1，42.5；N-[2-(5-溴吡啶基)]-N’-[2-(吡啶基)]硫脲(HI-142)收率54％；mp152-154℃；UV(MeOH)λmax208，273，306，485nm；IR(KBr)ν3224，3156，3085，3039，2931，1583，1558，1531，1465，1432，1361，1319，1263，1228，1166，1135，1095，1012，885，825，756，700，661，567，511cm-1；1H NMR(CDCl3)δ11.55(bs，1H)，9.56(bs，1H)，8.61-8.60(d，1H)，8.08-8.07(d，1H)，7.71-7.62(m，2H)，7.29-7.18(m，2H)，6.89-7.86(d，1H)，4.24-4.17(q，2H)，3.25-3.21(t，2H)；13CNMR(CDCl3)δ178.7，158.6，151.6，148.9，146.2，140.9，136.6，123.6，121.6，113.5，112.6，44.9，36.6；N-[2-(2-吡啶基乙基)]-N’-[2-(吡啶基)]硫脲(HI-207)收率49％；CHCl3∶MeOH(9∶1)中Rf＝0.68；UV(MeOH)λmax293，265，247和209nm；IR(KBr)ν3415，3222，3050，2360，1600，1533，1479，1436，1315，1240，1151和775cm-1；1H NMR(CDCl3)δ11.90(s，1H)，8.8(s，1H)，8.60-8.58(d，1H)，8.03-8.01(d，1H)，7.65-7.56(m，2H)，7.27-7.14(m，2H)，6.93-6.89(d，1H)，6.80-6.77(d，1H)，4.23-4.15(q，2H)和3.41-3.20(t，2H)；13C(CDCl3)δ179.2，158.9，153.0，149.2，145.5，138.5，136.4，123.5，121.4，117.7，111.8，44.9和36.9；MALDI-TOF測得質量257.1；準確質量＝258；分析(C13H14N4S)C，H，N，S；N-[2-(1-哌嗪基乙基)]-N’-[2-(5-溴吡啶基)]硫脲(HI-258)收率75％；mp178-180℃；UV(MeOH)λmax209，275，305，IR(KBr)ν3448，3223，3159，3034，2812，1666，1595，1466，1435，1308，1229，1130，1092，1000，833cm-1；1HNMR(CDCl3)δ1HNMR(CDCl3)11.50(s，1H)，9.77(s，1H)，8.19-8.11(d，2H)，7.75-7.71(d，1H)，6.97-6.95(d，1H)，3.87-3.86(q，2H)，3.63-3.60(t，2H)，3.45-3.42(t，2H)，2.74-2.69(t，2H)，2.59-2.52(m，4H)；13C(CDCl3)δ178.7，160.8，151.8，146.1，141.0，113.7，112.7，55.2，52，51.9，45.8，42.5和40.1；MALDI-TOF上測得質量343.5；準確質量＝343；分析(C12H18BrN5S)，實測值C41.98，H4.88，N18.74；S8.52，Br21.58；N-(2-噻吩乙基)-N’-[2-(5-氯吡啶基)]硫脲(DDE 524)收率40％；mp163-164℃；UV(MeOH)λmax206，253，274，303nm；IR3219，3160，3039，2935，2854，1596，1556，1531，1473，1334，1256，1228，1186，1134，1110，815，686cm-1；1H NMR(DMSO-d6)δ11.32(t，1H)，10.76(s，1H)，8.10(dd，1H，J＝3.3)，7.87-7.83(dd，1H，J＝11.4)，7.37-7.35(ddd，1H，J＝6.9)，7.18-7.15(dd，1H，J＝9.6)，6.99-6.95(m，2H)，3.84(q，2H，J＝5.4)，3.15(t，2H，J＝6.9)；13C NMR(DMSO-d6)δ179.2，152.1，143.6，141.2，138.9，127.1，125.8，124.5，123.8，114.1，46.5，28.6；MALDI-TOF 