血管粘著分子及其功能的調節的制作方法

專利名稱：血管粘著分子及其功能的調節的制作方法
技術領域：
本發明涉及鑒定血管粘著分子的新亞族，以及調節這些分子的功能以治療各種疾病。
在胚胎和出生后早期發育的整個過程中，內皮細胞通過血管生成和血管發生形成新的血管。在成年生物體內，內皮細胞限定血液組織屏障并由非循環的休眠細胞組成。這些極性化細胞彼此通過緊密接合和粘著接合連接以形成細胞的連續層。內皮細胞層的功能在于維持組織穩態、纖維蛋白溶解、凝集、血管緊張及白細胞反式遷移。所有這些性質都是受粘著分子表達和功能的精細調節控制的。
炎癥、腫瘤生長、創傷或血管發生等病理狀態均導致血管內皮上粘著分子數目和功能的臨時改變，并進而改變血管的穩態。例如，腫瘤可增加血管生成因子的局部濃度，使非循環休眠內皮細胞轉換成增殖的內皮。血管生成轉換是由包括IL-8、表皮生長因子(EGF)、血管內皮生長因子(VEGF)、可溶性VCAM-1、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和腫瘤壞死因子(TNF)在內的幾種因子誘導的。結果，已有血管的內皮細胞降解細胞外基質(ECM)和浸入周圍組織，進而導致腫瘤的血管形成。
在血管生成轉換期間，內皮細胞基因表達的模式受到改變。例如，用bFGF或TNFα處理內皮細胞可使參予內皮細胞遷移的粘著分子αvβ3整聯蛋白表達增加4倍。另外，血管生成轉換可改變內皮的炎性反應，導致白細胞向腫瘤異常遷移。正常情況下，白細胞在內皮上粘著并通過內皮遷移而從血液中外滲。這些機制發生在一個涉及選擇蛋白、整聯蛋白和免疫球蛋白超家族粘著分子的多步驟過程中。
在腫瘤相關內皮中，已發現VCAM、ICAM和選擇蛋白是受到下調的。這些粘著分子的下調可能代表一種腫瘤免受免疫系統的細胞毒性細胞侵入的機制。
本發明的目的是尋找在處于腫瘤影響下的內皮中受到轉錄調節的免疫球蛋白超家族(Ig Sf)的新的粘著蛋白。
本發明的再一個目的是定義用于治療各種適應癥如腫瘤和炎癥的衍生于新的粘著蛋白的分子。
在導致本發明的研究中，使用小鼠實驗模型鑒定在上皮細胞系與黑素瘤細胞共培養期間受調節的轉錄物。為了將篩選策略限制于Ig Sf的粘附分子，發展了一種稱為“定向差異顯示”的新的RNA顯示方法。這種改良的顯示技術的新穎性在于只使用一組簡并引物。如將在實施例中證明的，令人驚奇地發現這種方法具有足夠高的特異性。
更具體地說，使用部分簡并的引物(在本案中，簡并水平是一組內有2048至4096個不同形式的引物)使之針對見于Ig Sf成員的C2區域中的保守序列，以驅動基于聚合酶鏈反應(PCR)的定向差異顯示技術(Samaridis & Colonna(1997)Eur.J.Immunol.27，660-665)。
基于這一發現，本發明提供一種特異性鑒定差異表達的DNA序列的方法，其包括使用差異顯示反轉錄PCR，其中使用一組部分或完全簡并的靶基因特異性引物。常規RNA顯示策略的一個主要限制因素是該方法缺乏特異性。為了提高這種特異性，本發明人在尋找其它粘著分子中使用了針對編碼帶C2區之分子的序列的簡并引物。通過對比幾個Ig Sf粘著分子的C2區，并鑒定圍繞參與C2區結構Y(RQYS)-C-x-A-S-N-x2-G的半胱氨酸殘基的線性氨基酸共有區達到了此目的。在更普遍的意義上說，這種方法也可用于尋找其它序列，其中一個或多個最常見共有序列的反向翻譯被用來設計用于進行差異顯示的簡并引物。
該方法用于鑒定在黑素瘤或癌細胞存在下因匯合而在內皮細胞中受到下調的轉錄物。cDNA編碼具有不尋常結構特征，并稱為CRAM-1(“匯合調節的粘著分子”)的新的Ig Sf分子。目前對參予白細胞反式遷移的結構相關分子JAM的描述，提示存在有其中以JAM和CRAM-1為原型的新的粘著分子家族。與EST數據庫的序列對比進一步用于此分子家族的第三個成員CRAM-2的克隆。

圖1顯示編碼CRAM-1和CRAM-2蛋白的小鼠cDNA序列。在本申請中，名稱JAM和JAM-1、CRAM-1和JAM-2，以及CRAM-2和JAM-3是可以互換使用的。
編碼JAM、CRAM1和CRAM-2的轉錄物的比較組織分布顯示了這些分子在內皮和上皮區室中的優先表達，表明了其在維持細胞-細胞接觸中的作用。休眠內皮細胞的細胞-細胞相互作用調節血管通透性、細胞周期及白細胞穿過內皮細胞壁的反式遷移。
為了進一步闡明三種分子的功能和相互影響，使用了一種分子研究手段。為此，構建了由Flag尾端和與可溶性或膜結合形式的CRAM-1、CRAM-2或JAM融合的增強綠色熒光蛋白(EGFP)組成的嵌合分子(參見圖2)。當轉染到細胞系中時，CRAM-1和JAM的EGFP融合產物集中在細胞-細胞接觸點，證明這些分子在細胞-細胞聯系中發揮作用。相反，CRAM-2在細胞表面有更為廣泛的分布。另外，CRAM-1的可溶性構建體阻斷白細胞的體外跨內皮遷移，而可溶性JAM則只顯示出邊際效應。總之，這些結果提示這一新的粘著分子亞族在維持血管完整性和內皮層功能中發揮重要作用。
基于這些發現，本發明提供了用基于CRAM多肽的試劑抵抗慢性炎癥和腫瘤發展等醫學適應癥的新方法。
更具體地說，本發明涉及屬于人免疫球蛋白超家族的一個亞族的分離形式的多肽，該多肽顯示與鼠匯合調節的粘著分子1或2(CRAM-1或CRAM-2)的氨基酸序列至少有70％序列同源性(參見圖3上行和第二行)。圖4和5分別顯示小鼠JAM-2(CRAM-1)和JAM-3(CRAM-2)之間在氨基酸水平上的序列對比。
見于人或動物體內的CRAM多肽是生長細胞的標記。CRAM表達在生長的細胞中受到上調。
本文公開的是作為該家族成員的兩種新的小鼠多肽。基于這些多肽的序列信息，可以用已知的方法如PCR、DNA文庫的交叉雜交、抗體的交叉反應性來鑒定該家族的其它成員。
序列信息可以是氨基酸序列或編碼氨基酸序列的核苷酸序列。
更具體地說，本發明涉及人的相應多肽，其基本上包括如圖6B所示的氨基酸序列和與之至少70％同源的氨基酸序列。
除了使用本文公開的兩種CRAM蛋白鑒定其它種動物如人中該家族的其它成員外，也可使用這兩種蛋白質和其相應的家族成員制備衍生的分子，如抗本發明(多)肽的抗體、蛋白質的重組等同物(可以是可溶形式的)，或包括該多肽之至少一部分氨基酸序列的肽。適當的氨基酸序列部分是細胞外區域VC2和膜最接近的胞質序列A-[Y，Q]-[R，S]-[R，K]-G-[C，Y]-F。
除了抗體和(多)肽型衍生物外，本發明還涉及具有編碼完整多肽或其部分之序列的多或寡核苷酸，該多肽具有與本文所述的CRAM-1或CRAM-2蛋白的氨基酸序列至少70％同源的氨基酸序列。更具體地說，本發明涉及與圖6中所示的人DNA CRAM-1序列至少70％，優選80％，更優選90％，最優選100％同源的核苷酸序列。
例如這樣的多或寡核苷酸可以是RNA或DNA，并且可以是引物，探針，反義RNA等。
所有這些分子均可用于調節見于人或動物體之原始多肽的功能，或用于診斷。
