專利名稱：用于蛋白結合的改良的化合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及新的結合化合物，特別是蛋白結合化合物。這種新的化合物對于將蛋白結合至包括膜在內的表面來說是特別有用的。在本發明的優選的形式中，提供引入這些蛋白結合化合物的生物傳感器。本發明還涉及在本發明的結合化合物的合成中使用的中間體化合物。
1975年報道了在分離和純化蛋白質的過程中使用金屬-IDA配合物，此過程被稱為固定化金屬親和色譜(IMAC)(5)。在該過程中將IDA的衍生物連接于固體載體如瓊脂糖凝膠，然后將瓊脂糖凝膠填充入柱子中。將金屬離子加入到IDA部分(通過使金屬離子的稀溶液通過柱子)，然后加入蛋白質混合物。除了與金屬-IDA物種相互作用的蛋白質以外，洗脫蛋白質混合物將所有蛋白質除去。然后通過加入咪唑溶液、通過加入強金屬螯合劑如EDTA或EGTA，或者通過降低pH至4.5-5.3(6)而將這種或者這些蛋白質從柱子中洗脫下來。
1987年Hochuli及其合作者采用Ni-NTA配合物來純化蛋白質(7)，特別是重組設計的6位組氨酸標記的蛋白質(8)。組氨酸標記的蛋白質與帶有NTA的固體載體之間的親和力約為1013M-1(9)。
1996年報道了采用NTA衍生物將組氨酸標記的蛋白質連接到聚苯乙烯微孔板的孔上的方法(10)。
1997年，多個結合在石英載玻片表面的NTA的使用被描述為將蛋白質連接到表面的方法(11)。1998年報道了通過這種技術將組氨酸標記的5-羥色氨受體連接到石英片以通過全內反射熒光來研究(12)。
1995年，采用二齒、三齒和四齒金屬螯合基團衍生化表面被描述為檢測分析物的方法(13)。1996年報道了將組氨酸標記的蛋白質連接到帶有金的側基NTA部分上的混合自組裝單分子層(SAM)的表面上以通過表面等離子體激光共振來進行研究(14)。
1997年報道了通過采用SPR作為測量方法的商品化的傳感裝置將組氨酸標記的蛋白質結合到具有NTA-鎳部分的表面上(15)。
1997年報道了采用通過使用具有NTA部分的SAM將Fab片段結合到金涂層的表面上以通過FTIR進行研究(16)。還報道了通過使用具有NTA部分的SAM來檢測金屬離子(17)。
報道了通過使用具有IDA-Cu2+部分的單分子層將抗生物素蛋白鏈菌素結合至單分子層以通過X-射線晶體學(18)和電子顯微鏡法(19)進行研究。
1994年報道了通過使用具有NTA基團的脂質來制備金屬敏感的脂質膜(20)。
1996年報道了使用含有在雙分子層的表面具有芘部分和IDA-Cu2+部分的脂質的雙分子層通過激基締合物熒光檢測富含組氨酸的蛋白質(21)。
在上述報道中所采用的物質具有許多缺點。第一，三元配合物的穩定性，即金屬螯合物金屬與蛋白質之間的相互作用對于使蛋白質被固定化足夠長的時間以觀察和研究來說太弱。第二，所采用的金屬螯合物與其它未標記的蛋白質以非特異性的方式相互作用。另外，在某些分析系統中，在某種未知濃度的干擾物存在下三元配合物可能被破壞。
因此本發明是具有通式I的化合物Y-(Z)n分子式I其中，Y是分支部分，Z代表與金屬離子配位的多齒配體螯合劑；且n是至少為2的整數，優選是2-9。
Z可以是多齒配體，其與如Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+的金屬離子配位。給體原子Z可以是σ-給體原子或者π-給體原子。給體原子可以選自氮、氧、硫、磷和硅。給體原子優選是氮。Z可以是二齒、三齒(如IDA)或者四齒(如NTA)。Z優選是除環狀的或者多環的之外的。Z優選是四齒配體如NTA。
Y優選提供至少三個用以直接地或者通過任選的連接基團間接地與Z共價連接的部分。分支基團Y的主鏈可以是化合物的殘基、低聚物或聚合物。連接基團最優選具有直鏈主鏈。
另一方面，本發明提供如分子式II的化合物X-Y-(Z)n分子式II其中Y、Z和n如上所述，且X是間隔部分。
X可以是親水的、疏水的或者既具有親水區又具有疏水區。X可以是或者包含取代或未取代的烷基，任選地是被一個或多個雜原子(如氧、氮、硫或者它們的兩個或多個的組合)分隔，例如低聚乙二醇或其它低聚烷基乙二醇、氨基酸序列、多肽或聚酰胺或低聚酰胺(如氨基己酰基低聚物)。X可以是或者包含脂質。該脂質可以是跨膜脂質(MSL)。優選的X包含親水區，例如聚亞烷基低聚物，及疏水區，例如脂質，其中X通過疏水區，任選地通過間隔基團與Y相連。
又一方面，本發明提供如分子式III的化合物W-X-Y-(Z)n分子式III其中，X、Y、Z和n如上所述，且W是用以與其它分子連接，或者與表面連接，或者鑲嵌入膜中的基團。
在優選的實施方案中，W是用以與其它分子包括聚合物如瓊脂糖凝膠連接的基團(如胺官能團、羧酸官能團、醇官能團、鹵素官能團)或者與表面連接的基團(如用以與金或者其它的造幣金屬表面連接的硫醇或者二硫化物，或者如用以與氧化物表面連接的硅烷衍生物)，或者鑲嵌入膜中的基團(如脂質基團，或者可溶于膜的蛋白質，如短桿菌肽)。W也可以是能夠產生非共價連接的基團，如生物素與抗生物素蛋白鏈菌素之間的非共價連接。
優選的Y是分支部分，其提供多個用以與Z共價結合的部分以及提供一個用以與X共價結合的部分。對Y的非限制性的說明性實例包括氨基多元醇，如TRIS，bis-homotris氨基酸，如3，5-二氨基苯甲酸、5-氨基間苯二甲酸、
含有多個游離酸和/或胺部分的肽，例如 在另一實施方案中，Y是分支部分，其含有多個用以與Z和X共價連接的部分。Y的非限制性的說明性實例包括多元胺，如亞精胺、精胺、五亞乙基六胺；多元酸如酒石酸、1，3，5-苯三酸、檸檬酸，Kemp′s三酸多羥基化的物質如糖dendron，如商品化的“Starburst”化合物， 含有多個環氧部分的化合物，或者含有易被親核試劑(如鹵素、甲苯磺酸鹽或酯)取代的基團，或者親核試劑易于加成的基團(如α，β-不飽和酮)的化合物，或者它們的組合。
