專利名稱：肽的酰化方法和新酰化劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及將一個或多個酰基引入肽或蛋白質中的方法。更具體地說，本發明涉及將天然存在的GLP-1或其類似物中含有的賴氨酸殘基的ε-氨基酰化的改進方法。而且，本發明還涉及在所述方法中用作酰化劑的化合物。
背景技術：
肽廣泛用在醫學實踐中，而且由于其可通過重組DNA技術制備，可以預計，在未來許多年肽的重要性仍會增加。當天然肽或其類似物用于治療時，往往發現它們具有高廓清率(high clearance)。當期望長時間保持高廓清率治療試劑的高血液濃度時，由于需要重復給藥，因此，使用高廓清率治療試劑是麻煩的。具有高廓清率的天然肽的實例是ACTH(促腎上腺皮質激素)、促腎上腺皮質激素釋放因子、血管緊張肽、降鈣素、exendin、exendin-3、exendin-4、胰島素、胰高血糖素、胰高血糖素樣肽-1、胰高血糖素樣肽-2、胰島素樣生長因子-1、胰島素樣生長因子-2、腸抑胃肽、生長激素釋放因子、垂體腺苷酸環化酶活化肽、促胰液素、促腸胃液素(enterogastrin)、促生長素抑制素、生長激素、促生長因子、甲狀旁腺激素、血小板生成素、紅細胞生成素、下丘腦釋放因子、催乳激素、甲狀腺刺激激素、內啡肽類、腦啡肽類、后葉加壓素、催產素、阿片樣物質(opiods)和其類似物、超氧物歧化酶、干擾素、天冬酰胺酶、精氨酸酶、精氨酸脫氨酶、腺苷脫氨酶、核糖核酸酶。
相對于天然肽(或其未修飾的類似物)，將親脂性酰基導入天然存在的肽或其類似物中可得到作用時間延長了的酰化肽。該現象已在本申請人的下述在先申請中作了充分的描述和證明WO98/08871尤其公開了GLP-1和其類似物的酰化、WO98/08872尤其公開了GLP-2和其類似物的酰化和WO99/43708尤其公開了exendin和其類似物的酰化。而且認為，在親脂性基團的附近包含帶負電基團，如包含羧酸基團是有利的。
歐洲專利申請92107035.5(Kuraray Co.)描述了用于將長鏈羧酸導入蛋白質的長鏈二羧酸的活性單酯。
尤其感興趣的是，可以通過單或二肽間隔基(spacers)將親脂性酰基引入GLP-1中，并已在WO98/08871中提出和例解。并提出了用天冬氨酸和谷氨酸作為合適間隔基。然而，上述單或二肽間隔基含有多余的羧酸基團，因此，保護和隨后的脫保護步驟是必須的。在酸性條件下脫保護在一定程度上破壞了肽(GLP-1)。因此，期望有制備這些變體的替代方法。
所以，本發明目的是提供一種通過α-氨基-α，ω-二羧酸間接基將親脂基團引入肽中的替代方法。本發明方法能在親脂基團的附近引入可帶電的羧酸基團并且不會直接影響親脂基團，因而該方法方便了修飾肽的制備。
發明內容
本發明提供了酰化肽(或蛋白質)上的一個或多個氨基的方法，該方法包括(a)在堿性條件下，在非質子傳遞極性溶劑和水的混合物中，將具有至少一個游離氨基的肽(或蛋白質)與通式I的酰化試劑反應， 其中，n＝0-8；R1是COOR4；R2是親脂部分，例如，選自C3-39烷基、C3-39鏈烯基、C3-39鏈二烯基和甾族殘基；R3與和R3連接的羧基一起表示活性酯或活性N-羥基亞氨酸酯；和R4選自氫、C1-12烷基和芐基；和(b)如果R4不是氫，在堿性條件下，皂化酰化了的肽的酯基(COOR4)；以得到N-酰化的肽(或N-酰化的蛋白質)。
現已發現，可以在堿性條件下皂化酰化了的肽酯(其中R4是烷基或芐基)，并且肽和間隔基的各個α-氨基酸片段僅有少量外消旋化或沒有外消旋化。本申請人已發現，就純度和抑制副產物，如，抑制降解產物而言，堿性皂化無疑優于現有技術采用的酸性水解。
現已發現，在堿性條件下使用游離酸(R4是氫)作為酰化劑進行酰化反應，確實基本上直接生成所需產物酰化肽，同時沒有副產物形成并且無需脫保護步驟。
本發明還提供了在上述方法中用作酰化劑的新化合物，所述新化合物具有通式I 其中，n＝0-8；R1是COOH；R2是親脂部分，例如，選自C3-39烷基、C3-39鏈烯基、C3-39鏈二烯基和甾族殘基；和R3與和R3相連的羧基一起表示活性酯或活性N-羥基亞氨酸酯。
