專利名稱：核苷酸的生產方法
技術領域：
本發明與以核苷為原料合成核苷酸的工藝有關，尤其與核苷酸的大規模合成工藝有關。
DNA復制的基礎物質是5′-核苷三磷酸(簡稱核苷酸)。Yoskihawa等用POCl3將核苷磷酰化得到以5′-二氯磷酸核苷為主的產物。隨后Slotin等在中性水溶液，氨水及乙醇溶液中處理得到5′-核苷單磷酸鹽、3′,5′-核苷環磷酸等一系列產物。Ludwig發現5′-二氯磷酸核苷可以在中性無水DMF溶液中與過量的焦磷酸三正丁銨反應生成核苷三磷酸。
已知的核苷酸合成方法主要有1、Ott法，以5′-核苷單磷酸三正丁銨鹽與過量的1,1′-羰二酰咪唑于室溫下反應1hr，活化生成5′-核苷單磷酰咪唑。未反應的1,1′-羰二酰咪唑用甲醇除去。生成的5′-核苷單磷酰咪唑與焦磷酸鹽反應生成5′-核苷三磷酸。
反應產物用DEAE陰離子纖維樹脂層析柱分離純化。采用0-0.4mol碳酸三乙銨進行梯度洗脫，所得核苷酸三乙銨鹽用甲醇溶解，如入高氯酸鈉轉型成鈉鹽。
2、Ludwig法，0.26mmolPOCl3，加入到0.5ml磷酸三甲酯和0.20mmol核苷懸浮液中，0℃攪拌1.5hr。反應混合物中加入2ml 0.5M焦磷酸三正丁銨鹽的DMF溶液和0.2mlBu3N，迅速劇烈攪拌。一分鐘后加入pH=7.5的碳酸三乙銨緩沖液水解。反應產物用DEAE纖維樹脂層析分離，洗脫劑為碳酸三乙銨鹽，0-0.4mol梯度洗脫，得核苷酸三乙銨鹽。
已知方法的缺點Ott法工藝流程復雜，必須首先割得5′-核苷單磷酸銨鹽，使用二次層析分離，而且采用DEAE纖維樹脂層析分離，工藝難以放大，很難獲得高純度產品，必須用高壓液相色譜再次分離純化。
Ludwig法反應簡單，但采用DEAE樹脂分離同樣難以放大，只能放大到1g范圍之內，且收率極低，只有5％左右；另外，核苷酸用于DNA的復制，要求不含焦磷酸鹽，因為焦磷酸能夠絡合Ca2+、Mg2+、而Ca2+、Mg2+是DNA聚合酶的輔助因子，所以產品中若有焦磷酸鹽存在將影響DNA聚合酶的催化活性。此方法使用過多的焦磷酸丁銨鹽，必須使用HPLC分離去除焦磷酸鹽，而HPLC難以放大且成本相當高。
本發明的目的是提供一種工藝簡單，可以大規模合成核苷酸，產品收率高、純度高，生產成本低的核苷酸的生產方法。
本發明是這樣實現的本發明核苷酸的生產方法，包括將POCl3加到磷酸三甲酯和核苷懸浮液中反應，反應混合物中加入焦磷酸鹽，攪拌后上樹脂柱分離純化，用碳酸鹽溶液梯度洗脫得三磷酸核苷鹽。其特征在于所述的樹脂柱為離子交換樹脂GJ0l柱，GJDl柱的制備方法如下(1)將明膠加入去離子水中，加熱攪拌至50-70℃，形成0.5-1.0％重量的明膠水溶液；(2)在明膠水溶液中依次加入0.5-1.0％重量的過氧化苯甲酰，10-20％重量的汽油和二氧六環，10-30％重量的苯乙烯，1-5％重量的二乙烯苯，每隔一段時間取樣觀察顆粒大小及硬度，待顆粒變硬，升溫至70-90℃并保溫5-10小時，過濾，水洗滌，晾干，過篩取100-120目白球；(3)將白球氯甲基化，1-5公斤白球加入2-3倍重量的氯甲甲醚浸泡溶脹1-3小時；(4)將溶脹白球攪拌升溫至30-60℃；(5)加入白球重量10-50％的氯化鋅，繼續攪拌2-6小時，過濾，丙酮洗滌，真空干燥，過篩收取100-120目氯甲基化樹脂；(6)將1-5公斤氯甲基化樹脂加入1-5倍重量的40％二乙醇胺水溶液和1-4倍重量的二氧六環混合物中，常溫攪拌10-24小時，過濾，丙酮洗滌，水洗，干燥，過篩收取100-120目GJ01樹脂。
