新的器官陰離子轉運蛋白的制作方法

專利名稱：新的器官陰離子轉運蛋白的制作方法
技術領域：
本發明要求保護經分離的編碼全部或部分新的器官陰離子轉運蛋白(“OATP”)的核酸序列，所述新的器官陰離子轉運蛋白命名為OATP2，OATP-RP1，OATP-RP2，OATP-RP3，OATP-RP4和OATP-RP5。同時要求保護含上述核酸序列的載體，含所述載體的宿主細胞，以及具有OATP2，OATP-RP1，OATP-RP2，OATP-RP3，OATP-RP4和OATP-RP5全部或部分氨基酸序列的多肽。發明還描述了表達上述轉運蛋白的組織表達和上述轉運蛋白的一些底物。本發明還要求保護這些新的OATP-RP2的用途，包括對特定組織的靶向藥物中的應用，調節內源底物的濃度中的應用，以及驗證可由本發明中的新OATP所轉運的底物。
背景技術：
肝執行對多種代謝物、藥物和其它異生素的清理功能是通過將其轉運穿過竇狀隙膜進入肝細胞來完成的。目前已公開了幾種介導這些過程的轉運系統，包括人和大鼠肝中的Na+/牛磺膽酸協同轉運多肽，NTCP，(Hagenbuch，B.，等(1991)美國國家科學院院刊(Proc.znatl.Acad.Sci.USA)8810629-33；Hagenbuch，B.，等(1994)J.Clin.Invest.931326-31)和器官陰離子轉運多肽家族(OATPs)，該家族一般在肝，腎和腦中表達，并以非鈉依賴方式轉運大范圍的底物(Meier，P.J.，等，(1997)肝學，261667-77；Wolkoff，A.W.，(1996)Semin.Liver Dis.16121-127)。人們認為，這后一轉運蛋白家族在肝，腎和腦的脈絡膜中的分布反映出通常這些器官對清理大量器官陰離子的生理需求。在大鼠中有三種OATP同功型roatp1(Jacquemin，E.，等，(1994)美國國家科學院院刊(Proc.znatl.Acad.Sci.USA)91133-37)；roatp2(Noe，B.A.等，(1997)美國國家科學院院刊(Proc.znatl.Acad.Sci.USA)9410346-50；)和roapt3(Abe，T.，等(1998)生物化學雜志27311395-401)。除膽汁酸外，已知OATPs可轉運多種其它化合物。因不同的轉運蛋白而異，它們包括，結合或非結合的類固醇，例如，硫酸雌酮，雌二醇-17B-葡糖苷酸，醛甾酮，心苷，(Boussuyt，X.，等(1996)J.Pharmacol.Exp.Ther.276891-6；Boussuyt，X.(1996)J.Hepatol.25733-8；Kanai，N.，等，(1996))Am.J.Physiol.270F319-F325；Kanai，N.等(1996)Am.J.Physiol.270F326-F331；Noe，B.A.，等，(1997)美國國家科學院院刊(Proc.znatl.Acad.Sci.USA)9410346-50)。四溴酚酞磺酸鈉(Jacquemin，E.，等，(1994)美國國家科學院院刊(Proc.znatl.Acad.Sci.USA)91133-7)；真菌毒素(Kontaxi，M.，等，(1996)J.Pharmacol.Exp.Ther.2791507-13)；白三烯(Li，L.，等，(1998)生物化學雜志27316184-91)；和甲狀腺激素(Abe，T.，等(1998)生物化學雜志27311395)是附加底物。
已經有幾種蛋白得到鑒定。Jacquemin，E.，等在美國國家科學院院刊(Proc.znatl.Acad.Sci.USA)，91133-137中報道了首次被克隆和驗證的OATP轉運蛋白家族成員，命名為rat oatp1。首次被克隆和驗證的人OATP是由Kullak-Ublick，G.A.等(1995)在腸胃學，1091274-1282上報道的。在肝，腎和腦和其它器官中均發現有該蛋白表達。作者得出結論，基于底物特異性，該蛋白不是rat oatp1的人同系蛋白。
Kullak-Ublick，G.A.等(1994)在肝學，20411-416中討論了rat oatp1的底物特異性，而Bossuyt，X.，等在肝學雜志，25733-738中討論了人OATP的底物特異性。
后來發現的資料顯示，rat oatp1參與類固醇的轉運(Bossuyt，X.，等(1996)J.Pharmacol.Exp.Ther.276891-896)，人OATP為心理激素DHEAS轉運蛋白(Kullak-Ublick，G.A.等(1998)FEBSLett.，424173-176)。OATP家族和肝中器官陰離子轉運蛋白的綜述，參見/wolkoff，A.W.，(1996)Semin.Liver Dis.，16121-127。
第三種rat OATP同功型，其功能為轉運甲狀腺激素T3和T4，已被克隆，其相關報道見Abe，T.，等(1998)生物化學雜志，27322395-22401。
由本發明上下文中所引述的參考文獻，均視為全文引用。
發明概述本發明涉及新的器官陰離子轉運蛋白(“OATP”)和編碼上述OATPs的多核苷酸。此處所公開的OATPs命名為OATP2，OATP-RP2，OATP-RP3，OATP-RP4，OATP-RP5和OATP-RP1。本發明還公開了每一種OATP的多核苷酸序列和由其推測的氨基酸序列。編碼本發明所述的OATPs的cDNAs保藏于美國典型培養物保藏中心，所得的登錄號為ATCC207213(OATP2)，ATCC207212(OATP-RP2)，ATCC 207209(OATP-RP3)，ATCC207210(OATP-RP4)，ATCC207211(OATP-RP5)，和ATCC207214(OATP-RP1)。
發明人對編碼新的OATPs的cDNAs進行了序列測定，并確定了由其推測的蛋白產物的一級結構。此處公開的是OATP2的核酸序列(SEQID NO1)和氨基酸序列(SEQ ID NO2)；OATP-RP2的核酸序列(SEQ ID NO3)和氨基酸序列(SEQ ID NO4)；OATP-RP3的核酸序列(SEQ ID NO5)和氨基酸序列(SEQ ID NO6)；OATP-RP4的核酸序列(SEQ ID NO7)和氨基酸序列(SEQ ID NO8)；OATP-RP5的核酸序列(SEQ ID NO9)和氨基酸序列(SEQ ID NO10)；OATP-RP1的核酸序列(SEQ ID NO11)和氨基酸序列(SEQ ID NO12)。
本發明中的OATPs可由下述方法制得(1)將所公開的OATP的cDNA插入到合適的表達載體上；(2)將該表達載體轉染合適的宿主；(3)在合適的培養基中培養經轉染的宿主；和(4)分析轉染后的細胞中的轉運活性。
由此，本發明提供經純化和分離的核酸分子，優選DNA分子，所述核酸分子具有編碼OATP的序列，或編碼屬本發明的OATP的核酸分子的寡核苷酸片段。在本發明的優選實施例中，經分離純化的核酸分子具有如SEQ ID NO1(OATP2)所示的序列。在本發明的另一優選實施例中，經分離純化的核酸分子具有如SEQ ID NO3(OATP-RP2)所示的序列。在本發明的又一優選實施例中，經分離純化的核酸分子具有如SEQ ID NO5(OATP-RP3)所示的序列。在本發明的再一優選實施例中，經分離純化的核酸分子具有如SEQ ID NO7(OATP-RP4)所示的序列。在本發明的又一優選實施例中經分離純化的核酸分子具有如SEQ ID NO9(OATP-RP5)所示的序列。在本發明的再一優選實施例中，經分離純化的核酸分子具有如SEQ ID NO11(OATP-RP1)所示的序列。
本發明還涉及雙鏈的核酸分子，該核酸分子包含本發明的核酸分子及其中的通過氫鍵與互補的核苷酸堿基序列相連的寡核苷酸片段。
