專利名稱：煙草為原料制備輔酶q的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域尤其是輔酶Q10的制備輔酶Q10(CoenzymeQ10，CoQ10)又稱泛醌10，是2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-二苯醌的衍生物，其側鏈含有10個異戊烯基。它廣泛存在于動物、植物和微生物中，是呼吸鏈中電子/氫的載體。它可以以NADH脫氫酶，磷酸甘油脫氫酶、脂酰CoA脫氫酶、琥珀酸脫氫酶、鐵硫蛋白等中接受電子/氫，并將電子傳遞給Cyt。因此，在呼吸鏈中占據承上啟下的重要位置和作用。輔酶Q10是重要的藥源，在醫藥上廣泛用于治療心、腦、肝、腎疾病，細菌和病毒傳染病，癌癥病人的綜合治療，以及改善機體免疫功能等。
輔酶Q10在國外用化學合成法或微生物發酵法生成，但產率低、產物專一性差，成本高，價格貴，難于滿足制藥工業需要。目前國內尚無生產，至今我國制藥所需輔酶Q10完全依賴進口。因此，輔酶Q10在國內外都存在廣闊的市場。以煙草為原料生產輔酶Q10目前國內外都未見報道。
本發明的目的在于采用現代生物技術方法，利用植物細胞工程和酶工程的原理和技術，從發酵高產生長快的煙草細胞中制備高純度的結晶輔酶Q10，經濟、簡便的生產輔酶Q10，以適應經濟建設和國內外市場的需要。
我們從1994年起對煙草細胞發酵條件、工藝及其生產輔酶Q10技術、輔酶Q10的分離純化、結晶純度控制等技術進行了長期深入研究，從而發明了煙草為原料，以煙草細胞懸浮培養生產輔酶Q10的技術。
本發明是這樣實現的
(一)愈傷組織誘導取煙草植體，洗凈，70％乙醇溶液浸泡，再用0.1％氯化汞消毒，無菌水沖洗。在無菌條件下切碎，接種于誘導培養基上培養，置16-32℃培養箱中黑暗培養至形成愈傷組織，較理想的培養溫度為28±1℃。誘導培養基以MS為基本培養基，加入BA 0.05mg/L,2,4-D 1.0mg/L,NAA 1.0mg/L，蔗糖濃度3％，瓊脂0.7％，pH5.8，高壓滅菌。
(二)繼代培養上述愈傷組織轉入繼代培養基中進行繼代培養，繼代培養基以LS為基本培養基，另加入BA 0.05mg/L,2,4-D 1.0mg/L,NAA 1.0mg/L，蔗糖濃度3％，瓊脂0.7％，pH5.8，高壓滅菌，產生疏松愈傷組織；(三)懸浮培養出種子細胞將上述疏松愈傷組織，轉入懸浮培養基中進行懸浮培養出種子細胞。
1．懸浮培養基的組成組 成 含量最佳含量無機營養 LS LSKT,mg/L 0.02-4 0.022,4-D,mg/L 0.05-4 2.00肌醇mg/L80-800 100鹽酸硫胺素mg/L 0.05-8.0 4.00酵母膏％0.05-0.5 0.15蔗糖％ 1045 30甲硫酸胺mg/L5-20 20.02．培養條件☆搖床轉速，100-150r/min，最佳轉速為100r/min，振幅2cm
☆培養基pH,pH4.0-8.0，最佳pH5.8☆培養溫度，16-32℃，最佳培養溫度為28±1℃☆培養時間，8天☆黑暗中培養(四)輔酶Q10的制備1．輔酶Q10的提取用丙酮作為抽提溶劑，將煙草懸浮培養細胞與丙酮按12(質量/體積比)混合，研磨，過濾，殘渣重復2次以上，合并濾液，用0.5倍濾液體積的石油謎(30-65)℃作萃取劑進行萃取，所得石油醚萃取液為輔酶Q10的石油醚提取液。