發明詳述肽和蛋白質一般認為本發明可用于將親脂酰基導入任何肽(或蛋白質)中，以降低其在體內的廓清率。所述肽和蛋白質的實例是ACTH(促腎上腺皮質激素)、促腎上腺皮質激素釋放因子、血管緊張肽、降鈣素、exendin和其類似物、胰島素和其類似物、胰高血糖素和其類似物、胰高血糖素樣肽-1和其類似物、胰高血糖素樣肽-2和其類似物、胰島素樣生長因子-1、胰島素樣生長因子-2、腸抑胃肽、生長激素釋放因子、垂體腺苷酸環化酶活化肽、促胰液素、促腸胃液素(enterogastrin)、促生長素抑制素、生長激素、促生長因子、甲狀旁腺激素、血小板生成素、紅細胞生成素、下丘腦釋放因子、催乳激素、甲狀腺刺激激素、內啡肽類、腦啡肽類、后葉加壓素、催產素、阿片樣物質(opiods)和其類似物、超氧物歧化酶、干擾素、天冬酰胺酶、精氨酸酶、精氨酸脫氨酶、腺苷脫氨酶和核糖核酸酶。
當然，肽(或蛋白質)應當含有至少一個游離氨基，所述氨基是N-末端氨基或側鏈氨基。特別值得考慮的是賴氨酸和鳥氨酸氨基酸殘基的氨基。本發明方法尤其涉及賴氨酸殘基的ε-氨基的N-酰化作用。應當說明的是，本發明所研究的肽或蛋白質可含有兩個或多個可全部都被N-酰化的側氨基。
目前認為，本發明尤其適用于修飾GLP-1和其類似物。根據本發明，可被N-酰化的GLP-1和其類似物的實例是GLP-1和其截短的類似物，例如，Arg26-GLP-1(7-37)；Arg34-GLP-1(7-37)；Lys36-GLP-1(7-37)；Arg26，34Lys36-GLP-1(7-37)；Arg26，34Lys38-GLP-1(7-38)；Arg26，34Lys39-GLP-1(7-39)；Arg26，34Lys40-GLP-1(7-40)；Arg26Lys36-GLP-1(7-37)；Arg34Lys35-GLP-1(7-37)；Arg26Lys39-GLP-1(7-39)；Arg34Lys40-GLP-1(7-40)；Arg26，34Lys36，39-GLP-1(7-39)；Arg26，34Lys36，40-GLP-1(7-40)；Gly8Arg26-GLP-1(7-37)；Gly8Arg34-GLP-1(7-37)；Gly8Lys36-GLP-1(7-37)；Gly8Arg26，34Lys36-GLP-1(7-37)；Gly8Arg26，34Lys39-GLP-1(7-39)；Gly8Arg26，34Lys40-GLP-1(7-40)；Gly8Arg26Lys36-GLP-1(7-37)；Gly8Arg34Lys36-GLP-1(7-37)；Gly6Arg Lys39-GLP-1(7-39)；Gly8Arg34Lys40-GLP-1(7-40)；Gly8Arg26，34Lys36，39-GLP-1(7-39)；Gly8Arg26，34Lys36，40-GLP-1+(7-40)；Arg26，34Lys36GLP-1(7-38)；Arg26，34Lys39GLP-1(7-39)；Arg26，34Lys40GLP-1(7-40)；Arg26，34Lys41GLP-1(7-41)；Arg26，34Lys42GLP-1(7-42)；Arg26，34Lys43GLP-1(7-43)；Arg26，34Lys44GLP-1(7-44)；Arg26，34Lys45GLP-1(7-45)；Arg26，34Lys38GLP-1(1-38)；Arg26，34Lys39GLP-1(1-39)；Arg26，34Lys40GLP-1(1-40)；Arg26，34Lys41GLP-1(1-41)；Arg26，34Lys42GLP-1(1-42)；Arg26，34Lys43GLP-1(1-43)；Arg26，34Lys44GLP-1(1-44)；Arg26，34Lys45GLP-1(1-45)；Arg26，34Lys38GLP-1(2-38)；Arg26，34Lys39GLP-1(2-39)；Arg26，34Lys40GLP-1(2-40)；Arg26，34Lys41GLP-1(2-41)；Arg26，34Lys42GLP-1(2-42)；Arg26，34Lys43GLP-1(2-43)；Arg26，34Lys44GLP-1(2-44)；Arg26，34Lys45GLP-1(2-45)；Arg26，34Lys38GLP-1(3-38)；Arg26，34Lys39GLP-1(3-39)；Arg26，34Lys40GLP-1(3-40)；Arg26，34Lys41GLP-1(3-41)；Arg26，34Lys42GLP-1(3-42)；Arg26，34Lys43GLP-1(3-43)；Arg26，34Lys44GLP-1(3-44)；Arg26，34Lys45GLP-1(3-45)；Arg26，34Lys38GLP-1(4-38)；Arg26，34Lys39GLP-1(4-39)；Arg26，34Lys40GLP-1(4-40)；Ar926，34Lys41GLP-1(4-41)；Arg26，34Lys42GLP-1(4-42)；Arg26，34Lys43GLP-1(4-43)；Arg26，34Lys44GLP-1(4-44)；Arg26，34Lys45GLP-1(4-45)；Arg26，34Lys38GLP-1(5-38)；Arg36，34Lys39GLP-1(5-39)；Arg26，34Lys40GLP-1(5-40)；Arg26，34Lys41GLP-1(5-41)；Arg26，34Lys42GLP-1(5-42)；Arg26，34Lys43GLP-1(5-43)；Arg26，34Lys-GLP-1(5-44)；Arg26，34Lys45GLP-1(5-45)；Arg26，34Lys38GLP-1(6-38)；Arg36，34Lys39GLP-1(6-39)；Arg26，34Lys40GLP-1(6-40)；Arg26，34Lys41GLP-1(6-41)；Arg26，34Lys42GLP-1(6-42)；Arg26，34Lys43GLP-1(6-43)；Arg26，34Lys44GLP-1(6-44)；Arg26，34Lys45GLP-1(6-45)；Arg36Lys38GLP-1(1-38)；Arg34Lys38GLP-1(1-38)；Arg26，34Lys36，38GLP-1(1-38)；Arg26Lys38GLP-1(7-38)；Arg34Lys38GLP-1(7-38)；Arg26，34Lys36，38GLP-1(7-38)；Arg26，34Lys38GLP-1(7-38)；Arg Lys39GLP-1(1-39)；Arg34Lys39GLP-1(1-39)；Arg26，34Lys36，39GLP-1(1-39)；Arg26Lys39GLP-1(7-39)；Arg34Lys39GLP-1(7-39)；Arg26，34Lys36，39GLP-1(7-39)；Arg26-GLP-1(7-37)，Arg34-GLP-1(7-37)，Lys36-GLP-1(7-37)，Arg26，34Lys36-GLP-1(7-37)，Arg26Lys38-GLP-1(7-37)，Arg34Lys36-GLP-1(7-37)，Gly8Arg26-GLP-1(7-37)，Gly6Arg34-GLP-1(7-37)，Gly8Lys36-GLP-1(7-37)，Gly8Arg26，34Lys36-GLP-1(7-37)，Gly8Arg26Lys36-GLP-1(7-37)；Gly8Arg34Lys36-GLP-1(7-37)；Arg26Lys38-GLP-1(7-38)，Arg26，34Lys38-GLP-1(7-38)，Arg26，34Lys36，38-GLP-1(7-38)，Gly8Arg26Lys38-GLP-1(7-38)；Gly8Arg26，34Lys36，38-GLP-1(7-38)；Gly8，Arg26，34，Glu37，Lys38-GLP-1(7-38)，Arg26Lys39-GLP-1(7-39)，Arg26，34Lys36，39-GLP-1(7-39)，Gly8Arg26Lys39-GLP-1(7-39)；Gly8Arg26，34Lys36，39-GLP-1(7-39)；Arg34Lys40-GLP-1(7-40)，Arg26，34Lys36，40-GLP-1(7-40)，Gly8Arg34Lys40-GLP-1(7-40)和Gly8Arg26，34Lys36，40-GLP-1(7-40)。上述每個GLP-1類似物和其截短的類似物構成了本發明可供選擇的實施方案。