例如可用抗體抑制腫瘤中的血管生成。可使用它們作為針對攜帶CRAM多肽之細胞的導向分子。抗體可以自身發揮作用，或者可以與如毒素、放射性標記、熒光標記、酶標記、光活化標記的其它分子，以及與脂質體、細胞等偶聯。
標記的抗體特別適于抗體的診斷應用，即可以利用它們定位生長的腫瘤中的血管生成。此外，可以使用與毒素或放射性分子偶聯的抗體特異性地殺傷腫瘤(通過導向腫瘤中的(生長的)血管)。
發現除了淋巴結和淋巴集結等淋巴樣器官中的淋巴和高內皮小靜脈外，在正常維管結構中未檢測到CRAM型分子。其優點是，例如抗CRAM抗體的定向作用可以是對例如腫瘤細胞高度特異的，因而避免了不希望有的副作用。
此外，(多)肽可使分子結合在血管生成維管上，且借此刺激或抑制血管生成。
可以使用具有與CRAM多肽基本上相同的氨基酸序列的(多)肽治療血管內皮的炎性反應。根據本發明，發現可用sCRAM-1-IG2Do或抗CRAM-1單克隆抗體抑制白細胞的跨內皮遷移。因此可使用這種分子或相似分子抑制或刺激例如見于炎癥中的免疫反應。
分子在HEV血管細胞上的體內特異性表達(其為淋巴細胞遷移中特化的)支持CRAM對淋巴細胞遷移或血管通透性的刺激作用。因此這種作用可能是由于對正常參予封阻血管床的分子(CRAM-1，CRAM-2，JAM，PECAM，VE-鈣粘著蛋白)的調節。這一發現構成了本發明的其它應用的基礎，其中包括遞送本發明的重組CRAM分子(多)肽或抗CRAM-1單克隆抗體，以調節內皮細胞間接合。
也可使用抗CRAM抗體阻斷生長的細胞中的細胞-細胞相互作用。這種阻斷導致正常情況下維持血管屏障功能所需的細胞間接觸被打亂。可利用這一發現提高生長的血管的通透性，以增加藥物向生長的腫瘤、月經后子宮等部位的釋放。因此可利用細胞間接觸的打亂來阻斷帶抗原的腫瘤細胞如血管瘤(源于血管內皮的腫瘤)或某些迅速生長的癌瘤的發展。
為了診斷上的應用，可以利用標記的抗體，以及利用與見于表達CRAM蛋白之內皮細胞中的CRAM DNA或mRNA互補的標記的寡核苷酸。
下列實施例中將進一步舉例說明本發明，實施中所涉及的附圖如下圖1編碼CRAM-1和CRAM-2蛋白的鼠cDNA序列。將muCRAM-1亞克隆到pcDNA3載體中并使用Sp6和T7引物測序。作為IMAGE克隆從EST文庫(AcAA690843和W80145)中得到muCRAM-2并在pT7T3-DPac載體中使用T7和T3引物進行序列測定。
圖2實施例中所用分子工具的圖解顯示。上框中展示新家族的結構和重要的殘基。星號代表三種分子的胞質部分中的推測的磷酸化位點。C2區域中第二個典型Cys殘基在JAM序列中丟失。不同的嵌合分子呈現在融合位點的位置和周圍殘基的下方。白色背景中顯示來源于JAM、CRAM-1或CRAM-2序列的部分分子。
圖3CRAM-1和CRAM-2氨基酸序列的對齊比較。虛線指示缺口。
圖4鼠和人CRAM-1(JAM-2)之間的序列對比。
圖5鼠和人CRAM-2(JAM-3)之間的序列對比。
圖6人CRAM-1的核苷酸序列(上框)、人CRAM-1的完整氨基酸序列(中框)，和人CRAM-2的部分氨基酸序列。
圖7使用簡單引物進行定向差異顯示。(A)編碼存在于C2 Ig區域中之序列的PCR引物的核苷酸序列。兩個引物由于編碼Ser殘基的密碼子而編碼相同的序列。簡并性水平是編碼YRCXAS的引物有4096種不同的形式，其他引物有2048種形式。(B)示出用YYCXAS1引物得到的放射性PCR產物顯示。各泳道相當于從t-end內皮細胞系(泳道t-end)、B16黑素瘤細胞系(泳道B16)，或兩細胞系的共培養物(中央泳道)得到的cDNA跑出的PCR產物顯示。箭頭指示在共培養條件下從下調的轉錄物CRAM-1得到的PCR產物。
圖8(A)匯含調節的粘著分子1(CRAM-1)cDNA的核苷酸和推測的氨基酸序列。劃下線部分為推測的疏水信號肽(第一個)和跨膜區域(第二個)。圖中指出預計的N-糖基化位點(劃掉)，可能形成二硫鍵的半胱氨酸(括號)和可能的磷酸化位點的Ser/Thr/Tyr殘基(黑體)。(B)鼠CRAM-1蛋白的結構模型。顯示VH和C2樣Ig區域的細胞外部分有兩個推斷的N連接的糖基化位點。箭頭指向由用于定向差異顯示的部分簡并引物(YYCXAS1)導向的區域。
圖9JAM、CRAM-1和CRAM-2鼠蛋白序列對比。黑框內為相同殘基，灰色框指出同源殘基。CRAM-2和CRAM-1之間的總體相同性為36％，JAM和CRAM-1之間為31％，JAM和CRAM-2之間為33％，各自的同源性為52％、52％和49％。序列中虛線顯示缺口。星號標示V和C2區域的典型保守殘基(Cys和Trp)。
圖10以PT-PCR方法在不同泳道中檢測的(A)或以Northern印跡法在各種組織中檢測的(B)編碼JAM、CRAM-1和CRAM-2之轉錄物的表達。(A)對來源于經TNF處理的(泳道2和11相當于TNF處理的t-end)，或未處理的(泳道3、4、6、7、9、12分別相當于b-end.5、e-end.2、t-end V++L-、t-end VlowL++、TME和t-end)內皮細胞的cDNA進行PT-PCR。泳道5和10相當于腫瘤細胞系B16(黑素瘤)和KLN205(癌)。泳道8相當于未轉化的胸腺表皮細胞系MTE4-14。泳道1是對含有克隆的cDNA的質粒進行JAM、CRAM-1和CRAM-2擴增的陽性對照。(B)與小鼠Northern印跡進行P32探針雜交的放射自顯影。圖左側標明用于各個雜交的探針。以2kb大小檢測JAM和CRAM-1的雜交信號。
圖11JAM-2和JAM-1定位于已確立的細胞-細胞接觸點。A用抗JAM-2(a)或抗JAM-1(b)抗體對低聚甲醛固定的TME細胞進行免疫細胞化學分析。箭頭指示蛋白質特異性定位于細胞-細胞接觸點。標尺相當于10μm。BJAM-2-EGFP(a)和JAM-1-EGFP(c)嵌合分子特異性地定位于被轉染細胞間的細胞接觸點。轉染的和非轉染的細胞之間未觀察到EGFP重組蛋白質富集(箭頭)。標尺相當于20μm。CTME內皮細胞表面生物素化后JAM-2的免疫沉淀。分別使用抗PECAM(泳道1)和抗JAM-1(泳道2)抗體作為用CRAM-XIXH36抗體(泳道3)進行免疫沉淀的陰性和陽性對照。圖右側標出分子量。DCHO轉染的細胞中的EGFP重組蛋白質的免疫沉淀。使用抗JAM-2(泳道2、3、6)、抗JAM-1(泳道1、4、5)免疫沉淀來自未轉染的(泳道1和2)、JAM-1-EGFP(泳道3和4)，或JAM-2-EGFP(泳道5和6)轉染的CHO細胞中的生物素化的溶胞產物。圖右側指出分子量。
圖12在有或沒有趨化因子SDF-1存在下，脾細胞通過TNF活化的內皮細胞單層遷移。使用三種內皮瘤野生型t.end.1或用編碼CRAM-1或CRAM-2的cDNA轉染的t.end.1。試驗兩種抗小鼠CRAM-1的IgG1單克隆抗體F-26或H-26影響反式遷移的能力。