術語“經分離純化的核酸”，“經分離純化的多核苷酸”“基本純化的核酸”“基本純化的多核苷酸”例如，基本純化的DNA，指屬于下列的一或兩種情況的核酸分子(1)其與一或兩個序列如編碼序列不直接相連，所述序列在產生該核酸分子的生物有機體天然存在的基因組中與該核酸分子直接相連(即一個在5’端，一個在3’端)；或(2)基本不含產生該核酸分子的生物有機體的核酸序列。該術語包括，例如，整合入載體或原核或真核生物基因組DNA的重組DNA，所述載體如可自主復制的質粒或病毒，或不依賴其他DNA分子而獨立存在的分子(例如，經PCR擴增得到的或用限制性內切酶處理得到的cDNA或基因組DNA片段)。基本純化或經分離純化的DNA，也包括重組DNA，該重組DNA是編碼外加的OATP序列的雜合基因中的一部分。
本發明在一個實施例中公開了(a)一種經分離純化的核酸分子，該核酸分子包括編碼全部或部分，具有如SEQ ID NO2(OATP2)中所示氨基酸序列的核酸序列；(b)與(a)項序列互補的核酸序列；(c)與(a)具有至少80％，優選至少90％，更優選至少95％，最優選至少98％序列同一性的核酸序列；或(d)(a)項或(b)項中的片段，該片段有至少18個堿基，且在嚴緊條件下可與a)項或(b)項中的片段雜交。
兩序列之間的同源程度(序列同一性百分比)是可以確定的，例如，以用于該目的的一般計算機程序來對兩個序列進行比較。Devereux等在核酸研究12387中公開的GAP程序是一種適合的程序。GAP程序用了Needleman和Wunsch在分子生物學雜志(1970)48433中提出，由Smith和Waterman在Adv.Appl.Math.(1981)2482中修訂的對比法。簡言之，GAP程序定義了同一性百分比為，將兩個序列中較短的一個的標記總數除經序列對比同一的標記(即，核酸或氨基酸)數。
此處所用術語“嚴緊條件”包括本領域技術人員所知的條件，在該條件下核酸序列可與下列物質雜交(a)含蛋白編碼序列且經分離純化的核酸分子，所述蛋白具有此處所公開氨基酸序列，或(b)與(a)項中核酸序列互補的核酸序列。在嚴緊條件下篩選多核苷酸可依照自然，313402-404(1985)中所述的方法進行。能與本發明中的多核苷酸在嚴緊條件下進行雜交的多核苷酸可以是，例如，所公開DNA序列的等位基因變異體，也可能是其它來源的多核苷酸。一般的核酸雜交方法如Sambrook等在“分子克隆實驗手冊，第二版，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約(1984)”；和Haymes等在“核酸雜交實用方法”IRL出版社，華盛頓特區(1985)中所述，這兩篇文獻，在本發明中全文引用作為參考文獻。
本發明在另外一個實施例中提供了(a)經分離純化的核酸序列，該核酸序列含編碼全部或部分具有如SEQ ID NO4(OATP-RP2)所示氨基酸序列的蛋白的核酸序列；或(b)與(a)項中核酸序列互補的核酸序列；(c)與(a)項中核酸序列同一性至少為80％，優選至少90％，更優選至少95％，最優選至少98％的核酸序列；或(d)(a)或(b)中的片段，該片段至少含18個堿基，且可與(a)或(b)在嚴緊條件下雜交。
本發明提供另一實施例(a)經分離純化的核酸序列，該核酸序列含編碼全部或部分具有如SEQ ID NO6(OATP-RP3)所示氨基酸序列的蛋白的核酸序列；或(b)與(a)項中核酸序列互補的核酸序列；(c)與(a)項中核酸序列同一性至少為80％，優選至少90％，更優選至少95％，最優選至少98％的核酸序列；或(d)(a)或(b)中的片段，該片段至少含18個堿基，且可與(a)或(b)在嚴緊條件下雜交。
本發明提供另一實施例(a)經分離純化的核酸序列，該核酸序列含編碼全部或部分具有如SEQ ID NO8(OATP-RP4)所示氨基酸序列的蛋白的核酸序列；或(b)與(a)項中核酸序列互補的核酸序列；(c)與(a)項中核酸序列同一性至少為80％，優選至少90％，更優選至少95％，最優選至少98％的核酸序列；或(d)(a)或(b)中的片段，該片段至少含18個堿基，且可與(a)或(b)在嚴緊條件下雜交。
本發明提供另一實施例(a)經分離純化的核酸序列，該核酸序列含編碼全部或部分具有如SEQ ID NO10(OATP-RP5)所示氨基酸序列的蛋白的核酸序列；或(b)與(a)項中核酸序列互補的核酸序列；(c)與(a)項中核酸序列同一性至少為80％，優選至少90％，更優選至少95％，最優選至少98％的核酸序列；或(d)(a)或(b)中的片段，該片段至少含18個堿基，且可與(a)或(b)在嚴緊條件下雜交。
本發明提供另一實施例(a)經分離純化的核酸序列，該核酸序列含編碼全部或部分具有如SEQ ID NO12(OATP-RP1)所示氨基酸序列的蛋白的核酸序列；或(b)與(a)項中核酸序列互補的核酸序列；(c)與(a)項中核酸序列同一性至少為80％，優選至少90％，更優選至少95％，最優選至少98％的核酸序列；或(d)(a)或(b)中的片段，該片段至少含18個堿基，且可與(a)或(b)在嚴緊條件下雜交。
本發明提供另一實施例(a)經分離純化的核酸序列，該核酸序列含如SEQ ID NO1(OATP2)所示的序列；或(b)與(a)項中核酸序列互補的核酸序列；(c)與(a)項中核酸序列同一性至少為80％，優選至少90％，更優選至少95％，最優選至少98％的核酸序列；或(d)(a)或(b)中的片段，該片段至少含18個堿基，且可與(a)或(b)在嚴緊條件下雜交。
本發明又提供(a)經分離純化的核酸序列，該核酸序列含如SEQID NO3(OATP-RP2)所示的序列；或(b)與(a)項中核酸序列互補的核酸序列；(c)與(a)項中核酸序列同一性至少為80％，優選至少90％，更優選至少95％，最優選至少98％的核酸序列；或(d)(a)或(b)中的片段，該片段至少含18個堿基，且可與(a)或(b)在嚴緊條件下雜交。
本發明還提供(a)經分離純化的核酸序列，該核酸序列含如SEQ ID NO5(OATP-RP3)所示的序列；或(b)與(a)項中核酸序列互補的核酸序列；(c)與(a)項中核酸序列同一性至少為80％，優選至少90％，更優選至少95％，最優選至少98％的核酸序列；或(d)(a)或(b)中的片段，該片段至少含18個堿基，且可與(a)或(b)在嚴緊條件下雜交。
本發明進一步提供(a)經分離純化的核酸序列，該核酸序列含如SEQ ID NO7(OATP-RP4)所示的序列；或(b)與(a)項中核酸序列互補的核酸序列；(c)與(a)項中核酸序列同一性至少為80％，優選至少90％，更優選至少95％，最優選至少98％的核酸序列；或(d)(a)或(b)中的片段，該片段至少含18個堿基，且可與(a)或(b)在嚴緊條件下雜交。
本發明提供(a)經分離純化的核酸序列，該核酸序列含如SEQID NO9(OATP-RP5)所示的序列；或(b)與(a)項中核酸序列互補的核酸序列；(c)與(a)項中核酸序列同一性至少為80％，優選至少90％，更優選至少95％，最優選至少98％的核酸序列；或(d)(a)或(b)中的片段，該片段至少含18個堿基，且可與(a)或(b)在嚴緊條件下雜交。
本發明提供(a)經分離純化的核酸序列，該核酸序列含如SEQID NO11(OATP-RP1)所示的序列；或(b)與(a)項中核酸序列互補的核酸序列；(c)與(a)項中核酸序列同一性至少為80％，優選至少90％，更優選至少95％，最優選至少98％的核酸序列；或(d)(a)或(b)中的片段，該片段至少含18個堿基，且可與(a)或(b)在嚴緊條件下雜交。
本發明還包括帶有一個或多個結構突變的本發明所公開的多核苷酸和氨基酸序列，所述突變包括替代，缺失或插入突變。例如，信號肽可能缺失，或者由于保守性氨基酸的替換而產生的仍具有生物學能力或活性的蛋白。