本發明在使用前將GJ01樹脂柱預處理，其方法為將1公斤GJ01樹脂和1500毫升水裝入直徑9厘米層析柱，浸泡24小時，用雙蒸水洗滌1次，鹽酸，氫氧化鈉各洗滌一次，再用雙蒸水洗滌后備用。
本發明焦磷酸鹽為0.1-0.5M的焦磷酸三乙銨，其與磷酸三甲酯的體積比為1-5∶2-4。
本發明焦磷酸三乙銨的制備方法如下(1)將焦磷酸鈉溶于雙蒸水，得2.0-6.0％濃度的焦磷酸鈉水溶液，(2)將溶液通過20-100公斤的Dowex50(酸型)離子交換柱，水洗，使鈉離子與氫離子發生交換，生成焦磷酸，合并收集液，(3)將收集液減壓濃縮，(4)在濃縮液中加入1-4倍體積的三乙胺，反應得焦磷酸三乙銨，蒸干，加入無水DMF至1-4倍體積。
本發明三磷酸核苷的制備方法如下( 1)將核苷0.5-1mol懸浮于2.0-4.0升磷酸三甲酯中，攪拌，冰水浴冷卻10-40分種后，緩慢加入40-120毫升POCl3攪拌1-4小時生成以5′-單磷酸核苷為主的混合物，(2)加入0.1-0.5M焦磷酸三乙銨1-5開，強烈攪拌10-120分鐘，生成以5′-三磷酸核苷為主的混合物，(3)加入0.5-1.5M碳酸氫銨水溶液2-6升，減壓蒸餾至干，加500-1000毫升水溶液，(4)將水溶液上GJ01柱，首先用5-10升水洗滌，再用0-0.8M的碳酸氫銨水溶液梯度洗脫，收集產品流份，減壓蒸餾至晶體析出，過濾，洗滌干燥得三磷酸核苷銨鹽，(5)將三磷酸核苷銨鹽溶于1000-4000毫升雙蒸水，通過1000-2000毫升Dowex50(鈉離子型)離子交換柱，并用1000-2000毫升雙蒸水洗滌，合并流出液，減壓蒸餾，冷凍干燥，得白色三磷酸核苷鈉鹽。
本發明可使用等當量的焦磷酸鹽加入懸浮液中。
本發明的(1)中的核苷為0.54mol，磷酸三甲酯為2.8升，冰水浴冷卻時間為20分鐘，加入POCl3，磷酸三甲酯為2.8升，冰水浴冷卻時間為20分鐘，加入POCl3為60毫升，強烈攪拌時間為50分鐘，(3)中加入1M碳酸氫銨水溶液3升，加入1000毫升水溶解，(4)中上GJ01柱首先用10升水洗滌，再用0-0.2M的碳酸氫銨水溶液梯度洗脫，(5)中將三磷酸核苷銨鹽溶于3000毫升雙蒸水，通過1000毫升Dowex50離子交換柱，并用1000毫升雙蒸水洗滌。
本發明核苷為2′-脫氧腺苷或2′-脫氧胸苷或2′-脫氧鳥苷或2′-脫氧胞苷或腺苷或尿苷或鳥苷或胞苷或2′、3′-雙脫氧腺苷或2′、3′-雙脫氧胸苷或2、3′-雙脫氧鳥苷或2′、3′-雙脫氧胞苷或堿基結構修飾的2′-脫氧核苷或堿基結構修飾的核苷或堿基結構修飾的2′、3′-雙脫氧核苷。