本發明的化合物可以具有廣泛的用途。特別是它們對于將蛋白質和其它的生物大分子結合到表面是有用的。要理解這是許多傳感裝置和分析的要求。
據信本發明的化合物將特別地應用于生物傳感器。生物傳感器在本領域中是公知的，并且在PCT/AU93/00620、PCT/AU96/00482、PCT/AU95/00763、 PCT/AU96/00368、 PCT/AU97/00071、PCT/AU98/00423、 PCT/AU98/00424、 PCT/AU97/00294、PCT/AU93/00509、 PCT/AU96/00304、 PCT/AU89/00352、PCT/AU97/00014、 PCT/AU92/00132、 PCT/AU97/00316、PCT/AU90/00025、 PCT/AU98/00417、 PCT/AU96/00369以及PCT/AU94/00202中有描述，這些文獻引入本文作參考。
這些生物傳感器具有包括離子載體和受體的膜。分析物與受體結合導致膜的電導或者阻抗的可檢測的變化。這些生物傳感器提供對特別的分析物的靈敏的檢測。
通常，定向于所感興趣的分析物的受體連接于離子載體和膜。通常受體是蛋白質如抗體或其抗原結合片段如Fab。據信本發明的結合化合物在將這種受體連接于生物傳感器的離子載體和膜中將會有用。
因此在優選的實施方案中，本發明在于在本說明書中，“包含”這個詞將被理解為意為包括一定的元素、整數或步驟，或者元素組、整數組或步驟組，而不是將任何其它的元素、整數或步驟，或者元素組、整數組和步驟組排除在外。
圖26組氨酸CD40結合于J1.三NTA碎片。顯示100、200、400、600和800納摩爾/升的結合曲線(從下至上)。結合曲線是Fc1減去Fc2(對照，-Ni2+)的響應。
發明詳述為了更清楚地理解本發明的性質，以下將參考實施例對本發明的優選形式進行描述。概述將6組氨酸CD40結合于三NTA有著比將其結合于NTA高12倍的親和力。這主要是結合速率(Ka)高10倍的結果。但是，由于與金碎片上的三NTA相比(比較絕對結合程度)，NTA分子在BLAcore NTA碎片上的密度更高，因此NTA結合的脫離速率(offrate，Kd)可能被夸大。
本領域技術人員將會理解，在不背離如廣泛描述的本發明的實質和范圍的前提下，可以對本發明做多種改變和/或修改，如在具體的實施方案中所示。因此這些實施方案是說明性的的而非限制性的。1.一般過程N6-芐氧羰基-L-賴氨酸、2-三甲基甲硅烷基乙醇、鹽酸1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)、二環已基碳二亞胺(DCC)、N-羥基琥珀酰胺(NHS)及6-氨基己酸(X)購自Sigma-Aldrich化學公司。XXBoc是通過Xboc NHS酯(它自身是通過在標準條件下用BocON保護X的氨基，然后用DCC與NHS偶聯而獲得的)與X反應而獲得。臨用前將二氯甲烷用P2O5蒸餾。2.Z-賴氨酸NTA的合成 C18H24N2O8396.39396.153266C54.5％ H6.1％ N7.1％ O32.3％照Schmitt等1的過程合成Z-賴氨酸NTA。
將溴乙酸(4.17克，30.0毫摩爾)溶解在氫氧化鈉水溶液(1.5摩爾/升，15毫升)中并冷卻至0℃。在2小時內向反應混合物中逐滴加入Nε-Z-(L)-賴氨酸(2.0克，7.0毫摩爾)的氫氧化鈉水溶液(1.5摩爾/升，25毫升)。將溶液暖至室溫并在室溫下攪拌過夜。將反應混合物在50℃加熱2小時，然后冷至室溫。將鹽酸水溶液(1摩爾/升，40毫升)逐滴加入反應混合物中，然后將得到的白色沉淀過濾，并用鹽酸(0.1摩爾/升，20毫升)和蒸餾水(2×20毫升)洗滌。得到的白色固體在高真空下干燥數天，得到Z-賴氨酸NTA的白色固體(2.68克，收率95％)。數據1H NMR(200MHz，d6-DMSO)δ7.42(5H，m，-C6H5)，5.09(2H，s，-CH2Ph)，3.56(4H，AB四重峰，2×-NCH2CO2H)，3.41(1H，重疊dd，-NCHCO2H)，3.06(2H，m，-NHCH2-)，1.75-1.25(6H，重疊多重峰，-NHCH2CH2CH2CH2-)ppm。13C NMR(50MHz，d4-MeOD)δ175.9(2×-C(O)O-)，175.8(-C(O)O-)，158.9(-C(O)NH)，138.4(-C6H5)，129.4(-C6H5)，128.9(-C6H5)，128.7(-C6H5)，67.3(-CH2Ph)，66.7(-NCHC(O)-)，55.3(2×-NCH2C(O)-)，41.5(-NHCH2)，30.7(-NHCH2CH2-)，30.5(-NHCH2CH2CH2CH2-)，24.6(-NHCH2CH2CH2-)ppm。電噴霧M/Sm/z 397(100％)(M+H+)，398(21％)，353(30％)，792(15％)。3.Z-賴氨酸NTA.TMSE3的合成照Gao等2的過程合成Z-賴氨酸NTA.TMSE3。 C33H60N2O8Si3697.10696.365752C56.9％ H8.7％ N4.0％ O18.4％ Si12.1％
