專利名稱：對kdr特異的抗體及其應用的制作方法
背景技術：
血管發生是生成新的血管的過程。該過程涉及原先存在的血管的毛細管上皮細胞(capillary endothelial cell)的增殖、遷移和組織浸潤(tissue infiltration)。血管發生在正常的生理過程中，包括胚胎發育、卵泡生長和傷口愈合，以及在涉及腫瘤的生長和轉移的病理條件下是很重要的(Folkman，J.and Klagsbrun，M.Science235442-447(1987))。
在成人中，血管內皮通常是靜息的，并且它在血管發生中的激活受到嚴緊的控制。幾個因子被認為可能是體內血管發生的調節者。這些包括轉化生長因子(TGFb)，酸性和堿性纖維原細胞生長因子(aFGF和bFGF)，血小板生長因子(PDGF)和血管內皮生長因子(VEGF)(Klagsbrun，M.and D’Amore，P.(1991)，Annual rev.Physiol.53217-239)。VEGF，一種內皮細胞特異的分裂原，顯然是這些因子中的一種，因為它通過特異性地促進內皮細胞的增殖而作為血管發生誘導因子發揮作用。
VEGF是由兩個結構上與PDGF類似的23KD亞基組成的同二聚體糖蛋白。由于mRNA的不同剪接(alternative splicing)，存在四種不同的VEGF單體亞型。這些亞型包括兩種膜結合形式亞型(VEGF206和VEGF189)和兩種可溶形式亞型(VEGF165和VEGF121)。在除了胎盤外的所有人類組織中，VEGF165是最豐富的亞型。
VEGF在胚胎組織中(Breier et al.，Development(Camb.)114521(1992))、巨噬細胞中、傷口愈合中的增殖的上皮角化細胞中(Brown et al.，J.Exp.Med.，1761375(1992))表達，并可能對與炎癥相關的組織水腫負責(Ferrara et al.，Endocr.Rev.1318(1992))。原位雜交表明，在許多人類腫瘤系中，包括多形性成膠質細胞瘤(glioblastoma multiforme)，成血管細胞瘤，中樞神經系統瘤和AIDS相關的Kaposi’s肉瘤中，VEGF大量表達(Plate，K.et al.(1992)Nature 359845-848；Plate，K.et al.，(1993)Cancer Res.535822-5827；Berkman，R.et al.(1993)J.Clin.Invest.91153-159；Nakarmura，S et al.(1992)AIDS Weekly，13(1))。在組織缺氧誘導的血管發生中也觀察到了高水平的VEGF(Shweiki，D et al.(1992)Nature 359843-845)。
VEGF的生物學應答是通過高親和性的VEGF受體介導的，該受體在胚胎發生(Millauer，B.，et al.，(1993)Cell 7283-846)和腫瘤形成過程中選擇性地在內皮細胞上表達。VEGF受體通常為III類受體類型的酪氨酸激酶，其特征為在它們的氨基端細胞外受體-配基結合區域具有幾個，通常為5或7個，類似免疫球蛋白的環(Kaipainen et al.，J.Exp.Med.1782077-2088(1993))。另外兩個區域包括跨膜區域和羧基端的細胞內催化結構域，催化結構域被一段不同長度的，被稱為激酶插入結構域的親水性激酶內序列(interkinase sequence)的插入所中斷(Terman et al.，Oncogene61677-1683(1991))。VEGF受體包括FLT-1(由Shibuya M.etal.Oncogene 5，519-524(1990)所測序)；KDR(含激酶插入結構域的受體，kinase insert domain-containg receptor)，在1992年2月20日歸檔的PCT/US92/01300中和在Terman et al.，Oncogene 61677-1683(1991)中描述；和FLK-1，由Matthews W.et al.Proc.Acad.Sci.USA，889026-9030(1991)測序。KDR是小鼠FLK-1的人類同源物。KDR和FLK-1也被稱為VEGFR2。
具有同源氨基酸序列的對等受體，如上文所定義，存在于所有的哺乳動物中，例如，人類，小鼠。與一種VEGF受體結合的抗體并不一定意味著和另一種VEGF受體結合，與一種哺乳動物中的一種VEGF受體結合并不一定意味著和另一種哺乳動物中的對等受體結合。
有人提出KDR通路在人類腫瘤的血管發生中起著重要作用。VEGF受體主要在內皮細胞和造血細胞上表達。當腫瘤細胞合成和分泌VEGF后，VEGF與VEGFR2受體結合并刺激新的血管的生長。已經發現除非有專門的血液供應，否則腫瘤的生長不能超過一定的大小。
在PCT申請US95/01678中描述了通過雜交瘤技術生產抗鼠VEGF受體FLK-1的單克隆抗體。這些單克隆抗體被認為通過干擾VEGF和它的受體的相互作用而抑制受體的激活。這些抗體被證明能特異性地抑制VEGF對轉染的3T3細胞上表達的FLI-1受體的激活。在體內，它被表明能夠通過抑制與腫瘤相關的血管發生而強烈抑制人類成膠質細胞瘤異種移植物在裸鼠中的生長。
但是，不是所有與鼠受體FLK-1結合的抗體都能夠以足夠的親和性與其人類同源物，KDR，反應，以成為可用于人類治療用的，商業上可行的產品。因此，需要比現有技術中已知的抗體具有更高親和性的抗KDR抗體。
本發明的目標為提供能夠中和VEGF和其人類受體，KDR，之間的相互作用的高效力抗體，上述抗體的親和性比現有技術中已知的抗體要高。
發明概述通過提供與KDR結合的，親和性與人類VEGF可比的并且能夠中和KDR的激活的免疫球蛋白，已經達到了這些和其它目標，這對于本領域具有普通技術的人員將是顯而易見的。
免疫球蛋白分子包括單價單鏈抗體，多價單鏈抗體，雙體(diabody)，三體(triabody)，抗體，人源化抗體和嵌合抗體。
本發明進而提供了編碼這些免疫球蛋白分子的核酸分子。
本發明還提供了制備上述免疫球蛋白的方法。本發明進而提供了用這樣的免疫球蛋白分子，中和KDR激活的方法，在哺乳動物中抑制血管發生的方法和在哺乳動物中抑制腫瘤生長的方法。縮寫VEGF，血管內皮細胞生長因子；bFGF，堿性成纖維細胞生長因子；KDR，含激酶插入結構域的受體(也稱為VEGF受體2)；FLK-1，胎肝激酶1；scFv，單鏈Fv；HUVEC，人臍靜脈內皮細胞；PBS，0.01M磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)；PBST，含有0.1％吐溫20的PBS；AP，堿性磷酸酶；EGF，上皮細胞生長因子；VH和VL，分別為免疫球蛋白重鏈和輕鏈的可變區。
附圖描述
圖1是顯示不同的scFv抗體(p1C11，p1F12，p2A6，和p2A7)與固定的KDR直接結合的圖。
圖2是顯示不同的scFv抗體(p1C11，p1F12，p2A6，和p2A7)對KDR與固定的VEGF165的結合的抑制作用的圖。