本發明與已知的合成方法相比，具有簡便、高效、適于規模化等優點。核苷和POCl3在磷酸三甲酯溶劑系統中反應，形成5′-單磷酰化產物，然后與等當量焦磷酸鹽反應并延長三磷酸化時間生成核苷酸，產品用自行研制的大孔弱堿離子交換樹脂吸附并用磷酸氫銨溶液梯度洗脫。經31P核磁共振檢測，產品中不含焦磷酸鹽、5′-核苷單磷酸及5′-核苷二磷酸。產品數量以百克計，收率在10-15％左右。
與已知方法比較本發明有以下主要特點1，本發明為大規模合成核苷酸工藝，產品數量以百克計；而已知方法只適應小規模合成，其產品僅以mg、ug計；2，采用改進的Ludwig法，反應投料比、反應溫度及反應時間都有所不同。使用等當量的焦磷酸鹽，延長三磷酸化的時間化獲得較高的收率。由于焦磷酸使用量小，為下一步的分離純化帶來了方便。
3，反應物不是用碳酸三乙銨緩沖液水解，而是用碳酸氫銨溶液水解；4，產品采用自行研制的大孔弱堿性陰離子交換樹脂吸附，并用0-0.8M的碳酸氫銨溶液作梯度洗脫分離純化核苷酸，經過一次分離純化即可獲得產品。
5，用Dowex50強酸陽離子交換樹脂進行離子轉型獲得核苷酸鈉鹽。
如下是本發明的附圖。
圖1為本發明的生產流程圖。
圖2為制備離子交換樹脂GJ01的工藝流程圖。
如下是本發明的實施倒實施例1dATP的制備1、焦磷酸三乙銨的制備將4.5公斤能從市場上購得的焦磷酸鈉(100mol)溶于100升雙蒸水，通過Dowex50(50公升，酸型)離子交換柱，100升水洗，合并收集液。減壓濃縮至10升，加三乙胺10升，蒸干，加無水DMF至40升，配制成0.25M的溶液于4℃保存備用。
2、離子交換樹脂GJ01的制備100-120目白球400克明膠加入40公斤去離子水中，加熱攪拌至70℃，待明膠全部溶解，依次加入400克過氧化苯甲酰、8公斤汽油和二氧六環、10公斤苯乙烯、2公斤二乙烯苯(含量50％)，每隔10分鐘取樣觀察顆粒大小及硬度，并調解攪拌速度。待顆粒變硬，升溫至90℃并保溫8小時。過濾，水洗滌，晾干，過篩取100-120目白球備用。
氯甲基化5公斤100-120目白球加入15公斤氯甲甲醚，浸泡溶液2小時，攪拌升溫至50℃，加入2300克氯化鋅，繼續攪拌4小時，過濾，丙酮洗滌，真空干燥，過篩收取100-120目氯甲基化樹脂。氯含量15％。
叔胺化1公斤氯甲基化樹脂加入5公斤40％(重量濃度)二乙醇胺水溶液和4公斤二氧六環混合物中，常溫攪拌12小時，過濾，丙酮洗滌，水洗，干燥，過篩收取100-120目GJ10樹脂。
3、GJ10柱的預處理1公斤GJ10樹脂和1500毫升水裝入直徑9厘米層析柱，浸泡24小時，3000毫升雙蒸水洗滌1次，3000毫升2N鹽酸，2N氫氧化鈉各洗滌一次，3000毫升雙蒸水洗滌后備用。