在0℃將EDC(1.25克，12.5毫摩爾)加入Z-賴氨酸NTA(0.50克，1.25毫摩爾)、2-三甲基甲硅烷基乙醇(1.50克，12.5毫摩爾)及4-二甲基氨基吡啶(0.50克，4.15毫摩爾)在新蒸、干燥二氯甲烷(60毫升)中的溶液。反應在0℃下攪拌1小時，然后暖至室溫并在室溫下攪拌過夜。將蒸餾水(50毫升)加入反應混合物中，分離有機層。用二氯甲烷(2×50毫升)萃取水層，合并有機萃取液，以無水碳酸鈉干燥。過濾混合物，減壓除去所有揮發性物質，得到無色油狀物。采用從二氯甲烷至含5％甲醇的二氯甲烷溶劑梯度在閃蒸二氧化硅上以柱色譜純化，得到無色油狀的Z-賴氨酸NTA.TMSE3(0.75克，86％)。數據Rf＝0.78(含5％甲醇的二氯甲烷)1H NMR(200MHz，CDCl3)δ7.34(5H，m，-C6H5)，5.08(2H，s，-CH2Ph)，4.91(1H，br t，-NH)，4.16(6H，m，3×-OCH2-)，3.60(4H，s，2×-NCH2C(O)-)，3.39(1H，t，-NCHC(O)-，3JH-H＝7.5Hz)，3.19(2H，m，-NHCH2-)，1.3-1.8(6H，重疊多重峰，-NHCH2CH2CH2CH2-)，0.93-1.04(6H，重疊多重峰，3×-CH2Si-)，0.04(9H，s，1×-Si(CH3)3)，0.03(18H，s，2×-Si(CH3)3)ppm。13CNMR(100MHz，CDCl3)δ173.6(-C(O)O-)，172.2(2×-C(O)O-)，157.1(-OC(O)NH)，137.5(-C6H5)，129.2(-C6H5)，128.7(-C6H5)，67.2(-CH2Ph)，65.4(-NCHC(O)-)，63.5(1×-OCH2-)，63.3(2×-OCH2-)，53.6(2×-NCH2C(O)-)，41.6(-NHCH2-)，30.8(-NHCH2CH2-)，30.1(-NHCH2CH2CH2CH2-)，23.8(-NHCH2CH2CH2-)，18.3(-CH2Si-)，18.1(2×-CH2Si-)，-0.8(3×-Si(CH3)3)ppm。電噴霧M/Sm/z 719.4(100％)(M+Na+)4.賴氨酸NTA.TMSE3的合成 C25H54N2O6Si3562.97562.328973C53.3％ H9.7％ N5.0％ O17.1％ Si15.0％將Z-賴氨酸NTA.TMSE3(0.167克，0.24毫摩爾)溶解在甲醇(5毫升)中，加入刮勺尖端量(spatule-tip)的10％Pd/C，給反應容器裝上含有氫氣的氣囊。在室溫下攪拌反應混合物75分鐘，然后過濾，減壓除去所有的揮發物。1H NMR分析顯示發生完全氫化，得到無色油狀的賴氨酸NTA.TMSE3(0.127克定量收率)。數據1H NMR(200MHz，CDCl3)δ4.16(6H，m，3×-OCH2-)，3.61(4H，s，2×-NCH2C(O)-)，3.40(1H，表觀三重峰，-NCHC(O)-，3JH-H＝7.5Hz)，2.69(2H，brt，NH2CH2-，3JH-H＝6.1Hz)，1.3-1.8(6H，重疊多重峰，NH2CH2CH2CH2CH2-)，0.93-1.04(6H，重疊多重峰，3×-CH2Si-)，0.04(9H，s，1×-Si(CH3)3)，0.03(18H，s，2×-Si(CH3)3)ppm。13C NMR(100MHz，CDCl3)δ173.7(-C(O)O-)，172.2(2×-C(O)O-)，65.6(-NCHC(O)-)，63.5(2×-OCH2-)，63.3(1×-OCH2-)，53.6(2×-NCH2C(O)-)，42.7(NH2CH2-)，33.9(NH2CH2CH2-)，31.0(NH2CH2CH2CH2CH2-)，23.9(NH2CH2CH2CH2-)，18.3(-CH2Si-)，18.1(2×-CH2Si-)，-0.8(3×-Si(CH3)3)ppm。電噴霧M/Sm/z 563.3(100％)(M+H+)5.Z-三NTA.TMSE9的合成 C93H180N8O23Si92031.262029.108491C55.0％ H8.9％ N5.5％ O18.1％ Si12.4％將Z-賴氨酸NTA(60毫克，0.15毫摩爾)、4-二甲基氨基吡啶(60毫克，0.51毫摩爾)和賴氨酸NTA.TMSE3(0.37克，0.66毫摩爾)溶解在二氯甲烷(50毫升)中，將反應混合物冷至0℃。加入EDC(0.15克，0.75毫摩爾)，在0℃攪拌反應物1小時，然后暖至室溫，在室溫下攪拌過夜。向反應混合物中加入蒸餾水(40毫升)，分離有機層。水層以二氯甲烷(2×40毫升)萃取，合并有機萃取液，并且用無水碳酸鈉干燥。過濾混合物，減壓除去所有揮發物，得到無色的油狀物。采用從100％的二氯甲烷至含5％甲醇的二氯甲烷的溶劑梯度在閃蒸二氧化硅上以柱色譜純化，得到無色油狀的Z-三NTA.TMSE9(0.235克，76％)。數據Rf＝0.24(含5％甲醇的二氯甲烷)1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.37(2H，br t，NH)，7.34(5H，m，-C6H5)，7.26(1H，br t，NH)，5.15(1H，br t，NH)，5.08(2H，s，-CH2Ph)，4.17(18H，m，9×-OCH2-)，3.60(12H，二個比率為2∶1的重疊單峰，6×-NCH2C(O)O-)，3.39-3.34(5H，重疊多重峰)，3.26-3.16(10H，重疊多重峰)，3.07(1H，三重峰)，1.85-1.30(24H，重疊多重峰，12×-CH2)，0.97(18H，重疊多重峰，9×-CH2Si-)，0.05(27H，s，3×-Si(CH3)3)，0.04(54H，s，6×-Si(CH3)3)ppm。