圖3是顯示scFv抗體(p2A6和p1C11)對VEGF誘導的HUVEC增殖的抑制作用的圖。
圖4是c-p1C11的VH和VL鏈的核苷酸序列和推導的氨基酸序列。
圖5是顯示抗體(c-p1C11，p1C11，p2A6)與固定的KDR直接結合的圖。
圖6是顯示c-p1C11與表達KDR的HUVEC細胞結合的FACS分析的圖。
圖7是顯示不同的scFv抗體(c-p1C11，p1C11，p2A6)對KDR受體與固定的VEGF165結合的抑制作用的圖。
圖8是顯示c-p1C11和未標記VEGF165對放射性標記的VEGF165與固定的KDR受體結合的抑制作用的圖。
圖9是顯示抗KDR抗體(c-p1C11，p1C11)對VEGF誘導的HUVEC增殖的抑制作用的圖。
發明詳述本發明提供了與KDR的細胞外結構域特異結合的免疫球蛋白，其親和性可以與VEGF相比。這種結合的結果是，與先前描述的免疫球蛋白分子相比，該免疫球蛋白可以更有效地中和對受體的激活。VEGF受體的細胞外結構域在本文定義為在該受體的細胞外區域的配基結合結構域。
免疫球蛋白分子是識別并結合特定抗原或物質的蛋白。免疫球蛋白分子包括天然存在的抗體，單價單鏈抗體，多價單鏈抗體，雙體，三體，嵌合抗體，人源化抗體和其它與抗原特異結合的分子。
本發明的免疫球蛋白分子與KDR結合的親和性可以和天然配基相比。親和性，由抗原和免疫球蛋白分子結合的平衡常數(K)表示，度量了抗原決定簇和免疫球蛋白分子結合的強度，而與結合位點的數量無關。抗原決定簇，也被稱為表位，是在抗原上的特定免疫球蛋白分子結合的位點。通常K值為105到1011升/mol。任何小于104升/mol的K值被認為是意味著非特異結合。K的倒數被指定為Kd(Kd也可以被稱為解離常數)。Kd越小，抗原決定簇與抗體結合位點之間的結合力越強。
KDR的天然配基是人VEGF。VEGF以0.93nM的親和性(Kd)結合KDR。為了抑制VEGF與KDR的結合，抗KDR抗體必需以與VEGF可比的親和性與KDR結合。也就是說，抗KDR抗體必需成功地在與KDR的結合上與VEGF競爭。Kd至多為5nM的抗體，其與KDR結合的親和性被認為是與天然配基可以相比的。優選地，本發明的抗體結合KDR的親和性至多為約4nM，更優選地，親和性至多為約3nM，最優選地，親和性為至多約2nM，最佳親和性為約1nM。
本發明的抗體中和KDR(參見實施例)。在本說明書中，中和受體的意思是減小和/或失活該受體轉導信號的內源激酶活性。KDR中和的一種可靠的檢測方法是對受體磷酸化的抑制。
本發明不受任何特定的KDR中和機制的限制。在提出本申請時，抗體中和KDR的機制尚未被很好地了解，并且一種抗體所遵循的機制不一定與另一種抗體相同。一些可能的機制包括防止VEGF配基與KDR細胞外結合結構域結合，并且防止受體的二聚體化或寡聚體化。但是，不能排除其它機制。
優選的免疫球蛋白分子是稱為單價單鏈抗體(scFv)的抗體片段。單價單鏈抗體包括一個抗體重鏈可變片段(VH)通過肽接頭與一個抗體輕鏈可變片段(VL)連接，上述肽接頭允許兩個片段結合形成功能性的抗原結合位點(參見，例如U.S.Pat.No.4,946,778，Ladner et al.，(Genex)；WO88/09344，CreativeBiomolecules，Inc/Huston et al.)。WO 92/01047 CambridgeAntibody Technology et al./McCafferty et al.，描述了scFv在可溶的重組基因展示包裝(soluble recombinant genetic displaypackage)，如噬菌體，表面上的展示。帶有接頭的單鏈抗體可以被表示為VL-L-VH或VH-L-VL。
價(Valency)是指一個免疫球蛋白分子上所具有的對特定表位的結合位點數。例如，單價抗體具有一個特定表位的結合位點。抗體親抗源性(avidity)是對免疫球蛋白分子和其抗原之間結合強度的度量。抗體親抗源性同時涉及表位與其免疫球蛋白分子上的抗原結合位點之間的親和性以及免疫球蛋白的價。
單鏈抗體缺少它們所源自的完整抗體的部分或全部恒定結構域。因此，它們可能克服與完整抗體的使用相關的一些問題。例如，單鏈抗體傾向于避免重鏈恒定區和生物分子之間的不合乎需要的相互作用，或其它不需要的生物學活性。此外，單鏈抗體要比完整抗體小很多，因此可能具有比完整抗體更大的毛細管滲透性，從而允許單鏈抗體更有效地定位并更有效地與目的抗原結合位點結合。同時，單鏈抗體可以在原核細胞中較大量地產生，從而便利于它們的生產。進而，單鏈抗體相對較小的大小使得它們在接受者(recipient)中引起不合乎需要的免疫應答的可能性比完整抗體更小。
用來產生單鏈抗體的肽接頭可以是柔性的肽，柔性肽的選擇確保VL和VH連接后形成正確的三維折疊，以便使其保持全長的抗KDR抗體的目標分子結合活性。通常，VL或VH序列的羧基端被這樣的肽接頭連接到互補VH或VL序列的氨基端。該接頭通常為10-50個氨基酸殘基。優選地，該接頭為10-30個氨基酸殘基。更優選地，該接頭為12-30個氨基酸殘基。最優選地，該接頭為15-25個氨基酸殘基。這樣的接頭肽的一個例子為(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3。
單鏈抗體，每個具有通過一個第一肽接頭共價連接的一個VH和一個VL，可以至少被另一個肽接頭共價連接以形成多價單鏈抗體。多價單鏈使得具有完整抗體的特異性和抗體親抗源性，但是缺少全長抗體的恒定區的抗體片段的構建成為可能。
多價免疫球蛋白抗體可以是單特異性的或多特異性的。術語特異性指特定免疫球蛋白分子能夠結合的不同抗原決定簇的數目。如果免疫球蛋白分子只能結合一種抗原決定簇，該免疫球蛋白分子就是單特異性的。如果免疫球蛋白分子能結合不同的抗原決定簇，那么該免疫球蛋白分子就是多特異性的。
例如雙特異性多價抗原允許其識別兩個不同的表位。上述表位可以都在KDR上。替代地，一個表位可以是在KDR上，而另一個表位可以在其它抗原上。
多價單鏈抗體的每一條鏈包含一個輕鏈可變片段和一個重鏈可變片段，并且通過肽接頭和至少一個其它鏈連接。上述肽接頭至少由15個氨基酸殘基組成。最大氨基酸殘基數大約為100。在一個優選的實施方案中，VL和VH結構域的數目是相等的。優選地，肽接頭(L1)將VH和VL結構域連接在一起形成一條鏈，肽接頭(L2)將兩條或多條鏈連接在一起形成具有基本上相同氨基酸序列的多價scFv。
例如，兩價單鏈抗體可以如下表示VL-L1-VH-L2-VL-L1-VH，或VL-L1-VH-L2-VH-L1-VL，或VH-L1-VL-L2-VH-L1-VL，或VH-L1-VL-L2-VL-L1-VH。