本發明還包括，含本發明中的核酸分子或其中的寡核苷酸片段，及有效地連接到上述核酸分子或其中的寡核苷酸片段上的表達控制序列的重組分子。也提供含本發明所述重組分子的轉化宿主細胞。
另一方面，本發明的特色在于，提供了一種細胞或經純化的細胞的制品，所述細胞包含編碼本發明中OATP的新基因或誤表達編碼本發明中OATP的基因。所述細胞制品可包括人或非人細胞，如嚙齒動物，小鼠或大鼠細胞，兔細胞，非人靈長類動物細胞，或豬細胞。在優選實施例中，所述單個或多個細胞包括OATP轉基因，例如，OATP基因的異源形式，例如，人的基因(在非人細胞情況下)。OATP轉基因可能誤表達，如過表達或低表達。在其它優選實施例中，所述單個或多個細胞包括誤表達內源OATP基因的基因，例如，某基因的表達遭到破壞，如剔除。這樣的細胞可作為模型，來研究與經突變或誤表達OATP等位基因相關的紊亂，以用于藥物篩選。
更進一步，本發明提供包含本發明中核酸分子的質粒。本發明還包括含此處所公開核酸序列的載體，以及包含所述載體的宿主細胞。
本發明還包括新的OATP，或其中的活性部分。該蛋白或其中一部分的具有生物學能力或活性的形式，也指所述的“活性OATP或其中部分”。
本發明還進一步包括對本發明中的OATP或該蛋白的一部分的抗原表位具有特異性的抗體。這些抗體可以為多克隆抗體或單克隆抗體。所述抗體可以經可檢測的底物所標記，進而用于，例如在組織和細胞中檢測本發明中的新OATP。另外，本發明中的抗體或其中部分，可用于制造定向抗體以破壞OATP表達細胞(如，抗體-毒素融合蛋白或放射性標記抗體)。
本發明還公開了核酸探針的構建，該探針編碼本發明中的一種新OATP部分或全部，或該蛋白的一部分。從而本發明還涉及核酸探針，其中的核酸序列編碼表現本發明中新OATP特性的蛋白或僅屬于該蛋白的多肽的特征。探針可以是已經標記的，例如，用可檢測的(如，放射性的)底物標記，以便用于從核苷酸混合物中挑選出編碼具有本發明中新OATP特性的蛋白的核苷酸序列。
本發明還提供轉基因的非人動物(如，嚙齒動物，如，大鼠或小鼠，兔或豬)或胚胎，它們的生殖細胞和體細胞中均含有本發明中的重組分子，優選的重組分子含編碼本發明中OATP或其中一部分的核酸分子。上述重組分子所包含的編碼本發明中OATP或其中部分的核酸分子可以具有結構突變，或者含編碼本發明中OATP或其中部分的核酸分子，而其中有一個或多個調節元件與調控天然蛋白表達的調控元件不同。在另一優選實施例中，所述動物具有誤表達或非表達的OATP基因，如，剔除。這樣的轉基因動物可作為模型，來研究與經突變或誤表達本發明OATP等位基因相關的紊亂。
本發明還進一步涉及檢驗可與本發明中新OATP相結合的底物的方法，該方法包括，在允許底物與本發明中新OATP蛋白或其部分之間形成復合物的條件下，使底物與OATP蛋白或其部分相互作用，然后分析底物-OATP復合物，自由底物，非結合OATP或OATP的激活。
本發明的實施例提供了檢驗可與本發明中新OATP，其同功型，或部分蛋白相結合的底物的方法，該方法包括，在允許底物-轉運蛋白復合物形成的條件下，使本發明中新OATP，其同功型，或部分蛋白與至少一種與本發明中新OATP，其同功型，或部分蛋白具有潛在結合能力的底物相互作用，然后分析底物-轉運蛋白復合物，自由底物，非結合OATP蛋白或OATP的激活。在該方法的優選實施例中，證明了底物可與本發明中新OATP，其同功型，或部分蛋白結合，并由其轉運。
本發明還提供篩選具有潛在藥物用途的本發明中新OATP的刺激物或拮抗物的方法。該方法包括在已知的可由本發明中OATP轉運的化合物存在的條件下，向表達本發明中新OATP的細胞中添加待測試劑，然后檢測上述已知化合物的轉運的增加或抑制。
本發明中的一種OATP也可以用于驗證可被轉運到器官，例如，肝臟中去的化合物。研究中發現的可主動轉運到肝臟中的化合物，在其它以肝臟為靶器官的治療過程中作為載體是有用的。
包括本發明的OATP或其中的片段(或編碼所述OATP的核酸或其中的片段)以及一個或多個附加成分，如載體，稀釋劑或溶劑的組合物也是包括在本發明的范圍內的。添加的成分可以使上述組合物在體內，體外，制藥或獸醫領域中具有應用價值。
本發明中OATP的刺激物和拮抗劑也在本發明的范圍之內。藥物刺激物和/或拮抗物有利于提高或降低由本發明中的OATP轉運的化合物的流量。上述本發明中的刺激物或拮抗物優選地與可接受的載體，稀釋劑或溶劑一起使用。
本發明的另一方面涉及對具有某種發病傾向的哺乳動物，例如人，的治療方法，如以本發明的OATP的異常，非所需水平或生物活性為特征的疾病。另外，本發明還包括治療具有肝病的危險的哺乳動物，例如人，的方法。由于OATP2在肝臟中專一性表達，因此對OATP2最佳的化合物是針對肝臟的運輸中有用。這些化合物本身可能是具有治療作用的，或是作為其它對肝臟有治療作用的化合物有益的伴侶。另外，阻礙OATP2-化合物之間的相互作用，可以降低由肝臟的第一步的提取，從而提高胞質濃度和系統的藥物半衰期，由此提供利用價值。
包含全部或部分本發明中OATP的融合蛋白也包含在本發明的范圍內。
本發明的主要目的是通過驗證此處所公開的核酸和氨基酸序列對新的人OATPs進行鑒定。本發明的另一個目的是提供上述的cDNA，OATP蛋白，對所述新OATPs特異的單克隆抗體，包含本發明中OATP蛋白中的一部分的融合蛋白，新的OATP的刺激物和/或拮抗物的使用方法。
附圖的簡要描述

圖1是RNA印跡，結果表明OATP2，OATP-RP1，OATP-RP2，OATP-RP3，OATP-RP4，OATP-RP5的mRNA組織分布。各欄中各組織的縮寫在下面作了注釋。
圖2是表明OATP2轉運帕伐他丁(pravastatin)，脫氫表雄酮硫酸鹽(DHEAS)，牛磺膽酸鹽，和甲狀腺激素(T)。圖2A表明[3H]-帕伐他丁(pravastatin)和[3H]-DHEAS的特異攝入。圖2B表示[3H]-牛磺膽酸鹽的特異攝入。C區表示[125I]-甲狀腺激素的特異攝入。在過量的非標記底物存在(空心棒)或不存在(實心棒)下確定經pCEPOATP-RP1或空載體(MOCK)轉化的細胞對放射性標記的底物在5分鐘內的攝入量。
圖3是OATP家族成員的序列對比結果。人OATP2，OATP-RP1，OATP-RP2，OATP-RP3，OATP-RP4，OATP-RP5的蛋白序列與其它已知的OATP家族成員相對比。用粗體表示的是共有序列。在給定的位置，12個序列中的至少6個是同一的則表明為共有序列。與共有序列吻合的殘基用大寫形式表示。
發明詳述除非其它特殊情況下的定義，下述術語的定義在本說明書中全文適用。
“克隆”-從遺傳物質，例如基因組，基因組文庫，cDNA文庫中，對特定的基因進行分離，整合到質粒或其它載體上；“編碼區”-核酸序列中編碼活性蛋白的區域；“OATP”器官陰離子轉運蛋白；“嚴緊條件”(用于核酸雜交)DNA印跡中用0.1X SSC和0.1％SDS在至少約65℃條件下洗膜。見Maniatis等，分子克隆實驗手冊，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約(1982)；相關領域的技術人員可以認識到次嚴緊條件(例如，1X或2X SSC，和0.1％SDS)可應用在，用此處所公開的新序列來驗證編碼新OATPs的核酸序列中；“RNA印跡”通過與互補的核酸雜交，來檢驗特定的RNA片段的方法，上述的互補核酸，典型地為cDNA或寡核苷酸；“開放閱讀框”或“ORF”包含一系列編碼氨基酸的核酸三聯體密碼但缺少任何終止密碼的DNA序列；“質粒”在微生物細胞質中能自主復制的DNA成分；“啟動子”DNA上的一個區域，RNA聚合酶與該區域結合并起始轉錄；“DNA印跡”通過與互補的核酸雜交，來檢驗特定的DNA片段的方法，上述的互補核酸，典型的為cDNA或寡核苷酸；“轉運”物質穿過生物膜的運動，通過測定這樣的底物結合于轉運蛋白上穿越細胞膜后的重新分布情況來確定。
