專利名稱：營養酸模sod的提取工藝的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體地說是一種SOD超氧化物歧化酶的提取方法。
SOD(超氧化物歧化酶)酶是生物重要保護酶之一，能增強機體抗逆能力，防衰老。營養酸模是采用不同地區野生酸模通過基因工程培育而成的多年生物種，目前，國內主要用于生產實踐的是魯梅克斯雜交酸模。營養酸模具有優質、高產、速生、耐寒、耐旱、耐鹽堿等生物學特性，適于鹽漬、風沙、荒漠化土地生長。營養酸模的莖葉在抽莖期所含葉蛋白高達30％以上，僅次于大豆籽粒，另外，它還含有豐富的色素、氨基酸、維生素和微量元素。本申請人經過測定，發現營養酸模中含有較高的SOD活性，但至今沒有人對其提取工藝進行深入的研究。
本發明的目的在于提出一種從營養酸模中提取SOD粗酶的生產工藝。
以下敘述本發明的主要內容一種營養酸模SOD粗酶的提取工藝，包括原料的預處理、25-35％硫酸銨沉淀、85-95％硫酸銨沉淀、Sephadex G-25脫鹽和Sephadex G-100柱層析五步，其特征在于向粗提液加入硫酸銨，使粗提液中硫酸銨達到25-35％飽和度，過濾后，向濾液中再加入硫酸銨使其飽和度達到85-95％。
圖1為本發明的工藝流程圖。下面結合附圖敘述本發明實施過程1．原料的預處理將新鮮營養酸模的根、莖和葉通過組織搗碎機搗碎，殘余的組織塊面積小于2mm2；將搗碎的組織勻漿離心，棄除沉淀殘渣，保留上清液作為粗提液。
2．25-35％硫酸銨沉淀將離心后的獲得的粗提液加入硫酸銨后，使粗提液中硫酸銨的飽和度達到25-35％，在室溫(20-28℃)下攪拌45-60分鐘，靜置100-120分鐘即可進行離心或過濾。
3．85-95％硫酸銨沉淀在25-35％硫酸銨沉淀后的濾液中，加入硫酸銨使其飽和度達到85-95％，在室溫(20-28℃)下攪拌45-60分鐘，離心10000-13000rpm，將沉淀溶于最小量的5mM pH7.8磷酸鉀緩沖液中(含2mMEDTA)，然后用上述緩沖液和Sephadex G-25脫鹽。
4．Sephadex G-25脫鹽Sephadex G-25柱，預先用5mM pH7.8的磷酸鉀緩沖液平衡；將經過85-95％硫酸銨沉淀的酶樣溶解在最小量的5mM pH7.8磷酸鉀緩沖液中，經過Sephadex G-25柱層析，收集酶液。用奈氏試劑檢測收集脫鹽的SOD酶液。
5．Sephadex G-100柱層析預先用pH7.8、5mM的磷酸鉀緩沖液平衡Sephadex G-100柱，將脫鹽后的粗酶提取液加入到G-100柱中，采用全自動分布收集系統收集。將SOD活力高的部分收集。測SOD活力。
6．粗酶提取過程及制劑的質量要求粗酶提取液經過Sephadex G-100柱層析后，比活達1300以上，產率達65％-75％；SOD粗酶制劑酶活＞25000IU/g。
本發明較已有技術相比具有如下典型優點1、本發明創立的營養酸模SOD提取工藝可用于從營養酸模提取生產SOD粗酶。所獲得的SOD粗酶既可用于醫藥、獸藥、作物抗逆增產、日用化妝品、保健食品和保健飲料等，還可進一步用于提純SOD精酶和SOD結晶以及酶的性質、結構、氨基酸順序測定的研究，具有廣泛的開發應用前景。
2、該工藝流程簡單，損耗小，能耗小，節約能源，成本低，且無污染。
3、本發明經過反復試驗，選擇25-35％的硫酸銨沉淀，SOD酶無損失；，選擇85-95％的硫酸銨沉淀，可使SOD酶全部沉淀。
以下敘述
具體實施例方式實施例1用100公斤營養酸模提取300克SOD粗酶1．原料的預處理取100公斤新鮮營養酸模用組織搗碎機充分搗碎，搗碎的組織勻漿4000rpm離心10分鐘，棄沉淀留上清，獲得粗提液72.5公斤。
2．30％硫酸銨沉淀將粗提液加入硫酸銨，使粗提液中硫酸銨達到30％飽和度。在23℃下攪拌55分鐘，靜置110分鐘，采用膜系統過濾獲得濾液。
