巖藻依聚糖及在糖化合物的制造中有用的微生物的制作方法

專利名稱：巖藻依聚糖及在糖化合物的制造中有用的微生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及糖類研究領(lǐng)域中有用的糖化合物、在該糖化合物的生產(chǎn)中有用的糖分解酶、以及在該糖化合物的制造中有用的Fucoidanobacter屬的細(xì)菌。
巖藻依聚糖是包含在褐藻類中的硫酸化多糖，已報(bào)道它具有抗血液凝固作用、澄清血脂作用、抗腫瘤作用、抑制癌轉(zhuǎn)移作用、抗愛(ài)滋病毒感染作用等各種各樣的生物活性，作為醫(yī)藥品是非常有用的物質(zhì)。
然而，巖藻依聚糖是分子量非常大的硫酸化多糖，直接用作醫(yī)藥品時(shí)在抗原性、均一性、抗凝血活性等方面存在問(wèn)題，所以常常需要將巖藻依聚糖分解到某種程度。
因此，人們期待著弄清巖藻依聚糖的構(gòu)造、闡明構(gòu)造與生物活性的關(guān)系，但是，巖藻依聚糖是個(gè)分支很多的高分子，構(gòu)成糖的種類也多，硫酸基也可以結(jié)合于各種各樣的位置，所以結(jié)構(gòu)解析非常困難。為了解析多糖的結(jié)構(gòu)，雖然有使分解多糖的酶作用，然后解析生成的寡糖的結(jié)構(gòu)的方法，但現(xiàn)在市場(chǎng)上還沒(méi)有報(bào)告中的在巖藻依聚糖分解酶中的分解生成物的糖鏈結(jié)構(gòu)已清楚的產(chǎn)物和成為巖藻依聚糖寡糖的標(biāo)準(zhǔn)品的物質(zhì)。
由于上述理由人們需要得到判明結(jié)構(gòu)的糖化合物、在該糖化合物生產(chǎn)中有用的糖分解酶、以及在該糖化合物制造中有用的微生物。
本發(fā)明的目的在于提供可以用于巖藻依聚糖的結(jié)構(gòu)解析、巖藻依聚糖的酶分解物的鑒定以及可以用于生物活性檢索的糖化合物、在巖藻依聚糖的部分分解以及巖藻依聚糖寡糖的生產(chǎn)等與巖藻依聚糖有關(guān)研究中有用的新的內(nèi)向(endo)型巖藻依聚糖分解酶、以及在糖化合物的制造中有用的新的微生物。
如果概述本發(fā)明，本發(fā)明的第一項(xiàng)發(fā)明涉及將下面通式(1)或(2)
(1) (2) [式中X代表H或用下式(3)(3) 代表的基團(tuán)，Y代表H或用下式(4)，或(5)(4)
(5) 表示的基團(tuán)，但是X和Y不能都是H；Z代表H或用下式(6)(6) 表示的基團(tuán)]代表的化合物中的至少一個(gè)醇式羥基進(jìn)行硫酸酯化形成的糖化合物或其鹽。
作為用通式(1)或(2)代表的化合物的例子，舉出下式(7)～(15)表示的化合物。
(7)
(8) (9)
(10) (11)
(12) (13)
(14) (15)
本發(fā)明的第二項(xiàng)發(fā)明涉及內(nèi)向型巖藻依聚糖分解酶，其特征是具有下面的理化性質(zhì)。(I)作用作用于巖藻依聚糖，至少可以使上述式(7)和式(8)表示的糖化合物游離出來(lái)。(II)最適pH該酶的最適pH是6～10。(III)最適溫度該酶的最適溫度是30～40℃。
本發(fā)明的第三項(xiàng)發(fā)明涉及在作為本發(fā)明的第一項(xiàng)發(fā)明的糖化合物的制造中有用的新的微生物，也就是在其電子傳遞鏈中有甲基萘醌、GC含量約為60％的屬于Fucoidanobacter屬的細(xì)菌。
本說(shuō)明書記載的式(1)、(2)、(4)～(15)、以及(17)～(25)中的“～”意味著在甘露糖、或半乳糖中存在著α、β兩種異頭物。
本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)如果使作為本發(fā)明的第二項(xiàng)發(fā)明的酶或本發(fā)明的第三項(xiàng)發(fā)明的細(xì)菌的菌體提取物或培養(yǎng)液上清作用于巖藻依聚糖，可以得到本發(fā)明的糖化合物，從而使本發(fā)明完成。
附圖的簡(jiǎn)單說(shuō)明

圖1是利用L-柱分離糖化合物(a)的吡啶基(2)-氨基化糖化合物(PA-a)時(shí)的洗脫圖。圖2是利用L-柱分離糖化合物(b)的吡啶基(2)-氨基化糖化合物(PA-b)時(shí)的洗脫圖。圖3是利用L-柱分離糖化合物(c)的吡啶基(2)-氨基化糖化合物(PA-c)時(shí)的洗脫圖。圖4是利用L-柱分離糖化合物(d)的吡啶基(2)-氨基化糖化合物(PA-d)時(shí)的洗脫圖。圖5是利用L-柱分離糖化合物(e)的吡啶基(2)-氨基化糖化合物(PA-e)時(shí)的洗脫圖。圖6是利用L-柱分離糖化合物(f)的吡啶基(2)-氨基化糖化合物(PA-f)時(shí)的洗脫圖。圖7是利用L-柱分離糖化合物(g)的吡啶基(2)-氨基化糖化合物(PA-g)時(shí)的洗脫圖。圖8是利用L-柱分離糖化合物(h)的吡啶基(2)-氨基化糖化合物(PA-h)時(shí)的洗脫圖。圖9是利用L-柱分離糖化合物(i)的吡啶基(2)-氨基化糖化合物(PA-i)時(shí)的洗脫圖。圖10是糖化合物(a)的質(zhì)譜分析(negative測(cè)定)圖。圖11是糖化合物(b)的質(zhì)譜分析(negative測(cè)定)圖。圖12是糖化合物(c)的質(zhì)譜分析(negative測(cè)定)圖。圖13是糖化合物(d)的質(zhì)譜分析(negative測(cè)定)圖。圖14是糖化合物(e)的質(zhì)譜分析(negative測(cè)定)圖。圖15是糖化合物(f)的質(zhì)譜分析(negative測(cè)定)圖。圖16是糖化合物(g)的質(zhì)譜分析(negative測(cè)定)圖。圖17是糖化合物(h)的質(zhì)譜分析(negative測(cè)定)圖。圖18是糖化合物(i)的質(zhì)譜分析(negative測(cè)定)圖。圖19是糖化合物(a)的mass-mass譜分析(negative測(cè)定)圖。圖20是糖化合物(b)的mass-mass譜分析(negative測(cè)定)圖。圖21是糖化合物(c)的mass-mass譜分析(negative測(cè)定)圖。圖22是糖化合物(d)的mass-mass譜分析(negative測(cè)定)圖。圖23是糖化合物(e)的mass-mass譜分析(negative測(cè)定)圖。圖24是糖化合物(f)的mass-mass譜分析(negative測(cè)定)圖。圖25是糖化合物(g)的mass-mass譜分析(negative測(cè)定)圖。圖26是糖化合物(h)的mass-mass譜分析(negative測(cè)定)圖。圖27是糖化合物(i)的mass-mass譜分析(negative測(cè)定)圖。圖28是糖化合物(a)的1H-NMR譜圖。圖29是糖化合物(b)的1H-NMR譜圖。圖30是糖化合物(c)的1H-NMR譜圖。圖31是糖化合物(d)的1H-NMR譜圖。圖32是糖化合物(e)的1H-NMR譜圖。圖33是糖化合物(f)的1H-NMR譜圖。圖34是糖化合物(g)的1H-NMR譜圖。圖35是糖化合物(h)的1H-NMR譜圖。圖36是糖化合物(i)的1H-NMR譜圖。圖37是表示作為本發(fā)明的第2項(xiàng)發(fā)明的酶的pH和相對(duì)活性(％)的關(guān)系圖。圖38是表示作為本發(fā)明的第2項(xiàng)發(fā)明的酶的反應(yīng)溫度(℃)和相對(duì)活性(％)的關(guān)系圖。圖39是表示對(duì)作為本發(fā)明的第2項(xiàng)發(fā)明的酶進(jìn)行處理的pH和殘余活性(％)的關(guān)系圖。圖40是表示對(duì)作為本發(fā)明的第2項(xiàng)發(fā)明的酶進(jìn)行處理的溫度和殘余活性(％)的關(guān)系圖。圖41是利用DEAE-Sepharose FF分離糖化合物(a)-(i)時(shí)的洗脫圖。圖42是利用DEAE-Sepharose FF分離糖化合物(h)和(i)時(shí)的洗脫圖。
以下，詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明。
本發(fā)明的第2項(xiàng)發(fā)明中使用的菌株只要是屬于黃桿菌(Flavobact-erium)屬的，具有生產(chǎn)內(nèi)向型巖藻依聚糖分解酶能力的菌株，無(wú)論哪種菌株都可以。舉一個(gè)具體的具有生產(chǎn)內(nèi)向型巖藻依聚糖分解酶能力的菌株，例如，F(xiàn)lavobacterium sp.SA-0082菌株。如果讓來(lái)自該菌株的內(nèi)向型巖藻依聚糖分解酶作用于巖藻依聚糖，可以得到作為本發(fā)明的第一項(xiàng)發(fā)明的糖化合物。
本菌株是本發(fā)明者從青森縣的海水中新發(fā)現(xiàn)的菌株，該菌株的菌學(xué)性質(zhì)如下。1、Flavobacterium sp.SA-0082菌株a、形態(tài)方面的性質(zhì)(1)本菌株是短桿菌。
寬0.8-1.0μm長(zhǎng)1.0-1.2μm(2)有無(wú)胞子無(wú)(3)革蘭氏染色 陰性b、生理方面的性質(zhì)
(1)生育的溫度范圍在37℃以下可以生育。最適生育溫度是15～28℃。
(2)對(duì)氧的嗜好 好氧型(3)過(guò)氧化氫酶 陽(yáng)性(4)氧化酶 陽(yáng)性(5)脲酶 弱陽(yáng)性(6)酸的生成D-葡萄糖 陽(yáng)性乳糖 陽(yáng)性麥芽糖 陽(yáng)性D-甘露醇 陽(yáng)性蔗糖 陰性海藻糖 陰性(7)水解淀粉 陰性明膠 陽(yáng)性酪蛋白 陰性七葉苷 陽(yáng)性(8)硝酸鹽的還原 陰性(9)吲哚的生成 陰性(10)硫化氫的生成 陰性(11)奶的凝固 陰性(12)鈉的需求性陽(yáng)性(13)鹽的需求性在0％食鹽培養(yǎng)基中的生育 陰性在1％食鹽培養(yǎng)基中的生育 陰性在海水培養(yǎng)基中的生育 陽(yáng)性(14)醌系甲基萘醌6(15)菌體內(nèi)DNA的GC含量32％(16)OF-測(cè)定0