圖13CRAM-1對匯合功能的調節作用。使用對HPRT和CRAM-1 cDNA特異的引物的混合物驅動半定量PCR。PCR反應在1.2％瓊脂糖凝膠上進行并用溴化乙錠染色。泳道1、2和3相當于100、50、10％細胞匯合。100％匯合(泳道1)中可見微弱的CRAM-1信號。指明內皮細胞系(t-end.1和TME)自身或與腫瘤細胞系KLN205混合的培養條件。
圖14小鼠組織中JAM-2(a)、JAM-1(b)或β-肌動蛋白(c)轉錄物的Northern印跡分析。顯示對胚胎pc和成年mRNA制劑的分析結果。圖右側標出雜交信號的大小。
圖15JAM-2、JAM-1、ZO-1和PECAM表達的免疫組織學分析。用抗JAM-2(a，e，i)、抗JAM-1(b，f，j)、抗ZO-1(c，g，k)或抗PECAM(a，h，1)抗體著染一系列的腎(a-d)或腸系膜淋巴結(e-l)切片。各個圖片系列(a-d，e-h和i-l)都是用同樣的CCD設定獲得的。
圖16內皮細胞上的JAM-2表達。A內皮細胞系(tEnd.1、eEnd.2和TME)或鱗狀癌細胞系(KLN205)上JAM-2、JAM-1和PECAM表達的細胞熒光分析。陰影表示用針對CD4的抗體得到的陰性對照。B新鮮分離的內皮細胞上的JAM-2的細胞熒光分析。經膠原蛋白酶/分散酶消化解離所指出的器官，用所指出的DiIAc-LDL、CD31和抗JAM-2或抗JAM-1染色。通過選通對DiIAc-LDL(FL-2)和CD31(FL-3)呈陽性的內皮細胞群體得到直方圖剖視圖。刪去抗JAM-1或JAM-2的原始mAb得到陰性對照。
圖17(A)細胞-細胞接觸形成期間的JAM-2-EGFP定位。在JAM-2-EGFP轉染的CHO細胞單層形成期間以每小時3分鐘收集單個熒光照片。顯示前18分鐘得到的照片。在0時間，星號認定存在于視野中的三種細胞。在第6，12和18分鐘，箭頭標明JAM-2-EGFP在新形成的細胞-細胞接觸點的再定位。(B)受傷后的JAM-2-EGFP定位。箭頭符號指出受傷側并且箭頭尖突出標明富集JAM-2-EGEP的膜過程。照片上標出了所經過的時間。標尺相當于10μm。
圖18JAM-2表達降低旁側細胞通透性。通過非轉染的CHO細胞單層、用Tac(huIL2Rα)轉染的或用所指出的EGFP融合蛋白(JAM-1和JAM-2)轉染的CHO細胞的FITC-葡聚糖擴散，估測旁側細胞通透性。將JAM-2-EGFP或JAM-1-EGFP轉染到CHO細胞中導致旁側細胞通透性明顯降低(分別為57.8％+/-4.9和70.8％+/-3.6，p＜0.0001，而Tac轉染并沒有明顯地影響旁側細胞通透性(100.4％+/-4.4，p＝0.9872)。結果相對于非轉染的CHO細胞進行了校正。
圖19將JAM-2-EGFP(A)和JAM-1-EGFP(B)導向已存在的緊密連接點。用抗-occludin和抗兔-德克薩斯紅著染用JAM-2-EGFP(A)或JAM-1-EGFP(B)穩定轉染的匯合MDCK細胞。顯示從基礎至頂端水平的一系列照片(間隔0.9μm)的EGFP熒光(a)或occludin染色(b)。左邊基礎水平是任意限定的，如一系列照片包括+3.6和+4.5μm處焦點上的緊密接合水平(至右邊的第4和第5個照片)。
圖20可溶性重組分子對白細胞跨內皮遷移的影響。(A)以相對指數表示反式遷移并基于在非處理的t-end細胞系上得到的數值進行校正(虛線指數1)。顯示在1μg sJAM-Ig2do(白方塊)或1μg sCRAM-1-Ig2do(黑方塊)存在下得到的結果。以5次獨立的反式遷移實驗的平均值計算指數。(B)經Facs分析然后用抗CD3-FITC和抗B220-PE染色，從所得到的百分數計算細胞數，并以其表示反式遷移細胞的表型。星號代表與對照組有顯著差異的實驗點。
在下列實施例中，術語JAM和JAM-1、CRAM-1和JAM-2，以及CRAM-2和JAM-3可以互換使用。實施例材料和方法細胞系胸腺(tEnd.1)和胚胎(eEnd.2)內皮細胞系(Williams et al.，1989，Cell 571053-1063)由W.Risau和B.Engelhardt博士(MaxPlanck Institute，Bad-Nauheim，Germany)提供。SV40轉化的淋巴結內皮細胞系TME由A.Hamann博士提供(Harder et al.，1991，Exp.Cell Res.197259-267)提供。鱗狀細胞癌KLN 205、CHO、MDCK和骨髓瘤細胞系Sp2/0得自美國典型組織培養物保藏中心(ATCC)。除CHO外，所有細胞均生長在添加10％FCS(PAA Laboratories，Linz，Austria)、2mM谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素(均購自Gibco BRL)的DMEM(Gibco BRL，Paisley，Scotland)中。CHO細胞生長在添加上述成分的Nut.Mix.F-12(HAM)中。用PBS/0.15 mM EDTA洗，然后在胰酶/EDTA中37℃溫育5分鐘分離粘附細胞。顯示、克隆和序列分析為了進行共培養實驗，取5×105個t.End.1細胞連同2.5×104個B16 F10黑素瘤細胞在10cm組織培養皿中培養64小時。作為對照，取5×105個t.End.1細胞和2.5×105個B16 F10細胞分別在同樣條件下培養在64小時后產生匯合單層。按照生產商的說明書(Gibco BRL，Paisley，Scotland)在培養皿中用Trizol試劑直接提取總RNA。利用Oligo-dT(16鏈節)引物和Superscript反轉錄酶(Gibco BRL，Paisley，Scotland)由5μg總RNA制備cDNA。使用對管家HPRT cDNA特異的引物，對1μl 1∶5稀釋的cDNA進行27輪PCR以檢查cDNA的質和量。用下列編碼C2區域中遇到的最常見氨基酸序列YRCXAS、YQCXAS和YYCXAS的簡并引物5′TAYAGNTGYNNNGCYTCYAA3′、5′TAYCRGTGYNNNGCYTCYAA3′和5′TAYTAYTGYNNNGCYTCYAA3′進行差異PCR。PCR條件包括使用2μl稀釋的cDNA；2.5μl 10×Goldstar PCR緩沖液；2μl MgCl2；2μl簡并引物(0.3mM)；0.5μl dNTP(0.1mM)；0.1μl αP33dATP(10mci/m(Amersham PharmaciaBiotech，Dübendorf，Switzerland)；15.65μl H2O；0.25μl Goldstar Tag聚合酶(Eurogentech，Seraing，Belgium)。
PCR的參數如下94℃45秒；50℃90秒和72℃45秒，重復40次。加入甲酰胺/EDTA加樣緩沖液并將樣品于94℃變性2分鐘。然后在6％聚丙烯酰胺凝膠上分離PCR產物，并使用Kodak OM-Mat進行放射自顯影。比較帶的明暗度。