3．90％硫酸銨沉淀在30％硫酸銨沉淀后的濾液中，加入硫酸銨使其飽和度達到90％，在23℃下攪拌60分鐘，離心12000rpm，將沉淀溶于最小量的5mM pH7.8磷酸鉀緩沖液中(含2mM EDTA)。
4．Sephadex G-25脫鹽Sephadex G-25柱，預先用5mM pH7.8的磷酸鉀緩沖液平衡；將經過90％硫酸銨沉淀的酶樣溶解在最小量的5mM pH7.8磷酸鉀緩沖液中，經過Sephadex G-25柱層析，收集酶液。得到60公斤粗酶提取液。
5．Sephadex G-100柱層析Sephadex G-100柱，預先用pH7.8、5mM的磷酸鉀緩沖液平衡；將60公斤脫鹽后的粗酶提取液加入到柱中，并用上述緩沖液洗脫。采用全自動分布收集系統收集洗脫液，合并SOD活力高的收集液。得到SOD粗酶液濃縮、冷凍干燥得到SOD粗酶制劑300克干粉，酶活為27500IU/g。
實施例2SOD的測定SOD的測定方法采用NBT光化學法，具體如下(1)設備752型分光光度計；臺式離心機；光照培養箱；冰箱；10ml小燒杯等。
(2)試劑氯化硝基氮藍四唑(NBT)－上海前進制劑廠生產L-甲硫氨酸(L-Met－上海康達氨基酸廠生產乙二胺四乙酸(EDTA)－北京化工廠生產核黃素(VB2)－北京西中化工廠生產(3)反應液的配制NBT反應液的制備配制pH7.8，50mmol/L的磷酸緩沖液1000ml，加入1.933mg的L-Met，待完全溶解后，放入45.8mg NBT，0.47mg核黃素(配成0.47mg/ml溶液，吸取1ml加入)和29.0mgEDTA，溶液終濃度Met為13mmol/L；NBT為6.3×10-3mmol/L；核黃素為1．3×10-3mmol／L；EDTA為0.1mmol／L，置于棕色試劑瓶中，用黑布罩遮光，于4℃冰箱中可保存1個月。
(4)材料的預處理臍橙果肉用研缽研碎，按照果肉50mM磷酸緩沖液=1∶2的比例加入緩沖液，10000rpm離心10分鐘，取上清液進行SOD酶活測定。
(5)測定方法吸取30μl樣品，放入10ml透明玻璃小燒杯中，加入3mlNBT反應液，混勻，在28℃SOD光化反應室中，2×15W日光燈光照20分鐘(光照為4000勒克司)，在560nm處測定吸光度，以NBT反應液作空白對照，每組設3次重復，整個測定過程除光化反應外，均在避光或弱光條件下進行。同時測試過程中以美國"Sigma"公司、上海寶安公司的標準酶和貴州老來福藥業公司生產的SOD口服液作為測試對照。
(6)計算 式中CK——空白對照透光度n——樣品稀釋倍數A——樣品透光度酶活單位IU／g
權利要求
1.一種營養酸模SOD粗酶的提取方法，包括原料的預處理、SephadexG-25脫鹽和Sephadex G-100柱層析步驟，其特征在于向粗提液加入硫酸銨，使粗提液中硫酸銨達到25-35％飽和度，過濾后，向濾液中再加入硫酸銨使其飽和度達到85-95％。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于原料的預處理中殘余的組織塊面積小于2mm2。
全文摘要
本發明屬于生物技術領域,具體地說是一種超氧化物歧化酶(SOD)的提取方法。本發明包括原料的預處理、25—35%硫酸銨沉淀、85—95%硫酸銨沉淀、Sephadex G－25脫鹽和Sephadex G－100柱層析五步。本發明所獲得的SOD粗酶可用于醫藥、獸藥、作物抗逆增產劑、日用化妝品、保健食品和保健飲料。
文檔編號C07K1/14GK1287167SQ0013004
公開日2001年3月14日 申請日期2000年10月25日 優先權日2000年10月25日
發明者王 琦, 王嘉猷, 彭光映, 梁華榮, 付學池, 劉艷芳, 梅汝鴻 申請人:北京綠華偉業科技有限公司