(17)菌落顏色黃色(18)運(yùn)動(dòng)性 無(wú)(19)滑動(dòng)性 無(wú)本菌株被認(rèn)為是Bergey′s Manual of Systematic Bacteriology、第一卷(1984)，以及Bergey′s Manual of Determinative Bacteriology、第九卷(1994)記載的水生黃桿菌(Flavobacterium aquatile)、以及Flavobacterium meningosepticum的類緣細(xì)菌，但是，前者在消化葡萄糖后不形成酸方面，在不能分解酪蛋白方面，能夠分解七葉苷方面，可以使明膠液化方面，對(duì)脲酶顯陽(yáng)性方面是不同的。而后者在不能分解酪蛋白方面，在37℃下生育緩慢方面是不同的。因此，將本菌株鑒定為屬于Flavobacterium的細(xì)菌，命名為Flavobacterium sp.SA-0082。
上述菌株表示為Flavobacterium sp.SA-0082，以FERM BP-5402(原保藏日平成7年3月29日，向國(guó)際保藏單位的移管申請(qǐng)日平成8年2月15日)保藏于國(guó)立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所〖日本國(guó)茨城縣筑波市東1丁目1番3號(hào)(郵政編碼305)〗。
本發(fā)明的第2項(xiàng)發(fā)明中使用的菌株的培養(yǎng)基中加的營(yíng)養(yǎng)源只要是使用的菌株可以利用的、能夠生產(chǎn)內(nèi)向型巖藻依聚糖分解酶的培養(yǎng)基就可以，作為碳源，例如可以利用巖藻依聚糖、海藻粉末、藻酸、巖藻糖、葡萄糖、甘露醇、甘油糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、淀粉等，作為氮源可以利用酵母提取液、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米漿、肉湯、脫脂大豆、硫銨、氯化銨等比較合適。此外，也可以加入鈉鹽、磷酸鹽、鎂鹽、鋅鹽等無(wú)機(jī)物，以及金屬鹽類。
另外，本菌株在含有上述營(yíng)養(yǎng)源的海水或人工海水中也可以非常好地生育。
在培養(yǎng)內(nèi)向型巖藻依聚糖分解酶的生產(chǎn)菌時(shí)，產(chǎn)量隨培養(yǎng)條件變動(dòng)，但一般培養(yǎng)溫度為15～30℃、培養(yǎng)基的pH為5～9比較好，在5～72小時(shí)的通氣攪拌培養(yǎng)下，本發(fā)明的內(nèi)向型巖藻依聚糖分解酶的產(chǎn)量達(dá)到最高。當(dāng)然要根據(jù)使用的菌株、培養(yǎng)基的組成等來(lái)設(shè)定培養(yǎng)條件，使本發(fā)明的內(nèi)向型巖藻依聚糖分解酶的產(chǎn)量達(dá)到最高。
作為本發(fā)明的第2項(xiàng)發(fā)明的內(nèi)向型巖藻依聚糖分解酶既存在于菌體中也存在于培養(yǎng)物上清中。
在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)上述Flayobacterium sp.SA-0082菌株，收集該菌體，利用通常的破碎細(xì)胞的手段，例如通過(guò)超聲處理等破碎菌體得到無(wú)細(xì)胞提取液。
然后，利用通常使用的純化手段從該提取液中可以得到純化的酶制品。例如，利用鹽析、離子交換層析、疏水柱層析、凝膠過(guò)濾等進(jìn)行純化，可以得到不含其它的巖藻依聚糖分解酶的純化了的作為本發(fā)明的第2項(xiàng)發(fā)明的內(nèi)向型巖藻依聚糖分解酶。
另外，由于在從上述培養(yǎng)液除去菌體的上清中也存在大量的這種酶(菌體外酶)，所以，利用與菌體內(nèi)酶同樣的純化手段也可以純化。
作為本發(fā)明的第2項(xiàng)發(fā)明的內(nèi)向型巖藻依聚糖分解酶的化學(xué)以及物理化學(xué)性質(zhì)如下，菌體內(nèi)酶、菌體外酶除了分子量外都表示出同樣的性質(zhì)。(I)作用作用于巖藻依聚糖，至少可以使上述式(7)和式(8)表示的糖化合物游離出來(lái)。(II)最適pH該酶的最適pH是6～10(圖37)。即，圖37是表示該酶的pH和相對(duì)活性關(guān)系的圖。縱軸表示相對(duì)活性(％)，橫軸表示pH。(III)最適溫度該酶的最適溫度是30～40℃(圖38)。即，圖38是表示該酶的溫度和相對(duì)活性關(guān)系的圖?？v軸表示相對(duì)活性(％)，橫軸表示溫度℃。(IV)pH穩(wěn)定性該酶在pH6～11.5之間穩(wěn)定(圖39)。即，圖39是表示對(duì)該酶進(jìn)行處理的pH和殘余活性(％)的關(guān)系圖，縱軸表示殘余活性(％)，橫軸表示pH。(V)溫度穩(wěn)定性該酶大約在30℃以下穩(wěn)定(圖40)。即，圖40是表示該酶的處理溫度和殘余活性(％)的關(guān)系圖，縱軸表示殘余活性(％)，橫軸表示處理溫度℃。(VI)分子量利用Sephacryl S-200(Pharmacia)凝膠過(guò)濾法求該酶的分子量時(shí)，F(xiàn)lavobacterium sp.SA-0082菌株的菌體外酶的分子量大約是7萬(wàn)，菌體內(nèi)酶是大約是46萬(wàn)。(VII)酶活性的測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的第2項(xiàng)發(fā)明的內(nèi)向型巖藻依聚糖分解酶的酶活性的測(cè)定按如下方式進(jìn)行。
即，將2.5％的取自竹籃孔樣花紋海帶(kjellmaniella crassifolia)的巖藻依聚糖溶液50μl、10μl的本發(fā)明的第2項(xiàng)發(fā)明的內(nèi)向型巖藻依聚糖分解酶與含有60μl的667mM氯化鈉的83mM的磷酸緩沖液(pH7.5)混合攪拌，于230nm測(cè)定吸光度(AT)。作為對(duì)照，只用溶解本發(fā)明的酶的上述緩沖液代替作為本發(fā)明的第2項(xiàng)發(fā)明的內(nèi)向型巖藻依聚糖分解酶，利用同樣的條件使其反應(yīng)得到反應(yīng)產(chǎn)物，以及只使用水代替巖藻依聚糖溶液進(jìn)行反應(yīng)得到反應(yīng)產(chǎn)物，分別測(cè)定它們的吸光度(AB1和AB2)。
1單位的酶定義為于上述反應(yīng)體系中一分鐘使1μmol的甘露糖和糖醛酸之間的糖苷鍵切開的酶量。切開的鍵的定量以脫離反應(yīng)時(shí)生成的不飽和糖醛酸的毫摩爾分子吸光系數(shù)作為5.5來(lái)進(jìn)行計(jì)算。另外，酶的活性通過(guò)下式可以求得。
(AT-AB1-AB2)×2.105×120/5.5×105×0.01×180＝U/ml2.105測(cè)定吸光度的樣品液量(ml)。120酶反應(yīng)液的液量(μl)5.5不飽和糖醛酸在230nm的毫摩爾分子吸光系數(shù)(/mM)105稀釋用的反應(yīng)液液量(μl)0.01酶量(ml)180反應(yīng)時(shí)間(分)蛋白質(zhì)的定量是通過(guò)測(cè)定酶液在280nm的吸光度進(jìn)行的。此時(shí)，將1mg/ml的蛋白質(zhì)的吸光度作為1.0計(jì)算。
本發(fā)明者按如下所敘，確定了本發(fā)明的第2項(xiàng)發(fā)明的內(nèi)向型巖藻依聚糖分解酶的作用機(jī)制。(1)竹籃孔樣花紋海帶巖藻依聚糖的制備利用自由粉碎機(jī)M-2型(奈良機(jī)械制作所制)將干燥的竹籃孔樣花紋海帶粉碎，在10倍量的85％甲醇中于70℃處理2小時(shí)后，過(guò)濾，將殘?jiān)?0倍量的甲醇中于70℃處理2小時(shí)，過(guò)濾。向殘?jiān)屑尤?0倍量的水，于100℃處理3小時(shí)后，過(guò)濾，得提取液。將提取液的鹽濃度調(diào)到與400mM的氯化鈉溶液相同后，添加氯化十六(烷)基吡啶鎓直到不產(chǎn)生沉淀為止。用乙醇充分洗凈，完全除去氯化十六(烷)基吡啶鎓，利用限界過(guò)濾器(過(guò)濾膜的排阻分子量是10萬(wàn))(Amicon社制)脫鹽和除去低分子，通過(guò)離心分離除去生成的沉淀。將上清冷凍干燥得到精制的竹籃孔樣花紋海帶巖藻依聚糖。收率大約是干燥的竹籃孔樣花紋海帶粉末重量的4％。(2)利用內(nèi)向型巖藻依聚糖分解酶分解巖藻依聚糖以及分解物的純化使作為本發(fā)明的第2項(xiàng)發(fā)明的內(nèi)向型巖藻依聚糖分解酶作用于純化的竹籃孔樣花紋海帶巖藻依聚糖進(jìn)行分解物的大量制備。
即、將5％的竹籃孔樣花紋海帶巖藻依聚糖溶液600ml、100mM的磷酸緩沖液(pH8.0)750ml和4M的氯化鈉150ml以及1750mU/ml的本發(fā)明的內(nèi)向型巖藻依聚糖分解酶溶液3.43ml混合，于25℃反應(yīng)144小時(shí)。
用孔徑3500的透析膜對(duì)反應(yīng)液透析，收集分子量3500以下的級(jí)份。用Micro Acilyzer-G3(旭化成社制)脫鹽后，經(jīng)DEAE-Sepharose FF分成(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)和(i)9個(gè)級(jí)分。圖41給出了其洗脫圖。橫軸表示級(jí)分號(hào)，左邊的縱軸以及圖中的黑實(shí)心圓點(diǎn)用480nm的吸光度表示用酚硫酸法測(cè)定的糖含量，右邊的縱軸以及圖中的空心圓點(diǎn)用235nm的吸光度表示不飽和葡糖醛酸的含量，最右邊的縱軸以及圖中的虛線表示洗脫液中的醋酸銨濃度(M)。各個(gè)級(jí)分的級(jí)分號(hào)分別是，(a)42～43、(b)84～91、(c)51～52、(d)79、(e)102～103、(f)62～63、(g)45、(h)75、以及(i)77。
就級(jí)分(h)和(i)收集上述的級(jí)分64～78，利用DEAE-SepharoseFF進(jìn)行再純化。圖42給出了其洗脫圖。橫軸表示級(jí)分號(hào)，左邊的縱軸以及圖中的實(shí)心圓點(diǎn)用480nm的吸光度表示用酚硫酸法測(cè)定的糖含量，右邊的縱軸以及圖中的空心圓點(diǎn)用235nm的吸光度表示不飽和葡糖醛酸的含量，最右邊的縱軸以及圖中的虛線表示洗脫液中的醋酸銨濃度(M)。各個(gè)級(jí)分的級(jí)分號(hào)分別是(h)92～96、以及(i)99～103。(3)酶反應(yīng)生成物的結(jié)構(gòu)解析a、各級(jí)分均一性的確認(rèn)將上述的(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)和(i)9個(gè)級(jí)分各取一部分使用GlycoTAG和GlycoTAG ReagentKit(都是寶酒造社制)使其還原性末端進(jìn)行2-氨基吡啶化(PA化)，得到各個(gè)PA化糖(PA-a)、(PA-b)、(PA-c)、(PA-d)、(PA-e)、(PA-f)、(PA-g)、(PA-h)和(PA-i)。利用HPLC判明它們是否均一。