從干燥的聚丙烯酰胺凝膠上切下差異表達的帶并按已述方法(Liangand Pardee，1992，Science 257967-970)經煮沸和乙醇沉淀回收片段。然后使用沒有P33-ATP的增加濃度的dNTP(不是2μM，而是0.2mM)再擴增PCR產物。將按已述方法(Sambrook，Fritsch，and Maniatis，Molecularcloning；2nded.，Cold Spring Harbor Laboratory，Press；1989)將再擴增的產物克隆到pGem-T Easy載體(Promega Corp，Wallisellen，Switzer-land)中。
使用Thermo Sequence熒光標記引物循環測序試劑盒(AmershamPharmacia Biotech，Düendorf，Switzerland)和LI-COR DNA分析系統(MWG-Biotech GmbH，Ebersberg，Germany)測定兩個獨立克隆的核酸序列。JAM-3的鑒定通過在ExPASy分子生物學服務器(即Blast，Prosite，Swiss-Prot)上可用的應用進行序列分析和比較。鑒定與CRAM-1同源的三個不同的EST(登記號AA726206、AA052463和AA175925)。它們均不編碼全長轉錄物并且都包括有起始ATG序列。因此，按照生產商的說明書(GibcoBRL，Paisley，Scotland)，使用快速擴增cDNA末端的5′RACE-PCR系統(版本2.0)得到5′編碼序列。
使用下列三個基于EST序列設計的引物5′-GAGGTACTTGCATGTGCT-3′用于合成第一條鏈，5′-CGACAGGTGTCAGATAACA-3′和5′-CACCCTCCTCACTCGT-3′用于兩個嵌套式PCR。將5′RACE-PCR產物克隆到pGem-T載體中。為了得到CRAM-1的全長編碼序列，用Not I和Hpa I限制性酶消化克隆的5′RACE-PCR產物和EST(登記號AA726206)并連接到pGem-t載體中。全長CRAM-2的克隆是基于序列比較和5′RACE技術的同樣策略完成的。最后從EST登記號AA690843和W80145得到編碼CRAM-2的全長cDNA。這兩個克隆的不同在于3′未翻譯區的長度。Northern印跡按照試劑使用說明書，使用Trizol(Life Technologies AG，Basel，Switzerland)提取細胞或組織的總mRNA。使用Oligotex mRNA純化試劑盒(Qiagen，Zurich，Switzerland)從250μg總RNA中提取Poly-A+mRNA。胚胎Poly-A Northern印跡購自CLONTECH(P.H.Stehelin and CieAG，Basel，Switzerland)。由pcDNA3載體(Inv itrogen，Leek，Netherlan-ds)制備核糖探針，并包括編碼JAM-1和JAM-2的免疫球蛋白區域的序列，或編碼β-肌動蛋白的全長編碼序列。在含有50％甲酰胺的緩沖液中于62℃進行雜交。然后將印跡洗兩次(0.5×SSC，0.1％SDS，67℃)，并于-80℃在KodakX-Omat上進行放射自顯影。匯合實驗研究內皮細胞匯合對JAM-2 mRNA水平的影響。將2×105個TME內皮細胞在6、10和15cm直徑培養皿中培養，64小時后達到從10％到100％不等的細胞匯合水平。64小時后用錐蟲蘭排除法和計數法檢查細胞數目。結果可見所有情況下的細胞數目均相同，而且與培養皿的表面積無關。
使用半定量PCR反應或Northern印跡法確定在各種條件下轉錄物的相對量。為了檢測JAM-2轉錄物，使用5′-GACTCACAGACAAGTGAC-3′和5′-CACCCTCCTCACTCGT-3′引物對，得到750 bp擴增產物。作為內部對照，使用下列對Hprt cDNA特異的引物擴增350 bp長的片段5′-GTTGGATACAGGCCAGACTTTGTTG-3′和5′-GAGGGTAGGCTGGCCTATAGGCT-3′。表達載體的構建利用Hind III和Not I位點，將編碼EGFP的序列從pEGFP載體(CLONTECH，P.H.Stehelin and Cie AG，Basel Switzerland)亞克隆到pcDNA3中，因此命名為pcDNA3/EGFP。利用見于分別編碼JAM-2和JAM-1之胞質區域的序列中的3′限制位點Hpa I和Sca I，將EGFP之N末端的兩個序列融合到pcDNA3載體(Invitrogen，Leek，Netherlands)中。分別用SacII/HpaI或HindIII/ScaI消化，從pGemt或pRc/CMV上切下編碼JAM-2或JAM-1的插入段。
然后將編碼序列克隆到用Age I消化的pcDNA3/EGFP載體中，將末端修平并進一步用HindIII或SacII酶消化。如此在JAM-2的氨基酸位置DGV291和JAM-1的QPS285處產生融合位點。按照以前描述的方法(Ballestrem et al.，1998，J.Cell Sci.1111649-1658)轉化CHO細胞。
在含有1mg/ml G418的培養基中將被轉染的CHO細胞培養2周，以選擇用于通透性測定的穩定轉化體。分離抗性集落并以流式細胞儀(FACScalibur apparatus，Becton Dickinson，Mountain View，CA)檢查EGFP熒光強度，并用顯微鏡(Axiovert，Zeiss，Oberkochen，Germany)檢查熒光定位。
使用Axiovert熒光顯微鏡和Openlab軟件進行縮時圖象顯微術。
整合Flag-Tag(G.Wiedle，Dep.of Pathology，CMU，Geneva)編碼序列以對哺乳動物表達載體pcDNA3(Invetrogen，Leek，Holland)進行修飾。以PCR方法制備含有可溶形式JAM、CRAM-1和CRAM-2蛋白之編碼序列的Flag-Tag構建體。在所有情況下，均設計正向引物以適應ATG起始區。在編碼一個Ig可溶形式之鉸鏈區的序列中，或在編碼兩個Ig區域可溶分子的C2和跨膜區之間區域的序列中，均設計反向引物。所有反向引物都具有其中包括XbaI限制位點的3′延長部分，以便在Flag-Tag修飾的載體中進行直接的框內克隆。在PCR中利用Pfu DNA聚合酶，以避免頻繁突變(Stratagene，La Jolla，CA，USA)。然后用XbaI消化PCR片段并克隆到pcDNA3 Flag-Tag載體中，用EcoRI消化、用Klenow填平，然后再用XbaI消化。試劑和免疫熒光分析使用下列單克隆抗體抗PECAM(GC51，大鼠IgG2a；EA-3，大鼠IgG1)和抗JAM(H202.106.7.4，大鼠IgG1)(Malergue et al.，1998，Mol.Immunol.351111-1119；Piali et al.，1993，Eur.J.Immunol.232464-2471)。