三價或更高價的多價單鏈抗體具有通過其它肽連接序列連接到兩價單鏈抗體上的肽片段。三價單鏈抗體的一個例子為VL-L1-VH-L2-VL-L1-VH-L2-VL-L1-VH兩個單鏈抗體可以被組合成二體，也稱為二價二聚體。二體具有兩條鏈，二體的每條鏈含有一個與VL結構域連接的VH結構域。連接結構域的接頭足夠短，以防止同一條鏈上的結構域之間配對，因而促使不同鏈上的互補結構域配對，從而再現兩個抗原結合位點。上述肽接頭包括至少5個氨基酸殘基和不多于10個氨基酸殘基，例如，(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)，(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2。上述二體的結構是剛性而緊密的。抗原結合位點位于該分子相對的兩端。二體可以是單特異性的或雙特異性的。
三個單鏈抗體可以被組合成三體，也稱為三價三聚體。三體是通過VL或VH結構域的氨基端直接與VH或VL結構域的羧基端融合而構建的，即，無任何接頭序列。三體含有三個Fv頭部，其多肽是以環狀的，頭尾相接的方式排列的。三體分子的可能構象是平面的，三個結合位點位于一個平面上，彼此之間的角度為120度。三體可以是單特異性的，雙特異性的或三特異性的。
優選地，本發明的抗體含有完整抗體的所有6個互補決定區，雖然含有少于所有的這些區域，例如3個，4個或5個CDR，的抗體也是具有功能的。
為了將鼠源抗體的免疫原性最小化，本發明還提供了與KDR的細胞外結構域特異性結合并中和受體的激活的，嵌合的和人源化的抗體。嵌合抗體含有源自小鼠抗體的可變區和源自人類抗體的恒定區。嵌合抗體保持了它的結合特異性，但是更接近天然的人抗體。人源化抗體含有小鼠氨基酸的部份僅僅為那些識別KDR所必需的部分，即，CDR。
可以通過結合基本上或完全編碼人類恒定區的DNA和編碼可變區的DNA而制備得到編碼嵌合抗體的DNA，上述可變區基本上或完全源自除了人類以外的哺乳動物的可變區序列。
可以通過結合編碼恒定區和除了CDR外的可變區的DNA和編碼CDR的DNA而制備編碼人源化抗體的DNA，上述恒定區和除了CDR外的可變區基本上或完全源自相應的人類抗體，上述CDR基本上或完全源自人類以外的哺乳動物。
除了人類以外的適當的哺乳動物包括任何可以從其制備單克隆抗體的哺乳動物。這樣的哺乳動物的例子包括兔子、大鼠、小鼠、馬、山羊或靈長類。小鼠是優選的。
編碼抗體片段的DNA分子的適當來源包括任何表達全長抗體的細胞，如雜交瘤和脾細胞。另一來源是本領域中已知的，從噬菌體展示文庫產生的單鏈抗體。
本發明的抗體可以是任何類型的免疫球蛋白，如IgG，IgM，IgA，IgD，或IgE，和它們的亞類的成員，或者由這些成員結合而成。
用于制備免疫球蛋白分子的KDR通常是與細胞，如內皮細胞，結合的。上述KDR也可以是與非內皮細胞，如腫瘤細胞，結合。替代地，KDR可以是不與細胞結合的，優選地為可溶形式。
在以下的實施例中，封閉VEGF和KDR結合的高親和性抗KDR scFv抗體分離自噬菌體展示文庫，上述文庫是從用可溶形式的人類VEGF受體免疫的小鼠構建得到的。經過兩輪篩選后回收的克隆的90％以上對KDR具有特異性。KDR與這些scFv結合的親和性是在nM的范圍內，這與幾種通過雜交瘤技術制備的抗KDR二價單克隆抗體的親和性一樣高。
人類噬菌體文庫也可以被用來產生這樣的高親和性抗KDR scFv抗體。
上述scFv抗體，p1C11(圖4)，是從分離自噬菌體展示文庫的單鏈抗體(scFv)制備得到的。(參見下文的實施例)。p1C11被顯示能夠封閉VEGF-KDR相互作用，抑制VEGF刺激的受體磷酸化和HUVEC有絲分裂。該scFv同時結合可溶性的KDR和在HUVEC細胞表面表達的KDR。p1C11是本發明的一種優選的scFv。它和KDR以高親和性結合(Kd＝2.1nM)。
本發明抗體的每個結構域都可以是完整的免疫球蛋白重鏈或輕鏈可變結構域，或者它可以是天然存在的結構域的功能對等物或突變體或衍生物，或者是利用，例如，諸如WO93/11236(Medical ResearchCouncil et al./Griffiths et al.)中描述的技術體外構建的合成結構域。例如，可以將相應于抗體可變結構域的，缺少至少一個氨基酸的結構域連接在一起。最重要的特征是每個結構域與互補結構域連接形成抗原結合位點的能力。因此，術語“重鏈/輕鏈可變片段”不應當被解釋為將對本發明發揮作用無實質性影響的變體排除在外。
本發明的功能對等物包括氨基酸序列和全長KDR抗體的可變區或高變區的氨基酸序列基本上相同的多肽。“基本上相同”的氨基酸序列在本文中被定義為一段氨基酸序列和另一氨基酸序列的同源性至少為70％，優選地至少為約80％，更優選地至少為約90％，上述同源性是通過根據Pearson and Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.UsA 85，2444-2448(1988)的FASTA搜索方法確定的。
本發明的抗體可以與另外的氨基酸殘基融合。這樣的殘基可以是一段肽標記(peptide tag)，也許是為了便于分離，或者它們可以是在合成時從宿主細胞分泌的信號序列。可以適當地使用分泌引導序列，引導序列是與多肽的N-末端連接的將該多肽導出細胞質的氨基酸序列。
本發明還提供了含有根據本發明的多肽的編碼序列的核酸分子，以及這樣的核酸的各種庫。
可以通過已知的技術，如PCT申請WO93/21319，WO89/09622，歐洲專利申請239,400，338,745和332,424中所描述的技術和/或其它常規的重組DNA技術進行上文描述的DNA的缺失和重組，如下文所述。
在下文描述的實施例中從p1c11產生了嵌合的抗KDR抗體，c-p1C11。嵌合-p1C11與可溶的以及細胞表面表達的KDR的細胞外結構域特異性地結合。c-p1C11的結合親和性為0.82nM。它有效地中和了人類內皮細胞的KDR和MAP激酶p44/p42的激活。另外，c-p1C11有效地中和了VEGF誘導的人類內皮細胞有生分裂。
c-p1C11與KDR的結合比其母體scFv，p1C11，更為有效，并且在中和KDR相互作用的活性上和在抑制VEGF刺激的HUVEC有絲分裂上更為強有力。c-p1C11結合KDR的親和性大約為其母體scFv的2.5倍，這主要是由于二價c-p1C11的較低的解離速率(見表2)。