2．輔酶Q10分離純化將石油醚提取液用蒸發法濃縮至原體積的1/15，上硅膠柱層析純化，硅膠(60-325孔/cm)烘至恒重，加60克/L水活化，裝柱(2.0×20.0cm2)，用體積分數為4％的乙醚-石油醚濃度線性梯度洗脫，流速1ml/分鐘、5ml/管，收集黃色部分洗脫液，為輔酶Q10純化液。
3．結晶將純化輔酶Q10溶液于60℃水浴上蒸發除去有機溶劑后，干物質入乙醇溶解，密封于4-8℃冰箱中結晶，結晶完全后離心(10500轉/分鐘，4℃,15分鐘)，收集結晶為輔酶Q10。
4．干燥用冷凍干燥法干燥，密封避光保存。
5．輔酶Q10含量每克干重細胞產輔酶Q10500-510ug，回收率達59.2％，純度98％。輔酶Q10的特征特性輔酶Q10正品為黃色長菱形結晶，無毒，無味，易溶于有機溶液。水分＜5％，
輔酶Q10正品為黃色長菱形結晶，無毒，無味，易溶于有機溶液。水分＜5％，灰份＜3％，輔酶Q9及其他雜質＜0.2％。
其化學結構式 輔酶Q10含量檢測將輔酶Q10溶于10ml無水乙醇，取3ml在275 nm波長下測定其氧化型吸光值(A1)；然后，加入0.1ml0.7％硼氫化鈉水溶液，又在275nm波長下測定其還原型吸光值(A2)。對照為無水乙醇。按下式計算輔酶Q10含量CoQ10ug/g.dw細胞=(A1-A2)×n×106142×s式中n為稀釋倍數，s為細胞干重(g)，142為輔酶Q10的1％無水乙醇溶液在275波長下氧化型和還原型吸光值之差。
每g干重細胞達500-510ug輔酶Q10質量標準檢驗采用高效液相色譜法(HPLC)檢測輔酶Q10的純度。色譜條件色譜柱Zorbaxods7u；流動相為60％的乙醇/甲醇溶液；流速為1ml/min，波長283nm，進樣量為30ul，標樣和樣品輔酶Q10的濃度4.9umol/L。純度)98％，輔酶Q9及其他雜質＜0.2％。
水分、灰份檢測按常規法。
細胞干重按常規恒重法。
本發明的優點1．本發明為輔酶Q10藥源生產開辟了新途徑，為輔酶Q10藥源國產化奠定了基礎。以適應市場和經濟發展的需要。
2．本發明用煙草細胞為材料，細胞生長快，輔酶Q10含量高。從發酵細胞中易于提取輔酶Q10。
3．本發明工藝生產設備簡單，可以國產化，而且投資少，工藝簡便。輔酶Q10成本低。
4．發明輔酶Q10回收率高，純度高。達到藥用要求，可以用于制藥。
實例取盆栽砂培煙草黃花大金元具3-4片真葉幼苗的葉片，用自來水洗凈。在無菌條件下70％乙醇溶液浸泡5-8秒，再用0.1％氯化汞消毒8-10分鐘，無菌水沖洗3次，切成0.5cm-0.5cm小塊，接種于誘導培養基上培養，置28±1℃培養箱中黑暗培養25天形成愈傷組織。將愈傷組織轉入繼代培養基中進行繼代培養，產生疏松愈傷組織。將疏松愈傷組織轉入裝有50ml懸浮培養基的250ml錐形瓶中，接種4g。搖瓶；轉速為100-120r/分鐘，振幅2cm,28±1℃黑暗中培養8天。用吸管吸取培養基中上部細胞并過濾，可作為懸浮培養的種子細胞。