使用標準技術，并以重組可溶性分子作為免疫原(Aurrand-Lions etal.，1996，Immunity 5391-405)，在實驗室中產生一組抗JAM-2的CRAM抗體。用ELISA方法篩選所選擇的雜交瘤用于生產能特異性識別重組可溶性JAM-2分子的抗體。進一步在JAM-2 cDNA轉染的CHO細胞上試驗陽性克隆(未示出)。
除了IgG2b亞類的CRAM-25F24外，所有CRAM抗體都是IgG1或IgG2a同型的。按照生產商的說明書，在蛋白G瓊脂糖柱(Pharmacia BiotechEurope，Dübendorf，Switzerland)上純化抗體。使用CRAM-19H36 mAb進行免疫沉淀，而CRAM-18F26是用于免疫組織化學分析的試劑。用CRAM-4H31和CRAM-17D33 mAb得到相似的結果。
使用與FITC或德克薩斯紅(Jaekson Immunoresearch，Milan，AG，LaRoche，Switzerland)偶聯的次級試劑(分別用于細胞熒光光度術和免疫組織化學)進行免疫熒光分析。
為了進行免疫組織化學分析，用冷卻的(-20℃)甲醇將樣品固定5分鐘。在PBS、0.2％明膠，0.05％吐溫20中使樣品重新水合，與初級抗體一起溫育過夜后洗滌樣品，并用與德克薩斯紅偶聯的適當次級試劑顯現之。為了分析新鮮內皮細胞，按照已建立的方法(Kramer etal.，1984，J.Cell Bidl.99692-698)用膠原酶/分散酶消化以解離新鮮切割的組織。37℃下用DiI酰基化的LDL(Molecular Probe EuropeBV，Leiden，Netherlands)將解離的細胞著染2小時，然后再用抗CRAM-19和山羊抗大鼠FITC探針著染。洗滌三次后，用生物素化的抗CD31(Pharmingen)和鏈霉抗生物素Red 670(Life technologiesAG，Basel，Switzerland)著染細胞。
在對兩種內皮細胞標記乙酰化的LDL(FL-2)和CD31(FL-3)呈陽性的細胞上進行JAM-1或JAM-2表達分析。刪去初級抗體即得到陰性對照。免疫沉淀使用10mM Tris-HCl緩沖液(pH7.4)、150mM NaCl、0.5％Triton×100、0.5％NP40、用于溶胞的蛋白酶抑制劑混合物(Roche DiagnosticsLtd，Rotkreuz，Switzerland)，按照以前描述的方法(Aurrand-Lions etal.，1997，Cellular Immunology 176173-179)完成免疫沉淀。在免疫沉淀，SDS/PAGE，和轉移到硝酸纖維素膜上后，使用與過氧化物酶(Jackson Immunoresearch)和ECL(Amersham Pharmacia Biotech，UK)偶聯的鏈霉抗生物素揭示生物素化蛋白質。通透性測定使用Transwell小室(6.5mm直徑、PC濾器、0.4μm孔徑，Costar Corp.)檢測通透性。簡單地說，在先已用0.2％明膠包被30分鐘的濾器上將1×104個轉化或未轉化的CHO細胞培養到匯合成片。5天后，將培養基換成預加溫的沒有FCS的Nut/F12培養基(下方小室中500μl，上方小室中200μl)。以1mg/ml的終濃度在上方小室中加入FITC-葡聚糖(分子量38，900，Sigma Chemical Co.)。
1小時后，除掉小室并使用細胞熒光儀II直接讀出下方小室中的熒光強度。計算5個獨立小室的平均熒光強度并使用Statview軟件和t試驗不成對比較法比較之。為了校正實驗結果，以使用野生型CHO細胞得到的平均熒光強度值作為100％。轉染和可溶性分子的純化按照生產商的說明書(Gibco BRL，Paisley，Scotland)，借助Lipofectamine試劑用可溶性IglDo和Ig2Do Flagtag/pcDNA-3構建體瞬時轉染293 T、Bosc 23或穩定轉染CHO細胞。轉染后，在10天期間內每兩天收集上清液。用含有蛋白酶抑制劑混合物(BoehringerMannheim，Germany)的PBS將共價連接到抗Flag抗體上的M2小珠(Kodak，New Haven，USA)洗兩次。然后將小珠與被轉染細胞的上清液于4℃保溫3小時。用含有蛋白酶抑制劑的PBS洗5次后，用小珠裝柱，并用10mM甘氨酸緩沖液(pH3.4)洗脫重組分子(參見使用說明書)。然后在Centricon-10(Millipore)上濃縮含有重組分子的洗脫部分并對PBS透析。
使用Micro BCA測定法(Biorad)測定蛋白質終濃度。使純化的產物受到SDS/PAGE電泳，然后用考馬斯蘭染色以分析其純度。反式遷移測定按已述方法(Wheerasinghe et al.，1998，J.Cell Biology 142595-607)完成白細胞通過內皮細胞的反式遷移。簡單地說，在1μg Ig可溶性重組分子sJAM 2do或sCRAM-1 2do存在下，將1×105個t-end細胞在反式小井單元(聚碳酸酯濾膜，5μm孔經，Costar)中培養2天。2天后，向上區室內加入得自淋巴結和淋巴集結的1×106個白細胞，并在實驗期間每小時監測反式遷移細胞的數目。4小時后，合并從5個獨立的小井得到的反式遷移細胞，并對B和T細胞標記B220和CD3進行細胞熒光光度分析。使用Facscalibur儀器和Cell-Quest分析程序(Becton-Dickinson)測得結果。
為了用脾細胞進行反式遷移測定，將3×105個內皮細胞接種到反式小井單元(聚碳酸酯濾膜，8μm孔經，Costar)中，使細胞經18小時形成單層。除去上區室中的培養基并向上區室內加入以Ficoll離心法從脾組織新鮮制備的106個白細胞(在100μl中)。向下區室的培養基(終濃度40 nM)內加入SDF-1以建立上和下區室之間的趨化因子梯度。為了用抗體進行實驗，在有脾細胞的上區室中加入濃度為10μg/ml的純化的抗體18-F26或19-H36。4小時后，收獲并計數反式遷移的白細胞(在下區室中)。結果以引入數的百分比(％)表示。結果定向差異顯示內皮細胞中基因的調節依賴于它們的環境。本發明涉及鑒定當內皮與腫瘤細胞接觸時受到調節的基因。為此目的，使用黑素瘤細胞(B16)與內皮瘤細胞系(t-end)的共培養物建立體外測定法。使用從混合物中提取的總RNA作為制備受到差異PCR篩選之cDNA的模板。使用從單獨培養的內皮細胞或黑素瘤細胞制得cDNA作為對照。比較三個不同模式以鑒定受到共培養條件調節的轉錄物。為了將分析限制在編碼Ig超家族之細胞表面分子的序列上，使用針對圍繞Ig超家族分子中C2區域C末端半胱氨酸的序列的部分簡并引物。使用編碼序列YYCxAS1的引物得到PCR產物的最具重現性的模式(圖7A)。這種RNA顯示技術的改良方法被稱為TDD，即“定向差異顯示”。