目前認為，本發明還特別適用于修飾GLP-2和其類似物。根據本發明，可被N-酰化的GLP-2和其類似物的實例是GLP-2類似物和其截短的類似物，例如，Lys20GLP-2(1-33)；Lys20Arg30GLP-2(1-33)；Arg30Lys34GLP-2(1-34)；Arg30Lys35GLP-2(1-35)；Arg30，35Lys20GLP-2(1-35)；和Arg35GLP-2(1-35)。上述每個GLP-2類似物和其截短的類似物構成了本發明可供選擇的目前認為，本發明還特別適用于修飾exendin和其類似物。根據本發明，可被N-酰化的exendin和其類似物的實例是exendin類似物和其截短的類似物，例如，exendin-3和exendin-4。上述每個exendin類似物和其截短的類似物構成了本發明可供選擇的實施方案。
在本發明的其它實施方案中，N-酰化反應發生在賴氨酸殘基的ε-氨基上。
在WO98/08871中充分公開了GLP-1和其類似物的效果。
在WO98/08872中充分公開了GLP-2和其類似物的效果。
在WO99/43708中充分公開了exendin和其類似物的效果。
酰化試劑在本發明方法中，將具有至少一個游離氨基的肽(或蛋白質)與通式I的酰化試劑反應， 在通式I中，整數n優選0-8，例如，對于天冬氨酸和谷氨酸等，n特別優選0-6。優選n是0-4，例如，n＝0-2，例如，n是0(天冬氨酸)或1(谷氨酸)。上述各整數或整數范圍構成了本發明的備擇實施方案。
通式I中的R1表示游離酸基(COOH)或酯基(COOR4)。當R1是酯基時，R4選自可在堿性條件下通過水解(以相應的醇的形式)除去的基團。所述基團的實例是C1-12烷基，例如，甲基、乙基、丙-1-基、丙-2-基、丁-1-基、丁-2-基、2-甲基丙-1-基、2-甲基-丙-2-基(叔丁基)和己-1-基等，和芐基。上述各基團構成了本發明的備選實施方案。
通式I中的R2表示被引入到肽或蛋白質中的親脂部分。所述親脂部分-般選自C3-39烷基、C3-39鏈烯基、C3-39鏈二烯基和甾族殘基。C3-39烷基的具體實例是庚基、壬基、十一烷基、十三烷基、十五烷基、十七烷基和十九烷基。上述各親脂基團構成了本發明的備選實施方案。
親脂取代基或親脂部分的特征在于，在20℃水中的溶解度為約0.1mg/100ml水-250mg/100ml水，優選為約0.3mg/100ml水-75mg/100ml水。例如，辛酸(C8)在20℃水中的溶解度為68mg/100ml水，癸酸(C10)在20℃水中的溶解度為15mg/100ml水，和十八烷酸(C18)在20℃水中的溶解度為0.3mg/100ml水。上述各親脂取代基構成了本發明的備選實施方案。
術語“C3-39烷基”、“C3-39鏈烯基”和“C3-39鏈二烯基”分別包括C3-39直鏈和支鏈烴基，優選為直鏈飽和、單不飽和二不飽和的C3-39烴基。C3-39烷基的具體實例是庚基、壬基、十一烷基、十三烷基、十五烷基、十七烷基和十九烷基。
術語“甾族殘基”是指親脂基團，其與和R2相連的羰基一起衍生于甾族羧酸，即，衍生于三-、四-和五環全飽和或部分不飽和C16-36烴，所述基團R2-C(＝O)-的實例是石膽酸酰基(lithocholoyl)、脫氧膽酸酰基(deoxycholoyl)和膽酸酰基(choloyl)。
在上述親脂基團中，特別合適的是C7-25烷基、C7-25鏈烯基、C7-25鏈二烯基和甾族殘基。特別值得考慮的實例是庚基、壬基、十一烷基、十三烷基、十五烷基、十七烷基、十九烷基、石膽酸酰基(lithocholoyl)、脫氧膽酸酰基(deoxycholoyl)和膽酸酰基(choloyl)。上述各親脂基構成了本發明的備選實施方案。