取100g懸浮培養細胞，加入200ml丙酮，研磨，過濾，殘渣重復2次以上，合并濾液，用300ml石油謎(30-60)℃作萃取劑進行萃取，所得萃取液為輔酶Q10的石油醚提取液。將石油醚提取液置于60℃水浴濃縮至20ml，上硅膠柱(2.0×20.0cm)，用體積分數為4％的乙醚-石油醚濃度線性梯度洗脫，流速1ml/分鐘，5ml/管，收集黃色部分洗脫液250ml,60℃水浴上蒸發除去有機溶劑后，干物質加入10ml乙醇溶解，密封避光，置于4-8℃冰箱中結晶，2天后結晶完全，離心(10500轉/分鐘，4℃,15分鐘)，收集結晶，冷凍干燥，即為輔酶Q10成品。產率為500-510ug/干細胞，回收率達59.2％，純度98％以上。
權利要求
1．煙草為原料制造輔酶Q10的方法，其特征在于(1)愈傷組織誘導取煙草植體，洗凈，70％乙醇溶液浸泡，再用0.1％氯化汞溶液消毒，無菌水沖洗除去浸泡液和消毒液，在無菌條件下，切成小塊，接種于誘導培養基上，置16-32℃培養箱中黑暗培養至形成愈傷組織；(2)繼代培養將上述愈傷組織轉入繼代培養基中進行繼代培養，產生疏松愈傷組織；(3)懸浮培養出種子細胞將上述疏松愈傷組織，轉入懸浮培養基中培養出種子細胞；(4)輔酶Q10提取用丙酮作為抽提溶劑，將煙草懸浮培養細胞與丙酮按1∶2(質量/體積比)混合，研磨，過濾，殘渣重復2次以上，合并濾液，用0.5倍濾液體積的石油謎(30-65)℃作萃取劑進行萃取，所得石油醚萃取液為輔酶Q10的石油醚提取液；(5)輔酶Q10分離純化將石油醚提取液用蒸發法濃縮至原體積的1/15，上硅膠柱用體積分數為4％的乙醚-石油醚濃度混合液線性梯度洗脫，收集黃色部分洗脫液，為輔酶Q10純化液；(6)結晶將純化輔酶Q10溶液于60℃水浴上蒸發除去有機溶劑后，加入無機乙醇溶解，密封于4-8℃冰庫中結晶，結晶完全后離心，收集結晶，即為輔酶Q10產品。
2．根據權利要求1所說的煙草為原料制備輔酶Q10方法，其特征在于愈傷組織培養基以MS為基本培養基，加入BA 1.Smg/L,NAA 1.4mg/L，蔗糖濃度3％，瓊脂0.7％，pH6.0，較理想的培養溫度為28±1℃。
3．根據權利要求1所說的煙草為原料制造輔酶Q10方法，其特征在于繼代培養基以LS為基本培養基，加入BA 0.05mg/L,2，4-D 1.0mg/L,NAA 1.0mg/L，蔗糖濃度3％，瓊脂0.7％，pH5.8。
4．根據權利要求1所說的煙草為原料制備輔酶Q10方法，其特征在于懸浮培養基中各營養成分為無機營養LS,KT0.02-4mg/L,2,4-D0.05-4mg/L，肌醇80-800mg/L，鹽酸硫胺素0.05-8.0mg/L，酵母膏0.05-0.5％，蔗糖1045％，甲硫酸胺5-20mg/L；各營養成分較佳含量為LS(無機)，KT0.02mg/L,2,4-D2.00mg/L，肌醇100mg/L，鹽酸硫胺素4.00mg/L，酵母膏0.15％，蔗糖30％，甲硫氨酸10mg/L。
5．根據權利要求1和4所說的煙草為原料制備輔酶Q10方法，其特征在于煙草細胞在懸浮培養基的培養條件為搖床轉速100-150轉/分鐘，最佳轉速為100轉/分鐘，培養基的pH4.0-8.0，最佳的pH5.8，培養溫度16-32℃，最佳培養溫度為28±1℃，培養時間8天。
全文摘要
本發明是以煙草為材料,經過誘導、繼代和懸浮培養,產生生長快、輔酶Q
文檔編號C07C50/28GK1298942SQ0013081
公開日2001年6月13日 申請日期2000年11月28日 優先權日2000年11月28日
發明者徐鳳彩, 穆虹, 高向陽, 康起亮, 葉國洪 申請人:華南農業大學