-OC(O)NHCH2-13C NMR(100MHz，CDCl3)δ173.5(2×-C(O)O-)，173.5(-C(O)O-)，172.9(3×-C(O)NH-)，172.2(4×-C(O)O-)，172.1(2×-C(O)O-)，157.2(-OC(O)NH)，137.4(-C6H5)，129.1(-C6H5)，128.6(-C6H5)，67.1(-CH2Ph)，66.4(-NCHC(O)NH-)，65.5(-NCHC(O)O-)，65.4(2×-NCHC(O)O-)，63.4(6×-OCH2CH2-)，63.3(3×-OCH2CH2-)，56.9(2×-NCH2C(O)NH-)，53.7(4×-NCH2C(O)O-)，53.4(2×-NCH2C(O)O-)，41.2(-OC(O)NHCH2-)，39.9(3×-C(O)NCH2-)，30.7，30.5，30.2(4×-NHCH2CH2-)，29.9，29.5，28.9(4×NHCH2CH2CH2CH2-)，24.7，24.0，23.8(4×-NHCH2CH2CH2-)，18.3(3×-CH2Si(CH3)3-)，18.0(6×-CH2Si(CH3)3-)，-0.8(9×-Si(CH3)3)ppm。電噴霧M/Sm/z 2054.3(100％)(M+Na+)，1038.8(20％)，613.3(36％)6.Z-三NTA的合成 C48H72N8O23準確質量1128.47分子量1129.13C51.06； H6.43； N9.92； O32.59將Z-三NTA.TMSE9(0.12克，0.06毫摩爾)冷至0℃，加入三氟乙酸(3毫升)。在0℃下攪拌反應混合物3小時，然后減壓除去所有揮發物。以反相HPLC，在40分鐘內采用從100％水/0.05％TFA至含50％乙腈/0.05％TFA的水/0.05％TFA的溶劑梯度純化反應混合物。收集保留時間為21分鐘的HPLC色譜的主峰，得到純的Z-三NTA的白色固體(20毫克，30％收率)。數據1H NMR(400MHz，D2O)δ7.38(5H，m，-C6H5)，5.08(2H，s，-CH2Ph)，4.06-3.78(20H，m，8×-NCH2C(O)-+4×-NCHC(O)-)，3.23(6H，表觀三重峰，3×-C(O)NHCH2-)，3.08(2H，表觀三重峰，1×-OC(O)NHCH2-)，2.00-1.76(8H，重疊多重峰，4×-CH2)，1.60-1.40(14H，重疊多重峰，7×-CH2)，1.38-1.22(2H，多重峰，1×-CH2)ppm。13C NMR(100MHz，D2O)172.3，171.2，170.8，168.6，159.0，137.5，129.5，129.0，128.3，118.0，115.5，67.8，67.5，56.0，55.5，41.0，39.6，39.0，28.5，27.4，23.7，23.0ppm。電噴霧M/Sm/z 1151.4(100％)(M+Na+)，1129.2(88％)(M+H+)，1130.3(56％)(M+2H+)，1152.4(53％)(M+Na++H+)，1165.3(53％)，1143.3(52％)，755.5(50％)，907.2(41％)，393.2(26％)。7.三NTA TMSE9的合成 C85H174N8O21Si9準確質量1895.07分子量1897.10C53.81； H9.24； N5.91； O17.71； Si13.32將Z-三NTA TMSE9(38毫克，0.0187毫摩爾)溶解在甲醇(10毫升)中，加入催化量的披鈀木炭(10％)。在真空下以氫氣沖洗混合物，并且在氫氣氛中攪拌2小時。過濾反應混合物，蒸發濾液，得到三NTA TMSE9的澄清的油(34毫克，96％)。數據1H n.m.r.(CDCl3)δ0.00(81H，m，Si(CH3)3)，0.96(18H，m，CH2Si)，1.2-2.0(24H，m)，3.1-3.7(28H，m)，4.15(18H，m，OCH2)及7.4(2H，NH2)。8.三NTA TMSE9半琥珀酰胺的合成 C89H178N8O24Si9準確質量1995.09分子量1997.17C53.52； H8.98； N5.61； O19.23； Si12.66在0℃下攪拌三NTA TMSE9(0.5克)、半琥珀酸芐酯(71毫克)、DMAP(64毫克)的二氯甲烷溶液。將EDC(101毫克)加入反應混合物中，在室溫下繼續攪拌16小時。減壓除去溶劑，采用二氯甲烷-甲醇(96∶4)進行色譜分離剩余物，分離出537毫克的芐酯的中間體。將500毫克該物質溶解在甲醇(60毫升)中，以10％Pd/C(60毫克)為催化劑在常溫下氫化4小時。得到474毫克純的產物。數據1H n.m.r.(CDCl3)δ0.04(81H，m，Si(CH3)3)，0.96(18H，m，CH2Si)，1.2-2.0(24H，m)，2.5(2H，m)，2.65(2H，m)，3.2-3.45(16H，m)，3.59(s，12)，4.16(18H，m，OCH2)。電噴霧M/Sm/z 2019.8(35％)，(M+Na+)，1997.8(100％)(M+)。9.三NTA的合成 用甲苯研制三NTA TMSE9(34毫克，0.0179毫摩爾)，在高真空條件下蒸發和干燥。加入三氟乙酸(1毫升)，在0-5℃下在氮氣氛中攪拌2小時，然后在室溫下攪拌過夜。蒸發除去三氟乙酸，再次以甲苯研制剩余物，蒸發和干燥后得到三NTA(20毫克，100％)。數據1H n.m.r.(CD3OD)δ1.2-2.0(24H，m)，3.07(6H，m，CH2NHCO)和3.1-3.7(22H，m)。10.短桿菌肽琥珀酸酯的制備將短桿菌肽(75毫克，0.0398毫摩爾)溶解在吡啶(0.5毫升)中，加入琥珀酸酐(20毫克，0.200毫摩爾)。