通式I中的R3與和R3相連的羧基一起形成活性酯或活性的N-羥基亞氨酸酯。上述每種酯都構成了本發明的備選實施方案。活性酯或活性N-羥基亞氨酸酯是在有機化學(特別是肽化學)領域中已知的用于氨基、硫基和羥基的酰化作用的官能團。在本發明中，術語“活性酯或活性N-羥基亞氨酸酯”是指適用于將胺，優選將伯胺進行酰化的酯官能化形式的羧酸基團。不用說，活性酯或活性N-羥基亞氨酸酯對伯胺酰化反應的選擇優于對羥基和硫基酰化反應的選擇。特別優選活性N-羥基亞氨酸酯。
活性酯的實例是1-羥基苯并三唑酯和其衍生物。許多用于形成上述羧酸活性酯的高效試劑是已知的，例如，2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸鹽。上述活性酯通常在堿存在下，例如，在諸如三烷基胺的有機堿存在下就地形成。
活性N-羥基亞氨酸酯的酰亞胺部分的實例是那些在歐洲專利申請92107035.5第13頁第3行-第17頁第10行中具體公開的酰亞胺(在本發明中引作參考)。其中，特別值得考慮的酰亞胺部分的實例是琥珀酰亞胺和鄰苯二甲酰亞胺等等。上述各種酰亞胺部分構成了本發明的備擇實施方案。
通過相應的酸(即，N-酰化的α-羧基保護的二酸(R4不是氫))與等摩爾量(例如，0.95-1.05摩爾，優選1.0摩爾)相應酰亞胺的N-羥基酰亞胺縮合，可制得通式I的活性N-羥基亞氨酸酯。(另一方面，N-酰化的α-羧基保護的二酸通常可由相應的α-羧基保護的α-氨基二酸和親脂部分的苯并三唑酯制備。按WO98/02460所描述的DCC偶合(實施例1-3)，例如，由酰氯和苯并三唑或由游離酸和苯并三唑可制得上述苯并三唑酯)。通常在脫水條件下，例如，在諸如碳化二亞胺偶聯劑(例如，二環已基碳化二亞胺(DCC))的偶聯劑存在下進行縮合。當存在偶聯劑時，相對于酸，優選加入等摩爾量的偶聯劑。反應通常在諸如無水四氫呋喃(THF)、無水二甲基甲酰胺(DMF)、無水丙酮、無水二氯甲烷、無水二氧六環、無水二甲基乙酰胺或無水N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)的極性非質子傳遞溶劑中進行。通常在0-50℃，例如，在諸如室溫的5-30℃下進行反應1-96小時，例如，進行反應4-36小時。一組可能的反應試劑和反應條件如下將上述的N-羥基酰亞胺(例如，琥珀酰亞胺或鄰苯二甲酰亞胺)和酸以約1∶1的摩爾比溶解在無水THF或無水DMF(或其混合物)中，并向溶液中加入等摩爾量的DCC。在N-羥基酰亞胺和酸反應完成后，通過諸如過濾(如果使用DCC偶聯劑，則過濾出二環己基脲(DCU)沉淀)、結晶、重結晶和色譜等常規方法分離和提純產物。一種可能的提純途徑包括通過過濾除去用過的沉淀偶聯劑，減壓蒸發溶劑，將產物再懸浮在，例如，丙酮中，過濾，加入非極性溶劑，例如，加入已烷進行結晶，并任選進行重結晶和/或洗滌。產物可直接在本發明方法中用作式I的酰化試劑。
當以游離α-羧酸的形式(R4是氫)使用通式I的酰化試劑時，將其中R4為可被選擇性除去的基團的通式I的化合物轉化成相應的R4是氫的化合物。羧酸保護基團可以是能通過催化氫化除去的芐基或是能選擇性除去的烯丙基。室溫下，在極性非質子傳遞溶劑，例如，丙酮中，使用鈀碳和氫，通過催化氫化可除去芐基保護基。反應可以在密閉容器中和氫氣氣氛(一般為0.1-10atm)下劇烈攪拌進行。根據鈀催化劑的重量，通常在0.5-12小時內完成反應。使用常規處理方法。
相信R4是氫的通式I的化合物是新化合物，這些化合物構成了本發明的特征。因此，本發明還提供了通式I的新化合物 其中，n＝0-8；R1是COOH；R2是親脂基團，例如，選自C3-39烷基、C3-39鏈烯基、C3-39鏈二烯基和甾族殘基；和R3與和R3相連的羧基一起表示活性酯或活性N-羥基亞氨酸酯。
反應條件在堿性條件下，在極性非質子傳遞溶劑與水的混合物中，進行通式I的酰化試劑與肽或蛋白質的反應。
相對于待酰化的肽的氨基數量，通常使用稍稍過量的通式I的酰化試劑。考慮到肽中的氨基數量，上述比例通常為1∶1-1∶20，優選為1∶1.2-1∶5，并且酰化試劑過量。
應當理解的是，根據使用的酰化試劑的量和反應條件，可以將肽完全或部分N-酰化。優選N-酰化反應基本上按化學計量進行。