對于本說明書中其它術語的定義，參見F.Sherman等，酵母遺傳學方法實驗操作手冊，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約(1987)和Lewin，B.，基因IV，牛津大學出版社，牛津(1990)。縮寫詞語的定義參見Aldrichimica Acta，Vol.17，No.1(1984)。
使用和應用本發明的新的器官陰離子轉運蛋白與該家族已知轉運蛋白的氨基酸序列的對比見圖3。本發明中的序列與已知的器官陰離子轉運蛋白之間的序列同源性程度說明，本發明中的蛋白是器官陰離子轉運蛋白。
本領域的技術人員可以確信，OATP蛋白參與將化合物向肝臟轉運的過程。本領域的普通技術人員可以利用本發明中的OATP蛋白來分析可以提高或降低化合物轉運到肝臟中效率的試劑，或用來分析可由本發明中的OATPs轉運的化合物，該化合物可用作載體將特定器官(例如，肝臟)所需的化合物引入該器官中。
因此，提高或降低由本發明的OATPs轉運的物質的效率的試劑，經鑒定為載體的試劑，對治療肝臟疾病都是有用的。
由于本發明中的OATPs中的一些是組織特異/選擇性的(例如，OATP2-肝臟；OATP-RP4-心臟和骨骼肌，OATP-RP5-腦和睪丸)化合物特異性成為這些OATPs特異底物的組成部分，也成為由這些OATPs轉運的分子載體的組成部分。由本發明中上述OATPs轉運的試劑可以由此轉運到一些可表達OATPs的組織中，但不能轉運到缺少上述OATPs的組織中，由此完成了組織特異性定位。
本發明中的OATP核酸序列或反義核酸，可能是有用的治療和診斷試劑。對于這樣的基因治療，核酸可以整合到載體和/或如下述描述及本領域中的詳細描述明確表達。
本發明還為預測對藥物反應的診斷遺傳篩選提供了基礎。此處公開并要求保護的轉運蛋白中的至少一種是已知藥物的轉運蛋白(也就是說，OATP2轉運帕伐他丁(pravastatin)到肝細胞中)。此處公開的其它轉運蛋白也類似地將其它藥物轉運到組織中。本領域的技術人員可以(1)通過各種測序方法在一般的群體中篩選該轉運蛋白基因的等位基因變異體(基因型)；和(2)確定病人中這些轉運蛋白基因型與對經轉運的藥物在臨床試驗中的反應之間的相互關系。特殊的等位基因變異體在轉運藥物過程中效率或高或低，這與藥物的功效有關。從而所要求的轉運蛋白基因型可能形成預測病人藥物治療反應的臨床診斷實驗基礎。
本領域的技術人員可以使用本發明提供的多肽和核酸來制備載體，細胞或細胞系或抗體。所有這些對確定OATP正負調節劑(即，刺激物和/或拮抗物)和OATP載體的分析是有用的。此處所用的術語“正調節劑”是指可以提高化合物轉運到器官例如，肝臟中的效率或數量的試劑或化合物，或可以降低化合物轉運到器官中的效率或數量的試劑或化合物。術語“負調節劑”是指可摻入到第二種化合物中并阻止第二種化合物轉入或轉出細胞的化合物。此處的術語“載體”是指由本發明的OATP轉運的試劑或化合物，它能夠結合到另一種化合物中或輔助另一種化合物，伴隨其進入器官，如肝臟。載體包括某種介質，該介質用于運載某種化合物進入器官，非如此該化合物不會進入所述器官，還包括可以使能由OATP轉運進入器官的化合物的轉化增加的試劑。
人們可以將OATP調節劑和載體用于各種哺乳動物種中，例如，猴，狗，貓，小鼠，大鼠，人等。通過已知的方法，醫藥領域的技術人員能將OATP調節劑和載體結合到常規的系統給藥形式中，例如，片劑，膠囊，酏劑或可注射形式。以上給藥形式也包括任何必須的生理上可接受的載體物質，賦形劑，滑潤劑，緩沖物，抗菌劑，填充劑(如甘露醇)，抗氧化劑(抗壞血酸或酸性亞硫酸鹽)等。
制備過程概述本說明書公開了人OATPs的全長cDNA克隆和功能性表達，特別是OATP2(SEQ ID NO1)的核酸序列，(SEQ ID NO2)的氨基酸序列，OATP-RP2(SEQ ID NO3)的核酸序列，OATP-RP2(SEQ ID NO4)的氨基酸序列，OATP-RP3(SEQ ID NO5)的核酸序列，OATP-RP3(SEQ ID NO6)的氨基酸序列，OATP-RP4(SEQ ID NO7)的核酸序列，OATP-RP4(SEQ ID NO8)的核酸序列，OATP-RP5(SEQID NO9)的核酸序列，OATP-RP5(SEQ ID NO10)的氨基酸序列，OATP-RP1(SEQ ID NO11)的核酸序列，OATP-RP1(SEQ ID NO12)的氨基酸序列。
含編碼上述OATPs的核酸序列的DNA克隆已于1999年4月20日，交“美國典型培養物保藏中心”(“ATCC”)(10801UniversityBlvd.Manassas.VA 20110-2209)并獲得了下列ATCC登記號，207209(OATP-RP3)，207210(OATP-RP4)，207211(OATP-RP5)，207212(OATP-RP2)，207213(OATP2)，和207214(OATPRP1)。
本文所指的保藏物將根據國際承認的，用于專利程序的微生物保藏的布達佩斯條約的條款保藏。這些保藏僅為本領域技術人員提供方便，而不是承認根據35 U.S.C 112保藏是必需的。保藏物中所含的多核苷酸序列以及該序列編碼的多肽的氨基酸序列引入本文作參考，并且在與本文的序列描述有抵觸時，以前者為準。制造、使用或銷售保藏物需經許可，而本文不授予這種許可。
核酸利用此處已公開的OATP基因序列，本領域的技術人員能夠用已知的方法獲得本發明的OATP核酸。所述方法包括(1)DNA和RNA印跡；(2)Western免疫印跡；(3)化學合成；(4)由引物通過多聚酶鏈式反應(PCR)合成；(5)表達克隆；(6)負cDNA克隆。
本發明中優選的核酸序列包括下列序列(優選的編碼序列在其下示出)OATP2(SEQ ID NOS1和2)CGGACGCGTG GGCGGACGCG TGGGTCGCCC ACGCGTCCGA CTTGTTGCAG50TTGCTGTAGG ATTCTAAATC CAGGTGATTG TTTCAAACTG AGCATCAACA 100ACAAAAACAT TTGTATGATA TCTATATTTC AATC ATG GAC CAA AAT CAA149M D Q N QCAT TTG AAT AAA ACA GCA GAG GCA CAA CCT TCA GAG AAT AAG 191H L N K T A E A Q P S E N KAAA ACA AGA TAC TGC AAT GGA TTG AAG ATG TTC TTG GCA GCT 233K T R Y C N G L K M F L A ACTG TCA CTC AGC TTT ATT GCT AAG ACA CTA GGT GCA ATT ATT 275L S L S F I A K T L G A I IATG AAA AGT TCC ATC ATT CAT ATA GAA CGG AGA TTT GAG ATA 317M K S S I I H I E R R F E ITCC TCT TCT CTT GTT GGT TTT ATT GAC GGA AGC TTT GAA ATT 359S S S L V G F I D G S F E IGGA AAT TTG CTT GTG ATT GTA TTT GTG AGT TAC TTT GGA TCC 401G N L L V I V F V S Y F G SAAA CTA CAT AGA CCA AAG TTA ATT GGA ATC GGT TGT TTC ATT 443K L H R P K L I G I G C F IATG GGA ATT GGA GGT GTT TTG ACT GCT TTG CCA CAT TTC TTC 485M G I G G V L T A L P H F FATG GGA TAT TAC AGG TAT TCT AAA GAA ACT AAT ATC GAT TCA 527M G Y Y R Y S K E T 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2763本領域的技術人員也可以對編碼本發明中OATPs的核酸序列進行修飾，以制備有用的突變體。