4、dATP的制備2′-脫氧腺苷(135克，0.54mol)懸浮于2.8升磷酸三甲酯中，攪拌并用冰水浴冷卻。20分鐘后，于反應混合物中慢慢加入60毫升POCl3，繼續攪拌2小時。加入0.25M焦磷酸三乙銨(2000毫升)，強烈攪拌50分鐘后，倒入1M碳酸氫銨水溶液(3升)，減壓蒸餾至干，加1000毫升水溶解，上GJ10柱，首先用10升水洗滌，再用0-0.2M的碳酸氫銨水溶液梯度洗脫，收集產品流份，減壓蒸餾至晶體析出，放置12小時，過濾，洗滌干燥得28克dATP銨鹽。將25克dATP銨鹽溶于3000毫升雙蒸水，通過1000毫升Cowex(鈉離子型)離子交換柱，并用1000毫升雙蒸水洗滌，合并流出液，減壓蒸餾，冷卻干燥，得白色dATP鈉鹽(29.5克，收率10.2％)。純度＞98％(HPLC法)；31P-NMR(D2O+NaOD):-8.734(d,J=19Hz)；-10.302(d,J=18Hz)；-19.102(t=J=18Hz)。
實施例2dTTP的制備′工藝同dATP,2′-脫氧胸苷用量122克，收率15％；純度＞98％(HPLC法)；31P-NMR(D2O+NaOD):-8.347(d,J=19Hz)；-10.829(d,J=19Hz)；-21.238(t,J=19Hz)。
實施例3dGTP的制備工藝同dATP,2′-脫氧鳥苷用量144克，收率10％；純度＞98％(HPLC法)；31P-NMR(D2O+NaOD):-8.356(d,J=19Hz)；-10.735(d,J=19Hz)；-21.646(t,J=19Hz)。
實施例4dCTP工藝同dATP,2′-脫氧鳥苷用量144克，收率10％；純度＞98％(HPLC法)；31P-NMR(D2O+NaOD):-8.694(d,J=20Hz)；-10.934(d,J=20Hz)；-21.818(t,J=20Hz)。
權利要求
1.一種核苷酸的生產方法，包括將POCl3加到磷酸三甲酯和核苷懸浮液中反應，反應混合物中加入焦磷酸鹽，攪拌后上樹脂柱分離純化，用碳酸鹽溶液梯度洗脫得三磷酸核苷鹽，其特征在于所述的樹脂柱為離子交換樹脂GJ01,GJ01的制備方法如下(1)將明膠加入去離子水中，加熱攪拌至50-70℃，形成0.5-1.0％重量的明膠水溶液；(2)在明膠水溶液中依次加入0.5-1.0％重量的過氧化苯甲酰，10-20％重量的汽油和二氧六環，10-30％重量的苯乙烯，1-5％重量的二乙烯苯，每隔一段時間取樣觀察顆粒大小及硬度，待顆粒變硬，升溫至70-90℃并保溫5-10小時，過濾，水洗滌，晾干，過篩取100-120目白球；(3)將白球氯甲基化，1-5公斤白球加入2-3倍重量的氯甲甲醚浸泡溶脹1-3小時；(4)將溶脹白球攪拌升溫至30-60℃；(5)加入白球重量10-50％的氯化鋅，繼續攪拌2-6小時，過濾，丙酮洗滌，真空干燥，過篩收取100-120目氯甲基化樹脂；(6)將1-5公斤氯甲基化樹脂加入1-5倍重量的40％二乙醇胺水溶液和1-4倍重量的二氧六環混合物物中，常溫攪拌10-24小時，過濾，丙酮洗滌，水洗，干燥，過篩收取100-120目GJ01樹脂。
2.根據權利要求1所述的核苷酸的生產方法，其特征在于在使用前將GJ01樹脂柱預處理，其方法為將1公斤GJ01樹脂和1500毫升水裝入直徑9厘米層析柱，浸泡24小時，用雙蒸水洗滌1次，鹽酸，氫氧化鈉各洗滌一次，再用雙蒸水洗滌后備用。