混合物在50℃下在氮氣氛中攪拌20小時，然后蒸發。將粗產物的甲醇溶液通過sephadexLH-20柱，蒸發洗脫液，并且以閃蒸二氧化硅柱用二氯甲烷/甲醇/水/乙酸(400∶50∶4∶1)純化。產物用水離心進行進一步的純化。潷去水后，在高真空下干燥產物，得到短桿菌肽琥珀酸酯(53毫克，67％)。數據1H n.m.r.(CD3OD)δ0.4-1.8(66H，m)，2.0-2.2(4H，m)，2.56(4H，s，CH2CO)，2.9-3.4(10H，m)，3.90(2H，dd，CH2-gly)，4.0-4.8(16H，m)，6.8-7.6(20H，m)和8.18(1H，s，CHO)。11.短桿菌肽琥珀酸NHS酯的制備將短桿菌肽琥珀酸酯(21毫克，0.0105毫摩爾)、N-羥基琥珀酰胺(12毫克，0.1042毫摩爾)和4-二甲氨基吡啶(2.5毫克，0.0204毫摩爾)與蒸餾的四氫呋喃(10毫升)合并。在氮氣中攪拌下加入二環己基碳二亞胺(22毫克，0.1066毫摩爾)。混合物加熱回流1小時。蒸發混合物，使混合物在甲醇中通過Sephadex LH-20柱。將適當的部分蒸發并且干燥，得到短桿菌肽琥珀酸NHS酯(22毫克，100％)。數據1H n.m.r.(CD3OD)δ0.4-1.8(66H，m)，2.0-2.2(4H，m)，2.56(4H，s，CH2CO)，2.82(4H，s，NHS)2.9-3.4(10H，m)，3.90(2H，dd，CH2-gly)，4.0-4.8(16H，m)，6.8-7.6(20H，m)和8.18(1H，s，CHO)。12.短桿菌肽琥珀酸酯三NTA的制備 將賴氨酸三NTA(20毫克，0.0201毫摩爾)溶解在甲醇(1毫升)中，加入三乙胺(2滴)中和。然后加入短桿菌肽琥珀酸酯NHS(15毫克，0.0072毫摩爾)的甲醇(2毫升)溶液。反應混合物在50℃加熱24小時，然后在甲醇中用Sephadex LH-20柱純化。得到短桿菌肽琥珀酸酯賴氨酸三NTA(14毫克，65％)。數據1H n.m.r.(CD3OD)δ0.4-1.8(90H，m)，2.0-2.2(4H，m)，2.52(4H，m，CH2CO)，3.0-3.8(38H，m)，3.90(2H，dd，CH2-gly)，4.0-4.8(16H，m)，6.8-7.6(20H，m)和8.18(1H，s，CHO)。MALDI m.s.2963.4((M+Na+)-H2O)，2982.9(M+Na+)，2998(M+K+)。13.gA賴氨酸-XXBOC的制備 gA賴氨酸XXBOC
將短桿菌肽賴氨酸(15毫克，0.0076毫摩爾)溶解在甲醇(2毫升)中，并加入一當量三乙胺，將其與XXBOC的N-羥基琥珀酰胺酯(10毫克，0.0226毫摩爾)(通過在干燥的二氯甲烷中將XXBOC與1當量DCC和NHS及1當量DMAP反應而制備)反應。反應混合物在室溫下攪拌18小時。蒸發反應混合物，并在甲醇中通過Sephadex LH-20柱。將含有合適部分的洗脫液蒸發，并在閃蒸二氧化硅柱上用二氯甲烷/甲醇/水/乙酸(400∶40∶4∶1)純化，得到gA賴氨酸2XBOC(12毫克，68％)。數據1H n.m.r.(CD3OD)δ0.4-1.8(84H，m)，1.41(9H，s，BOC)，2.0-2.2(4H，m)，2.9-3.4(14H，m)，3.90(2H，dd，CH2-gly)，4.0-4.8(15H，m)，6.8-7.6(20H，m)和8.18(1H，s，CHO)。14.gA賴氨酸XXBOC半琥珀酸酯的制備 將短桿菌肽賴氨酸2XBOC(12毫克，0.0052毫摩爾)用甲苯研制，在真空下蒸發并干燥。加入三氟乙酸(1毫升)，在氮氣中蒸發并干燥。再次加入甲苯，在真空中蒸發并干燥。將粗胺溶解在吡啶(0.5毫升)中，并與琥珀酸酐(2.6毫克，0.0259毫摩爾)反應。將反應混合物在室溫下攪拌20小時。高真空下除去吡啶，剩余物在甲醇中通過Sephadex LH-20柱。產物在閃蒸二氧化硅柱上用甲醇洗脫進行進一步純化，得到gA賴氨酸2X琥珀酸酯(10毫克，83％)。數據1H n.m.r.(CD3OD)δ0.4-1.8(84H，m)，2.0-2.2(8H，m)，2.58(4H，dd，CH2-CO)，2.9-3.4(14H，m)，3.90(2H，dd，CH2-gly)，4.0-4.8(15H，m)，6.8-7.6(20H，m)和8.18(1H，s，CHO)。15.gA賴氨酸2X三NTA的合成 將短桿菌肽賴氨酸2X琥珀酸酯(8.5毫克，0037毫摩爾)、N-羥基琥珀酰胺(4.2毫克，0.0364毫摩爾)和4-二甲基氨基吡啶(1毫克，0.0081毫摩爾)在蒸餾過的四氫呋喃(5毫升)中攪拌，并加入二環己基碳二亞胺(7.5毫克，0.0363毫摩爾)。混合物在氮氣中回流1小時。蒸發混合物，并在甲醇中通過sephadex LH-20柱純化。蒸發合適的部分，加入賴氨酸三NTA(8.5毫克，0.0085毫摩爾)。混合物在室溫下攪拌18小時。蒸發反應混合物，在甲醇(X2)中通過sephadex LH-20柱純化。得到gA賴氨酸2X三NTA(2.6毫克，19％)(因為溶解度低，所以損失一些化合物)。數據1H n.m.r.(CD3OD)δ0.4-1.8(108H，m)，2.0-2.2(8H，m)，2.62(4H，dd，CH2CO)，3.0-3.8(42H，m)，3.90(2H，dd，CH2-gly)，4.0-4.8(15H，m)，6.8-7.6(20H，m)和8.18(1H，s，CHO)。MALDI m.s. 3291.17(M+Na+)，3309.02(M+K+)。16. 