例如，可以對序列進行修飾以在核酸中提供附加的限制性內切酶識別位點。這樣的突變可以是沉默的也可以由突變的密碼子改變所編碼的氨基酸。技術人員能制備這些突變的核酸，例如，通過突變編碼本發明中OATPs的核酸序列導致缺失，替換，插入，倒位或在所編碼的多肽中增加一個或多個氨基酸。關于這些定點突變的方法參見Taylor，J.W.等，(1985)核酸研究(Nucl.AcidsRes.)13，8749-64和Kunkel，J.A.(1985)，美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)82482-92。另外，定點突變試劑盒可通過供應商購買(如BioRad Laboratories，Richmond，CA；AmershamCorp.，Arlington Heights，IL)。有關破壞，缺失和切斷的方法參見Sayers，J.R.等(1988)核酸研究(Nucl.Acids Res.)16791-800。
本發明也包括經修飾的核酸，包括(1)可變剪接外顯子變異體；(2)等位基因變異體；和(3)嵌合蛋白，其中的融合結構包括OATP或OATP中的片段。本領域的普通技術人員利用本發明所公開的內容可以獲得此類經修飾的核酸。
表達載體本發明進一步涉及含編碼本發明的OATP的核酸序列的表達載體。優選地，表達載體包括全部或部分如SEQ ID NO1，SEQ ID NO3，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，或SEQ ID NO11所示的核酸序列，優選的是編碼如上所示的OATP的核酸序列(即，編碼區域)。
表達載體通常為質粒，但本發明包括到目前為止，本領域所知的具有等同功能的其它載體形式。本領域的技術人員也可以將OATP的編碼序列穩定的整合到合適的宿主細胞的染色體中。
表達載體典型地包含能夠影響OATP表達的調節元件。這些調節元件可以是異源的或天然的OATP組分。典型地，載體包括復制起點，啟動子，和轉錄終止序列。載體還可以包括其它調節序列，包括mRNA穩定序列，該序列可使表達產物穩定；分泌引導序列，該序列可使表達產物分泌；環境反饋序列，該序列可使結構基因的表達得到調節(例如，在生長培養基中存在或缺乏營養物或其它誘導物)；標記序列，該序列能在轉化后的宿主細胞中提供表型選擇；限制位點，該序列提供限制性內切酶的酶切位點；以及在各類宿主，包括原核生物，酵母，真菌，植物和高等真核生物中允許表達的序列。
本發明的表達載體至少具有能夠引導本發明中的核酸和蛋白復制，最好是表達，的能力。合適的復制起點包括，例如，Col E1，病毒SV40，Epstein Barr病毒，和M13的復制起點。合適的啟動子包括，例如巨細胞病毒啟動子，lacZ啟動子，gal10啟動子和苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcMNPV)多角體啟動子。合適的終止序列包括，例如，牛生長激素，SV40，lacZ，和AcMNPV多角體聚腺苷酸化信號。篩選標記的例子包括新霉素，氨芐青霉素，和潮霉素之類。
本領域的技術人員能將編碼本發明中的OATP的DNA插入到幾種商業載體中。此類例子如，哺乳動物細胞兼容的載體，例如pcDNA3或pCEP4；桿狀病毒載體，例如pBlueBac；原核載體，例如pcDNA2；和酵母載體，例如pYes2。關于載體的修飾技術，參見Sambrook等(1989)分子克隆實驗手冊，第二版，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約。
宿主細胞本發明還包括含有表達載體的宿主細胞，所述表達載體包括編碼本發明中的OATP的序列，優選OATP2，OATP-RP2，OATP-RP3，OATP-RP4，OATP-RP5，OATP-RP1的編碼序列。本發明中的宿主細胞優選地包含某種表達載體，該表達載體包含全部或部分已在SEQ IDNO1，SEQ ID NO3，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO11中公開的核酸序列，特別是其中的編碼序列。合適的宿主細胞包括原核細胞(例如，大腸桿菌HB101，DH5α，XL1Blue，Y1090和JM101)和真核細胞(例如，草地夜蛾昆蟲細胞，中國倉鼠卵巢細胞(CHO cell)，COS-7細胞，HEK293細胞，人皮膚成纖維細胞，和釀酒酵母細胞)。
本領域的技術人員可以通過各種已知的方法將表達載體引入宿主細胞。示例性的方法如通過磷酸鈣沉淀法轉染，電穿孔，脂質體融合，核酸注射，病毒或噬菌體侵染。人們可以在允許大量OATP表達的條件下培養宿主細胞。
人們可以通過下述五種一般方法中的任意一種來驗證此類經修飾的宿主細胞。
(a)用與編碼OATP的序列互補的序列為探針進行DNA-DNA雜交(DNA印跡)。
(b)檢測標記基因的功能，例如，胸腺嘧啶脫氧核苷激酶活性，抗生素抗性之類。標記基因可作為受相同或不同啟動子調節的OATP序列置于同一質粒上。
(c)通過雜交分析檢測mRNA的轉錄(例如，RNA印跡或利用與該RNA互補的探針進行核酸酶保護分析)。
(d)基因表達的免疫檢測(例如，用OATP的抗體進行Westernblotting)(e)用與表達載體序列或OATP編碼序列同源的引物進行PCR。若PCR產生預期長度的DNA片段，則表明表達系統摻入了宿主細胞。
本領域的技術人員可以通過多種已知方法來確定DNA序列。參見，例如Sanger等，在美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)745463-7中描述的雙脫氧鏈終止法和Maxam-Gilbert法，見Maxam-Gilbert(1977)美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)74560-4。
人們可以采取現在看來是顯而易見的各種方法利用本發明的宿主細胞。人們可以利用這些細胞來篩選與本發明中的OATP相結合或對所述OATP功能進行調節或調控的化合物，上述化合物可用于對OATP2，OATP-RP2，OATP-RP3，OATP-RP4，OATP-RP5，OATP-RP1的活性進行調節，例如使其激活或滅活；研究信號轉導機制和蛋白-蛋白相互作用；或為下述用途制備OATP。
并非所有的表達載體和DNA調節序列都對表達本發明的DNA序列具有同等良好的功能。也不是所有的宿主細胞都適合于同一個表達系統。但本領域的技術人員依照此處所公開的指導能夠在不偏離本發明的范圍內，無須多余的實驗即可選擇出表達載體，調節序列和宿主細胞。
多肽本發明進一步涉及含全部或部分本發明的OATP的氨基酸序列的多肽。本發明人優選包含全部或部分如SEQ ID NO2(OATP2)，SEQID NO4(OATP-RP2)，SEQ ID NO6(OATP-RP3)，SEQ ID NO8(OATP-RP4)，SEQ ID NO10(OATP-RP5)or SEQ ID NO12(OATPRP1)所示的氨基酸序列的多肽。當本發明中的OATP的一部分被使用時，優選與包含該部分的完整OATP具有相同生物功能的部分。例如，在本發明的范圍內，是一些多肽，它們包含表現轉運活性的OATP2，OATP-RP2，OATP-RP3，OATP-RP4，OATP-RP5，或OATP-RP1的全部或其中一部分。該部分可能包含一個或多個突變，因此使蛋白失去轉運活性，但它們仍可以用于篩選調節或結合于該蛋白或其中一部分的化合物。