HPLC的條件如下。
裝置L-6200型(日立制作所制)柱子L-柱(4.6×250mm){(財(cái))化學(xué)藥品檢查協(xié)會(huì)}洗脫液對(duì)于前述式(7)、(8)、和(9)[(PA-a)、(PA-b)、(PA-c)]物質(zhì)，用50mM醋酸三乙基胺(pH5.5)對(duì)于前述式(10)、(12)、(13)、和(15)[(PA-d)、(PA-f)、(PA-g)、和(PA-i)]物質(zhì)，使用100mM醋酸三乙基胺(pH5)。
對(duì)于前述式(11)[(PA-e)]物質(zhì)，從0分鐘直到10分鐘用200mM醋酸三乙基胺(pH3.8)，從10分鐘直到60分鐘，200mM醋酸三乙基胺(pH3.8)和含有0.5％四氫呋喃的200mM醋酸三乙基胺(pH3.8)的比率由100∶0直線變化到20∶80。
對(duì)于前述式(14)[(PA-h)]物質(zhì)，從0分鐘直到60分鐘，200mM醋酸三乙基胺(pH3.8)和含有0.5％四氫呋喃的200mM醋酸三乙基胺(pH3.8)的比率由80∶20直線變化到50∶50。
檢測(cè)使用熒光檢測(cè)器F-1150(日立制作所制)，于激發(fā)波長(zhǎng)320nm、熒光波長(zhǎng)400nm下檢測(cè)。
流速1ml/分柱溫40℃b、酶反應(yīng)生成物的還原末端糖以及中性糖組成的分析各個(gè)PA化糖(PA-a)、(PA-b)、(PA-c)、(PA-d)、(PA-e)、(PA-f)、(PA-g)、(PA-h)和(PA-i)用4N的鹽酸于100℃水解3小時(shí)，通過(guò)HPLC檢測(cè)還原末端糖。
另外，使用GlycoTAG和GlycoTAG Reagent Kit(都是寶酒造社制)，使該水解物的還原末端PA化，利用HPLC研究中性糖組成。HPLC的條件如下。
裝置L-6200型(日立制作所制)柱子Palpak A型(4.6×150mm)(寶酒造社制)洗脫液700mM硼酸緩沖液(pH9.0)∶乙腈＝9∶1檢測(cè)使用熒光檢測(cè)器F-1150(日立制作所制)，于激發(fā)波長(zhǎng)310nm、熒光波長(zhǎng)380nm下檢測(cè)。
流速0.3ml/分柱溫65℃結(jié)果，(PA-a)、(PA-b)、(PA-c)、(PA-d)、(PA-e)、(PA-f)、和(PA-i)的還原末端糖都是甘露糖。而作為中性糖組成，(PA-a)、(PA-b)、(PA-c)、(PA-e)、(PA-f)、和(PA-i)含有等摩爾的甘露糖和巖藻糖，(PA-d)中的甘露糖和巖藻糖比率是2∶1。
(PA-g)以及(PA-h)的還原末端糖都是半乳糖，作為中性糖組成，(PA-g)中半乳糖和巖藻糖的比是1∶2，而(PA-h)中半乳糖和巖藻糖的比是2∶1。
另外，為了研究作為構(gòu)成糖之一的甘露糖的立體構(gòu)型，利用F-kit葡萄糖/果糖以及磷酸甘露糖異構(gòu)酶(都是Boehringer Mannheim-Yamanouchi制)，根據(jù)說(shuō)明書構(gòu)建可以只測(cè)定D-甘露糖的反應(yīng)系，用該反應(yīng)系測(cè)定用2N鹽酸于100℃，對(duì)各100μg的(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、和(i)水解3小時(shí)后被中和的產(chǎn)物。其結(jié)果因?yàn)閺?a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、和(i)中都檢測(cè)出D-甘露糖，所以判明(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、和(i)的構(gòu)成糖甘露糖都是D型的。
為了研究作為(g)以及(h)構(gòu)成糖之一的半乳糖的立體構(gòu)型，利用可以只能檢測(cè)出D型的半乳糖的F-試劑盒乳糖/半乳糖(BoehringerMannheim-Yamanouchi制)。即用這一試劑盒測(cè)定用2N鹽酸于100℃對(duì)各100μg的(g)以及(h)水解3小時(shí)后被中和的產(chǎn)物。其結(jié)果，因?yàn)閺?g)以及(h)檢測(cè)出半乳糖，所以判明(g)以及(h)的構(gòu)成糖半乳糖都是D型的。
另外另一種構(gòu)成糖巖藻糖的立體構(gòu)型按照Clinical Chemistry第36卷，第474-476頁(yè)(1990)記載的方法，用該反應(yīng)系測(cè)定用2N鹽酸于100℃，對(duì)各100μg的(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)和(i)水解3小時(shí)后被中和的產(chǎn)物。利用該反應(yīng)系不能檢測(cè)出D-巖藻糖，只能檢測(cè)出L-巖藻糖。結(jié)果從(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)和(i)中檢測(cè)出L-巖藻糖。
c、酶反應(yīng)生成物的分子量的分析使用API-III質(zhì)量分析器(Perkin-Elmer Science社制)，對(duì)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)和(i)進(jìn)行質(zhì)量分析，它們的分子量分別是564、724、1128、1062、1448、644、632、1358、和1288。(b)和(c)是由2價(jià)的陰離子形成主要的信號(hào)。(d)中可以檢測(cè)出1價(jià)的離子和帶有鈉的1價(jià)的離子和2價(jià)的離子。(e)中可以檢測(cè)出帶有4個(gè)鈉離子的2價(jià)的離子，帶有3個(gè)鈉離子的3價(jià)的離子，帶有1個(gè)鈉離子的4價(jià)的離子等。(f)中可以檢測(cè)出帶有2個(gè)鈉離子的1價(jià)的離子。(g)中可以檢測(cè)出1價(jià)的離子和結(jié)合了鈉的1價(jià)的離子和2價(jià)的離子。(h)中可以檢測(cè)出帶有4個(gè)、3個(gè)、2個(gè)、和1個(gè)鈉離子的、分別為1價(jià)、2價(jià)、3價(jià)、4價(jià)的離子等。(i)中2個(gè)硫酸基解離，可以檢測(cè)出帶有1個(gè)鈉離子的1價(jià)的離子以及獲得2個(gè)硫酸基的2價(jià)的離子。
另外，通過(guò)Negatived MS/MS的分析，(a)中可以檢測(cè)出一價(jià)的硫酸離子(分子量97)、由不飽和己糖醛酸得到水分子和氫離子的一價(jià)離子(分子量157)、由不飽和己糖醛酸得到氫離子的一價(jià)離子(分子量175)、從巖藻糖和硫酸結(jié)合的產(chǎn)物得到水分子和氫離子的一價(jià)離子(分子量225)、從巖藻糖和硫酸結(jié)合的產(chǎn)物得到氫離子的一價(jià)離子(分子量243)、由不飽和己糖醛酸和甘露糖結(jié)合的產(chǎn)物得到水分子和氫離子的一價(jià)離子(分子量319)、從巖藻糖、硫酸和甘露糖結(jié)合的產(chǎn)物得到氫離子的一價(jià)離子(分子量405)。
同樣，通過(guò)Negatived MS/MS的分析，(b)中可以檢測(cè)出一價(jià)的硫酸離子(分子量97)、由不飽和己糖醛酸得到氫離子的一價(jià)離子(分子量175)、從巖藻糖和硫酸結(jié)合的產(chǎn)物得到氫離子的一價(jià)離子(分子量243)、由不飽和己糖醛酸、巖藻糖、甘露糖和2個(gè)硫酸結(jié)合的產(chǎn)物得到2個(gè)氫離子的2價(jià)離子(分子量321)、從巖藻糖、硫酸和甘露糖結(jié)合的產(chǎn)物得到氫離子的一價(jià)離子(分子量405)、由不飽和己糖醛酸、甘露糖和硫酸結(jié)合的產(chǎn)物得到氫離子的一價(jià)離子(分子量417)。
同樣，通過(guò)Negatived MS/MS的分析，(c)中可以檢測(cè)出一價(jià)的硫酸離子(分子量97)、由不飽和己糖醛酸得到氫離子的一價(jià)離子(分子量175)、從巖藻糖和硫酸結(jié)合的產(chǎn)物得到水分子和氫離子的一價(jià)離子(分子量225)、從巖藻糖和硫酸結(jié)合的產(chǎn)物得到氫離子的一價(jià)離子(分子量243)、由不飽和己糖醛酸、甘露糖、巖藻糖和硫酸結(jié)合的產(chǎn)物得到2個(gè)氫離子的2價(jià)離子(分子量371)、從巖藻糖、硫酸和甘露糖結(jié)合的產(chǎn)物得到氫離子的一價(jià)離子(分子量405)、由不飽和己糖醛酸、甘露糖、巖藻糖、己糖醛酸和硫酸結(jié)合的產(chǎn)物得到水和氫離子的1價(jià)離子(分子量721)。
同樣，通過(guò)Negatived MS/MS的分析，從(d)的2價(jià)離子中可以檢測(cè)出一價(jià)的硫酸離子(分子量97)、由不飽和己糖醛酸得到氫離子的一價(jià)離子(分子量175)、從巖藻糖和硫酸結(jié)合的產(chǎn)物得到水分子和氫離子的一價(jià)離子(分子量225)、從巖藻糖和硫酸結(jié)合的產(chǎn)物得到氫離子的一價(jià)離子(分子量243)、從巖藻糖、硫酸和甘露糖結(jié)合的產(chǎn)物得到氫離子的一價(jià)離子(分子量405)、從(d)得到2個(gè)硫酸基、2個(gè)氫離子的2價(jià)離子(分子量450)、從(d)得到1個(gè)硫酸基2個(gè)氫離子的2價(jià)離子(分子量490)。