實施例下文列出的實施例是用來幫助對本發明的理解，而不是用來，并不應被理解為用來，在任何方面限制本發明的范圍。實施例不包括對傳統方法的詳細描述，如那些用于構建載體和質粒的方法，將編碼多肽的基因插入到這樣的載體和質粒的方法或將質粒引入宿主細胞的方法。這樣的方法對于本領域中具有普通技術的人員是眾所周知的，并且在許多出版物中都有所描述，包括Sambrook，J.，fritsch，E.F.and Maniais，T.(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual，2nd edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press.實施例I.單鏈抗體的產生實施例I(a)細胞系和蛋白原代培養的HUVEC細胞在EBM-2培養基中，在37℃，5％ CO2的條件下維持。所有分析中使用的細胞都在2-5代之間。VEGF165蛋白在桿狀病毒中表達并純化。編碼KDR細胞外結構域的cDNA是通過RT-PCR從人胎腎mRNA中分離得到的，并且被亞克隆到AP-Tag載體的Bg1 II和BspE I位點之間。在上述質粒中，KDR的細胞外結構域與人胎盤AP cDNA在讀碼框架內融合。上述質粒與新霉素表達載體pSV-Neo一起被通過電穿孔法導入NIH3T3細胞，并用G418選擇穩定的細胞克隆。利用固定的針對AP的單克隆抗體通過親和層析從細胞培養物的上清中純化融合蛋白KDR-AP。實施例I(b).小鼠的免疫和單鏈抗體噬菌體展示文庫的構建在雌性BALB/C小鼠的腹膜內(i.p.)兩次注射10μg在200μlRIBI佐劑系統中的KDR-AP，并且在兩個月后進行一次無RIBI佐劑的i.p.注射。在第一次免疫同時，也在上述小鼠的皮下(s.c.)注射10μg在200μlRIBI佐劑系統中的KDR-AP。在進行安樂死的三天之前，對上述小鼠腹膜內進行20μg KDR-AP的加強注射。取出供體小鼠的脾臟并且分離細胞。提取RNA，并從脾細胞的總RNA中純化mRNA。利用上述mRNA構建scFv噬菌體展示文庫，該mRNA被展示在絲狀噬菌體M13的表面。
在絲狀噬菌體表面展示scFv時，抗體VH和VL結構域通過15個氨基酸長的接頭(GGGGS)3被連接在一起并且與噬菌體蛋白III的N末端融合。在VL的C末端和蛋白III之間插入一個15氨基酸長的E標記物，其后緊接琥珀密碼子(TAG)，以便用于檢測和其它分析目的。位于E標記物和蛋白III之間的琥珀密碼子使得當構建體被轉入到抑制宿主時(如TGI細胞)，構建體以表面展示的形式制造scFv，當構建體被轉入到非抑制宿主時(如HB2151)，構建體以可溶的形式制造scFv。
裝配的scFv DNA被連接到PCANTAB 5E載體。轉化后的TG1細胞被涂布到2YTAG平板上并溫育。將菌落刮取到10ml 2YT培養基中，與5ml 50％的甘油混合并儲存在-70 C作為文庫的儲存物。實施例I(c)生物淘選(Biopanning)文庫的儲存物被生長到對數生長期，用M13K07輔助噬菌體援救(resecue)并在2YTAK培養基含有(100μg/ml氨芐青霉素和50μg/ml卡那霉素的2YT培養基)中30C擴增過夜。噬菌體制備物用4％PEG/0.5M NaCl沉淀，重懸浮于含有500μg/mlAP蛋白的3％脫脂牛奶/PBS中，并在37C溫育1小時以捕獲展示抗AP scFv的噬菌體并封閉其它非特異性結合。
將用KDR-AP(10μg/ml)包被的Maxisorp Star管(Nunc，Denmark)首先用3％牛奶/PBS在37C封閉1小時，然后與噬菌體制備物在室溫溫育1小時。將該管用PBST洗10次后，用PBS洗10次(含0.1％吐溫20的PBS)。將結合的噬菌體在室溫用新鮮制備的100mM三乙胺洗脫10分鐘。將洗脫的噬菌體與10ml對數中期的TG1細胞37C靜置溫育30分鐘和搖晃溫育30分鐘。將感染的TG1細胞涂布到2YTAG平板上并30C溫育過夜。
經過3輪篩選后，百分之九十九(185/186)的克隆都被發現是KDR的特異性結合者。但是，這些結合者中只有15個(8％)能夠封閉KDR與固定的VEGF的結合。這15個克隆的BstN I指紋圖譜表明存在兩種不同的消化圖譜；而21種隨機挑取的VEGF非封閉克隆(non-blocker)產生4種不同的方式。在第二輪淘選后鑒定的克隆中也見到了所有的消化圖譜。
從第二輪淘選后的克隆中挑出每種消化圖譜的代表克隆并進行DNA測序。在15個測序的克隆中，鑒定出了2個獨特的VEGF封閉克隆(blocker)和3個非封閉克隆。一種既不結合KDR也不封閉VEGF和KDR的結合的scFv，p2A7，被選出作為所有研究的陰性對照。實施例I(d)噬菌體ELISA在96孔板中37℃生長單個克隆，并如上文所述用M13K07輔助噬菌體進行援救。擴增的噬菌體制備物用1/6體積的18％牛奶/PBS室溫封閉1小時，并加入到用KDR-AP或AP(1μg/ml×100μl)包被的Maxi-sorp 96孔微量滴定板(Nunc)。室溫溫育1小時后，將滴定板用PBST洗3次，并與兔抗M13噬菌體-HRP交聯物溫育。將滴定板洗5次，加入TMB過氧化物酶底物，用讀板機讀取450nm的OD，鑒定scFv抗體并測序。實施例I(e)可溶性scFv的制備用單個克隆的噬菌體感染非抑制(non-suppressor)E.coli宿主HB2151，并在2YTAG-N平板上篩選被感染的宿主。通過在含有1mM異丙基β-D硫代半乳糖苷的2YTA培養基中30C培養細胞而誘導scFv在HB2151細胞中的表達。細胞周質抽提物的制備如下將細胞沉淀懸浮于含有20％(w/v)20％蔗糖，200mM NaCl，1mM EDTA和0.1mMPMSF的25mM Tris(pH7.5)中，然后在4C溫育并輕柔攪拌1小時。15,000rpm離心15分鐘后，利用RPAS Purification Module(Pharmacia Biotech)通過親和層析從上清中純化可溶性的scFv。實施例II分析檢測實施例II(a)定量KDR結合分析兩種分析方法被用來定量檢驗純化的可溶scFv與KDR的結合。
用非抑制宿主E.coli HB 2151細胞在搖床燒瓶中表達4個不同的克隆，包括兩個VEGF封閉克隆，p1C11和p1F12，一個非封閉克隆，顯性克隆p2A6和一個不結合的克隆，p2A7。通過抗-E-標記的親和層析從E.coli的周質抽提物中純化可溶的scFv。這些克隆的純化scFv的產量在100-400μg/升培養物之間。
在直接結合分析中，不同量的可溶scFv被加入到KDR包被的96孔Maxi-sorp微量滴定板中并在室溫溫育1小時，然后用PBST洗板3次。然后將滴定板在室溫與100μl小鼠抗-E-標記抗體溫育1小時，接著與100pl兔抗鼠抗體-HRP交聯物溫育。按照上文噬菌體ELISA實驗中描述的方法將滴定板洗滌和顯色。
在另一個分析檢測中，即，競爭性VEGF封閉檢測中，不同量的scFv與固定量的KDR-AP(50ng)混合并在室溫溫育1個小時。將混合物轉移到用VEGF165(200ng/孔)包被的96孔微量滴定板并在室溫繼續溫育2小時，然后將滴定板洗5次，加入AP的底物以對結合的KDR-AP分子定量。然后計算IC50，即，50％抑制KDR與VEGF結合所需要的scFv濃度。
圖1示通過直接結合ELISA測定的，scFv和固定的KDR的劑量依賴型結合。如圖2中所示，克隆p1C11和克隆p1F12也能封閉KDR與固定的VEGF的結合，但是克隆p2A6不能。圖2中所示的數據是3次重復實驗的平均數±SD。陰性對照克隆，p2A7既不能結合KDR也不能封閉KDR與VEGF的結合(圖1和2)。克隆p1C11，每次淘選后的顯性克隆，表現出最高的KDR結合能力和最大的封閉VEGF與KDR結合的強度(表1)。與KDR 50％最大結合所需要的和50％抑制KDR與VEGF結合所需要的克隆p1C11的抗體濃度分別為0.3nM和3nM(見表1)。FACS分析表明p1C11，p1F12和p2A6也能與HUVEC細胞表面表達的受體結合。實施例II(b)可溶scFv的BIAcore分析用BIAcore生物感應器(Pharmacia Biosensor)測量了可溶性scFv與KDR結合的動力學。KDR-AP融合蛋白被固定到感應器的芯片上，被注射的可溶性scFv的濃度在62.5nM到1000nM之間。在每個濃度得到感應器譜圖(Sensorgram)，并用一個程序，BIA Evaluation2.0對其進行評估，以確定速率常數kon和koff。從速率常數kon/koff的比率計算得到Kd。