通常，極性非質子傳遞溶劑選自無水四氫呋喃(THF)、無水二甲基甲酰胺(DMF)、丙酮、二氯甲烷、二甲亞砜(DMSO)、二氧六環、二甲基乙酰胺和N-甲基-2-吡咯烷酮和其混合物。其中，優選二甲基甲酰胺、二甲亞砜、二甲基乙酰胺和N-甲基-2-吡咯烷酮，特別優選N-甲基-2-吡咯烷酮。通常，極性非質子傳遞溶劑與水(例如，N-甲基-2-吡咯烷酮與水)的比例為1∶10-10∶1，優選為1∶5-5∶1，特別優選為1∶1-3∶1。
反應溫度一般保持在-10-50℃，優選0-25℃。
為使反應平穩進行，溶劑混合物的pH值為7-14，例如，9-13，優選為9.5-12.5是重要的。當溶劑混合物的pH值為10-12時，通常收率和純度最佳。通過加入諸如氫氧化鈉和氫氧化鉀的堿金屬氫氧化物和/或諸如三烷基胺(例如，三乙基胺、N，N-二異丙基乙基胺等)的有機堿，得到所需pH值。
進行步驟(a)反應的典型實例是使用1∶1-1∶5摩爾比的蛋白質和通式I的酰化試劑。通常在-10-30℃，例如，在0-25℃，預先將肽溶解在水中，用堿金屬氫氧化物(例如，氫氧化鈉或氫氧化鉀)調節溶液的pH值至所需值。使用酸，例如，乙酸和堿，例如，三烷基胺可進一步調節pH值，但優選將溫度保持在上述范圍內。然后加入極性非質子傳遞溶劑(或溶劑混合物)。隨后加入酰化試劑。在加入水和酸，例如，乙酸調節pH值至6.5-9.0之前，通常要使反應完全進行(用HPLC監控)，反應完全進行所需時間通常為0.2-4小時，例如，0.2-1小時。產物通常用HPLC分離和提純，或通過等電pH值沉淀，或在提純之前進行水解(步驟(b))。
當使用R4是氫的酰化試劑時，直接得到帶有親脂部分和游離羧基的N-酰化的肽或蛋白質。因此，R4是氫的各種酰化試劑代表了本發明方法的另外，即，當R4是C1-12烷基或芐基時，在堿性條件下將N-酰化的肽酯(或蛋白質酯)皂化，以得到N-酰化的肽或N-酰化的蛋白質。皂化反應通常在0.01-4.0M的諸如氫氧化鈉或氫氧化鉀的堿金屬氫氧化物溶液中進行。溶液pH一般為10-14。反應通常在0-40℃，例如，在室溫下，進行0.1-12小時，優選進行0.5-4小時。反應完成后，通過例如在等電pH值下沉淀和/或通過制備HPLC可提純產物。因此，R4是C1-12烷基或芐基的各種酰化試劑是本發明方法的優選實施方案。
本發明還涉及下述方面1.一種酰化肽或蛋白質的氨基的方法，該方法包括(a)在堿性條件下，在非質子傳遞極性溶劑和水的混合物中，將具有至少一個游離氨基的肽與通式I的酰化試劑反應， 其中，n＝0-8；R1是COOR4；R2是親脂部分；R3與和R3相連的羧基一起表示活性酯或活性N-羥基亞氨酸酯；和R4選自氫、C1-12烷基和芐基；和(b)如果R4不是氫，在堿性條件下皂化酰化了的肽的酯基(COOR4)；以得到N-酰化的肽。
2.根據1的方法，其中R4是氫。
3.根據1的方法，其中R4選自C1-8的烷基和芐基。
4.根據1-3的任一方法，其中R3與和R3相連的羧基一起表示活性N-羥基亞氨酸酯。
5.根據1-4的任一方法，其中非質子傳遞極性溶劑和水的混合物是1∶5-5∶1的N-甲基-2-吡咯烷酮和水的混合物。
6.根據1-5的任一方法，其中步驟(a)中反應混合物的pH值為9-13。
7.根據1-6的任一方法，其中步驟(a)的反應溫度為0-50℃。
8.根據3-7的任一方法，其中在pH值為10-14的條件下皂化酰化的肽酯。
9.根據上述任一方法，其中R2選自C3-39烷基、C3-39C鏈烯基、C3-39鏈二烯基和甾族殘基。
10.通式I的化合物 其中，n＝0-8；R1是COOH；R2是親脂部分；R3與和R3相連的羧基一起表示活性酯或活性N-羥基亞氨酸酯。
11.根據10的化合物，其中n為0或1，R3與和R3相連的羧基一起形成活性N-羥基亞氨酸酯。
12.根據10-11的任一化合物，其中R2選自C3-39烷基、C3-39鏈烯基、C3-39鏈二烯基和甾族殘基。