本領域的普通技術人員可以利用本領域所公知的方法制備上述多肽。例如，可以使用化學合成法，如Houghton等，(1985)美國國家科學院院刊。825131-5中描述的固相合成法。另一種方法是mRNA的體外轉錄法。人們也可以在上述宿主細胞中制造這些多肽，這是本發明優選的方法。例如，人們可以如上所述用PCR的方法合成包含全部或部分如SEQ ID NO1，SEQ ID NO3，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO11所示的DNA序列，將合成的序列插入表達載體，轉化宿主細胞，培養宿主細胞制造所需多肽。
本領域的技術人員可以用目前已知的任何一種方法來分離純化所得多肽例如離子交換層析，凝膠過濾層析，親和層析。這樣的技術有可能需要對蛋白進行修飾。例如，需要給蛋白加上組氨酸標記使之能用鎳柱純化。
本領域的技術人員能在多種領域中應用本發明的多肽。例如，人們可以利用它們制造多克隆或單克隆抗體。技術人員可以利用這些抗體進行免疫檢測(例如，放射免疫分析，酶免疫分析，免疫細胞化學)，對多種來源的多肽進行免疫純化(例如，親和層析)或免疫治療。
本領域的技術人員可以利用已知的方法制造經修飾的OATP多肽。這種修飾可導致活性的提高或降低，獲得高水平的蛋白產物，簡化蛋白的純化。這種修飾有助于檢驗所結合的特異OATP氨基酸，而這又轉而有助于OATP調節劑的合理的藥物設計。人們可以基于所包括殘基的相似極性，電荷，溶解性，疏水性，親水性，和/或兩親性，來制造氨基酸替代物。例如，帶負電荷的氨基酸包括天冬氨酸，谷氨酸；帶正電荷的氨基酸包括，賴氨酸，精氨酸；帶有不帶電荷的極性頭部和具有相似的親水性的非極性頭部的氨基酸包括，包括亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸，精氨酸，甘氨酸，丙氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，絲氨酸，蘇氨酸；苯丙氨酸，酪氨酸，所有這些經修飾的多肽均包括在本發明的范圍內。
優選的類似物包括不同于本發明中新的OATPs(或其中的活性片段)的蛋白，這種不同是通過一個或多個保守氨基酸的替換，或在不影響生物活性的前提下，通過一個或多個非保守氨基酸的替換，缺失，或插入而造成的。保守替換典型的包括有由具有相似特性的氨基酸之間的替換，如下列組中各氨基酸之間的替換纈氨酸，甘氨酸；甘氨酸，丙氨酸；纈氨酸，異亮氨酸，亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸；天冬酰胺，谷氨酰胺；絲氨酸，蘇氨酸；賴氨酸，精氨酸；和苯丙氨酸，酪氨酸。其他的保守氨基酸之間的替換可以參考下表。
表1保守氨基酸間的替換
其它包括在本發明內的是那些經修飾提高了蛋白或多肽穩定性的類似物，這樣的類似物可以包括，例如，在蛋白或多肽中的一個或多個非肽鍵(替代肽鍵)。還包括含非天然存在的L-氨基酸，例如D-氨基酸或非天然存在的或合成氨基酸，例如，β或γ氨基酸殘基的類似物。
本發明還包括上述多肽的許多其它變異體。這些變異體包括所述多肽的鹽和酯，和上述多肽的前體(例如，具有N端取代基的如，甲硫氨酸，N-甲酰甲硫氨酸，和前導序列)。本發明包括所有這樣的變異體。
檢測核酸的方法本發明進一步包括檢測編碼OATP蛋白的核酸的方法。在此方法中，本領域的普通技術人員(a)將未知序列的核酸與具有與已知編碼序列(例如來自下列序列的至少10個核苷酸，所述序列為SEQ IDNO1，SEQ ID NO3，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ IDNO9，或SEQ ID NO11，特別是其中的編碼區域)互補的序列相接觸，其中后一核酸帶有可檢測的標記；和(b)檢測與任何未知序列的核酸相結合的標記。結合標記的存在說明有所需核酸序列存在。人們可以應用這一方法檢測其它組織中的OATP核酸(其可能具有其它調節元件)和其它種(例如猴)中的核酸。
本領域的普通技術人員知道如何獲得本方法中用于分析的核酸。對于基因組DNA，人們可以將組織迅速冷凍，將其擠壓成易于消化的片，將經擠壓的組織在蛋白酶K和SDS中溫育，至大部分細胞蛋白降解。然后通過連續地經苯酚/氯仿/異戊醇抽提，使基因組DNA脫蛋白，乙醇沉淀回收DNA，干燥，懸浮于緩沖液中。對于RNA，可以在4M的胍溶液中裂解培養細胞，用20-號針吸取裂解物，由氯化銫梯度離心使RNA成球狀，去除上清液，小球中即包含純化的RNA。
可檢測標記可以是連接到互補核酸的一個核苷酸上的放射性離子。盡管人們可以用其它的標記，例如生物素，但通常的放射性標記為32P和35S，本領域的普通技術人員知曉用多種方法都可以將放射性標記連接到互補核酸上，(例如用隨機引物法附加32P或35S)。
本領域的普通技術人員都能知道如何用這樣的方法來檢測核酸。例如，可以用放射性標記的OATP互補的寡核苷酸探針進行DNA或RNA印跡。然后通過放射自顯影檢測雜交信號。利用不同的標記人們也可以使用其它的檢測方法(例如分光光度法)。
檢測OATP調節劑和由本發明中的OATPs轉運的化合物的方法本發明進一步涉及檢測本發明中的OATPs的方法和檢測由本發明中的OATPs(例如被轉運到肝中作為其它化合物載體的化合物)轉運的化合物的方法。在表達OATP的細胞中篩選OATP調節劑需要檢測所結合的分子(例如，多肽，天然產物，合成化合物)。另外，篩選OATP正調節劑和/或負調節劑需要檢測已知化合物轉運的增加和/或抑制。篩選OATP轉運化合物需要檢測由OATP轉運的分子(例如，多肽，天然產物，合成化合物)。
對本發明的OATPs進行克隆和測序使人們能夠構建可用于篩選由OATP活性結合，調節，和/或轉運的天然產物或合成化合物的細胞。檢測OATP調節劑的方法需要用如上所述的方法轉化合適的載體到感受態的受體細胞。人們用測試物(例如，合成化合物或天然化合物)與經轉化的細胞作用，然后在測試物存在或不存在時檢測其活性。
OATP分析測定OATP活性的方法可依下述步驟進行在聚d賴氨酸包被的平皿中加入添加了10％的胎牛血清，及青霉素和鏈霉素的Dullbecco改進的Eagle培養基(DMEM)，在其上涂布HEK293細胞，用Lipofectamine Plus(Life technologies，Inc)將OATP轉運蛋白表達質粒共轉化HEK293細胞。在底物轉運24小時后分析細胞和培養基。或者，在無需感染的情況下，可直接涂布和分析為穩定表達OATPs而設計的細胞系。為測定轉運，去除培養基，用無血清的DMEM培養基洗一次，加入僅含[3H]-底物或含不同濃度的非標記測試化合物的同樣的培養基，對單層細胞細胞一式三份進行分析。對OATP2，[3H]-底物可以是[3H]-帕伐他丁(pravastatin)，[3H]-牛磺膽酸鹽，[3H]-硫酸脫氫表雄酮，或[125I]-甲狀腺激素(T4)。單層細胞根據不同轉運蛋白在室溫下培養5到10分鐘。然后細胞用含5％BSA的冰冷的DMEM快速地洗一次，用含0.1％BSA的DMEM洗兩次，再用DMEM單獨洗一次。用0.1N的NaOH裂解細胞，用一部分裂解物以液閃記數測定放射性同位素標記的摻入情況，另一部分以BSA作標準用Bradford分析法分析裂解物中的蛋白濃度。用每分鐘每毫克細胞蛋白中轉運到細胞內的底物摩爾數表示轉運活性。
藥物導向表達本發明中OATP的器官也表達包含在本發明的范圍內。本發明的OATPs也可用于針對表達上述OATP的特定器官(例如，肝)的導向藥物，及內源底物濃度的調節。