表1示在BIAcore儀器上的表面等離子體共振的結果。VEGF-封閉性的scFv，p1C11和p1F12，分別和固定的KDR以Kd 2.1和5.9nM結合。非封閉性的scFv，p2A6，與KDR結合的親和性比最好的結合克隆p1C11大約弱6倍(Kd，11.2nM)，主要是由于其解離速率要快很多。如所預期的那樣，p2A7不與固定在BIAcore上的KDR結合。實施例II(c)磷酸化分析磷酸化分析是利用HUVEC的早期傳代細胞按照先前描述的方法進行的。簡言之，將HUVEC與補充了0.5％牛血清白蛋白的，無血清的EBM-2基礎培養基在有或無5μg/ml scFv抗體的情況下室溫溫育10分鐘，然后用20ng/ml的VEGF165在室溫繼續刺激15分鐘。裂解細胞，用偶聯了兔抗KDR多克隆抗體(ImClone Systems Incorporated)的蛋白A Sepharose小珠從細胞裂解液中免疫沉淀KDR受體。洗滌小珠，與SDS上樣緩沖液混合，將上清進行Western印跡分析。為了檢測KDR的磷酸化，印跡用抗磷酸化酪氨酸的Mab，4G10檢測。對于MAP激酶活性分析，將細胞裂解液用SDS-PAGE進行解析后利用磷特異的MAP激酶抗體進行Western印跡分析。所有的信號都用FCL探測。
結果表明VEGF-封閉性的scFv p1C11能夠抑制VEGF刺激的KDR受體的磷酸化，而非封閉性的scFv p2A6不能。進而，p1C11也有效地抑制了VEGF刺激對MAP激酶p44/p42的激活。相反，p1C11和p2A6都不能抑制FGF刺激對MAP激酶p44/p42的激活。實施例II(d)抗有絲分裂原分析將HUVEC(5×103細胞/孔)加入到96孔組織培養板(Wallach，Inc.，Gaithersburg，MD)的200μl無VEGF，bFGF或EGF的EBM-2培養基中并在37C溫育72小時。往一式兩份的平行孔(duplicate wells)中加入不同量的抗體并在37C預溫育1小時，然后加入終濃度16ng/ml的VEGF165。溫育18小時后往每個孔中加入0.25μCi的[3H]-TdR(Amersham)并繼續溫育4小時。將細胞置于冰上，用無血清的培養基洗兩次，然后與10％TCA在4C溫育10分鐘。然后將細胞用水洗一次，并用25μl2％的SDS溶解。加入閃爍液(150μl/孔)并在液閃計數器(Wallach，Model 1450 MicrobetaScintillation Counter)上測定摻入DNA的放射性活性。
scFv抗體封閉HUVEC上VEGF刺激的有絲分裂原活性的結果在圖3顯示。VEGF-封閉性的scFv p1C11強有力地抑制了HUVEC中VEGF誘導的DNA合成，其EC50，即對VEGF刺激的HUVEC有絲分裂50％抑制所需要的抗體濃度，為大約5nM。非封閉性的scFv p2A6對VEGF的有絲分裂原活性表現為無抑制效應。p1C11和p2A6都不能抑制HUVEC中bFGF誘導的DNA合成(數據未示出)。圖3中顯示的數據為至少3次單獨實驗的代表。()只有VEGF；()無VEGF。實施例IV.嵌合抗體的產生實施例IV(a)細胞系和蛋白原代培養的人臍靜脈細胞(HUVEC)在EBM-2培養基中，在37℃，5％CO2的條件下維持。所有分析中使用的細胞都在2-5代之間。VEGF165和KDR-堿性磷酸酶融合蛋白(KDR-AP)分別在桿狀病毒中和NIH 3T3細胞中表達，并按照上文描述的方法純化。抗KDR的scFvp1C11和scFv p2A6，一種與KDR結合但是不封閉KDR-VEGF相互作用的抗體，是從噬菌體展示文庫分離得到的，上述噬菌體展示文庫是從用KDR免疫的小鼠構建得到的，如上文所述。C225是針對上皮生長因子(EGF)受體的一種嵌合IgG1抗體。實施例(b)scFv p1C11可變結構域的克隆p1C11的輕鏈(VL)和重鏈(VH)可變結構域是分別利用引物1和2，以及引物3和4，通過PCR從scFv表達載體克隆得到的。分別利用引物5和2，以及引物5和4，通過PCR，將用于在哺乳動物細胞中負責蛋白分泌的引導肽序列加入到VL和VH的5’端。引物15′CTA GTA GCA ACT GCA ACT GGA GTA CAT TCA GAC ATCGAG CTC3′引物25′TCG ATC TAG AAG GAT CCA CTC ACG TTT TAT TTC CAG3′BamHI引物35′CTA GTA GCA ACT GCA ACT GGA GTA CAT TCA CAG GTCAAG CTG3′引物45′TCG AAG GAT CCA CTC ACC TGA GGA GAC GGT3′BamHI引物55′GGT CAAAAG CTTATG GGA TGG TCA TGT ATC ATC CTT TTTHindIIICTA GTA GCA ACT3′實施例IV(e)嵌合p1C11 IgG表達載體的構建分別構建了用于表達嵌合IgG輕鏈和重鏈的載體。克隆的VL基因用Hind III和BamHI水解，并與含有人κ輕鏈恒定區(CL)的載體pKN100連接以產生表達嵌合p1C11輕鏈，c-p1C11-L，的載體。克隆的VH基因用HindIII和BamH I水解，并與含有人IgG1(γ)重鏈恒定區(CH)的載體pGID105連接以產生表達嵌合p1C11重鏈，c-p1C11-H，的表達載體。通過限制性內切酶水解檢測上述兩種構建體，并通過脫氧核酸測序確認。
如圖4中所見，VH和VL結構域都在其5’端精確地和編碼導肽序列的基因片段融合，如所標明的那樣。VH和VL結構域通過HindIII和BamH I水解位點分別被連接到載體pG1D105和pKN100上，上述質粒pG1D105含有cDNA形式的人γ1恒定區基因，質粒pKN100含有cDNA形式的人κ鏈恒定區基因。在每種情況下，表達都是在HCMVi啟動子的控制之下，并且由人工終止序列終止。根據Kabat et al.等人的關于高變序列的描述定義的輕鏈和重鏈互補決定區(CDR)用下劃線表示并且分別標明CDR-H1到H3和CDR-L1到L3。實施例IV(d)IgG的表達和純化用等量的c-p1C11-L和c-p1C11-H質粒共轉染COS細胞以進行IgG的瞬時表達。在含有DMEM/10％FCS的150mm培養皿中生長的分會合(subconfluent)COS細胞用20ml含有40mM Tris(pH7.4)的DMEM洗滌一次，然后與4ml的DMEM/DEAE-Dextran/DNA混合物(含有40mM Tris，0.4mg/ml的DEAE-Dextran(Sigma)，以及c-p1C11-L和c-p1C11-H質粒各20μg的DEME)在37C一起溫育4.5小時。