在TDD的重復實驗中，鑒定了十六個差異表達的基因。克隆后，進行核苷酸和氨基酸序列分析，發現16個PCR產物中有3個可能是編碼Ig超家族之未知成員的候選序列。選擇3個候選序列中的一個(CRAM-1)作進一步地研究。當分別培養時，t-end.1內皮細胞和B16黑素瘤細胞表達高水平的CRAM-1轉錄物。但當處于共培養條件下時，CRAM-1的表達水平受到向下調節(圖7B)。相當于CRAM-1的350bp片段的翻譯顯示了表明Ig C2區域結尾的氨基酸序列YYCxAS之后是含18氨基酸(加有跨膜區記號)疏水段的可讀框(ORF)。免疫球蛋白超家族成員CRAM-1PCR產物序列和核苷酸數據庫間的序列比較揭示出小鼠EST數據庫中的同源和相同序列。EST的存在表明，PCR產物相當于體內表達的序列。發現三個EST在其3′端含有與TDD產物中的300 bp相同的300 bp序列。每個EST的3′末端均含有一個Poly-A尾部。總EST長度為1270 bp并且相當于CRAM轉錄物的3′末端。因為轉錄物的5′末端在EST cDNA克隆中丟失，所以其可經5′RACE-PCR得到。圖8A中顯示推想的CRAM-1cDNA之所得的1980核苷酸長的全長編碼序列。有一個5′末端翻譯起始16 bp下游的強共有位點(GACATGG)，然后是推測為310氨基酸之蛋白質的單一ORF。繼潛在起始蛋氨酸之后的31氨基酸區域為信號肽的特征序列。推測切割位點是在Ala 31-Val 32處。
推斷的鼠CRAM-1蛋白質的結構示于圖8B中，并且由帶有可變重鏈的細胞外區域和帶有兩個潛在N連接的糖基化位點(aa 104和192)的恒定2型樣免疫球蛋白區域(Pfam，The Sanger Centre and Blast)組成。疏水性分析(Tmpred，ISREC)推斷在242-260位置之間有一個跨膜區。推測的胞質區由49個氨基酸組成并含有一些高度保守的Ser/Thr和Tyr磷酸化位點(圖8A，斜體字表示的殘基)。用Prosite程序檢索已知的模式，鑒定出作為蛋白激酶C的SSK/SYK，作為CK2的SKQD/TSEE和作為酪氨酸激酶磷酸化標記的KQDGESY/KHDGVNY等基元。JAM、CRAM-1和CRAM-2限定一個新的亞族幾種蛋白質顯示與CRAM-1有高度同源性。發現Ig超家族的兩個成員人A33抗原和小鼠中性細胞粘著分子的一部分即N-CAM與CRAM-1分別有41％和46％同源性。Ig Sf的另一個成員JAM具有與CRAM-1相似的結構，有34％氨基酸序列相同性和54％同源性。利用JAM和CRAM-1之間的明顯相同性找到EST數據庫中的第三個密切相關的序列，即CRAM-2，這三種分子之間的相同性提示在Ig超家族中存在一個新的分子亞族(圖9)。同源性不僅影響V和C2區的總體結構(圖9中的C54至C118和C147至C235)，而且影響胞質區內部的序列。令人感興趣的是，發現這三種分子之間最趨異的區域是在V區的開始部分(位置40至60)和近端胞質部分(位置280至300)。這兩個區域的功能相當于Ig超家族其它成員中與配體結合和信號轉導相關的序列，表明了JAM、CMAM-1和CRAM-2在細胞-細胞聯系中的作用。JAM、CRAM-1和CRAM-2 mRNA的組織分布使用PT-PCR檢測不同器官的細胞中三種轉錄物的表達。盡管不同的轉錄物的表達程度不同但所試驗的所有內皮、表皮和大多數腫瘤細胞系均為陽性(圖10A)。發現CRAM-1在SV40轉化的HEV細胞系TME(泳道9)，和胚胎內皮細胞系t-end 2(泳道2)中的表達水平最高。CRAM-2和JAM轉錄物顯示了更為局限的分布，并伴隨CRAM-1轉錄物見于成年內皮細胞系中(泳道3、7、9和12)。值得注意的是，JAM和CRAM-2轉錄物經TNF處理內皮細胞受到下調，而CRAM-1轉錄物的水平則保持不變(泳道2和11)。令人感興趣的是，胚胎內皮細胞系(泳道4)或代表t-end的血管生成變體的成年內皮細胞系(泳道6)沒有表達JAM或CRAM-2。
用Northern印跡法探查JAM-2轉錄物的組織分布并與JAM-1比較(圖14)。JAM-2轉錄物為2Kb長，其在胚胎組織，和在淋巴集結、淋巴結、腎及成年動物組織中得到高度表達。在睪丸中檢測到1.8Kb的推定的剪接變體。JAM-2轉錄物在肺、肝、脾和胸腺中的表達水平較低。比較胚胎發生期間JAM-1和JAM-2的相對豐度早至交配后7.5天即可檢測到編碼JAM-2的mRNA，而在胚胎發生期間根本未檢測到JAM-1mRNA。
這些結果提示胚胎發生期間CRAM-1被廣泛表達，并表明在成年組織中的表達局限于表皮或內皮區室。這一結果是與其在細胞極性化組織的建立和維持中發揮作用這一觀點相符的。45KD蛋白質JAM-2在細胞-細胞接觸點的定位取決于同嗜性相互作用因為HEV衍生的細胞系TME表達最高水平的JAM-2，所以使用該內皮細胞系進一步研究JAM-2的亞細胞定位，并與JAM-1的亞細胞定位相比較。JAM-2蛋白質在內皮細胞表面上的定位局限于細胞-細胞接觸點(圖11A，a)。JAM-2的染色比JAM-1的染色弱，而且細胞間的膜延伸不太明顯。
然后研究了存在于細胞-細胞接觸點的JAM-2是否與JAM-2同嗜性相互作用，或者是否與相鄰細胞上的另一分子異嗜性相互作用。為此，使JAM-2蛋白與綠色熒光蛋白(JAM-2-EGFP)融合，并將構建體轉染到CHO細胞中。當用JAM-2-EGFP cDNA轉染的CHO細胞達到匯合成片時，只在兩個細胞均表達這種蛋白質的細胞-細胞接觸處觀察到JAM-2(圖11B)，而表達細胞和非表達細胞間的接觸處則沒有JAM-2(圖11B，a，由箭頭尖示出)。當用嵌合分子JAM-1-EGFP轉染細胞時，得到同樣的結果(圖11B，b)。這一結果表明，JAM-2或JAM-1需要同嗜相互作用以定位于細胞-細胞接觸處。
為了鑒定JAM-2的生化性質，進行了分別由TME細胞系或由被轉染的CHO細胞表達的JAM-2或EGFP嵌合蛋白質的免疫沉淀(圖11C和D)。抗JAM-2抗體CRAM-19H36免疫沉淀來自TME細胞溶胞產物的45kD單條帶(圖11C，泳道3)。
在還原或非還原條件下的表觀分子量是完全相同的(結果未示出)，并相當于由JAM-2的氨基酸序列推斷的預計分子量(每個N糖基化位點占5kDa)。使用H202-106抗JAM特異性抗體免疫沉淀JAM-1產生一條低分子量帶(~42KD，泳道2)，排除了抗JAM-2和抗JAM-1抗體間發生交叉反應的可能。