299.5(M+2)；N-[2-(2-噻吩乙基)]-N’-[2-(噻唑基)]硫脲(DDE 530)收率36％；mp193-194℃；UV(MeOH)λmax207，212，215，232，236，255，289nm；IR3219，3151，3087，3003，2935，1595，1552，1531，1471，1298，1263，1211，1188，1134，1076，846，812，686cm-1；1H NMR(DMSO-d6)δ11.66(br s，1H)，9.69(br s，1H)，7.34(d，2H，J＝3.3)，7.08(d，1H，J＝3.6)，6.97-6.93(m，2H)，3.78(q，2H)，3.12(t，2H)；13CNMR(DMSO-d6)δ178.3，161.9，141.1，136.5，127.1，125.6，124.4，112.1，45.9，28.6；MALDI-TOF 270.7(C10H11N3S3+1)。純化RT的抗-HIV活性試驗采用無細胞Quan-T-RT系統(Amersham，Arlington Heights，IL)，對所合成化合物進行抗純化重組HIV RT的RT抑制活性(IC50[rRT])試驗，該系統利用Bosworth等，1989，Nature 341167-168中說明的閃爍親近測定法原理。在該實驗中，通過生物素/鏈霉抗生物素鍵合，使DNA/RNA模板與SPA珠粒結合。引物DNA是16-聚體寡聚(T)，其已被退火為多(A)模板。該引物/模板與鏈霉抗生物素-包被的SPA珠粒結合。
通過逆轉錄，將3H-TTP結合到該引物中。簡言之，將終濃度為0.5μ Ci/樣品的3H-TTP在RT試驗緩沖液(49.5mM Tris-Cl，pH8.0，80mM KCl、10mM MgCl2、10mM DTT、2.5mM EGTA、0.05％Nonidet-P-40)中稀釋，然后加入到退火的與SPA珠粒結合的DNA/RNA中。以0.001μM-100μM濃度，將試驗化合物加入到反應混合液中。加入10mU重組HIV RT并在37℃下孵育1小時，得到延長的結合3H-TTP的引物。加入0.2ml 120mM EDTA終止反應。用Beckman LS 7600儀器，在開放視窗內，對樣本計數。通過與未處理樣本進行測定的對比，計算IC50值。數據見下表1。表1.HI-443的HIV-RT抑制活性 如表1中所示，吡啶基環的取代主要對trovirdine的RT-抑制功能產生影響。除trovirdine外，只有噻吩-乙基硫脲(TET)化合物N’-[2-(2-噻吩)乙基]-N’-[2-(5-溴吡啶基)]-硫脲(HI-443)能在體外抑制90％以上的重組RT。HI-443抑制重組RT的IC50值為0.8μM，IC90值為12μM。
如trovirdine一樣，HI-443的噻吩基占據RT的NNI結合囊的相同側翼2區域，但其分子體積較小。另外，RT結合部位中HI-443的預測對接位置遮蔽了最適氫鍵供體的幾何位。因此，并不奇怪與trovirdine或我們先前公開的引導化合物HI-172相比，HI-443對重組RT具有稍低的抑制活性(IC50＝0.8μM)，HI-172具有空間較大的雜環取代基哌啶基(IC50＝0.6μM)(Mao等，1998，Bioorg.Med.Chem.Lett.82213)(見表1)。
實施例3TET化合物與其它NNI的比較采用以上實施例2說明的純化重組RT和Quan-T-RT試驗系統，將TET化合物的抗-HIV活性與trovirdine以及雜環NNI、HI-172(Mao等，1998，Bioorg.Med.Chem.Lett.82213)的活性進行比較。
另外，采用Uckun等1998，Antimicrobial Agents and Chemotherapy42383中描述的方法，通過測定抑制健康志愿捐獻者外周血單核細胞(PBMC)中HIV-1毒株HTLVIIIB、RT-MDR、A17和A17變體復制的能力，測定化合物的抗-HIV活性。