上述細胞與4ml含有100nM氯喹(Sigma)的DMEM/2％FCS在37℃溫育1小時，然后與1.5ml 20％的甘油/PBS在室溫溫育1min。上述細胞用DMEM/5％FCS洗滌兩次并在20ml同樣的培養基中37℃溫育過夜。用普通的DMEM洗滌兩次后，將上述細胞轉入無血清的DMEM/HEPES培養基中。在轉染后48小時和120小時收集細胞培養物的上清。按照廠商(Pharmacia Biotech)所描述的方法利用Protein G柱通過親和層析從收集的上清中純化嵌合的IgG。收集含有IgG的級分，將緩沖液換成PBS，并用Centricon 10濃縮器濃縮(Amicon Corp.，Beverly，MA)。IgG的純度用SDS-PAGE進行分析。用羊抗人y鏈特異的抗體作為捕捉劑，用HRP交聯的羊抗人k鏈抗體作為檢測試劑，通過ELISA確定純化的抗體的濃度。利用臨床級別的抗體，C225，校準標準曲線。
Protein G親和純化后，在SDS-PAGE中看到一條～150KD的單一蛋白條帶。用HRP交聯的抗人IgG1 Fc特異的抗體進行的Western印跡分析確認了純化的蛋白中存在人IgG Fc部分(未顯示)。
ELISA結果表明c-p1C11與固定的KDR的結合比母體scFv更有效(圖5)。實施例V.檢測和分析實施例V(a).FACS分析將早期傳代(early passage)的HUVEC細胞在無生長因子的EBM-2培養基生長過夜，以誘導KDR的表達。收集上述細胞并用PBS洗滌三次，與c-p1C11 IgG(5μg/ml)在4C溫育1小時，然后與FITC標記的兔抗人Fc抗體(Capper，Organon Teknika Corp.，WestChester，PA)繼續溫育60min。洗滌上述細胞并用流式細胞儀(ModelEPICS，CoulterCorp.，Edison，NJ)分析。
圖6是顯示c-p1C11與表達KDR的HUVEC結合的FACS分析圖。與先前在母體scFv中所見到的那樣，c-p1C11與在早期傳代HUVEC上表達的KDR特異結合。實施例V(b).定量KDR結合分析將不同量的抗體加入到KDR包被的96孔Maxi-sorp微滴定量板(Nunc.Danmark)并在室溫溫育1小時，然后用含有0.1％吐溫-20的PBS將上述滴定板洗滌三次。然后，對于scFv，將上述滴定板與100μl的小鼠抗-E標記的抗體-HRP交聯物(Pharmacia Biotech)室溫溫育1小時，或對于嵌合IgG，將滴定板與100μl兔抗人IgG特異的抗體-HRP交聯物(Cappel，Organon Teknika Corp.)室溫溫育1小時。將滴定板洗滌5次，加入TMB過氧化物酶底物(KPL，Gaithersburg，MD)，用讀板機(Molecular Device，Sunnyvale，CA)讀取450nm的OD值。
圖5是顯示抗體與固定的KDR直接結合的圖。顯示的結果表明C-p1C11與固定的KDR受體的結合比其母體scFv更有效實施例V(c)BIAcore分析用BIAcore生物感應器(Pharmacia Biosensor)測量了抗體與KDR結合的動力學。KDR-AP融合蛋白被固定到感應器芯片上，濃度在25nM到200nM之間的抗體或VEGF被注射入。在每個濃度得到感應器譜圖(Sensorgram)，并用一個程序，BIA Evaluation 2.0對其進行評估，以確定速率常數kon和koff。從速率常數kon/koff的比率計算得到Kd。
BIAcore分析結果表明c-p1C11與KDR的結合比其母體scFv的親和性更高(表2)。c-p1C11的Kd是0.82nM，而scFv的是2.1nM。c-p1C11親和性的升高主要是由于二價的嵌合IgG的解離速率(koff)較低。值得注意的是c-p1C11和KDR結合的親和性(Kd)與天然配基VEGF結合KDR的親和性，根據BIAcore分析的測定為0.93nM(表2)，相似。實施例V(d)競爭性VEGF結合實驗在第一個分析實驗中，將不同量的抗體與固定量的KDR-AP(50ng)混合并在室溫溫育1小時。然后將混合物轉移到VEGF165(200ng/孔)包被的96孔微量滴定板并在室溫繼續溫育2小時，之后將滴定板洗5次，加入AP的底物(p-硝基酚磷酸(p-nitrophenyl phosphate)，Sigma)以對結合的KDR-AP分子進行定量。然后計算EC50，即50％抑制KDR與VEGF結合所需要的抗體濃度。
圖7顯示c-p1C11以劑量依賴的方式封閉了KDR受體與固定的VEGF的結合。在封閉VEGF-KDR相互作用上嵌合抗體更為強有力，其IC50為0.8nM，而scFv的為2.0nM。作為對照的scFv p2A6也與KDR結合，但是不能封閉VEGF-KDR相互作用(圖7)。
在第二個分析實驗中，將不同量的c-p1C11抗體或無同位素標記的VEGF165蛋白與固定量的125I標記的VEGF165混合并加入到KDR受體包被的96孔微量滴定板。滴定板在室溫溫育2小時，洗滌5次后計數與固定的KDR受體結合的放射性標記的VEGF165。確定50％封閉放射性VEGF與固定的KDR受體結合所需要的c-p1C11和未標記VEGF165的濃度。
對放射性標記的VEGF165結合的抑制的結果在圖8顯示。顯示的數據是三次重復測量的平均值。顯示結果表明c-p1C11能以劑量依賴的方式有效地與125I標記的VEGF競爭結合固定的KDR受體。如所預期的那樣，C225，針對EGF受體的的嵌合抗體不與KDR受體結合或封閉VEGF-KDR相互作用(結果未顯示)。實施例V(e)磷酸化分析實驗前將接近匯合(subconfluent)的HUVEC細胞在無生長因子的EBM-2培養基中生長24到48小時。用50nM正釩酸鈉預處理30分鐘后，細胞在有或無抗體的條件下溫育15分鐘，然后用20ng/ml的VEGF165或10ng/ml的EGF繼續刺激15分鐘。然后在裂解緩沖液(50nM Tris，150mM NaCl，1％NP-40，2mM EDTA，0.25％脫氧膽酸鈉，1mM PMSF，1μg/ml亮肽素(Leupeptin)，1μg/ml抑肽素(pepstatin)，10μg/ml抑肽酶(aprotinin)，pH7.5)中裂解細胞，將細胞裂解液用于KDR和MAP激酶磷酸化分析。用偶聯了抗KDR抗體，Mab 4.13(ImClone Systems)的蛋白A Sepharose小珠(SantaCrutz Biotechnology，Inc.CA)從細胞裂解液中免疫沉淀KDR受體。用SDS-PAGE解析蛋白并進行Western印跡分析。為了檢測KDR磷酸化，用抗磷酸酪氨酸Mab，PY20(ICN Biomedicals，Inc.Aurora，OH)對印跡進行探測。對于MAP激酶活性分析，細胞裂解液用SDS-PAGE解析，然后用磷酸特異的MAP激酶抗體(New England BioLabs，Beverly，MA)進行Western印跡分析。用ECL(Amersham，ArlingtonHeights，IL)檢測所有的信號。在兩種分析實驗中，用多克隆抗KDR抗體(ImClone Systems)重新檢測印跡以保證在每個SDS-PAGE凝膠道中上樣了等量蛋白。