例如，這里所公開的新器官陰離子轉運蛋白，OATP2，由于具有調節細胞吸收和分泌幾種具有重要生物學功能的器官陰離子的能力而代表潛在的治療目標，所述的器官陰離子包括，膽酸和雄性激素硫酸脫氫表雄酮(“DHEAS”)。而且，由于OATP2轉運至少一種藥物(即，帕伐他丁(pravastatin))，而且已知這一家族的其它成員轉運多種生物異源物質，則可以利用這一轉運蛋白將藥物從其它組織轉運出和進入肝臟進行最優化。
OATP家族中，OATP2是目前唯一已知的在肝臟中專一性表達的器官陰離子轉運蛋白。因而，以這種轉運蛋白優化的藥物比用其它已知的轉運蛋白優化的藥物對肝的導向運輸具有更高的選擇性。將這種方法一般化，可以檢測某種小分子接頭(由OATP2轉運的化合物)，這種接頭可由OATP2有效地識別并轉運，而OATP2又可以附加于其它以肝臟為靶器官的藥物，即使上述的母核化合物并非由OATP2轉運。
另外，如果治療性化合物完全或主要通過OATP2被肝吸收，人們可以通過增加上述不能由OATP2轉運的化合物的官能度來抑制肝的清除作用，并由此提高循環濃度，或提高該化合物在外周血中的半衰期。類似的，若某種內源底物通過OATP2而被肝臟吸收并在循環中清除，則競爭性或非競爭性的OATP2抑制劑可以提高所述化合物在血漿中的水平。例如，DHEAS是一種腎上腺雄激素，由實驗動物數據表明它隨年齡增長而衰退，事實表明DHAS缺陷的替換可以刺激年齡相關的免疫缺陷，提高認識功能和胰島素敏感度，保持骨骼質量。通過阻礙DHEAS與OATP2的相互作用可以抑制肝對內源DHEAS的清除，導致在沒有激素補充的情況下激素水平提高。
根據這里提供的信息，本領域的技術人員可以鑒定，由此處所公開的OATPs，如OATP2轉運的天然存在或人工合成的分子(包括治療性藥物)。作為一類，OATPs一般表現為廣泛的底物特異性(“多特異性”載體)。因而，可以預見這些轉運蛋白的多種其他底物都是可以得到證明的。
基因治療本領域的普通技術人員可以利用正義或反義核酸作為治療OATP相關適應癥的治療劑。可以構建載體來指導合成所需的DNA，RNA，或規劃本領域所描述的核酸。
有幾篇文獻是描述反義分子的效用的。參見Toulme and Helene(1988)，基因(Gene)7251-8；Inouye(1988)，基因(Gene)，7225-34；Uhlmann and Peyman(1990)，化學綜述(ChemicalReviews)90543-584；生物技術信息觀察(BiotechnologyNewswatch)(1996年1月15日，)，p.4Robertson.NatureBiotechnology 15209(1997)；Gibbons and Dzau(1996)，科學(Science)272689-93。技術人員可以以基因組DNA和/或cDNA，5’或3’側翼控制區，其它側翼序列，內含子序列，和在形成三股DNA時使用的非經典Waston和Crick堿基配對的序列為基礎來設計它們。這樣的反義分子包括反義的寡聚脫氧核糖核酸，寡聚核糖核酸，寡核苷酸類似物，諸如此類，而且可以包括15到25個堿基。
反義分子可以共價或非共價地結合到OATP DNA或RNA上。這種結合可以，例如，裂解OATP DNA或RNA，或者使OATP DNA或RNA易于裂解，提高核或細胞質中mRNA的降解，或者抑制轉錄，翻譯，反式激活因子的結合，mRNA前體的拼接或加工。反義分子也可以包括附加的功能，如提高穩定性，向細胞內外轉運，結合親和力，靶分子的裂解，諸如此類。所有這些效果均降低OATP蛋白的表達，因此構建反義分子作為OATP調節劑是有用的。
實施例下列實施例均包含于本發明的范圍內，并非是對本發明的限制，本發明要求保護的范圍僅由權利要求書中內容限定。
實施例1分離OATP2，OATP-RP1，OATP-RP2，OATP-RP3，OATP-RP4和OATP-RP5全長cDNAs并克隆到哺乳動物表達載體上通過在公共的EST數據庫中搜索人OATP同源的序列驗證了人OATP2。一個EST序列Genebank登錄號為T73863，編碼與OATP有明顯序列同一性的部分cDNA。通過在公共的EST數據庫和Incyte，Inc.EST數據庫中搜索人OATP同源的序列，驗證了編碼OATP-RP1，OATP-RP2，OATP-RP3.OATP-RP4和OATP-RP5的部分cDNA的EST序列。與OATP-RP1相關的EST克隆IDs是820117，2668489，1610706，2972518，和588148。這些克隆表示編碼全長cDNA中的一部分的重疊群。與OATP-RP2相關的Incyte EST克隆IDs是1664737和2641944。這些克隆表示編碼全長cDNA中的一部分的重疊群。與OATP-RP3相關的Incyte EST克隆IDs是2493241，2497845，和2664024。這些克隆表示編碼全長cDNA中的一部分的重疊群。與OATP-RP4相關的Incyte EST克隆IDs是1494683和1685219。這些克隆表示編碼全長cDNA中的一部分的重疊群。與OATP-RP5相關的Incyte EST克隆IDs是925716。這一克隆僅編碼全長cDNA中的一部分。用Gene Trapper cDNA正選擇系統(LifeTechnologies，Inc.)獲得了上述基因的全長克隆。在這一過程中與每一個EST重疊群或單個EST序列互補的單寡核苷酸或多寡核苷酸，均在3’端由生物素酰化，與在pCMVSport2(LifeTechnologies，Inc.)中構建的單鏈人cDNA文庫雜交。用于每個基因的寡核苷酸序列及所篩選文庫的組織來源如表2所示。
表2以Gene-Trapper Selection法篩選OATP全長cDNA序列所用到的寡核苷酸
生物素酰化的寡核苷酸與單鏈cDNA雜交的雜交體，可由抗生物素蛋白鏈菌素包被的磁珠捕獲。清洗后，被捕獲的單鏈cDNA從生物素酰化的寡核苷酸上釋放出來，通過DNA聚合酶，用相應的寡核苷酸使其恢復為雙鏈。接下來，轉化，涂皿，用PCR分析方法驗證對于每個基因的陽性克隆。全長的cDNA通過測序驗證。對于OATP-RP1，部分cDNA是由上述技術(pSP-RP1A)獲得的。作為OATP-RP1重疊組的一部分的另一個cDNA克隆是通過在公共EST數據庫中搜索驗證的(Genebank登錄號為AI027850)。這一克隆的EcoRI-NotI片段包括OATP-RP1(SEQ ID NO11)(由Research Genetics，Inc.獲得)的前477個核苷酸，與經EcoRI-NotI消化的pSP-RP1A相連接，以產生全長序列。
在對多OATP-RP4 cDNA克隆進行測序時證明了兩個多形態位點。因此，SEQ ID NO7中的第713號核苷酸可以是C，在SEQ ID NO8中編碼亮氨酸，或者是T，在SEQ ID NO8中編碼苯丙氨酸。相似的，SEQ ID NO7中的第2397號核苷酸可以是G，在SEQ ID NO8中編碼甘氨酸，或者是T，在SEQ ID NO8中編碼纈氨酸。
為研究表達，將OATP2 cDNA克隆到表達載體pCEP4βR中，用于瞬時轉染。pCEP4βR(Invitrogen，Inc)是pCE4經修飾的形式，其中CMV啟動子驅動的表達盒是反向的。為此，用KpnI-NoI精確地酶切pCMVSport2中的OATP2 cDNA，其相應于SEQ ID NO1中第59到2361位核苷酸。將該片段克隆進KpnI-NotI消化的pCEP4βR。該克隆，pCEP-OATP2用于瞬間轉染表達研究。