同樣，通過(guò)Negatived MS/MS的分析，從(e)中可以檢測(cè)出一價(jià)的硫酸離子(分子量97)、從巖藻糖和硫酸結(jié)合的產(chǎn)物得到水分子和氫離子的一價(jià)離子(分子量225)、從巖藻糖和硫酸結(jié)合的產(chǎn)物得到氫離子的一價(jià)離子(分子量243)、從巖藻糖和2分子的硫酸基以及鈉離子結(jié)合的產(chǎn)物得到2個(gè)氫離子的一價(jià)離子(分子量345)、從(e)得到2個(gè)硫酸基、帶有3個(gè)鈉離子和6個(gè)氫離子的3價(jià)離子(分子量450)、從(e)得到1個(gè)硫酸基、得到6個(gè)氫離子、帶有3個(gè)鈉離子的3價(jià)離子(分子量476)、由不飽和己糖醛酸、甘露糖、巖藻糖和硫酸結(jié)合的產(chǎn)物得到氫離子的1價(jià)離子(分子量563)、以及由不飽和己糖醛酸、甘露糖、巖藻糖和3分子硫酸結(jié)合的產(chǎn)物得到水分子和氫離子的1價(jià)離子(分子量705)。
同樣，通過(guò)Negatived MS/MS的分析，從(f)中可以檢測(cè)出一價(jià)的硫酸離子(分子量97)、從巖藻糖和硫酸結(jié)合的產(chǎn)物得到氫離子的一價(jià)離子(分子量243)、由不飽和己糖醛酸、甘露糖、硫酸和鈉結(jié)合的產(chǎn)物得到水和氫離子的1價(jià)離子(分子量421)。
同樣，通過(guò)Negatived MS/MS的分析，從(g)中可以檢測(cè)出從巖藻糖、硫酸和甘露糖結(jié)合的產(chǎn)物得到氫離子的一價(jià)離子(分子量405)、以及由2分子巖藻糖、1分子半乳糖和1分子硫酸基結(jié)合的產(chǎn)物得到氫離子的1價(jià)離子(分子量551)。
同樣，通過(guò)Negatived MS/MS的分析，可以從3分子鈉結(jié)合于(h)、并得到5分子氫離子的產(chǎn)物檢測(cè)出一價(jià)的硫酸離子(分子量97)、從巖藻糖和硫酸結(jié)合的產(chǎn)物得到水分子和氫離子的一價(jià)離子(分子量225)、以及由2分子巖藻糖、4分子半乳糖和3分子硫酸基結(jié)合的產(chǎn)物得到1分子氫離子的1價(jià)離子(分子量1197)。
同樣，通過(guò)Negatived MS/MS的分析，可以從由(i)得到2個(gè)硫酸基的2價(jià)離子中檢測(cè)出一價(jià)的硫酸離子(分子量97)、從巖藻糖、2分子硫酸和鈉結(jié)合的產(chǎn)物得到氫離子的一價(jià)離子(分子量345)。
d、酶反應(yīng)生成物的糖組成的分析從上述質(zhì)量分析的結(jié)果顯示出(a)、(b)、(c)、(d)、(f)和(i)在分子內(nèi)含有不飽和己糖醛酸的可能性極高。
為了證明酶反應(yīng)生成物的分子內(nèi)存在有不飽和鍵的己糖醛酸，進(jìn)行了如下的實(shí)驗(yàn)。如果分子內(nèi)存在有不飽和鍵，在230～240nm處應(yīng)有強(qiáng)的吸收。因此，測(cè)定純化的(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)和(i)的各個(gè)寡糖水溶液的230～240nm的吸收度，在(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)及(i)的水溶液中存在強(qiáng)的吸收，則表明分子內(nèi)存在有不飽和鍵。因?yàn)殡S著該酶對(duì)巖藻糖的分解反應(yīng)進(jìn)行的同時(shí)，230～240nm的吸收度的增加也被證實(shí)，所以，強(qiáng)烈地顯示出該酶通過(guò)脫離反應(yīng)切斷巖藻糖中的甘露糖和己糖醛酸之間或半乳糖和己糖醛酸之間的糖苷鍵。
幾乎所有的酶反應(yīng)生成物其非還原末端帶有不飽和的己糖醛酸，還原末端是甘露糖。由此表明在制備的巖藻依聚糖中存在著己糖醛酸和甘露糖交互并列的分子。
由于巖藻依聚糖的很多構(gòu)成糖是巖藻糖，所以巖藻依聚糖比一般的多糖更容易被酸水解。而己糖醛酸和甘露糖之間的結(jié)合鍵對(duì)酸是比較強(qiáng)的。本發(fā)明者為了弄清存在于竹籃孔樣花紋海帶巖藻依聚糖的分子內(nèi)的己糖醛酸和甘露糖交互結(jié)合的分子種類中的己糖醛酸的種類，參考CarbohydrateResearch第125卷，第283-290頁(yè)，1984年的方法，首先將巖藻依聚糖溶解于0.3M的硝酸中，于100℃處理3小時(shí)，然后對(duì)處理物進(jìn)行分子量分級(jí)，收集分子量在3000以上的級(jí)分，再利用陰離子交換樹脂收集吸附級(jí)分。將該物質(zhì)冷凍干燥后用4N的鹽酸進(jìn)行酸水解pH調(diào)整到8后，進(jìn)行PA化，利用HPLC進(jìn)行糖醛酸的分析。HPLC的條件如下。
裝置L-6200型(日立制作所制)柱子Palpak N型(4.6×250mm)(寶酒造社制)洗脫液200mM醋酸-三乙基胺緩沖液(pH7.3)∶乙腈＝25∶75檢測(cè)使用熒光檢測(cè)器F-1150(日立制作所制)，于激發(fā)波長(zhǎng)320nm、熒光波長(zhǎng)400nm下檢測(cè)。
流速0.8ml/分柱溫40℃而PA化的己糖醛酸的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中，葡糖醛酸是Sigma制，半乳糖醛酸是和光純藥社制，艾杜糖醛酸是Sigma制的4-methylumbelliferyl-α-L-iduronide的水解產(chǎn)物，甘露糖醛酸和葡糖醛酸是根據(jù)Acta chemicascandinavicaj(第15卷第1397-1398頁(yè)、1961年)記載的方法將和光純藥社制的藻酸水解后再將經(jīng)陰離子交換樹脂分離的產(chǎn)物PA化后得到的。
結(jié)果表明上述巖藻依聚糖的分子中含有的己糖醛酸只是葡糖醛酸。
利用陰離子交換樹脂將上述分子的水解物中的葡糖醛酸分離成D-甘露糖，冷凍干燥后測(cè)定其比旋度，判明呈現(xiàn)右旋的葡糖醛酸是D-葡糖醛酸。
另外，關(guān)于預(yù)先用本發(fā)明的第2項(xiàng)發(fā)明的內(nèi)向型巖藻依聚糖分解酶處理取自竹籃孔樣花紋海帶的巖藻依聚糖的產(chǎn)物雖然也和上述一樣用硝酸水解但檢測(cè)不出D-葡糖醛酸和甘露糖交互結(jié)合成的聚合物。由此判明本發(fā)明的酶通過(guò)脫離反應(yīng)切斷的巖藻依聚糖的分子的骨架構(gòu)造具有D-葡糖醛酸和甘露糖交互結(jié)合的構(gòu)造。
另外，為了研究D-葡糖醛酸和甘露糖各自的結(jié)合位置和糖苷鍵的異頭構(gòu)型，對(duì)通過(guò)硝酸水解得到的聚合物進(jìn)行了NMR分析。
聚合物的NMR分析結(jié)果如下。其中，在1H-NMR的化學(xué)位移值，是將三乙基胺的甲基的化學(xué)位移值表示為1.13ppm，在13C-NMR，其化學(xué)位移值表示為9.32ppm。
1H-NMR(D2O)δ5.25(1H，br-s，1-H)、4.32(1H，d，J＝7.6Hz，1′-H)、4.00(1H，br-s，2-H)、3.71(1H，m，5′-H)、3.69(1H，m，5-CH的H)、3.68(1H，m，3-H)、3.63(1H，m，5-CH的H)、3.63(1H，m，4′-H)3.57(1H，m，4-H)、3.54(1H，m，3′-H)、3.53(1H，m，5-H)、3.25(1H，t，J＝8.5Hz，2′-H)13C-NMR(D2O)δ175.3(5′-COOHのC)、102.5(1′-C)、99.6(1-C)、78.5(2-C)、77.9(4′-C)、77.0(3′-C)、76.7(5′-C)、73.9(5-C)、73.7(2′-C)、70.6(3-C)、67.4(4-C)、61.0(5-CH2OH的C)峰的歸屬號(hào)如下式(16)。 D-葡糖醛酸的1位的立體構(gòu)型從其連位結(jié)合常數(shù)(vicinal bingingconstant)為7.6Hz可以確定是β-D-葡糖醛酸。
而甘露糖的1位的立體構(gòu)型從其連位結(jié)合常數(shù)為5.25ppm可以確定是α-D-甘露糖。
構(gòu)成糖的結(jié)合形式利用異核1H檢測(cè)法HMBC確定。
1H-NMR的歸屬中使用DQF-COSY法和HOHAHA法，在13C-NMR的歸屬中使用HSQC法。
通過(guò)HMBC光譜，在1-H和4′-C之間以及4′-H和1-C之間、1′-H和2-C之間以及2-H和1′-C之間分別看到交叉峰。由此表明D-葡糖醛酸通過(guò)β鍵與D-甘露糖的2位結(jié)合D-甘露糖通過(guò)α鍵與D-葡糖醛酸的4位結(jié)合。
e、酶反應(yīng)生成物的的糖結(jié)合形式以及硫酸基的結(jié)合位置的分析為了研究構(gòu)成糖和硫酸基的結(jié)合形式，利用500MHz核磁共振裝置JNM-α500型(日本電子造)對(duì)酶反應(yīng)生成物進(jìn)行NMR光譜分析。從分析結(jié)果可以判明(a)是前式(7)表示的結(jié)構(gòu)，(b)是前式(8)表示的結(jié)構(gòu)，(c)是前式(9)表示的結(jié)構(gòu)，(d)是前式(10)表示的結(jié)構(gòu)，(e)是前式(11)表示的結(jié)構(gòu)，(f)是前式(12)表示的結(jié)構(gòu)，(g)是前式(13)表示的結(jié)構(gòu)，(h)是前式(14)表示的結(jié)構(gòu)，(i)是前式(15)表示的結(jié)構(gòu)。即，(a)是在作為還原末端殘基的D-甘露糖上結(jié)合了不飽和的D-葡糖醛酸和結(jié)合了結(jié)合有硫酸基的L-巖藻糖的結(jié)構(gòu)；(b)是在結(jié)合了硫酸基的還原末端殘基D-甘露糖上結(jié)合了結(jié)合有不飽和的D-葡糖醛酸和2個(gè)硫酸基的L-巖藻糖的結(jié)構(gòu)；(c)是在還原末端殘基D-甘露糖上結(jié)合了D-葡糖醛酸和結(jié)合有硫酸基的L-巖藻糖結(jié)構(gòu)，其D-葡糖醛酸結(jié)合了D-甘露糖，而該D-甘露糖又結(jié)合了結(jié)合有不飽和D-葡糖醛酸和硫酸基的L-巖藻糖；(d)是在還原末端殘基D-甘露糖上結(jié)合了結(jié)合有D-葡糖醛酸和2個(gè)硫酸基的L-巖藻糖的結(jié)構(gòu)，該D-葡糖醛酸結(jié)合了D-甘露糖，而該D-甘露糖又結(jié)合了不飽和D-葡糖醛酸；(e)是在還原末端殘基D-甘露糖上結(jié)合了結(jié)合有硫酸基、D-葡糖醛酸和2個(gè)硫酸基的L-巖藻糖，該D-葡糖醛酸結(jié)合了帶有硫酸基的D-甘露糖，而該D-甘露糖又結(jié)合了帶有2分子的硫酸基的L-巖藻糖和不飽和D-葡糖醛酸；(f)是在結(jié)合了硫酸基的還原末端殘基D-甘露糖上結(jié)合了結(jié)合有不飽和的D-葡糖醛酸和硫酸基的L-巖藻糖的結(jié)構(gòu)，(g)是在還原末端殘基D-半乳糖上結(jié)合了結(jié)合有硫酸基的L-巖藻糖結(jié)構(gòu)，而該L-巖藻糖又結(jié)合了結(jié)合有硫酸基的L-巖藻糖；(h)具有以結(jié)合了硫酸基的還原末端殘基D-半乳糖為起點(diǎn)分成2個(gè)鏈的結(jié)構(gòu)，其一條糖鏈?zhǔn)窃贒-半乳糖上結(jié)合帶有硫酸基的L-巖藻糖，在該L-巖藻糖上結(jié)合帶有硫酸基的L-巖藻糖，而另一條糖鏈?zhǔn)窃诮Y(jié)合了硫酸基的D-半乳糖上結(jié)合了帶有硫酸基的D-半乳糖的結(jié)構(gòu)；(i)是在還原末端殘基D-甘露糖上結(jié)合了結(jié)合有硫酸基、D-葡糖醛酸和硫酸基的L-巖藻糖結(jié)構(gòu)，該D-葡糖醛酸又結(jié)合了D-甘露糖，而該D-甘露糖又結(jié)合了帶有2分子的硫酸基的L-巖藻糖和不飽和的D-葡糖醛酸。