3.根據權利要求1所述的核苷酸的生產方法，其特征在于使用等當量的焦磷酸鹽加入懸浮液中。
4.根據權利要求1所述的核苷酸的生產方法，其特征在于所說的焦磷酸鹽為0.1-0.5M的焦磷酸三乙銨，其與磷酸三甲酯的體積比為1-5∶2-4。
5.根據權利要求3所述的核苷酸的生產方法，其特征在于焦磷酸三乙銨的制備方法如下(1)將焦磷酸鈉溶于雙蒸水，得2.0-6.0％濃度的焦磷酸鈉水溶液，(2)將溶液通過20-100公斤的Dowex50(酸型)離子交換柱，水洗，使鈉離子與氫離子發生交換，生成焦磷酸，合并收集液，(3)將收集液減壓濃縮，(4)在濃縮液中加入1-4倍體積的三乙胺，反應得焦磷酸三乙銨，蒸干，加入無水DMF至1-4倍體積。
6.根據權利要求1或2或3或4或5所述的核苷酸的生產方法，其特征在于所說的核苷酸為三磷酸核苷，其制備方法如下(1)將核苷0.5-1mol懸浮于2.0-4.0升磷酸三甲酯中，攬拌，冰水浴冷卻10-40分種后，緩慢加入40-120毫升POCl3攪拌1-4小時生成以5′-單磷酸核苷為主的混合物，(2)加入0.1-0.5M焦磷酸三乙銨1-5升，強烈攬拌10-120分鐘，生成以5′-三磷酸核苷為主的混合物，(3)加入0.5-1.5M碳酸氫銨水溶液2-6升，減壓蒸餾至于，加500-1000毫升水溶解，(4)將水溶液上GJ01柱，首先用5-10升水洗滌，再用0-0.8M的碳酸氫銨水溶液梯度洗脫，收集產品流份，減壓蒸餾至晶體析出，過濾，洗滌干燥得三磷酸核苷銨鹽，(5)將三磷酸核苷銨鹽溶于1000-4000毫升雙蒸水，通過1000-2000毫升Dowex50(鈉離子型)離子交換柱，并用1000-2000毫升雙蒸水洗滌，合并流出液，減壓蒸餾，冷凍干燥，得白色三磷酸核苷鈉鹽。
7.根據權利要求6所述的核苷酸的生產方法，其特征在于(1)中的核苷為0.54mol，磷酸三甲酯為2.8升，冰水浴冷卻時間為20分鐘，加入POCl3，磷酸三甲酯為2.8升，冰水浴冷卻時間為20分鐘，加入POCl3為60毫升，強烈攪拌時間為50分鐘，(3)中加入1M碳酸氫銨水溶液3升，加入1000毫升水溶解，(4)中上GJ01柱首先用10升水洗滌，再用0-0.2M的碳酸氫銨水溶液梯度洗脫，(5)中將三磷酸核苷銨鹽溶于3000毫升雙蒸水，通過1000毫升Dowex50離子交換柱并用1000毫升雙蒸水洗滌。
8.根據權利要求7所述的核苷酸的生產方法，其特征在于所說的核苷為2′-脫氧腺苷或2′-脫氧胸苷或2′-脫氧鳥苷或2′-脫氧胞苷或腺苷或尿苷或鳥苷或胞苷或2′、3′-雙脫氧腺苷或2′、3′-雙脫氧胸苷或2、3′-雙脫氧鳥苷或2′、3′-雙脫氧胞苷或堿基結構修飾的2′-脫氧核苷或堿基結構修飾的核苷或堿基結構修飾的2′、3′-雙脫氧核苷。
全文摘要
本發明為一種核苷酸的生產方法,包括將POCl
文檔編號C07H1/00GK1304939SQ00132078
公開日2001年7月25日 申請日期2000年12月15日 優先權日2000年12月15日
發明者陳耀明, 江云, 明新, 高正波, 張燕 申請人:成都國嘉制藥有限責任公司