C-p1C11有效地抑制了VEGF刺激的KDR受體的磷酸化以及p44/p42 MAP激酶的激活。相反，C225未顯示出任何對VEGF刺激的KDR受體和MAP激酶的激活的抑制。單獨的c-p1C11和單獨的C225對KDR受體和p44/p42 MAP激酶的活性都無任何的作用。與先前在scFv p1C11中所見到的那樣，c-p1C11不抑制FGF刺激的p44/p42 MAP激酶的激活(未顯示)。此外，scFv p2A6和p2A6的嵌合IgG形式(c-p2A6)都不抑制VEGF刺激的KDR受體和MAP激酶的激活(未顯示)。實施例V(f).抗有絲分裂分析通過[3H]-TdR DNA摻入分析，用HUVEC確定了抗KDR抗體對VEGF刺激的人內皮細胞有絲分裂的作用。將HUVEC(5×103細胞/孔)加入到96孔組織培養板的200μl無VEGF，bFGF或EGF的EBM-2培養基中，并在37C溫育72小時。將不同量的抗體加入微孔，一式兩份并在37C預溫育1小時，然后加入最終濃度為16ng/ml的VEGF165。溫育18小時后，在每孔中加入0.25μCi的[3H]-TdR并繼續溫育4小時。用閃爍計數器確定摻入的DNA的放射性。圖9中所示的數據是至少三個單獨實驗的代表。
c-p1C11和scFv p1C11都有效地抑制了VEGF刺激的HUVEC有絲分裂(圖9)。C-p1C11對VEGF誘導的HUVEC有絲分裂的抑制比母體scFv更強。對于c-p1C11和scFv，50％抑制VEGF誘導的HUVEC有絲分裂所需要的抗體濃度分別是0.8nM和6nM。如所預期的那樣，scFv p2A26未顯示出任何對VEGF刺激的內皮細胞增殖的抑制作用。
權利要求
1.一種免疫球蛋白，它與KDR結合的親和性可與人VEGF相比，并且它中和KDR的激活。
2.根據權利要求1的免疫球蛋白分子，其中該免疫球蛋白分子選自單鏈抗體，雙體，三體或抗體。
3.一種中和KDR的激活的單鏈抗體，其中該單鏈抗體含有至少一個重鏈可變片段，該重鏈可變片段包含CDRH1，具有SEQ.ID.NO.1所列出的氨基酸序列；CDRH2，具有SEQ.ID.NO.2所列出的氨基酸序列；以及CDRH3，具有SEQ.ID.NO.3所列出的氨基酸序列；以及至少一個輕鏈可變片段，該輕鏈可變片段包含CDRL1，具有SEQ.ID.NO.4所列出的氨基酸序列；CDRL2，具有SEQ.ID.NO.5所列出的氨基酸序列；以及CDRL3，具有SEQ.ID.NO.6所列出的氨基酸序列。
4.一種中和KDR的激活的單鏈抗體，其中該單鏈抗體含有至少一個重鏈可變片段，該片段具有SEQ.ID.NO.7所列出的氨基酸序列；以及至少一個輕鏈可變片段，該片段具有SEQ.ID.NO.8所列出的氨基酸序列。
5.一種編碼權利要求3的單鏈抗體的核酸分子。
6.權利要求5的核酸分子，其由SEQ.ID.NO.9所列出的編碼CDRH1的核酸序列；SEQ.ID.NO.10所列出的編碼CDRH2的核酸序列；SEQ.ID.NO.11所列出的編碼CDRH3的核酸序列；SEQ.ID.NO.12所列出的編碼CDRL1的核酸序列；SEQ.ID.NO.13所列出的編碼CDRL2的核酸序列；以及SEQ.ID.NO.14所列出的編碼CDRL3的核酸序列組成。
7.一種編碼權利要求4的單鏈抗體的核酸分子。
8.權利要求7的核酸分子，其由SEQ.ID.NO.15所列出的編碼重鏈可變片段的核酸序列；以及SEQ.ID.NO.16所列出的編碼輕鏈可變片段的核酸序列組成。
9.權利要求3的單鏈抗體，其中重鏈可變片段和輕鏈可變片段通過至少一個肽接頭共價地連接在一起。
10.權利要求9的單鏈抗體，其中肽接頭含有至少15個氨基酸。
11.權利要求9的單鏈抗體，其中肽接頭含有SEQ.ID.NO.17所列出的氨基酸序列。
12.一種編碼權利要求11的肽接頭的核酸分子。
13.權利要求12的核酸分子，其由SEQ.ID.NO.18所列出的編碼肽接頭的核酸序列組成。
14.一種中和KDR的激活的雙體，其中該雙體含有至少一個重鏈可變片段，該重鏈可變片段包含CDRH1，具有SEQ.ID.NO.1所列出的氨基酸序列；CDRH2，具有SEQ.ID.NO.2所列出的氨基酸序列；以及CDRH3，具有SEQ.ID.NO.3所列出的氨基酸序列；以及至少一個輕鏈可變片段，該輕鏈可變片段包含CDRL1，具有SEQ.ID.NO.4所列出的氨基酸序列；CDRL2，具有SEQ.ID.NO.5所列出的氨基酸序列；以及CDRL3，具有SEQ.ID.NO.6所列出的氨基酸序列。
15.一種中和KDR的激活的雙體，其中該雙體含有一個重鏈可變片段，它具有SEQ.ID.NO.7所列出的氨基酸序列；以及一個輕鏈可變片段，它具有SEQ.ID.NO.8所列出的氨基酸序列。
16.一種編碼權利要求14的雙體的核酸分子。
17.權利要求16的核酸分子，其由SEQ.ID.NO.9所列出的編碼CDRH1的核酸序列；SEQ.ID.NO.10所列出的編碼CDRH2的核酸序列；SEQ.ID.NO.11所列出的編碼CDRH3的核酸序列；SEQ.ID.NO.12所列出的編碼CDRL1的核酸序列；SEQ.ID.NO.13所列出的編碼CDRL2的核酸序列；以及SEQ.ID.NO.14所列出的編碼CDRL3的核酸序列組成。
18.一種編碼權利要求15的雙體的核酸分子。
19.權利要求18的核酸分子，其由SEQ.ID.NO.15所列出的編碼重鏈可變片段的核酸序列；以及SEQ.ID.NO.16所列出的編碼輕鏈可變片段的核酸序列組成。
20.權利要求14的雙體，其中重鏈可變片段和輕鏈可變片段通過至少一個肽接頭共價地連接在一起。
21.權利要求20的雙體，其中肽接頭含有至少5個氨基酸并且不多于10個氨基酸。
22.權利要求21的雙體，其中肽接頭含有SEQ.ID.NO.19所列出的氨基酸序列。
23.一種編碼權利要求22的肽接頭的核酸分子。
24.權利要求23的核酸分子，其由編碼SEQ.ID.NO.20所列出的肽接頭的核酸序列組成。
25.權利要求14的雙體，其中所述的雙體是單一特異性的。
26.權利要求14的雙體，其中所述的雙體是雙特異性的并且該雙體與KDR上至少一個表位結合。
27.一種中和KDR的激活的三體，其中該三體含有至少一個重鏈可變片段，該重鏈可變片段包含CDRH1，具有SEQ.ID.NO.1所列出的氨基酸序列；CDRH2，具有SEQ.ID.NO.2所列出的氨基酸序列；以及CDRH3，具有SEQ.ID.NO.3所列出的氨基酸序列；以及至少一個輕鏈可變片段，該輕鏈可變片段包含CDRL1，具有SEQ.ID.NO.4所列出的氨基酸序列；CDRL2，具有SEQ.ID.NO.5所列出的氨基酸序列；以及CDRL3，具有SEQ.ID.NO.6所列出的氨基酸序列。