表面生物素化后免疫沉淀重組JAM-1-EGFP或JAM-2-EGFP蛋白質，產生分別為70和73KD的單一寬帶，表明分子是在CHO轉染細胞表面上表達的(圖11D，泳道4和6)。因為EGFP分子量為28kD，所以所測得的這些分子量是在預料中的。致密度和白細胞遷移為了弄清分子如何影響內皮細胞單層的完整性和它們如何調節血管內皮的功能，在重組可溶性JAM或CRAM-1存在下進行了白細胞跨內皮遷移測定。在sJAM-Ig2Do或sCRAM-1-Ig2Do存在下將內皮細胞培養2天。在此期間單層完整性沒有受到影響，可能是由于細胞-細胞接觸形成機制的分子豐余性。在1μg重組可溶性分子存在下進行反式遷移測定。如圖20A中所示，在前3個小時中，sJAM-Ig2Do的存在(空方框)對反式遷移細胞的數目影響不大。4小時后，反式遷移細胞的數目高于對照組(虛線)。相反，sCRAM-1-Ig2Do的存在(黑圓圈)明顯降低了反式遷移細胞的數目。
因為白細胞群體是異源性的，所以須估測是否sCRAM-1-Ig2Do作用于特異的白細胞亞群，或者是否反式遷移受到阻斷而無特異性。為此目的，就淋巴細胞標記物CD3和B220標記了反式遷移的細胞(圖20B)。
很顯然，sCRAM-1-Ig2Do特異地阻斷非淋巴樣白細胞，即髓樣譜系細胞的反式遷移(中心框，點線欄)。相反，sJAM-Ig2Do沒有明顯增加反式遷移T細胞的數目(左框，空心欄)，對其它細胞亞群沒有任何影響。
此外，當使用CRAM-1轉染的內皮細胞進行反式遷移測定時，可見反式遷移數增加(圖12)，而CRAM-2轉染則對反式遷移沒有影響。當在測定體系中加入SDF-1時，白細胞跨內膜遷移率達到20％。這是由于受到抗CRAM-1單克隆抗體的部分阻斷所致。
這些結果表明內皮細胞間CRAM-1的會合可能調節內皮層的功能。可以預想到，當內皮細胞達到匯合時該家族的分子將會變成屏障。為此，在不同的培養條件下研究了內皮細胞中CRAM-1轉錄物的調節作用。CRAM-1受到細胞高度匯合的向下調節因為編碼CRAM-1的轉錄物不受TNF的調節，但當內皮細胞與腫瘤細胞共培養時則受到下調，所以使用匯合測定試驗進一步研究了這種調節作用。在低匯合下，細胞活躍循環并且未發生CRAM-1相互作用，而在高匯合條件下，細胞分化較少而且CRAM-1受到約束。在各種細胞密度下用半定量RT-PCR法檢測了CRAM-1的mRNA表達的水平。如圖13中所示，當達到細胞匯合時的(圖13中的泳道1、2、3分別相當于100、50和10％匯合)，CRAM-1轉錄物的表達水平降低。這種效應很難用t-end細胞檢測到，但用高表達CRAM-1的TME細胞系較為顯著。當內皮細胞與本身并不表達CRAM-1的KLN 205癌細胞共培養時，也提高內皮中CRAM-1的下調作用。這一結果進一步證實了CRAM-1表達與細胞周期之間的關聯，因為腫瘤細胞與內皮細胞接觸后可提高內皮細胞的生長速度。值得注意的是，用KLN 205癌細胞獲得的結果與我們原來的篩選策略中用B16黑素瘤細胞得到的結果完全相同。這表明了腫瘤影響內皮細胞行為的一般機制。JAM-2在胚胎發生期間高表達，并且在成年組織中局限于HEV和內皮細胞亞群為了更好地限定JAM-2的組織分布，對表達最高水平JAM-2轉錄物的腎和腸系膜淋巴結切片進行了免疫組織學分析(圖15)。在腎臟的皮質區中，用抗PECAM(GC51)或抗JAM-2(CRAM-XVIIIF26)mAb監測小管間結構的特異性著染，而抗ZO-1或抗JAM-1則主要著染小管表皮細胞(結果未示出)。
因此本發明人將關注的焦點放在血管結構上(其向下深入到髓質并相當于邊緣靜脈或直小血管內皮結構)。為此目的，制備一系列切片并用抗PECAM染色鑒定血管結構(圖15d)。在相鄰切片的等同區域上，用抗JAM-2、抗JAM-1或抗ZO-1檢測線性內皮間染色情況(分別見圖15a、b和c)。在腸系膜淋巴結切片上，用抗JAM-2的mAb獲得高內皮小靜脈(HEVs)的典型染色(圖15e)。還發現HEV表達JAM-1、ZO-1或PECAM(圖15f、g和h)，同時在染色的亞細胞定位上有細微差異(圖15e-h，插入圖)。在腸系膜淋巴結的皮質區，用所有抗體均觀察到被膜下淋巴竇的典型染色(圖15i-l)，相應于輸入淋巴管的染色。因此，用CRAM-18F26抗JAM-2 mAb染色僅限于某些內皮細胞或與維管結構密切相關的結構。
為了澄清內皮細胞染色是否可解釋圖15中所示的照片，對各種細胞系或從解離組織新鮮分離的內皮細胞進行JAM-2表達的細胞熒光光度分析。內皮細胞系(tEnd.1，eEnd.2和TME)在細胞表面上表達低水平的JAM-2或可變水平的JAM-1(圖16A)。
對在膠原酶/分散酶器官解離后得到的細胞懸液進行三重染色，進行新鮮分離的內皮細胞的細胞計量分析。通過獲得用PECAM/CD31和乙酰化LDL著染的細胞鑒定內皮細胞(Voyta et al.，1984，J，CellBiol.992034)。圖16B顯示該雙陽性細胞群體的JAM-2或JAM-1染色。在腎和淋巴集結中，所有分離的CD31和乙酰化LDL陽性細胞也都呈JAM-2染色，這就意味著這些器官中至少內皮細胞體內表達了JAM-2。當對得自淋巴結的細胞進行染色時，只在細胞亞群上發現有JAM-2表達，這就反映出該組織內可能存在有內皮細胞表型的異質性。
總之，細胞計量和免疫組織化學分析的結果表明腎、淋巴集結和淋巴結的內皮細胞共表達了JAM-1和JAM-2。JAM在細胞-細胞接觸點的動態定位使用縮時圖象顯微術進一步研究JAM-2特異性定位于細胞-細胞接觸點的機制。胰酶消化用熒光嵌合分子穩定轉染的CHO細胞，并鋪敷在成象的分隔室載玻片中。細胞涂布后，JAM-2-EGFP的表面表達不是均勻的，而是主要集聚在細胞-細胞接觸點(圖17A，由星號標示的細胞)。在新的細胞-細胞接觸點形成期間，觀察到JAM-2-EGFP重新定位于細胞接合處，并且在形成新的細胞-細胞接觸的細胞間接觸點上檢測到一個強的熒光信號(箭頭)。嵌合蛋白質富集在接觸細胞間的膜突出部，形成12至18分鐘后可見到的“拉鏈樣”圖象。令人感興趣的是，在形成新的膜接觸期間JAM-2在原始細胞-細胞接觸點的定位沒有丟失(參見圖中左上角細胞接觸點)。這一發現表明JAM-2-EGFP特異地重新定位于新的細胞接觸點，并且在接合后其定位是穩定的。
為了進一步弄清JAM-2定位的要求，在使細胞單層受傷后進行縮時圖象顯微術(圖17B)。受傷邊緣處細胞中的JAM-2仍保留在其完整的接觸位點(箭頭尖)，但受傷側(箭頭)則失去了JAM-2的定位，表明JAM-2借助相對細胞上配體實現的接合對于維持其膜定位是必需的。受傷后90分鐘內，傷口邊緣的細胞開始遷移到受傷區域中。有趣的是，這些細胞仍通過呈亮熒光(即JAM-2陽性，箭頭尖)的膜突出部分與鄰近細胞保持接觸。這些結果支持JAM-2同嗜相互作用可能在細胞-細胞接觸的建立和維持中發揮作用這一假設。JAM-2增加單層致密度并參予形成緊密接合復合物因為已證明參予細胞-細胞連接的許多分子可調節細胞單層的細胞旁通透性，所以試驗了JAM-2是否也可影響這一功能。JAM-2-EGFP轉染降低了對FITC葡聚糖的細胞旁通透性并使CHO細胞單層的密閉程度改善42.5％；而無關分子Tac(IL2Rα)的轉染則不明顯地降低CHO轉染細胞的細胞旁通透性(圖18)。JAM-1-EGFP轉染也降低CHO轉染細胞單層的細胞旁通透性。