三NTA.TMSE9的合成 C85H174N8O21Si91897.121895.071711C53.8％ H9.2％ N5.9％ O17.7％ Si13.3％將Z-三NTA.TMSE9(0.1克，50微摩爾)溶解在甲醇(10毫升)中。加入披鈀木炭(10％)(約10毫克)并裝上含有氫氣的氣囊。在室溫下攪拌反應混合物90分鐘，這段時間之后TLC分析顯示起始物質已完全消失。反應混合物通過鐵鈣酸四鈣石的短塞過濾，減壓從反應混合物中除去所有的揮發物，得到三NTA.TMSE9的無色油狀物(0.09克，定量)。數據電噴霧M/Sm/z 1898.3(100％)(M+H+)17.生物素三NTA.TMSE9的合成 C95H188N10O23SSi92123.422121.149311C53.7％ H8.9％ N6.6％ O17.3％ S1.5％ Si11.9％將生物素(20毫克，0.08毫摩爾)、4-二甲氨基吡啶(12毫克，0.1毫摩爾)和三NTA.TMSE9(0.10克，0.1毫摩爾)加入到干燥、新蒸的二氯甲烷(5毫升)中，并將反應混合物冷至0℃。加入EDC(40毫克，0.2毫摩爾)，反應在0℃攪拌1小時，然后暖至室溫并在室溫下攪拌3天。減壓從反應混合物中除去所有揮發物，混合物用Sephadex LH-20柱以甲醇為洗脫液純化。合并含有在5％的甲醇/二氯甲烷中Rf＝0.1的斑點的部分。得到生物素三NTA.TMSE9的無色的油狀物(73毫克，0.03毫摩爾，34％)。數據電噴霧M/Sm/z 1173.9(100％)，2146.4(25％)(M+Na+)18.生物素三NTA的合成 C50H80N10O23S1221.291220.511851C49.2％ H6.6％ N11.5％ O30.1％ S2.6％在0℃下將三氟乙酸(2毫升)加入生物素三NTA TMSE9(19毫克，9微摩爾)中。在0℃下攪拌反應混合物3小時，然后減壓除去所有揮發物。通過在Vydac C18柱上的反相HPLC采用在40分鐘內自100％的溶劑A至含50％溶劑B的溶劑A梯度(溶劑A水/0.05％TFA；溶劑B乙腈/0.05％TFA)分析反應混合物，顯示保留時間Rt＝24.1分鐘的一個主峰。用反相制備HPLC分離反應混合物，得到生物素三NTA的白色固體(1.0毫克，0.8微摩爾，9％)。數據電噴霧M/Sm/z 1221.5(100％)(M+H+)，1243.4(33％)(M+Na+)19．脂質-三NTA的合成 C72H127N9O231486.841485.904482C58.2％ H8.6％ N8.5％ O24.7％在室溫下將二十四胺(100毫克)的二氯甲烷(5毫升)溶液加入到琥珀酸酐(120毫克)和三乙胺(40毫克)的二氯甲烷(5毫升)溶液中。反應攪拌過夜，真空除去溶劑，剩余物用二氯甲烷-甲醇( )進行色譜分離，得到60毫克二十四胺半琥珀酰胺。將該物質加入三NTA TMSE9的二氯甲烷(10毫升)溶液中，隨后加入DMAP(14毫克)。反應混合物冷至0℃，加入EDC(22毫克)，混合物在室溫下攪拌3天。然后除去溶劑，剩余物用SephadexLH-20柱純化，用甲醇洗脫，得到97毫克純物質。將10毫克該物質溶解在TFA(1毫升)中，在氮氣中攪拌3小時。真空除去溶劑，用水(1毫升)洗滌剩余的固體，真空干燥。該物質通過制備HPLC(C18 Alltime柱，含1％TFA的乙腈)純化，分離得到期望產物(4毫克)。數據電噴霧M/Sm/z 1486.6(100％)(M+H+)，1508.8(62％)(M+Na+).20.跨膜磷酸膽堿脂(MSL-PC)的合成 C124H220NO24PS2準確質量2202.52分子量2204.17C67.57； H10.06； N0.64； O17.42； P1.41； S2.91將MSL-OH3(895毫克，0.44毫摩爾)溶解在含有喹啉(0.12毫升，2.2當量，用磷酸鈉干燥，用前以鋅粉蒸餾)的氯仿(6毫升)中。室溫下將其緩慢加入新蒸的POCl3(0.09毫升，2.2當量)中。混合物在45℃下攪拌30分鐘。冷卻后加入溶解在干燥的吡啶(1毫升)中的甲苯磺酸膽堿(363毫克，1.3毫摩爾)，反應混合物在室溫下攪拌過夜。加入水(0.5毫升)，混合物另外攪拌1小時。向反應混合物中加入氯仿(50毫升)，然后用每部分40毫升的水(×2)、3％碳酸鉀(×2)、水(×2)、5％鹽酸(×2)及水(×2)依次洗滌。(注意由于每次洗滌都會形成乳濁液，因此相分離過程是相當費時的。為了改善該過程，加入甲醇是必須的。)合并有機相，并用磷酸鈉干燥。減壓除去溶劑，剩余物通過硅膠柱色譜純化[(洗脫液二氯甲烷∶丙酮∶甲醇∶氫氧化氨(8∶5∶5∶3))，得到122毫克無色蠟狀的物質。數據1H n.m.r.δ(CDCl3∶CD3OD(3∶1))0.82-0.92(m，30H，植烷基CH3)，0.92-1.80(m，100H，植烷基CH2和CH)，2.61(t，2H，CH2CH2S)，2.65(s，8H，琥珀酸H)，3.20(s，9H，-N(CH3)3)，3.35-3.74(m，44H，-OCH2，-OCH，CH2N)，3.85(s，2H，SCH2Ph)，3.92(t，2H，CH2OP)，4.10(m，2H，POCH2CH2)，4.20(m，8H，酯的H)，6.90和7.43(d，8H，聯苯基)，7.30(s，5H，PhCH2)。電噴霧M/Sm/z 2206(M+2)，1112，587，48821.二(N-甲基)-C38二胺的合成 準確質量1373.29分子量1374.31C78.66；H12.32；N2.04；O6.99向冷卻至0℃的溶解在THF(10毫升)中的勃拉兩親物C38二醇(bola-amphiphile C38-diol3)(300毫克)的THF(10毫升)溶液中加入三乙胺(92微升)和甲烷磺酰氯(51微升)。