使本發(fā)明的第2項(xiàng)發(fā)明的內(nèi)向型巖藻依聚糖分解酶作用于巖藻依聚糖，得到包含在本發(fā)明的第1項(xiàng)發(fā)明的糖化合物中的化合物。
下面給出了用作為本發(fā)明的第1項(xiàng)發(fā)明的糖化合物的例子式(7)、(8)、(9)、(10)、(11)、(12)、(13)、(14)以及式(15)所表示的化合物的物理性質(zhì)，即(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)以及(i)的物理性質(zhì)。
圖1、2、3、4、5、6、7、8以及9中給出了各個(gè)吡啶(-2-)胺基化糖化合物(PA-a)、(PA-b)、(PA-c)、(PA-d)、(PA-e)、(PA-f)、(PA-g)、(PA-h)和(PA-i)的HPLC的洗脫圖，圖中縱軸表示相對(duì)熒光強(qiáng)度，橫軸表示保留時(shí)間(分)。而進(jìn)一步在圖10給出了(a)的、圖11給出了(b)的、圖12給出了(c)的、圖13給出了(d)的、圖14給出了(e)的、圖15給出了(f)的、圖16給出了(g)的、圖17給出了(h)的、圖18給出了(i)的質(zhì)譜圖，圖19給出了(a)、圖20給出了(b)、圖21給出了(c)、圖22給出了(d)、圖23給出了(e)、圖24給出了(f)、圖25給出了(g)、圖26給出了(h)、圖27給出了(i)的mass-mass譜圖，各圖中縱軸表示相對(duì)強(qiáng)度(％)，橫軸表示m/z值。
而圖28給出了(a)、圖29給出了(b)、圖30中給出了(c)、圖31給出了(d)、圖32給出了(e)、圖33給出了(f)、圖34給出了(g)、圖35給出了(h)、圖36給出了(i)的1H-NMR光譜，各圖中縱軸表示信號(hào)強(qiáng)度，橫軸表示化學(xué)位移值(ppm)。在1H-NMR中的化學(xué)位移值中，HOD的化學(xué)位移值表示為4.65ppm。
(a)的物理性質(zhì)分子量564MS m/z 563[M-H+]-MS/MS m/z 97[HSO4]-、157[不飽和的D-葡糖醛酸-H2O-H+]-、175[不飽和的D-葡糖醛酸-H+]-、225[L-巖藻糖硫酸-H2O-H+]-、243[L-巖藻糖硫酸-H+]-、319[不飽和D-葡糖醛酸和D-甘露糖結(jié)合的產(chǎn)物-H2O-H+]-、405[M-不飽和的D-葡糖醛酸-H+]-、483[M-SO3-H+]-1H-NMR(D2O)δ5.78(1H，d，J＝3.7Hz，4″-H)、5.26(1H，d，J＝1.2Hz，1-H)、5.12(1H，d，J＝4.0Hz，1′-H)、5.03(1H，d，J＝6.1Hz，1″-H)、4.47(1H，d-d，J＝3.4.10，4Hz，3′-H)、4.21(1H，br-s，2-H)、4.12(1H，m，5′-H)、4.10(1H，d-d，J＝3.7，5.8Hz，3″-H)、4.03((1H，d，J＝3.4Hz，4′-H)、3.86(1H，m，3-H)、3.83(1H，d-d，J＝4.0，10.4Hz，2′-H)、3.72(1H，m，4-H)、3.72(1H，m，5-H)、3.70(2H，m，5-CH2的H2)、3.65(1H，d-d，J＝5.8，6.1Hz，2″-H)、1.08(3H，d，J＝6.7Hz，5′-CH3的H3)糖組成L-巖藻糖∶不飽和的D-葡糖醛酸∶D-甘露糖＝1∶1∶1(各1分子)硫酸基1分子(L-巖藻糖的3位)而1H-NMR中的峰的歸屬序號(hào)如下式(17)。 (b)的物理性質(zhì)分子量724MS m/z 723[M-H+]-、361[M-2H+]2-MS/MS m/z 97[HSO4]-、175[不飽和的D-葡糖醛酸-H+]-、243[L-巖藻糖硫酸-H+]-、321[M-SO3-2H+]2-、405[M-不飽和的D-葡糖醛酸-2SO3-H+]-、417[M-L-巖藻糖-2SO3-H+]-1H-NMR(D2O)δ5.66(1H，d，J＝3.4Hz，4″-H)、5.27(1H，d，J＝7.3Hz，1″-H)、5.25(1H，d，J＝1.8Hz，1-H)、5.21(1H，d，J＝3.7Hz，1′-H)、4.50(1H，d，J＝3.1Hz，4′-H)、4.32(1H，q，J＝6.7Hz，5′-H)、4.27(1H，d-d，J＝3.7，10.4Hz，2′-H)、4.21(1H，d-d，J＝3.4，6.7Hz，3″-H)、4.18((1H，d-d，J＝1.8，11.0Hz，5-CH的H)、4.15(1H，br-s，2-H)、4.10(1H，d-d，J＝5.8，11.0Hz、5-CH的H)、3.99(1H，d-d，J＝3.1，10.4Hz、3′-H)、3.90(1H，m，5-H)、3.82(1H，m，3-H)、3.82(1H，m，4-H)、3.54(1H，br-t，J＝7.3Hz，2″-H)、1.11(3H，d，J＝6.7Hz，5′-CH3的H3)糖組成L-巖藻糖∶不飽和的D-葡糖醛酸∶D-甘露糖＝1∶1∶1(各1分子)硫酸基3分子(L-巖藻糖的2位和4位以及D-甘露糖的6位)而1H-NMR中的峰的歸屬號(hào)如下式(18)。 (c)的物理性質(zhì)分子量1128MSm/z1127[M-H+]-MS/MSm/z97[HSO4]-、175[不飽和的D-己糖醛酸-H+]-、225[L-巖藻糖硫酸-H2O-H+]-、243[L-巖藻糖硫酸-H+]-、371[M-不飽和的D-葡糖醛酸-L-巖藻糖-SO3-2H+]2-、405[硫酸化L-巖藻糖和D-甘露糖結(jié)合的產(chǎn)物-H+]-、721[M-D-甘露糖-L-巖藻糖-SO3-H2O-H+]-1H-NMR(D2O)δ5.69(1H，d，J＝3.7Hz，(4)″-H)、5.34(1H，s，(1)-H)、5.16(1H，s，1-H)、5.10(1H，d，J＝4.0Hz，(1)′-H)、5.05(1H，d，J＝3.7Hz、1′-H)、4.93(1H，d，J＝6.4Hz，(1)″-H)、4.50(1H，d-d，J＝3.4，10.7Hz、3′-H)、4.47(1H，d-d，J＝3.4，10.4Hz，(3)′-H)、4.39(1H，d，J＝7.9Hz，1″-H)、4.33(1H，br-s，(2)-H)、4.14(1H，m，2-H)、4.12(1H，m，(3)″-H)、4.12(1H，m，5′-H)、4.12(1H，m，(5)′-H)、4.04(1H，m，4′-H)、4.03(1H，m，(4)′-H)、3.85(1H，m，2′-H)、3.85(1H，m，(2)′-H)、3.82(1H，m，3-H)、3.82(1H，m，(3)-H)、3.73(1H，m，4-H)、3.73(1H，m，5-H)、3.73(1H，m，(4)-H)、3.70(2H，m，5-CH2的H2)、3.70(2H，m，(5)-CH2的H2)、3.67(1H，m，5″-H)、3.62(1H，m，4″-H)、3.62(1H，m，(2)″-H)、3.62(1H，m，(5)-H)、3.51(1H，t，J＝8.9Hz，3″-H)、3.28(1H，t，J＝7.9Hz，2″-H)、1.09(3H，d，J＝6.7Hz，(5)′-CH3的H3)、1.07(1H，d，J＝6.7Hz，5′-CH3的H3)糖組成L-巖藻糖∶不飽和的D-葡糖醛酸∶D-葡糖醛酸∶D-甘露糖＝2∶1∶1∶2(L-巖藻糖和D-甘露糖各2分子，不飽和的D-葡糖醛酸和D-葡糖醛酸各1分子)硫酸基2分子(每個(gè)L-巖藻糖的3位)而1H-NMR中的峰的歸屬序號(hào)如下式(19)。(19) (d)的物理性質(zhì)分子量1062MSm/z1061[M-H+]-MS/MSm/z97[HSO4]-、175[不飽和的己糖醛酸-H+]-、225[L-巖藻糖硫酸-H2O-H+]-、243[L-巖藻糖硫酸-H+]-、405[L-巖藻糖和D-甘露糖和硫酸基結(jié)合的產(chǎn)物-H+]-、450[M-2SO3-2H+]2-、490[M-SO3-2H+]2-1H-NMR(D2O)δ5.67(1H，d，J＝3.7Hz，(4)″-H)、5.32(1H，br-s，(1)-H)、5.17(1H，d，J＝3.5Hz，1′-H)、5.17(1H，br-s，1-H)、4.93(1H，d，J＝6.4Hz，(1)″-H)、4.71(1H，m，1″-H)、4.53(1H，d，J＝3.4Hz，4′-H)、4.33(1H，q，J＝6.7Hz，5′-H)、4.28(1H，d-d，J＝3.5，11.0Hz，2′-H)、4.18(1H，m，5-CH2的H)、4.13(1H，m，(2)-H)、4.12(1H，m，(3)″-H)、4.08(1H，m，5-CH2的H)、4.07(1H，m，2-H)、3.98(1H，d-d，J＝3.4，11.0，3′-H)、3.88(1H，m，5-H)、3.82(1H，m，4″-H)、3.78(1H，m，3-H)、3.78(1H，m，4-H)、3.78(1H，m，(3)-H)、3.67(2H，m，(5)-CH2的H2)、3.63(1H，m，(2)″-H)、3.60(1H，m，3″-H)、3.59(1H，m，5″-H)、3.57(1H，m，(4)-H)、3.57(1H，m，(5)-H)、3.16(1H，t，J＝7.9Hz，2″-H)、1.10(3H，d，J＝6.7Hz，5′-CH3的H3)糖組成L-巖藻糖∶不飽和的D-葡糖醛酸∶D-葡糖醛酸∶D-甘露糖＝1∶1∶1∶2(L-巖藻糖、不飽和的D-葡糖醛酸、D-葡糖醛酸各1分子，D-甘露糖2分子)硫酸基3分子(L-巖藻糖的2位和4位以及還原末端-側(cè)的D-甘露糖的6位)而1H-NMR中的峰的歸屬序號(hào)如下式(20)。 (e)的物理性質(zhì)分子量1448MSm/z767[M+Na-6H+]2-503.7[M+3Na-6H+]3-366.5[M+Na-5H+]4-MS/MS m/z97[HSO4]-、225[L-巖藻糖硫酸-H2O-H+]-、243[L-巖藻糖硫酸-H+]-、345[L-巖藻糖2硫酸+Na-2H+]、450[M+3Na-2SO3-6H+]3-、477[M+3Na-SO3-6H+]3-、563[不飽和的D-葡糖醛酸和D-甘露糖、L-巖藻糖和硫酸的結(jié)合產(chǎn)物-H+]-、705[不飽和的D-葡糖醛酸和D-甘露糖硫酸和L-巖藻糖2硫酸的結(jié)合產(chǎn)物-H2O-H+]1H-NMR(D2O)δ5.58(1H，d，J＝3.4Hz，(4)″-H)、5.35(1H，br-s，(1)-H)、5.22(1H，d，J＝6.7Hz，(1)″-H)、5.19(1H，d，J＝3.7Hz，1′-H)、5.19(1H，d，J＝3.7Hz，(1)′-H)、5.16(1H，d，J＝1.8Hz，1-H)、4.62(1H，d，J＝7.6Hz，1″-H)、4.50(1H，m，4′-H)、4.50(1H，m，(4)′-H)、4.30(1H，m，5-H)、4.30(1H，m，(5)′-H)，4.30(1H，m，(5)-CH2的H)、4.25(1H，m，2′-H)、4.25(1H，m，(2)-H)、4.25(1H，m，(2)′-H)、4.20(1H，m，(5)-CH2的H)、4.18(1H，m，5-CH2的H)、4.16(1H，m，(3)″-H)、4.08(1H，m，5-CH2的H)、4.07(1H，m，2-H)、4.02(1H，m，3′-H)、4.02(1H，m，(3)′-H)、3.85(1H，m，5-H)、3.85(1H，m，(5)-H)、3.78(1H，m，3-H)、3.78(1H，m，(3)-H)、3.76(1H，m，4″-H)、3.76(1H，m，5″-H)、3.75(1H，m，4-H)、3.75(1H，m，(4)-H)、3.58(1H，m，3″-H)、3.55(1H，m，(2)″-H)、3.18(1H，t，J＝8.2Hz，2″-H)、1.10(3H，d，J＝6.7Hz，(5)′-CH3的H3)、1.09(3H，d，J＝6.7Hz，5′-CH3的H3)糖組成L-巖藻糖∶不飽和的D-葡糖醛酸∶D-葡糖醛酸∶D-甘露糖＝2∶1∶1∶2(L-巖藻糖和D-甘露糖各2分子，不飽和的D-葡糖醛酸和D-葡糖醛酸各1分子)硫酸基6分子(每個(gè)L-巖藻糖的2位和4位以及每個(gè)D-甘露糖的6位)而1H-NMR中的峰的歸屬序號(hào)如下式(21)。
(21)
(f)的物理性質(zhì)分子量644MSm/z 687[M+2Na-3H+]-MS/MS m/z 97[HSO4]-、243[L-巖藻糖硫酸-H+]-、421[不飽和的D-葡糖醛酸和D-甘露糖硫酸+Na-H2O-2H+]-1H-NMR(D2O)δ5.60(1H，d，J＝3.4Hz，4″-H)、5.24(1H，br-s，1-H)、5.08(1H，d，J＝4.0Hz，1′-H)、4.94(1H，d，J＝6.7Hz，1″-H)、4.45(1H，d-d，J＝3.1，10.4Hz，3′-H)、4.20(1H，br-s，2-H)、4.14(2H，m，5-CH2的H2)、4.14(1H，m，5′-H)、4.09、(1H，m，3″-H)、4.01(1H，d，J＝3.1Hz，4′-H)、3.91(1H，m，5-H)、3.85(1H，m，3-H)、3.85(1H，m，2′-H)、3.75(1H，t，J＝9.8Hz，4-H)、3.59(1H，t，J＝6.7Hz，2″-H)、1.06(3H，d，J＝6，4Hz，5′-CH3的H3)糖組成L-巖藻糖∶不飽和的D-葡糖醛酸∶D-甘露糖＝1∶1∶1(L-巖藻糖、D-甘露糖、不飽和的D-葡糖醛酸各1分子)硫酸基2分子(L-巖藻糖的3位以及D-甘露糖的6位)而1H-NMR中的峰的歸屬序號(hào)如下式(22)。 (g)的物理性質(zhì)分子量632MSm/z631[M-H+]-MS/MS m/z 405[D-半乳糖和L-巖藻糖硫酸的結(jié)合產(chǎn)物-H+]-、551[L-巖藻糖硫酸和L-巖藻糖和D-半乳糖的結(jié)合產(chǎn)物-H+]-1H-NMR(D2O)δ5.15(1H，d，J＝4.3Hz，F(xiàn)11-H)、4.93(1H，d，J＝3.7Hz，F(xiàn)21-H)、4.53(1H，d-d，J＝2.4，10.4Hz，F(xiàn)13-H)、4.49(1H，d，J＝7.6HzG11-H)、4.46(1H，d-d，J＝3.1，10.7Hz，F(xiàn)23-H)、4.36(1H，q，J＝6.7HzF25-H)、4.14(1H，q，J＝6.7HzF15-H)、4.09(1H，d，J＝2.4HzF14-H)、4.03(1H，d，J＝3.1HzF24-H)、3.97(1H，d-d，J＝4.3，10.4Hz，F(xiàn)12-H)、3.90(1H，br-s，G14-H)、3.81(1H，d-d，J＝3.7，10.7Hz，F(xiàn)22-H)、3.59(1H，m，G13-H)、3.59(1H，m，G15-H)、3.59(2H，m，G15-CH2的H2)、3.56(1H，m，G12-H)、1.19(3H，d，J＝6.7Hz，F(xiàn)15-CH3的H3)、1.14(3H，d，J＝6.7Hz，F(xiàn)25-CH3的H3)糖組成L-巖藻糖∶D-半乳糖＝2∶1(L-巖藻糖2分子，D-半乳糖1分子)硫酸基2分子(每個(gè)L-巖藻糖的3位)而1H-NMR中的峰的歸屬序號(hào)如下式(23)。(23) (h)的物理性質(zhì)分子量1358MS m/z 1445[M+4Na-5H+]-MS/MS m/z 97[HSO4]-、225[L-巖藻糖硫酸-H2O-H+]-、1197[M-2SO3-H+]-1H-NMR(D2O)δ5.19(1H，d，J＝4.3Hz，F(xiàn)11-H)、4.93(1H，d，J＝3.7Hz，F(xiàn)21-H)、4.62(1H，m，G21-H)、4.59(1H，m，G11-H)、4.54(1H，d-d，J＝2.7，10.6Hz，F(xiàn)13-H)、4.46(1H，m，F(xiàn)23-H)、4.46(1H，d，J＝7.6HzG31-H)、4.41(1H，br-s，G14-H)、4.41(1H，d，J＝7.6Hz，G41-H)、4.37(1H，q，J＝6.4HzF25-H)、4.27(1H，m，G13-H)、4.24(1H，br-s，G34-H)、4.21(1H，m，G33-H)、4.19(1H，m，G43-H)、4.15(1H，br-s，G44-H)、4.13(1H，q，J＝6.7Hz，F(xiàn)15-H)、4.09(1H，d，J＝2.7Hz.F14-H)、4.04(1H，d，J＝2.8Hz，F(xiàn)24-H)、3.98(1H，m，G15-CH2的H)、3.96(1H，d-d，J＝4，3.10.6Hz，F(xiàn)12-H)、3.88(1-H，br-s，G24-H)、3.93(1H，m，G35-CH2的H)、3.86(1H，m，G15-H)、3.81(1H，m，F(xiàn)22-H)、3.81(1H，m，G15-CH2的H)、3.80(1H，m，G35-H)、3.80(1H，m，G35-CH2的H)、3.66(1H，m，G23-H)、3.65(1H，m，G12-H)、3.64(1H，m，G25-CH2的H)、3.64(1H，m，G45-CH2的H)、3.61(1H，m，G45-H)、3.58(1H，m，G22-H)、3.56(1H，m，G25-CH2的H)、3.56(1H，m，G45-CH2的H)、3.55(1H，m，G42-H)、3.54(1H，m，G25-H)、3.54(1H，m，G32-H)、1.20(3H，d，J＝6.7Hz，F(xiàn)15-CH3的H3)、1.14(3H，d，J＝6.4Hz，F(xiàn)25-CH3的H3)糖組成L-巖藻糖∶D-半乳糖＝1∶2(L-巖藻糖2分子，D-半乳糖4分子)硫酸基5分子(各L-巖藻糖的3位、還原性末端D-半乳糖的3位、以及結(jié)合于還原性末端D-半乳糖的6位的D-半乳糖的3位、以及結(jié)合于該D-半乳糖的6位的D-半乳糖的3位)而1H-NMR中的峰的歸屬序號(hào)如下式(24)。(24) (i)的物理性質(zhì)分子量1288MS m/z 1149[M+Na-2SO3-2H+]-MS/MS m/z 97[HSO4]-、345[L-巖藻糖2硫酸+Na-2H+]-、1H-NMR(D2O)δ5.68(1H，d，J＝3.4Hz，(4)″-H)、5.34(1H，br-s，(1)-H)，5.19(1H，m，1-H)、5.19(1H，m，(1)′-H)、4.94(1H，m，1′-H)，4.94(1H，d，J＝6.4Hz，(1)″-H)、4.72(1H，d，J＝7.9Hz、1″-H)、4.54(1H，m，(4)′-H)、4.48(1H，d-d，J＝3，3.10，6Hz，3′-H)、4.38(1H，q，J＝6.4Hz，5′-H)、4.34(1H，q，J＝6.7Hz，(5)′-H)、4.29(1H，m，(2)′-H)、4.20(1H，m，5-CH2的H)、4.14(1H，m，(2)-H)、4.13(1H，m，(3)″-H)、4.09(1H，m，5-CH2的H)、4.08(1H，m，2-H)、4.05(1H，d，J＝3.3Hz，4′-H)、3.99(1H，m，(3)′-H)、3.89(1H，m，5-H)、3.83(1H，m，4″-H)、3.81(1H，m，2′-H)、3.80(1H，m.4-H)、3.78(1H，m，3-H)、3.78(1H，m，(3)-H)、3.68(2H，m，(5)-CH2的H2)、3.62(1H，m，(2)″-H)、3.60(1H，m，3″-H)、3.60(1H，m，5″-H)、3.58(1H，m，(5)-H)、3.56(1H，m，(4)-H)、3.17(1H，t，J＝7.9Hz，2″-H)、1.15(3H.d，J＝6.4Hz，5′-CH3的H3)、1.11(3H，d，J＝6.7Hz，(5)′-CH3的H3)糖組成L-巖藻糖∶不飽和的D-葡糖醛酸∶D-葡糖醛酸∶D-甘露糖＝2∶1∶1∶2(L-巖藻糖和D-甘露糖各2分子，不飽和的D-葡糖醛酸和D-葡糖醛酸各1分子)硫酸基4分子(結(jié)合于還原性末端D-甘露糖的L-巖藻糖的3位、另一個(gè)L-巖藻糖的2位和4位以及還原性末端D-甘露糖的6位)而1H-NMR中的峰的歸屬序號(hào)如下式(25)。 另外，作為本發(fā)明的第一項(xiàng)發(fā)明糖化合物也可以通過(guò)使從作為本分明的第三項(xiàng)發(fā)明的屬于Fucoidanobacter屬的細(xì)菌得到的菌體提取物或培養(yǎng)上清作用于巖藻依聚糖來(lái)制造。