28.一種中和KDR的激活的三體，其中該三體含有至少一個重鏈可變片段，它具有SEQ.ID.NO.7所列出的氨基酸序列；以及至少一個輕鏈可變片段，它具有SEQ.ID.NO.8所列出的氨基酸序列。
29.一種編碼權利要求27的三體的核酸分子。
30.權利要求29的核酸分子，其由SEQ.ID.NO.9所列出的編碼CDRH1的核酸序列；SEQ.ID.NO.10所列出的編碼CDRH2的核酸序列；SEQ.ID.NO.11所列出的編碼CDRH3的核酸序列；SEQ.ID.NO.12所列出的編碼CDRL1的核酸序列；SEQ.ID.NO.13所列出的編碼CDRL2的核酸序列；以及SEQ.ID.NO.14所列出的編碼CDRL3的核酸序列組成。
31.一種編碼權利要求28的三體的核酸分子。
32.權利要求31的核酸分子，其由SEQ.ID.NO.15所列出的編碼重鏈可變片段的核酸序列；以及SEQ.ID.NO.16所列出的編碼輕鏈可變片段的核酸序列組成。
33.權利要求27的三體，其中所述的三體是單一特異性的。
34.權利要求27的三體，其中所述的三體是雙特異性的并且該三體與KDR上至少一個表位結合。
35.權利要求27的三體，其中所述的三體是三特異性的并且該三體與KDR上至少一個表位結合。
36.一種中和KDR的激活的抗體，其中該抗體含有至少一個重鏈可變片段，該重鏈可變片段包含CDRH1，具有SEQ.ID.NO.1所列出的氨基酸序列；CDRH2，具有SEQ.ID.NO.2所列出的氨基酸序列；以及CDRH3，具有SEQ.ID.NO.3所列出的氨基酸序列；以及至少一個輕鏈可變片段，該輕鏈可變片段包含CDRL1，具有SEQ.ID.NO.4所列出的氨基酸序列；CDRL2，具有SEQ.ID.NO.5所列出的氨基酸序列；以及CDRL3，具有SEQ.ID.NO.6所列出的氨基酸序列。
37.一種中和KDR的激活的抗體，其中該抗體含有一個重鏈可變片段，它具有SEQ.ID.NO.7所列出的氨基酸序列；以及一個輕鏈可變片段，它具有SEQ.ID.NO.8所列出的氨基酸序列。
38.一種編碼中和KDR的激活的抗體的核酸分子，該核酸分子含有SEQ.ID.NO.9所列出的編碼CDRH1的核酸序列；SEQ.ID.NO.10所列出的編碼CDRH2的核酸序列；SEQ.ID.NO.11所列出的編碼CDRH3的核酸序列；SEQ.ID.NO.12所列出的編碼CDRL1的核酸序列；SEQ.ID.NO.13所列出的編碼CDRL2的核酸序列；以及SEQ.ID.NO.14所列出的編碼CDRL3的核酸序列。
39.一種編碼中和KDR的激活的抗體的核酸分子，該核酸分子含有SEQ.ID.NO.15所列出的編碼重鏈可變片段的核酸序列；以及SEQ.ID.NO.16所列出的編碼輕鏈可變片段的核酸序列。
40.一種含有權利要求36的抗體的嵌合抗體。
41.一種含有權利要求36的抗體的人源化抗體。
42.一種制備免疫球蛋白的方法，該免疫球蛋白與KDR結合的親和性可與人VEGF相比，并且中和KDR的激活，該方法包括在宿主細胞中插入編碼該免疫球蛋白分子的核酸序列，以及表達該核酸序列。
43.一種中和KDR的激活的方法包括對哺乳動物施用有效量的免疫球蛋白分子，該免疫球蛋白分子與KDR結合的親和性可與人VEGF相比，并且中和KDR的激活。
44.一種減緩腫瘤生長的方法包括對哺乳動物施用有效量的免疫球蛋白分子，該免疫球蛋白分子與KDR結合的親和性可與人VEGF相比，并且中和KDR的激活。
45.一種抑制血管發生的方法包括對哺乳動物施用有效量的免疫球蛋白分子，該免疫球蛋白分子與KDR結合的親和性可與人VEGF相比，并且中和KDR的激活。
46.一種制備單鏈抗體方法，該單鏈抗體與KDR結合的親和性可與人VEGF相比并且中和KDR的激活，該方法包括在宿主細胞中插入編碼該單鏈抗體的核酸序列，以及表達該核酸序列。
47.一種中和KDR的激活的方法包括對哺乳動物施用有效量的單鏈抗體，該單鏈抗體與KDR結合的親和性可與人VEGF相比，并且中和KDR的激活。
48.一種減緩腫瘤生長的方法包括對哺乳動物施用有效量的單鏈抗體，該單鏈抗體與KDR結合的親和性可與人VEGF相比，并且中和KDR的激活。
49.一種抑制血管發生的方法包括對哺乳動物施用有效量的單鏈抗體，該單鏈抗體與KDR結合的親和性可與人VEGF相比，并且中和KDR的激活。
50.一種制備雙體的方法，該雙體與KDR結合的親和性可與人VEGF相比，并且中和KDR的激活，該方法包括在宿主細胞中插入編碼該雙體的核酸序列，以及表達該核酸序列。
51.一種中和KDR的激活的方法包括對哺乳動物施用有效量的雙體，該雙體與KDR結合的親和性可與人VEGF相比，并且中和KDR的激活。
52.一種減緩腫瘤生長的方法包括對哺乳動物施用有效量的雙體，該雙體與KDR結合的親和性可與人VEGF相比，并且中和KDR的激活。
53.一種抑制血管發生的方法包括對哺乳動物施用有效量的雙體，該雙體與KDR結合的親和性可與人VEGF相比，并且中和KDR的激活。
54.一種制備三體的方法，該三體與KDR結合的親和性可與人VEGF相比，并且中和KDR的激活，該方法包括在宿主細胞中插入編碼該三體的核酸序列，以及表達該核酸序列。
55.一種中和KDR的激活的方法包括對哺乳動物施用有效量的三體，該三體與KDR結合的親和性可與人VEGF相比，并且中和KDR的激活。
56.一種減緩腫瘤生長的方法包括對哺乳動物施用有效量的三體，該三體與KDR結合的親和性可與人VEGF相比，并且中和KDR的激活。
57.一種抑制血管發生的方法包括對哺乳動物施用有效量的三體，該三體與KDR結合的親和性可與人VEGF相比，并且中和KDR的激活。
58.一種制備抗體的方法，該抗體與KDR結合的親和性可與人VEGF相比，并且中和KDR的激活，該方法包括在宿主細胞中插入編碼該抗體的核酸序列，以及表達該核酸序列。
59.一種中和KDR的激活的方法包括對哺乳動物施用有效量的抗體，該抗體與KDR結合的親和性可與人VEGF相比，并且中和KDR的激活。
60.一種減緩腫瘤生長的方法包括對哺乳動物施用有效量的抗體，該抗體與KDR結合的親和性可與人VEGF相比，并且中和KDR的激活。
61.一種抑制血管發生的方法包括對哺乳動物施用有效量的抗體，該抗體與KDR結合的親和性可與人VEGF相比，并且中和KDR的激活。
全文摘要
本發明提供了一種與SI(KDR)結合的,親和性和人類VEGF可比的,能夠中和KDR的激活的免疫球蛋白分子。免疫球蛋白分子包括單價單鏈抗體、多價單鏈抗體、雙體(diabody)、三體(tribody)、抗體、人源化抗體和嵌合抗體。本發明進而提供了編碼這些免疫球蛋白分子的核酸分子。本發明還提供了制備上述免疫球蛋白的方法。本發明進而提供了用這樣的免疫球蛋白分子中和KDR激活的方法,在哺乳動物中抑制血管發生的方法和在哺乳動物中抑制腫瘤生長的方法。
文檔編號C07K16/28GK1345334SQ00805856
公開日2002年4月17日 申請日期2000年1月28日 優先權日1999年1月29日
發明者Z·朱, L·維特 申請人:伊姆克羅尼系統公司