實施例原料的制備實施例1N-十六烷酰基谷氨酸α-芐酯的制備在20-25℃下，將谷氨酸α-芐酯(4.75g，20.0mmol)懸浮于N-甲基-2-吡咯烷酮(100ml)中。加入三乙胺(2.53g，25.0mmol)，然后加入1-十六烷酰基苯并三唑(7.15g，20.0mmol)。在20-25℃下，攪拌反應混合物22小時。向所得溶液中加入0.2M(250ml)鹽酸。將所得懸浮液冷卻至0℃下3小時。過濾分離產物，用水(50ml×4)洗滌，并在40℃下減壓干燥至恒重。
收率9.15g(96％)白色物質，用示差掃描量熱法(DSC)測定熔點為90.0℃(峰值)。
實施例2
N-十六烷酰基谷氨酸α-甲酯的制備在類似于實施例1的反應條件下，用8.06g(50.0mmol)谷氨酸α-甲酯制備N-十六烷酰基谷氨酸α-甲酯。
收率17.70g(88％)白色物質，用DSC測定熔點為95.4℃(峰值)。
實施例3N-十六烷酰基谷氨酸α-芐酯γ-N-羥基琥珀酰亞氨酸酯的制備在20-25℃下，將N-十六烷酰基谷氨酸α-芐酯(23.78g，50.0mmol)溶解于四氫呋喃(200ml)中。加入N-羥基琥珀酰亞胺(5.75g，50.0mmol)，然后加入二環己基碳化二亞胺(10.32g，50.0mmol)。在20-25℃下攪拌反應混合物20小時。過濾所得懸浮液，并減壓蒸發濾液至干。在40℃，將結晶殘余物溶解在丙酮(100ml)中，并通過過濾使其澄清。向所得濾液中加入正庚烷(300ml)。在20-25℃下攪拌所得懸浮液4小時，然后冷卻至0℃并保溫0.5小時。過濾分離產物，用正庚烷(50ml×3)洗滌，并在40℃減壓干燥至恒重。
收率23.75g(83％)白色物質，用DSC測定熔點為98.6℃(峰值)。
實施例4N-十六烷酰基谷氨酸α-甲酯γ-N-羥基琥珀酰亞氨酸酯的制備在類似于實施例3的反應條件下，用8.00g(20.0mmol)N-十六烷酰基谷氨酸α-甲酯制備N-十六烷酰基谷氨酸α-甲酯γ-N-羥基琥珀酰亞氨酸酯。
收率6.45g(65％)白色物質，用DSC測定熔點為106.0℃(峰值)。
實施例5N-十六烷酰基谷氨酸γ-N-羥基琥珀酰亞氨酸酯的制備在20-25℃下，將N-十六烷酰基谷氨酸α-芐酯γ-N-羥基琥珀酰亞氨酸酯(5.73g，10.0mmol)溶解于丙酮(100ml)中。加入10％膏狀鈀碳(約0.25g干燥物)。在氫氣氣氛下攪拌懸浮液直至不再消耗氫氣(290ml氫氣，45分鐘)。濾除催化劑，在20-25℃下減壓蒸發濾液至干。在20-25℃下，將殘余物溶解于丙酮(25ml)中，并通過過濾使其澄清。向濾液中加入正庚烷(200ml)。在20-25℃下攪拌所得懸浮液1小時。過濾分離產物，用正庚烷(50ml×2)洗滌，并在40℃減壓干燥至恒重。
收率4.20g(87％)白色物質，用DSC測定熔點為100.8℃(峰值)。
酰化的GLP-1類似物的制備實施例6Arg34Lys26[N-ε-(γ-Glu(N-十六烷酰基))]-GLP-17-37的制備在0-5℃，將Arg34-GLP-17-37(同種沉淀的冷凍肽物料5.0g，約0.15mmol)溶解于水(25ml)中。加入1.0M氫氧化鈉溶液(2.25ml)將溶液的pH值調節至12.5。2分鐘后，加入N-甲基-2-吡咯烷酮(50ml)和1.0M乙酸(1.25ml)，并保持溫度為15℃。加入三乙胺(0.2ml)，然后加入N-十六烷酰基谷氨酸γ-N-羥基琥珀酰亞氨酸酯(97.0mg，0.20mmol)。在15℃下放置30分鐘后，加入水(50ml)，并加入1.0M乙酸(1.70ml)將溶液的pH值調節至8.0。
收率通過分析RP-HPLC，表明反應混合物含有77％(峰面積)Arg34Lys26[N-ε-(γ-Glu(N-十六烷酰基))]-GLP-17-37。
通過柱色譜得到最終提純的產物。
實施例7Arg34Lys26-[N-ε-(γ-Glu-OMe(N-十六烷酰基))]-GLP-17-37的制備在類似于實施例6的反應條件下，使用N-十六烷酰基谷氨酸α-甲酯γ-N-羥基琥珀酰亞氨酸酯酰化Arg34-GLP-17-37。
收率通過分析RP-HPLC，表明反應混合物含有64％(峰面積)Arg34Lys26-[N-ε-(γ-Glu-OMe(N-十六烷酰基))]-GLP-17-37。使用1M乙酸調節反應混合物的pH值至6.0，從而分離出作為沉淀的產物。或者，反應混合物可直接用于下述實施例8。