作為本分明的第三項(xiàng)發(fā)明的菌株只要是屬于Fucoidanobacter屬的本發(fā)明的菌株哪種都可以，舉一個(gè)具體的例子，例如Fucoidanobacter marinusSI-0098菌株。
該菌株是本發(fā)明者從青森縣的海水中新發(fā)現(xiàn)的菌株，它的細(xì)菌學(xué)的性質(zhì)如下。2、Fucoidanobacter marinus SI-0098a、形態(tài)方面的性質(zhì)(1)本菌株是球狀短桿菌，有時(shí)呈現(xiàn)雙球菌的形態(tài)。
寬0.5-0.7μm長(zhǎng)0.5-0.7μm(2)有無(wú)胞子無(wú)(3)革蘭氏染色 陰性b、生理方面的性質(zhì)(1)生育的溫度范圍在37℃可以生育。最適生育溫度是15～28℃。
(2)對(duì)氧的嗜好 好氧型
(3)對(duì)過(guò)氧化氫酶 陽(yáng)性(4)對(duì)氧化酶 陰性(5)對(duì)脲酶陰性(6)水解淀粉 陽(yáng)性明膠 陰性酪蛋白陰性七葉苷陽(yáng)性(7)硝酸鹽的還原 陰性(8)吲哚的生成陰性(9)硫化氫的生成 陽(yáng)性(10)奶的凝固 陰性(11)鈉的需求性 陽(yáng)性(12)鹽的需求性在0％食鹽培養(yǎng)基中的生育 陰性在1％食鹽培養(yǎng)基中的生育 陰性在海水培養(yǎng)基中的生育 陽(yáng)性(13)醌系甲基萘醌7(14)菌體內(nèi)DNA的GC含量61％(15)細(xì)胞壁的二氨基庚二酸 陰性(16)羥乙?；囼?yàn)陰性(17)羥基脂肪酸的存在 陽(yáng)性(18)OF-測(cè)定0(19)菌落顏色 沒(méi)有生成有特征的菌落色素(20)運(yùn)動(dòng)性有(21)滑動(dòng)性無(wú)(22)鞭毛極單毛本菌株按照Bergey′s Manual of determinative bacteriology，第9卷(1994)記載的基本分類被分為第4類(革蘭氏陰性好氧性桿菌和球菌)。然而，本菌株在電子傳遞鏈中有甲基萘醌類7，GC含量為61％等方面與屬于第4類的菌有很大的不同?；旧细锾m氏陰性菌在電子傳遞鏈上有泛醌，而革蘭氏陽(yáng)性菌有甲基萘醌類。
雖然作為革蘭氏陰性菌的Flavobacterium屬以及Cytophaga屬例外地在電子傳遞鏈上有甲基萘醌類，但屬于這些屬的細(xì)菌的GC含量，作為土壤細(xì)菌Cytophaga arvensicola為43～46％，作為海洋細(xì)菌的Cytophagadiffluens、Cytophaga fermentans、Cytophaga marina、以及Cytophagauliginosa是42％，與本菌株的性質(zhì)完全不同。比較本菌株和已鑒定的菌株的16rDNA序列的相同性，即使在相同性最高的已鑒定的菌株Verrucom-icrobium spinosum其相同性也只是76.6％。16SrDNA序列的相同性在90％以下時(shí)，一般都認(rèn)為兩個(gè)細(xì)菌的屬是不同的，本發(fā)明者斷定本菌株是不屬于已知屬的新屬的細(xì)菌，由此本菌株被命名為Fucoidanobacter marinusS1-0098。
而上述菌株被表示為Fucoidanobacter marinus SI-0098，以FERM BP-5403(原保藏日平成7年3月29日，向國(guó)際保藏單位的移管申請(qǐng)日平成8年2月15日)保藏于國(guó)立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所〖收件人日本國(guó)茨城縣筑波市東1丁目1番3號(hào)(郵政編碼305)〗。
培養(yǎng)作為本分明的第三項(xiàng)發(fā)明的屬于Fucoidanobacter屬的細(xì)菌，通過(guò)使該菌體提取物或培養(yǎng)液上清作用于巖藻依聚糖，可以使本發(fā)明的第一項(xiàng)發(fā)明的糖化合物游離出來(lái)。作為培養(yǎng)的菌株只要是屬于Fucoidanobacter屬的，通過(guò)使其菌體提取物或培養(yǎng)液上清作用于巖藻依聚糖，可以得到本發(fā)明的第一項(xiàng)發(fā)明的糖化合物的菌株，無(wú)論哪種都可以，舉個(gè)具體的例子，如Fucoidanobacter marinus SI-0098菌株。
向Fucoidanobacter屬的細(xì)菌的培養(yǎng)基中加的營(yíng)養(yǎng)源只要是該菌株能利用的、能夠使該菌株由巖藻依聚糖生產(chǎn)可能生成作為本發(fā)明的第一項(xiàng)發(fā)明的糖化合物的菌體提取物以及培養(yǎng)上清的營(yíng)養(yǎng)源都可以。作為碳源，例如可以利用巖藻依聚糖、海藻粉末、藻酸、巖藻糖、葡萄糖、甘露醇、甘油糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、淀粉等，作為氮源，酵母提取液、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米漿、肉湯、脫脂大豆、硫銨、氯化銨等比較合適。此外，也可以加入鈉鹽、磷酸鹽、鉀鹽、鎂鹽、鋅鹽等無(wú)機(jī)物，以及金屬鹽類。
另外，本菌株在含有上述營(yíng)養(yǎng)源的海水或人工海水中也可以非常好地生育。
在培養(yǎng)作為本發(fā)明的第三項(xiàng)發(fā)明的屬于Fucoidanobacter屬的細(xì)菌時(shí)，一般培養(yǎng)溫度為15～30℃、培養(yǎng)基的pH為5～9比較好，在5～72小時(shí)的通氣攪拌培養(yǎng)下，該菌體提取物以及培養(yǎng)上清的內(nèi)向型巖藻依聚糖分解酶的活性達(dá)到最高。根據(jù)使用的菌株、培養(yǎng)基的組成等設(shè)定培養(yǎng)條件，使該菌株生產(chǎn)的菌體提取物以及培養(yǎng)上清的內(nèi)向型巖藻依聚糖分解活性達(dá)到最高。
在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)屬于Fucoidanobacter屬的SI-0098菌株，培養(yǎng)結(jié)束后如果離心可得到該菌體和培養(yǎng)上清，再利用通常的破碎細(xì)胞的手段，例如通過(guò)超聲處理等破碎菌體，然后離心，可得到菌體提取液。
將通過(guò)限界過(guò)濾濃縮的培養(yǎng)液上清或菌體提取液與含有氯化鈉的磷酸緩沖液混合，再加入巖藻依聚糖，使其反應(yīng)。
反應(yīng)結(jié)束后，利用分子量分級(jí)用的柱子將反應(yīng)液分級(jí)，可以得到作為本發(fā)明的第一項(xiàng)發(fā)明的糖化合物。
作為本發(fā)明的第一項(xiàng)發(fā)明的糖化合物可以用作糖鏈工程用試劑，如果按照特公平5-65108號(hào)記載的方法進(jìn)行PA化，制備PA化物，則可以提供作為糖鏈工程用試劑的非常有用的物質(zhì)。預(yù)料本發(fā)明的糖化合物具有作為抗癌劑、癌轉(zhuǎn)移抑制劑、抗病毒劑的生理活性。
以下，用實(shí)施例給出了作為本發(fā)明的第一項(xiàng)發(fā)明的糖化合物的制造方法，但本發(fā)明并不限于以下的實(shí)施例的范圍。實(shí)施例1將Flavobacterium sp.SA-0082(FERM BP-5402)接種于分注入由葡萄糖0.1％、胨1.0％、含有酵母提取液0.05％的人工海水(JamarinLaboratory制)pH7.5組成的培養(yǎng)基600ml的、經(jīng)過(guò)滅菌(120℃，20分鐘)的2升的三角燒瓶里，24℃下培養(yǎng)20小時(shí)后作為種子培養(yǎng)液。將取自竹籃孔樣花紋海帶的巖藻依聚糖0.3％、胨0.5％、酵母提取液0.01％、以及含有消泡劑(信越化學(xué)工業(yè)制KM70)0.01％的人工海水(JamarinLaboratory制)pH7.5組成的培養(yǎng)基20升加入30升的發(fā)酵罐里，于120℃，滅菌20分鐘。冷卻后接種上述的種子培養(yǎng)液600ml，24℃下，在每1分鐘10升的通氣量和每分鐘125轉(zhuǎn)的攪拌速度的條件下培養(yǎng)20小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，將培養(yǎng)液離心分離得到菌體和培養(yǎng)液上清。
利用限界過(guò)濾(過(guò)濾膜的排阻分子量為1萬(wàn)，Amicon制)將培養(yǎng)液上清濃縮，測(cè)定本發(fā)明內(nèi)向型巖藻依聚糖分解酶時(shí)可以檢測(cè)出6mU/ml的活性。
另外，將這次培養(yǎng)得到的菌體懸浮于含有200mM的食鹽的20mM的醋酸-磷酸緩沖液(pH7.5)中，超聲破碎后，離心分離得到菌體提取液。測(cè)定菌體提取液中的本發(fā)明內(nèi)向型巖藻依聚糖分解酶的活性，為20mU/ml。