這些結果提出了一個是否嵌合分子能夠參入極性化表皮細胞中的亞細胞特化區室如緊密接合點的問題。
為了回答這個問題，將EGFP嵌合蛋白轉染到MDCK細胞中，并將其亞細胞定位與緊密接合標記occludin的定位相比較。如圖19A中所示，當分析每個相隔0.9μm的一系列圖片上的EGFP熒光并與occludin染色比較時，可見JAM-2-EGFP特異性地富集于處于緊密接合水平的細胞-細胞接觸點。在基礎水平(左側)下，觀察到細胞內EGFP熒光點。對JAM-1-EGFP轉染的MDCK細胞所作的相似分析(圖19B)顯示了與occludin相似的共定位。然而，JAM-1-EGFP熒光的分布與處于緊密接合水平的JAM-2-EGFP中所觀察到的情況相比連續性較差。討論本實施例報道了使用新的篩選策略鑒定受調節的編碼粘著分子Ig超家族成員的轉錄物。本文所描述的是用這種方法克隆作為受調節之轉錄物的新的分子CRAM-1。用半定量RT-PCR證實在腫瘤存在下生長的內皮細胞中所觀察到的調節作用，并且顯示這種調節作用是依賴于細胞的生長期的。由于在改變細胞匯合條件下發生差異表達，所以采用CRAM-1即“匯合調節的粘著分子-1”這一名稱。
本文也描述了與CRAM-1密切相關的序列即CRAM-2。CRAM-1和-2代表粘著分子新亞族的原型，所說的亞族還包括最近已描述的分子.JAM(Chretien et al.，1998，Eur.J.Immunol.28，4094-4104；Malergue etal.，1998，Mol.Immunol.35，1111-1119)。
CRAM-1和JAM優先在細胞-細胞接觸點被內皮和表皮組織表達，并賦予極性化層以特殊性質。可溶性重組分子在跨內皮遷移測定中的作用及JAM、CRAM-1和CRAM-2的調節作用表明，這三種分子在維持血管生理學中起著重要作用。
已證明稱為定向差異顯示(TDD)的新的篩選策略是一種選擇性擴增感興趣cDNA的有效技術。TDD成功地開發了使用部分簡并的引物，以選擇性地導向C2樣Ig區域的保守區Y(Y/Q/R)CXAS。反復實驗導致可重現的顯示圖形。16個差異表達的轉錄物中，有三個相當于與保守的Ig序列有顯著同源性的基因。這種特異性的增加可以克服已知的經典RNA指紋分析和差異顯示技術中的主要困難。長期以來一直使用RNA指紋分析鑒定差異表達的基因。然而，由于所利用的是序列特異性引物，所以這種方法只檢測選擇的和已知的蛋白質的轉錄物。另一方面，RNA顯示中利用隨機引物并包括非特異性擴增轉錄物。在這種情況下，目標是在mRNA水平上確認兩個生物學系統間的任何差異。TDD是一種結合RNA指紋分析的特異性和差異RNA顯示的簡并性，從而提高選擇性的先進的篩選方法。由于相關轉錄物的導向，所以這種技術顯著地減少了篩選所需要的時間。因此，使鑒定特定蛋白質家族的新成員成為可能。這是對已報導的非特導性篩選策略的實質性改進。
利用這些共同特征構建重組蛋白質，以研究JAM、CRAM-1和CRAM-2的功能。在本實施例中，在體外反式遷移測定中描述了sJAM-Ig2Do和sCRAM-1-Ig2Do的作用。用sCRAM-1-Ig2Do可觀察到對髓樣細胞遷移的特異性阻斷作用，而用sJAM-Ig2Do則只顯示對淋巴細胞有小的影響。
在TNF的影響下，JAM和CRAM-2轉錄物顯示有相似的組織分布和表達調節作用，表明它們是通過相似的生理機制起作用的。相反，CRAM-1轉錄物不受TNF而受內皮細胞增殖速度或密度調節。事實上，循環細胞中CRAM-1轉錄物的過表達和其在休眠細胞中的下調表明這種分子參予連續細胞單層的建立。其在細胞的匯合單層中的功能是維持內皮細胞層和相關性質。因為不同的白細胞群體都必須遷移到免疫反應位點，所以認為非淋巴樣細胞通過CRAM-1依賴性機制遷移，而淋巴樣細胞則通過JAM或CRAM-2遷移。在這種情況下，可以聯合使用不同的可溶性重組分子來調節免疫反應。
權利要求
1.屬于人免疫球蛋白超家族的一個亞族的分離形式的多肽，該多肽顯示分別與如圖3中上和下列所示的鼠匯合調節的粘著分子1或2(CRAM-1或CRAM-2)的氨期酸序列至少有70％序列同源性。
2.如權利要求1中限定的多肽，其包括與如圖6中所示的人CRAM-1的氨基酸序列至少70％、優選至少80％，更優選至少90％，最優選基本上100％同源的氨基酸序列。
3.針對如權利要求1和2中限定的多肽的抗體。
4.如權利要求3的抗體用作攜帶如權利要求1和2中限定之多肽的細胞的導向分子。
5.如權利要求3或4中限定的抗體用于抑制腫瘤血管生成。
6.如權利要求3或4中限定的抗體用于治療炎性反應。
7.如權利要求3或4中限定的抗體用于調節，特別是增加血管通透性。
8.如權利要求7中限定的抗體，其中血管通透性的增加是在腫瘤中實現的以便遞送藥物。
9.如權利要求3-8中限定的抗體與選自毒素、放射性標記、熒光標記、酶標記、光活化性標記、脂質體、藥物和細胞的另一種分子偶聯。
10.具有與如權利要求1和2中限定的多肽基本上相同的氨基酸序列的可溶性多肽用于治療炎性反應。
11.具有如權利要求1和2中限定的多肽之至少一部分氨基酸序列的肽用于治療炎性反應。
12.如權利要求11中限定的肽，其中至少一部分氨基酸序列包括細胞外區域VC2，和/或膜近端胞質序列A-[Y，Q]-[R，S]-[R，K]-G-[C，Y]-F。
13.如權利要求1、2、11和12中限定的可溶形式的(多)肽用于調節血管通透性。
14.具有編碼完整多肽或其部分的核苷酸序列的多或寡核苷酸，其中所說的多肽具有與如圖3上和下行中給出的氨基酸序列至少70％同源的氨基酸序列。
15.如權利要求14中限定的具有編碼完整多肽或其部分的核苷酸序列的多或寡核苷酸，其中所說的多肽具有與如圖6中所示的人CRAM-1的氨基酸序列至少70％，優選至少80％，更優選至少90％，最優選基本上100％同源的氨基酸序列。
16.如權利要求15中限定的多或寡核苷酸，其具有基本上相同于如圖6中所示的人CRAM-1之核苷核酸序列的核苷酸序列。
17.如權利要求14-16中限定的多或寡核苷酸，該多或寡核苷酸是RNA或DNA。
18.如權利要求14-17中限定的多或寡核苷酸，該多或寡核苷酸是引物、探針、反義RNA等。
19.特異性鑒定差異表達的DNA序列的方法，該方法包括使用差異顯示反轉錄PCR，其中使用一組對靶基因特異的部分或完整的簡并引物。
全文摘要
本發明涉及屬于人免疫球蛋白超家族的一個亞族的分離形式的新的多肽,該多肽顯示分別與如圖3中上和下行所示的鼠匯合調節的粘著分子1或2(CRAM－1或CRAM－2)的氨基酸序列至少有70%序列同源性。本發明還涉及上述多肽的抗體及它們在治療炎癥和腫瘤中的應用。
文檔編號C07K16/18GK1355843SQ00806320
公開日2002年6月26日 申請日期2000年3月13日 優先權日1999年3月11日
發明者B·A·英霍夫, M·奧蘭德-里昂斯 申請人:Rmf迪克塔吉恩有限公司