實施例8Arg34Lys26-[N-ε-(γ-Glu(N-十六烷酰基))]-GLP-17-37的制備用1M氫氧化鈉調節實施例7得到的含有產物的反應混合物的pH值至12-13，進行堿性水解。將反應混合物的溫度保持在8-18℃。2小時后完成反應，加入1M乙酸調節反應混合物的pH值至7.45。
收率通過分析RP-HPLC，表明反應混合物含有65％(峰面積)Arg34Lys26-[N-ε-(γ-Glu(N-十六烷酰基))]-GLP-17-37。
通過柱色譜得到最終提純的產物。
實施例9
類似于實施例6的化合物制備下述化合物，并通過柱色譜得到最終提純的產物。
Arg26，34，Lys36-(N-ε-(γ-Glu(N-十六烷酰基)))-GLP-17-36，Arg26，Lys34-(N-ε-(γ-Glu(N-十六烷酰基)))-GLP-17-37，和Gly8，Arg26，34，Glu37，Lys38-(N-ε-(γ-Glu(N-十六烷酰基)))-GLP-17-38。
權利要求
1.一種酰化肽或蛋白質的氨基的方法，該方法包括(a)在堿性條件下，在非質子傳遞極性溶劑和水的混合物中，將具有至少一個游離氨基的肽與通式I的酰化試劑反應， 其中，n＝0-8；R1是COOR4；R2是親脂部分；R3與和R3相連的羧基一起表示活性酯或活性N-羥基亞氨酸酯；和R4選自氫、C1-12烷基和芐基；和(b)如果R4不是氫，在堿性條件下皂化酰化了的肽酯基(COOR4)；以得到N-酰化的肽。
2.根據權利要求1的方法，其中R4是氫。
3.根據權利要求1的方法，其中R4選自C1-8烷基和芐基。
4.根據權利要求1-3中任一項的方法，其中R3與和R3相連的羧基一起表示活性N-羥基亞氨酸酯。
5.根據權利要求1-4中任一項的方法，其中非質子傳遞溶劑和水的混合物是1∶5-5∶1的N-甲基-2-吡咯烷酮和水的混合物。
6.根據權利要求1-5中任一項的方法，其中步驟(a)中反應混合物的pH值為9-13。
7.根據權利要求1-6中任一項的方法，其中步驟(a)中反應混合物的溫度為0-50℃。
8.根據權利要求3-7中任一項的方法，其中在pH值為10-14的條件下皂化酰化的肽酯。
9.根據上述任一權利要求的方法，其中R2選自C3-39烷基、C3-39鏈烯基、C3-39鏈二烯基和甾族殘基。
10.根據上述任一權利要求的方法，其中R2選自C7-25烷基。
11.根據上述任一權利要求的方法，其中所述肽選自GLP-1(1-37)和其類似物、exendin和其類似物和GLP-2(1-34)和其類似物。
12.根據上述任一權利要求的方法，其中所述肽選自exendin-3、exendin-4、Arg26-GLP-1(7-37)、Arg34-GLP-1(7-37)、Val8GLP-1(7-37)、Thr8GLP-1(7-37)、Met8GLP-1(7-37)、Gly8GLP-1(7-37)、Val8GLP-1(7-36)酰胺、Thr8GLP-1(7-36)酰胺、Met8GLP-1(7-36)酰胺和Gly8GLP-1(7-36)酰胺。
13.通式I的化合物 其中，n＝0-8；R1是COOH；R2是親脂部分；R3與和R3相連的羧基一起表示活性酯或活性N-羥基亞氨酸酯。
14.根據權利要求13的化合物，其中n為0或1，R3與和R3相連的羧基一起表示活性N-羥基亞酸酯。
15.根據權利要求13-14中任一項的化合物，其中R2選自C3-39烷基、C3-39鏈烯基、C3-39鏈二烯基和甾族殘基。
全文摘要
本發明提供了一種酰化肽(或蛋白質),例如,GLP－1的一個或多個氨基(通常為賴氨酸的氨基)的方法,該方法包括(a)在堿性條件下,在非質子傳遞極性溶劑和水(例如,N－甲基－2－吡咯烷酮和水)的混合物中,將具有至少一個游離氨基的肽(或蛋白質)與通式I的酰化試劑反應,其中,n=0－8;R
文檔編號C07K1/08GK1344248SQ00805003
公開日2002年4月10日 申請日期2000年3月16日 優先權日1999年3月17日
發明者路易斯·B·漢森 申請人:諾沃挪第克公司