溶液在室溫下攪拌過夜，并用乙醚(30毫升)稀釋。有機相用飽和碳酸氫鈉(2×20毫升)和水(2×60毫升)洗滌，干燥(硫酸鈉)并真空濃縮。將得到的物質(315毫克)加入壓力管中，冷卻至-80℃，加入急冷的甲胺(12毫升)。封上耐壓管，并將混合物暖至室溫。在室溫下放置過夜后，蒸發掉過量的甲胺，將剩余物溶解在二氯甲烷中，與碳酸鉀一起攪拌。過濾除去固體，濾液真空干燥。剩余物用二氯甲烷-甲醇-氨( )進行色譜分離，得到242毫克純的產物。數據1H n.m.r.(CDCl3)δ0.80-0.95(30H，m，植烷基CH3)，0.95-1.70(100H，m，植烷基CH2和CH)，2.45(6H，s)，2.69(4H，m)，3.40-3.80(14H，m，CH-O和CH2-O)，3.98(4H，t，CH2OAr)，6.93，7.43(8H，AA′XX′多重峰，芳香-H)。22.XXFmoc的合成 C27H34N2O5準確質量466.25分子量466.57C69.50；H7.35；N6.00；O17.15在氮氣中用TFA(5毫升)處理2X-Boc(420毫克)20分鐘。減壓除去TFA，并在高真空下干燥。然后將該剩余物溶解在9％的碳酸鈉水溶液(6毫升)中，并將溶液冷卻至0℃。將溶解在DMF(3毫升)中的Fmoc-NMS酯(購自CALBIOCHEM)(420毫克)加入到上面的在0℃攪拌的溶液中，并在室溫下攪拌30分鐘。加入水(100毫升)，用乙酸乙酯(2×50毫升)萃取水溶液，棄去有機萃取液。水層用濃鹽酸(2-3毫升)酸化，并在冰浴中冷卻，其間出現沉淀。過濾該沉淀物并干燥，得到白色粉末(210毫克)。數據NMR(CDCl3)1.2-1.8(m，12H)，2.20(t，2H)，2.35(t，2H)，3.25(m，4H)，4.259m，1H)，4.40(m，1H)，5.05(m，1H)，5.53(m，1H)，6.65(m，1H)，7.3-7.5(m，4H)，7.6(d，2H)，7.25(d，2H)EI質譜483.9(M+Na+)23.C38(NCH3)2單BOC的合成 將C38二胺(320毫克)、BOC-ON(63毫克)、三乙胺(37毫克)、THF(3毫升)和水(2毫升)的混懸液在室溫下攪拌過夜。反應混合物用水(50毫升)稀釋，并用二氯甲烷(2×80毫升)萃取。合并有機萃取液，用鹽水(50毫升)洗滌，用硫酸鎂干燥，并減壓除去溶劑。粗產物用色譜純化(含5-7％甲醇的二氯甲烷)。得到粘稠液體狀的純物質(150毫克)。數據NMR(CDCl3)0.7-0.9(m，30H)，1.0-1.9(m，109H)，2.51(s，3H)，2.7(m，2H)，2.91(s，3H)，3.1-3.7(m，16H)，4.0(t，4H)，6.9(d，4H)，7.4(d，4H)ES質譜1474.9(M+，100％)24.Boc-C38-2X-Fmoc的合成 C122H208N4O12準確質量1921.58分子量1922.98C76.20；H10.90；N2.91；O9.98
將2X-Fmoc(47毫克)、DCC(35毫克)、DMAP(3毫克)、C38-單Boc(150毫克)和DCM(10毫升)的混合物在室溫下攪拌24小時。減壓除去溶劑，粗產物用柱色譜(含5％甲醇的二氯甲烷)純化，得到純產物(200毫克)。數據NMR(CDCl3)0.8-0.9(m，30H)，0.95-2.5(m，125H)，2.9，2.95，3.05(3xs，6H)，3.1-3.75(m，m，22H)，4.0(t，4H)，4.1-4.4(m，3H)，6.9(d，4H)，7.3-7.4(m，4H)，7.5(d，4H)，7.6(d，2H)，7.75(d，2H)ES質譜1923.3(M+)，1945.1(M+Na+)25.MSL-三-NTA的合成 將Fmoc保護的物質(200毫克)溶解在哌啶DMF(20∶80)的溶液中，在室溫下攪拌10分鐘。減壓除去DMF，以柱色譜(甲醇∶氨水∶DCm 10∶2∶88)純化粗產物。分離得到無色半固體狀的純產物(148毫克)。
將一部分該C38衍生物(210毫克)、三NTA衍生物(135毫克)、DCC(33毫克)和DMAP(3毫克)溶解在干燥的二氯甲烷(3毫升)中，在室溫下放置18小時。減壓除去溶劑，以柱色譜純化粗產物，得到無色粘稠液體狀的純物質(179毫克)。
將Boc和TMSE保護的物質(100毫克)溶解在TFA(2毫升)中，在室溫下攪拌4小時。減壓除去TFA，并在真空下干燥樣品。
分子式如下的二硫化物酸的合成已在其它地方4被報導。 通過在DCC(15毫克)和DMAP(2.6毫克)的存在下，將酸(50毫克)與NHS(8毫克)在二氯甲烷(3毫升)中反應4小時，并以甲醇為洗脫液用Sephadex LH-20柱純化，制備該物質的NHS酯。
將該活性酯在甲醇中與以上制備的完全脫保護的物質C38二胺-三NTA(100毫克)反應。室溫下攪拌16小時后，除去溶劑，粗物質以甲醇為洗脫液用Sephadex LH-20柱被部分純化。所獲得的物質用制備HPLC(C18 Alltima柱，含0.05％TFA的甲醇-二氯甲烷)進一步純化。26.6位組氨酸標記的蛋白與三NTA結合的動力學分析采用BIAcore技術進行結合的表面等離子體激光共振(SPR)分析。將商品化的J1芯片(BIAcore，烏普薩拉，瑞典)通過涂覆脂質層進行修飾。在一個超凈防護罩中，將BIAcore J1芯片拔出以暴露金表面。將含有1.2微摩爾/升MSL三NTA、24微摩爾/升MSLPC的乙醇溶液(100微升)直接分散在金上。在保溫1小時期間，每隔10-15分鐘加入乙醇以防止乙醇的完全蒸發。然后通過移液管量取10×100微升的乙醇洗滌金表面，并在超凈防護罩中風干。然后將芯片重新套上并用塑料薄膜(Parafilm)密封。