在暴露于HIV-1或其它HIV毒株之前，在補充20％(v/v)熱-失活胎牛血清(FBS)、3％白細胞介素-2、2mM L-谷氨酰胺、25mM HEPES、2μL NAHCO、50mg/mL慶大霉素和4μg/mL植物凝集素的RPMI1640中，將HIV-陰性捐獻者的正常人體外周血單核細胞(PBMNC)培養72小時。然后在37℃下、在濕潤的5％CO2空氣中，在1小時的吸附期間，以0.1的感染復數(MOI)，用病毒感染該細胞。然后，在各種抑制劑濃度存在下，將細胞在96-孔微量滴定板中培養(100μL/孔；2×106細胞/mL，一式三個孔)。按以上Erice等1993，Antimicrob.Ag.Chemotherapy 37385-838中說明的方法，在感染后第7日，從孔中取出等份培養物上清液，進行p24抗原p24酶免疫測定(EIA)。所用的p24EIA是由Coulter Corporation/Immunotech，Inc.(Westbrook，ME)市售提供的未改良動力學試驗。通過將實驗底物-處理的感染細胞中得到的p24值與未處理感染細胞(即，病毒對照)中得到的p24值進行比較，計算病毒復制的百分抑制率。
采用如Uckun等1998，Antimicrobial Agents and Chemotherapy42383；和Mao等，1998，Bioorg.Med Chem.Lett.82213說明的方法，用氫氧化2，3-雙(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-5-[(苯氨基)-羰基]-2H-四唑鎓，進行微量培養四唑鎓試驗(MTA)以評估化合物的細胞毒性。
抑制抗藥性HIV毒株的活性采用如Uckun等1998，Antimicrobial Agents and Chemotherapy42383中說明的方法，測定該TET化合物，HI-443，抑制藥物敏感毒株(HTLV VIIIB)、NNI-抗性毒株(A17和A17變體)以及對多種藥物有抗性HIV-1毒株(RT-MDR)的活性(見表2)。采用以上說明的方法，測定該TET化合物，DDE-526、DDE-524、HI-443和DDE-530對藥物敏感毒株(HTLV VIIIB)、對多種藥物有抗性HIV-1毒株(RT-MDR)以及從AIDS患者中分離的臨床HIV的活性(見表3)。RT-MDR從Dr.Bendan Larder的AIDS Research and Reference Reagent Program中獲得，并在Larder等，1993，Nature，365，451-453中說明。
表2和表3中給出的數據為抑制PBMC中HIV p24抗原產生的IC50值(化合物抑制50％ p24產生時的濃度)。令人驚奇的是，該TET化合物，HI-443，對V106A突變型以及其它突變型(包括RT殘基74V、41L和215Y)的對多種藥物有抗性HIV-1毒株RT-MDR的有效性比HTLV VIIIB強10倍。
表2
如表2中所示，在三組三個獨立實驗中，該TET化合物，HI-443，能有效抑制人體外周血單核細胞(PBMC)中HIV-1毒株HTL VIIIB的復制，IC50平均值為0.03μM。與HI-443抗重組RT的較高IC50值一致，HI-443抑制HTLVIIIB復制的IC50值比trovirdine的IC50值高5倍，比HI-172的IC50值高30倍。
令人驚奇的是，HI-443抑制具有V106A突變型以及其它突變型(包括RT殘基74V、41L和215Y)的對多種藥物有抗性HIV-1毒株RT-MDR的有效性比抑制HTLV IIIB強10倍。
表3
1野生型AZT-敏感HIV-1實驗室毒株HTLV IIIB2突變型對多種藥物有抗性HIV毒株RT-MDR3AIDS患者臨床分離物HI-443抑制具有Y181C突變的NNI-抗性HIV-毒株A17活性與抑制HTL VIIIB的活性幾乎一致(IC500.048μM對0.030μM)，并且其能夠抑制RT中帶有Y181C加K103N突變的抗trovirdine A17變體(IC503.263μM)，盡管其效力比HTL VIIIB低100倍(表2)。HI-443抑制對多種藥物有抗性HIV-1毒株RT-MDR的效力比trovirdine高5倍，比奈韋拉平高1250倍，比delavirdine高100倍，比MKC-442高75倍，比HI-172高25,000倍，比HI-240(最近報道的具有有效抗HIV活性的氟取代的PETT衍生物)(Vig等，1998，Bioor.Med.Chem.61789)高1.25倍，比AZT高50倍。類似地，HI-443抑制NNI-抗性HIV-1毒株A17的效力比trovirdine高10倍，比奈韋拉平高2083倍，比delavirdine高1042倍，比HI-172高2083倍，比HI-240高4.2倍。最后，HI-443抑制NNI-抗性HIV-1毒株A17變體的復制，其IC50值為3.263μM，而trovirdine、奈韋拉平、delavirdine和HI-172的IC50值均＞100μM，HI-240的IC50值為41μM(表2)。這些發現證實TET化合物HI-443作為新的NNI，對HIV-1抗性和對多種藥物有抗性的毒株，具有有效的抗病毒活性。