實施例2OATP2，OATP-RP1，OATP-RP2，OATP-RP4和OATP-RP5的組織和細胞分布表達OATP2，OATP-RP1，OATP-RP2，OATP-RP4和OATP-RP5的組織分布，通過來自多種人體組織的(圖1)的聚A+RNA的RNA印跡確定。在文獻中預先描述的這一家族的轉運蛋白，即人OATP，rat oatp1，rat oatp2，rat oatp3，都是在肝臟，腎臟和腦中表達的。以上所有的轉運蛋白均轉運膽酸和多種其它底物，所轉運的物質對這些轉運蛋白的成員具有特異性。相反，OATP2也轉運膽酸但其表達具有很強的肝特異性；其僅與來自肝臟，而非其他組織的RNA雜交時可以觀察到一條主要的3.2kb帶和幾條小雜交帶。由OATP2的核糖探針與人肝臟樣品的原位雜交來檢測表達這一轉運蛋白的特異細胞類型。強雜交信號定位于全部肝小葉的肝細胞，在小葉中心部分，中間條帶或周圍區域中信號的強度沒有明顯的區別。在膽管，枯柏法細胞或血管中均無信號，在人肺部的任意一種細胞類型中也沒有檢測到信號。(數據未提供)OATP-RP1幾乎在所有被檢測的組織中都有表達，在骨骼肌，肺，胎盤，和心臟中量最高。OATP-RP2在所有被檢測的組織均表達。OATP-RP4的表達具有較強的限制性，在骨骼肌和心臟中有大量的轉錄物，而在前列腺和胸腺中很少。OATP-RP5也有類似的組織特異性，僅在腦和睪丸中檢測到了轉錄物。
實施例3OATP2在轉染后細胞中的表達
293EBNA細胞(Invitrogen，Inc)，一種HEK293細胞衍生物，經OATP2表達載體pCEP-OATP2或單獨的pCEP4載體(MOCK)瞬間轉染，24小時后檢測由[3H]標記的底物的轉運情況。圖2A顯示[3H]標記的帕伐他丁(pravastatin)和[3H]標記的DHEAS的特異性攝入。圖2B和2C分別顯示[3H]標記的牛磺膽酸鹽和[125I]標記的甲狀腺激素的特異性攝入。在過量的非標記底物存在(空心棒)或不存在(實心棒)下確定經pCEPOATP-RP1或空載體(MOCK)感染的細胞對放射性標記的底物在5分鐘內的攝入量。因此，OATP2是轉運至少包括HMGCoA還原酶抑制劑，膽酸，腎上腺皮質激素和甲狀腺激素的肝臟特異性的人體轉運蛋白。
權利要求
1.一種經分離純化的編碼全部或部分器官陰離子轉運蛋白(“OATP”)的核酸序列，所述的OATP包括選自下列組中的氨基酸序列SEQ ID NO2(OATP2)，SEQ IDNO4(OATP-RP2)，SEQ ID NO6(OATP-RP3)，SEQ ID NO8(OATP-RP4)，SEQ ID NO10(OATP-RP5)，和SEQ ID NO12(OATP-RP1)。
2.如權利要求1所述的核酸序列，包含(a)選自下列組中的核酸序列SEQ ID NO1，SEQ ID NO3，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9，和SEQ ID NO11；(b)(a)項中的編碼區；(c)(a)或(b)項中序列的互補序列；或(d)由于遺傳密碼的簡并性與(a)，(b)或(c)有區別的核酸序列。
3.一種表達載體，包含如權利要求1或2所述核酸分子以及有效的與核酸分子相連接的表達控制序列。
4.一種經轉化的宿主細胞，包括一種表達載體，該表達載體包含如權利要求1或2所述核酸分子以及有效的與核酸分子相連接的表達控制序列。
5.一種OATP蛋白，包括選自下述組中的氨基酸序列SEQ ID NO2(OATP2)，SEQ NO4(OATP-RP2)，SEQ ID NO6(OATP-RP3)，SEQID NO8(OATP-RP4)，SEQ ID NO10(OATP-RP5)，和SEQ ID NO12(OATP-RP1)。
6.經修飾的OATP蛋白，包括如權利要求5中所述的OATP蛋白，該蛋白保持了權利要求5中所述的OATP蛋白的活性，但至少包括一個氨基酸的替換或缺失。
7.生產OATP的方法，所述方法包括下列步驟a)將如權利要求1或2所述的編碼OATP蛋白或其同源物的核酸序列插入合適的表達載體，b)將所述表達載體轉染合適的轉染宿主細胞，c)在合適的培養基中培養所述的經轉染的宿主細胞，d)從上述培養基中純化OATP蛋白或其同源物。
8.經分離的核酸序列，該核酸序列在嚴緊條件下可與如權利要求1或2所述的核酸序列雜交，其中所述核酸序列至少包括選自SEQID NO1，SEQ ID NO3，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9或SEQ ID NO11中的連續的18個核苷酸。
9.如權利要求5所述的OATP的特異抗體。
10.如權利要求9所述的抗體，其特征在于所述抗體為單克隆抗體。
11.權利要求5所述的OATP的生產方法，包括a)將編碼所述OATP的核酸序列插入合適的表達載體，b)將上述表達載體轉染合適的轉染宿主細胞，c)在合適的培養基中培養所述的經轉染的宿主細胞，d)從上述培養基中純化OATP蛋白。
12.鑒定能與如權利要求5所述的OATP，或其中一部分相結合的配基的方法，該方法包括下列步驟a)在允許配基-OATP復合物形成的條件下，使所述OATP，或所述OATP的一部分與所述配基反應，所述配基潛在地能與所述OATP，或所述OATP的一部分相結合；b)對配基-OATP復合物，自由配基和非結合OATP進行分析。
13.鑒定能由如權利要求5中所述OATP或所述OATP的一部分轉運的底物的方法，該方法包括下列步驟a)在允許所述底物穿過細胞膜的條件下，使所述OATP，或所述OATP的一部分與所述底物反應，所述底物潛在地能與所述OATP，或所述OATP的一部分相結合；b)對所述底物穿越細胞膜的運動進行分析。
14.向表達如權利要求5所述的OATP蛋白的器官運送分子的方法，該方法包括a)鑒定可由所述OATP轉運的底物，b)將待轉運的分子與底物相結合形成底物-分子融合復合物，c)將所述底物-分子融合復合物提供給所述器官。
15.一種融合蛋白，該融合蛋白包括全部或部分如權利要求5所述的OATP，其與另一種多肽相結合。
16.鑒定調節劑的方法，該調節劑能夠增強或抑制由如 5所述OATP，或所述OATP的一部分轉運的底物的運輸，該方法包括a)在允許所述底物穿過細胞膜的條件下，使所述OATP，或所述OATP的一部分與所述底物和所述的調節劑反應，所述調節劑潛在地能增強或抑制底物的轉運；b)對所述調節劑對所述化合物轉運的增強或抑制進行檢測。
17.如權利要求2所述的核酸分子，其特征在于所述核酸分子包括，包含在ATCC登錄號為207209中的OATP基因，或OATP基因的互補基因。
18.如權利要求2所述的核酸分子，其特征在于所述核酸分子包括，包含在ATCC登錄號為207210中的OATP基因，或OATP基因的互補基因。
19.如權利要求2所述的核酸分子，其特征在于所述核酸分子包括，包含在ATCC登錄號為207211中的OATP基因，或OATP基因的互補基因。
20.如權利要求2所述的核酸分子，其特征在于所述核酸分子包括，包含在ATCC登錄號為207212中的OATP基因，或OATP基因的互補基因。
21.如權利要求2所述的核酸分子，其特征在于所述核酸分子包括，包含在ATCC登錄號為207213中的OATP基因，或OATP基因的互補基因。
22.如權利要求2所述的核酸分子，其特征在于所述核酸分子包括，包含在ATCC登錄號為207214中的OATP基因，或OATP基因的互補基因。
全文摘要
本發明公開了新的器官陰離子轉運蛋白(“OATPs”)的核酸序列和氨基酸序列。本發明包括此處描述的OATPs,及含其cDNA序列的載體,包含上述載體的宿主細胞和含全部或部分OATP的多肽。還包括OATPs在針對特定器官的靶向藥物中及調節內源底物濃度中的應用。
文檔編號C07K14/47GK1351612SQ00807838
公開日2002年5月29日 申請日期2000年5月19日 優先權日1999年5月20日
發明者T·G·基爾克格斯納, B·斯昂, Y·朱, Y·吳, Z·王, J·S·林奇, X·黃, W·P·楊 申請人:布里斯托爾-邁爾斯斯奎布公司