將該J1.三NTA芯片連接入BIAcore2000機器，在21℃用泵沖洗，流速為40微升/分鐘的HBS/EDTA流動緩沖液(50毫摩爾/升HEPES，300毫摩爾/升氯化鈉，50微摩爾/升EDTA，pH8.0)進行試驗。相對于對照流通池1(Fc1)，流通池2(Fc2)用作試驗池。因此，含有500微摩爾/升氯化鎳的流動緩沖液僅注入通過Fc2，然后用緩沖液洗滌Fc25分鐘。然后將感興趣的蛋白質(100-600納摩爾/升)注入(用KINJECT功能)，通過Fc1和Fc2 3-7分鐘，然后用解離相7-15分鐘。然后表面用含有350毫摩爾/升EDTA的流動緩沖液再生以除去氯化鎳，從而將6位組氨酸標記的蛋白質從三NTA分子中釋放出來。對各蛋白質，在所示濃度(
圖1，圖2)的范圍內重復步驟2-4。采用的陰性對照是與6位組氨酸標記的蛋白質。結果表明三NTA與6位組氨酸標記的蛋白質以高親和力結合(圖1，圖2)。6組氨酸核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶和6組氨酸CD40與三NTA結合的平衡常數分別是300皮摩爾/升和2.9納摩爾/升。在沒有Ni2+的存在下這些蛋白質不與三NTA結合，并且沒有用6位組氨酸標記的蛋白質也不與三NTA結合。
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本領域技術人員將會理解，在沒有背離如廣泛描述的本發明的實質和范圍的前提下，可以對如具體實施方案所示的本發明做多種變化或修改。因此在任何方面，這些實施方案都是說明性的而非限制性的。
權利要求
1.通式I的化合物Y-(Z)nI其中Y是分支部分，Z代表與金屬離子配位的多齒配體螯合劑；且n是至少為2的整數。
2.如權利要求1所述的化合物，其中n是2至9的整數。
3.如權利要求2所述的化合物，其中n至少是3。
4.如前述任一權利要求所述的化合物，其中n是4。
5.如前述任一權利要求所述的化合物，其中Z的給體原子是氮。
6.如權利要求5所述的化合物，其中Z是四齒配體。
7.如權利要求7所述的化合物，其中Z是NTA殘基。
8.如前述任一權利要求所述的化合物，其中Y提供至少三個部分，每個部分直接地共價連接于Z，或者通過任選的連接基團間接地連接于Z。
9.如前述任一權利要求所述的化合物，其中Y具有自低聚物或聚合物形成的主鏈。
10.如權利要求9所述的化合物，其中的主鏈是直鏈的。
11.如權利要求1-8中任一權利要求所述的化合物，其中Y選自由氨基多元醇、氨基酸、氨基多元羧酸、多元胺、多元酸和多羥基化合物組成的組。
12.如權利要求9所述的化合物，其中Z選自由肽和dendron組成的組。
13.如前述任一權利要求所述的化合物，具有分子式IIX-Y-(Z)nII其中Y、Z和n如前定義，X是分隔部分。
14.如權利要求13所述的化合物，其中X是親水的、疏水的或者具有疏水區和親水區。
15.如權利要求14所述的化合物，其中X是或者包含選自由取代或未取代的烷基組成的組的部分，任選地被一個或多個雜原子、低聚烯化氧、氨基酸序列、多肽、低聚酰胺、聚酰胺和脂質分隔。
16.如權利要求15所述的化合物，其中X選自由低聚乙二醇、氨基己酰低聚物和跨膜脂質(MSL)組成的組。
17.如權利要求13-16中任一權利要求所述的化合物，其中X包含親水區、疏水區。
18.如權利要求13-17中任一權利要求所述的化合物，其中Y是分支部分，它提供多個用以共價連接于Z的部分和一個用以共價連接于X的部分。
19.如權利要求18所述的化合物，其中Y選自由氨基多元醇、氨基酸、含有多個游離酸和/或胺部分的肽、多羥基化物質和含有易于被親核試劑取代的基團或者親核試劑易于加成其上的基團的化合物或它們的組合組成的組。
20.如權利要求19所述的化合物，其中Y選自由TRIS、bis-homotris、3，5-二氨基苯甲酸、5-氨基間苯二甲酸、 糖、dendron和α，β-不飽和酮組成的組。
21.如權利要求13-20中任一權利要求所述的化合物，具有分子式IIIW-X-Y-(Z)nIII其中X、Y、Z和n如前定義，W是允許連接于其它分子、連接于表面或者鑲嵌入膜中的基團。
22.如權利要求21所述的化合物，其中W包含選自胺官能團、羧酸官能團、醇官能團、鹵素官能團、硫醇、二硫化物、硅烷衍生物、可溶于膜的蛋白質、允許非共價連接的基團、離子載體或脂質基團的一個或多個官能團。
23.如權利要求22所述的化合物，其中W是短桿菌肽或生物素。
24.包含自組裝膜的生物傳感器，所述的膜包含多個如權利要求13-23中任一權利要求所述的分子式III的結合化合物，其中W是嵌入膜中的離子載體。
25.如權利要求24所述的生物傳感器，其中的離子載體是短桿菌肽。
26.如權利要求24或25所述的生物傳感器，其中的膜包含第二種多個分子式III的結合化合物，其中的W是嵌入膜中的雙親物。
27.如權利要求1-23中任一權利要求所述的化合物在金屬親和色譜中的用途。
28.包含如權利要求1-23中任一權利要求所述的化合物的金屬親和色譜柱。
全文摘要
本發明涉及分子式(III)的新的蛋白結合化合物:W－X－Y－(Z)
文檔編號C07B61/00GK1345301SQ00803375
公開日2002年4月17日 申請日期2000年2月8日 優先權日1999年2月8日
發明者殷萍, 克里斯托弗·約翰·伯恩斯, 馬修·彼得·威爾金森 申請人:澳大利亞膜和生物技術研究所, 悉尼大學