本發明中描述的所有出版物、專利和專利文獻均全文結合到本發明中作為參考。可對在此描述的本發明進行修改以包括另外的實施方案。所有這些明顯的改動都在本發明的精神和范圍之內，如以下權利要求所示。
權利要求
1.一種下式化合物或其藥學上可接受的加成鹽 其中n是0-3；R是H、鹵素、(C1-C12)烷基、(C1-C12)烷氧基、氨基、氰基、硝基或羥基；和R1包括環(C3-C12)烷基、環(C3-C12)鏈烯基、異噻唑基、四唑基、三唑基、吡啶基、咪唑基、萘基、苯并噁唑基、苯并咪唑基、噁唑基、苯并噻唑基、吡嗪基、噠嗪基、噻二唑基、苯并三唑基、吡咯基、吲哚基、苯并噻吩基、噻吩基、苯并呋喃基、喹啉基、異喹啉基或吡唑基，它們任選由一或多個選自(C1-C3)烷基、(C1-C3)烷氧基、鹵素或羥基的取代基取代。
2.一種下式的化合物或其藥學上可接受的加成鹽 n是0-3；X是S或O；Z是-NH-或O；R是H、鹵素、(C1-C12)烷基、(C1-C12)烷氧基、氨基、氰基、硝基或羥基；和R2包括環(C3-C12)烷基、環(C3-C12)烯基、異噻唑基、四唑基、三唑基、吡啶基、咪唑基、萘基、苯并噁唑基、苯并咪唑基、噻唑基、噁唑基、苯并噻唑基、吡嗪基、噠嗪基、噻二唑基、苯并三唑基、吡咯基、吲哚基、苯并噻吩基、噻吩基、苯并呋喃基、喹啉基、異喹啉基或吡唑基，它們任選由一或多個選自H、(C1-C3)烷基、(C1-C3)烷氧基、鹵素、-CO-烷基或羥基的取代基取代。
3.一種下式的化合物 其中R1是可被取代的吡啶基。
4.權利要求3的化合物，其中R1是被鹵素取代的吡啶基。
5.權利要求3的化合物，其中R1是被溴或氯取代的吡啶基。
6.權利要求3的化合物或其藥學上可接受的加成鹽，其具有[2-(2-噻吩)乙基]-N-[2-(5-溴吡啶基)]-硫脲(HI-443)的結構。
7.權利要求4的化合物或其藥學上可接受的加成鹽，其具有[2-(2-噻吩)乙基]-N-[2-(5-氯吡啶基)]-硫脲的結構。
8.權利要求2、3、4、6或7的化合物在制備用于治療HIV感染患者的藥物中的用途。
9.權利要求2、3、4、6或7中的至少一種化合物在制備用于治療接受初次治療的患者或抗藥性HIV感染患者的藥物中的用途。
10.一種藥用組合物，其包括治療有效量的權利要求4的化合物和藥學上可接受的載體或稀釋劑。
11.權利要求4的化合物在制備用于抑制HIV逆轉錄酶的藥物中的用途。
12.至少一種下式化合物或其藥學上可接受的加成鹽 在制備用于治療接受初次治療的或抗藥性HIV感染的患者的藥物中的用途，其中n是0-3；R是H、鹵素、(C1-C12)烷基、(C1-C12)烷氧基、氨基、氰基、硝基或羥基；和R1包括環(C3-C12)烷基、環(C3-C12)烯基、異噻唑基、四唑基、三唑基、吡啶基、咪唑基、苯基、萘基、苯并噁唑基、苯并咪唑基、噻唑基、噁唑基、苯并噻唑基、吡嗪基、噠嗪基、噻二唑基、苯并三唑基、吡咯基、吲哚基、苯并噻吩基、噻吩基、苯并呋喃基、喹啉基、異喹啉基或吡唑基。
13.一種治療HIV患者的方法，該方法包括給予患者有效量的權利要求1、2、3、4、5、6或7中的至少一種化合物。
14.一種治療接受初次治療的患者或抗藥性HIV感染患者的方法，其包括給予患者有效量的權利要求1、2、3、4、5、6或7中的至少一種化合物。
15.一種抑制HIV的方法，其包括使病毒與有效量的權利要求1、2、3、4、5、6或7中的至少一種化合物接觸。
全文摘要
新的噻吩－乙基－硫脲(TET)化合物,其作為逆轉錄酶抑制劑和治療HIV感染(包括突變型、藥物敏感性、耐藥性和對多種藥物有抗性的HIV)的有效治療劑。
文檔編號C07D405/12GK1356997SQ00809112
公開日2002年7月3日 申請日期2000年6月23日 優先權日1999年6月23日
發明者F·M·烏昆, T·文卡塔查拉姆 申請人:帕克·休斯研究所