向上述的培養(yǎng)液上清的濃縮液中加入硫酸銨至終濃度達(dá)90％的飽和度，攪拌溶解后離心分離，將沉淀與上述菌體提取液同樣懸浮于緩沖液里，用含有50mM的食鹽的20mM的醋酸-磷酸緩沖液(pH7.5)充分透析。通過(guò)離心分離去除透析產(chǎn)生的沉淀后，讓樣品吸附于預(yù)先用含有50mM的食鹽的20mM的醋酸-磷酸緩沖液(pH7.5)平衡好的DEAE-sepharose FF柱，用相同的緩沖液充分洗凈吸附物，利用50mM至600mM的食鹽梯度將吸附物洗脫出，收集活性級(jí)分。然后向該活性級(jí)分中加入食鹽使它的終濃度達(dá)到4M后，使它吸附于預(yù)先用含有4M的食鹽的20mM的磷酸緩沖液(pH8)平衡好的Phenyl Sepharose CL-4B柱，用相同的緩沖液充分洗凈吸附物，利用4M至1M的食鹽梯度將吸附物洗脫出，收集活性級(jí)分。利用限界過(guò)濾器(Amicon制)將該活性級(jí)分濃縮后，利用預(yù)先用含有50mM的食鹽的10mM的磷酸緩沖液平衡好的Sephacryl S-200柱進(jìn)行凝膠過(guò)濾，收集活性級(jí)分。然后向該活性級(jí)分中加入食鹽使它的終濃度達(dá)到3.5M后，使它吸附于預(yù)先用含有3.5M的食鹽的10mM的磷酸緩沖液(pH8)平衡好的PhenylSepharose HP柱，用相同的緩沖液充分洗凈吸附物，利用3.5M至1.5M的食鹽梯度將吸附物洗脫出，收集活性級(jí)分，得到純化的酶。從SephacrylS-200的保留時(shí)間可以求出該酶的分子量約為7萬(wàn)。表1給出了以上的純化過(guò)程。
表1
實(shí)施例2將F1avobacterium sp.SA-0082(FERM BP-5402)接種于分注入由葡萄糖0.25％、胨1.0％、含有酵母提取液0.05％的人工海水(JamarinLaboratory制)pH7.5組成的培養(yǎng)基600ml的、經(jīng)過(guò)滅菌(120℃，20分鐘)的2升的三角燒瓶里，24℃下培養(yǎng)24小時(shí)后作為種子培養(yǎng)液。將由葡萄糖0.25％、胨1％、酵母提取液0.05％、以及含有消泡劑(信越化學(xué)工業(yè)制KM70)0.01％的人工海水(Jamarin Laboratory制)pH7.5組成的培養(yǎng)基20升加入30升的發(fā)酵罐里，于120℃，滅菌20分鐘。冷卻后接種上述的種子培養(yǎng)液600ml，24℃下，在每1分鐘10升的通氣量和每分鐘125轉(zhuǎn)的攪拌速度的條件下培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，將培養(yǎng)液離心分離得到菌體和培養(yǎng)液上清。
利用限界過(guò)濾(過(guò)濾膜的排阻分子量為1萬(wàn)，Amicon制)將培養(yǎng)液上清濃縮，測(cè)定本發(fā)明內(nèi)向型巖藻依聚糖分解酶時(shí)可以檢測(cè)出1mU/ml的活性。
另外，將這次培養(yǎng)得到的菌體懸浮于含有200mM的食鹽的20mM的醋酸-磷酸緩沖液(pH7.5)中，超聲破碎后，離心得到菌體提取液。測(cè)定菌體提取液中的本發(fā)明內(nèi)向型巖藻依聚糖分解酶時(shí)可以檢測(cè)出5mU/ml的活性。
向該提取液中加入硫酸銨至終濃度達(dá)90％的飽和度，攪拌溶解后離心分離，將沉淀與上述菌體提取液同樣懸浮于緩沖液里，用含有50mM食鹽的20mM的醋酸-磷酸緩沖液(pH7.5)充分透析。通過(guò)離心去除透析產(chǎn)生的沉淀后，讓樣品吸附于預(yù)先用含有50mM的食鹽的20mM的醋酸-磷酸緩沖液(pH7.5)平衡好的DEAE-sepharose FF柱，用相同的緩沖液充分洗凈吸附物，利用50mM至600mM的食鹽梯度將吸附物洗脫出，收集活性級(jí)分。然后向該活性級(jí)分中加入食鹽使它的終濃度達(dá)到4M后，使它吸附于預(yù)先用含有4M食鹽的20mM的磷酸緩沖液(pH8)平衡好的Phenyl Sepharose CL-4B柱，用相同的緩沖液充分洗凈吸附物，利用4M至1M的食鹽梯度將吸附物洗脫出，收集活性級(jí)分。利用限界過(guò)濾器(Amicon制)將該活性級(jí)分濃縮后，利用預(yù)先用含有50mM食鹽的10mM的磷酸緩沖液平衡好的SephacrylS-300進(jìn)行凝膠過(guò)濾，收集活性級(jí)分。從Sephacryl S-300的保留時(shí)間可以求出該酶的分子量約為46萬(wàn)。用含有25mM食鹽的10mM的磷酸緩沖液(pH7)對(duì)該活性級(jí)分透析。將該酶液吸附于預(yù)先用含有250mM食鹽的10mM的磷酸緩沖液(pH7)平衡好的Mono Q HR5/5柱，用相同的緩沖液充分洗凈吸附物，利用250mM至450mM的食鹽梯度將吸附物洗脫出，收集活性級(jí)分，得到純化的酶。表2給出了以上的純化過(guò)程。
表2
實(shí)施例3使本發(fā)明的實(shí)施例1得到的內(nèi)向型巖藻依聚糖分解酶(菌體內(nèi)酶)作用于純化的取自竹籃孔樣花紋海帶的巖藻依聚糖，進(jìn)行分解物的制備。
即，將2.5％的巖藻依聚糖溶液16ml、50mM的磷酸緩沖液(pH7.5)12ml、4M的氯化鈉4ml和32mU/ml的本發(fā)明的內(nèi)向型巖藻依聚糖分解酶溶液8ml混合，25℃，反應(yīng)48小時(shí)。
反應(yīng)液經(jīng)Cellulofine GCL-300柱(生化學(xué)工業(yè)社制)進(jìn)行分子量分級(jí)，收集分子量2000以下的級(jí)分。該級(jí)分經(jīng)Micro Acilyzer G3(旭化成社制)脫鹽后，再經(jīng)DEAE-Sepharose FF分成3個(gè)級(jí)分。結(jié)果得到上述物質(zhì)(a)、(b)、(c)的量分別為41mg、69mg、以及9.6mg。實(shí)施例4使本發(fā)明的實(shí)施例2得到的內(nèi)向型巖藻依聚糖分解酶(菌體外酶)作用于純化的取自竹籃孔樣花紋海帶的巖藻依聚糖，進(jìn)行分解物的制備。
即，將2.5％的巖藻依聚糖溶液16ml、50mM的磷酸緩沖液(pH7.5)1 2ml、4M的氯化鈉4ml和32mU/ml的本發(fā)明的內(nèi)向型巖藻依聚糖分解酶溶液8ml混合，25℃，反應(yīng)48小時(shí)。
反應(yīng)液經(jīng)Cellulofine GCL-300柱(生化學(xué)工業(yè)社制)進(jìn)行分子量分級(jí)，收集分子量2000以下的級(jí)分。該級(jí)分經(jīng)Micro Acilyzer G3(旭化成社制)脫鹽后，再經(jīng)DEAE-Sepharose FF分成3個(gè)級(jí)分，冷凍于燥。結(jié)果得到上述物質(zhì)(a)、(b)、(c)的量分別為40mg、65mg、以及9.2mg。實(shí)施例5將由得自竹籃孔樣花紋海帶的巖藻依聚糖0.3％、胨0.5％、酵母提取液0.05％、以及含有消泡劑(信越化學(xué)工業(yè)制KM70)0.01％的人工海水(Jamarin Laboratory制)pH7.5組成的培養(yǎng)基600ml加入到三角燒瓶里，滅菌(120℃，20分鐘)，然后將Fucoidanobacter marinus SI-0098(FERM BP-5403)接種于該培養(yǎng)基中，25℃下，在每分鐘120轉(zhuǎn)的攪拌速度的條件下培養(yǎng)48小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，將培養(yǎng)液離心分離得到菌體和培養(yǎng)液上清。
利用限界過(guò)濾(過(guò)濾膜的排阻分子量為1萬(wàn)，Amicon制)將培養(yǎng)液上清濃縮，測(cè)定本發(fā)明內(nèi)向型巖藻依聚糖分解酶時(shí)可以檢測(cè)出0.2mU/ml的活性。
另外，將這次培養(yǎng)得到的菌體懸浮于含有200mM食鹽的20mM的醋酸-磷酸緩沖液(pH7.5)中，超聲破碎后，離心得到菌體提取液。測(cè)定菌體提取液中的本發(fā)明內(nèi)向型巖藻依聚糖分解酶時(shí)可以檢測(cè)出20mU/ml的活性。實(shí)施例6使本發(fā)明的實(shí)施例5得到的Fucoidanobacter marinus SI-0098菌株的菌體內(nèi)酶作用于純化的取自竹籃孔樣花紋海帶的巖藻依聚糖，進(jìn)行分解物的制備。
即，將2.5％的巖藻依聚糖溶液16ml、含有800mM氯化鈉的100mM的磷酸緩沖液(pH8)20ml和20mU/ml的本發(fā)明的實(shí)施例5得到的Fucoid-anobacter marinus SI-0098菌株的菌體內(nèi)酶溶液4ml混合，5℃，反應(yīng)48小時(shí)。
反應(yīng)液經(jīng)Cellulofine GCL-300柱進(jìn)行分子量分級(jí)，收集分子量2000以下的級(jí)分。該級(jí)分經(jīng)Micro Acilyzer G3(旭化成社制)脫鹽后，再經(jīng)DEAE-Sepharose FF分成3個(gè)級(jí)分，冷凍干燥。結(jié)果得到上述物質(zhì)(a)、(b)、(c)的量分別為38mg、60mg、以及8.2mg。
本發(fā)明提供可以用于巖藻依聚糖的結(jié)構(gòu)解析、巖藻依聚糖的酶分解物的鑒定以及生物活性的檢定中的糖化合物；在巖藻依聚糖的部分分解以及巖藻依聚糖寡糖的生產(chǎn)等與巖藻依聚糖有關(guān)的研究中有用的新的內(nèi)向型巖藻依聚糖分解酶；以及在糖化合物的制造中有用的新的微生物。
權(quán)利要求
1.內(nèi)向型巖藻依聚糖分解酶，其特征是具有下述的理化性質(zhì)，(I)作用作用于巖藻依聚糖，至少可以使下述式(7)和式(8)表示的糖化合物游離出來(lái)；(II)最適pH該酶的最適pH是6～10；(III)最適溫度該酶的最適溫度是30～40℃。
2.電子傳遞鏈中含有甲基萘醌、GC含量約為60％的Fucoidanobacter屬的細(xì)菌。
全文摘要
本發(fā)明提供新的內(nèi)向型巖藻依聚糖分解酶、以及在糖化合物的制造中有用的新的微生物。
文檔編號(hào)C07H1/00GK1330143SQ0013482
公開日2002年1月9日 申請(qǐng)日期2000年12月1日 優(yōu)先權(quán)日1995年4月28日
發(fā)明者酒井武, 木村眸, 兒島薰, 中西芳邦, 加藤郁之進(jìn), 豬飼勝重, 秋吉純子 申請(qǐng)人:寶酒造株式會(huì)社, 株式會(huì)社糖鎖工學(xué)研究所