與磷酸酶反應(yīng)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的化合物的中間體的制作方法
                            
            
                            
            文檔序號(hào)：3560781閱讀：631來(lái)源：國(guó)知局
            
                            
                        
            
                        
            
                        
            
                            專利名稱：與磷酸酶反應(yīng)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的化合物的中間體的制作方法
            
本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)?7190142.2、申請(qǐng)日1997年1月15日、題為“與磷酸酶反應(yīng)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的化合物、組合物和方法“的專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
            
上述申請(qǐng)是同時(shí)待審的申請(qǐng)日為1996年1月16日的序號(hào)為08/585,090和申請(qǐng)日為1996年7月19日的序號(hào)為08/683,927的美國(guó)申請(qǐng)的部分繼續(xù)。
            
本發(fā)明涉及能和磷酸酶反應(yīng)并發(fā)光的化學(xué)發(fā)光化合物。本發(fā)明特別涉及帶有一個(gè)雜環(huán)基團(tuán)和一個(gè)磷酸烯醇酯基團(tuán)的化學(xué)發(fā)光化合物，而該磷酸烯醇酯基在用磷酸酶除去磷酸基并生成烯醇酯(鹽)的基礎(chǔ)上和氧發(fā)生反應(yīng)生成一個(gè)羰基化合物并產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。
            
本發(fā)明還涉及與磷酸酶反應(yīng)而發(fā)光的組合物。該化學(xué)發(fā)光組合物包括含有一個(gè)雜環(huán)基和磷酸烯醇酯基的第一化合物以及在磷酸酯化合物和磷酸酶反應(yīng)中起著增加光產(chǎn)生作用的第二化合物。本發(fā)明涉及通過(guò)磷酸酶和化學(xué)發(fā)光組合物反應(yīng)而發(fā)光或者化學(xué)發(fā)光的方法。本發(fā)明尤其涉及這些方法的改進(jìn)，而這些改進(jìn)可以顯著地增強(qiáng)光發(fā)射。
            
本發(fā)明還涉及該化學(xué)發(fā)光反應(yīng)以及組合物在測(cè)定磷酸酶的以及在免疫檢測(cè)，核酸探針檢測(cè)及其它類似的檢測(cè)中測(cè)定磷酸酶標(biāo)記的特異結(jié)合對(duì)的方法中的應(yīng)用。
            
本發(fā)明涉及與磷酸酶反應(yīng)并產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的化學(xué)發(fā)光化合物的制備工藝。本發(fā)明涉及在本工藝中有用的新的中間體。本發(fā)明尤其涉及制備帶有雜環(huán)基和烯醇磷酸酯基的化學(xué)發(fā)光化合物的工藝和中間體。該上述烯醇磷酸酯基在除去磷酸保護(hù)基的情況下和氧反應(yīng)生成羰基化合物并產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。
            
a．化學(xué)發(fā)光檢測(cè)磷酸酶諸如堿性磷酸酯酶的水解酶經(jīng)常在生物分子和諸如藥物，激素，類固醇以及腫瘤標(biāo)記物的其它重要被分析物的酶聯(lián)檢測(cè)中用作標(biāo)記物。此外，諸如堿性磷酸酶(AP)和酸性磷酸酶(AcP)的磷酸酶本身就在人類和獸醫(yī)學(xué)診斷中具有重要的臨床意義。作為一種安全，方便和靈敏的檢測(cè)這些酶的方法，化學(xué)發(fā)光法提供了一個(gè)定量測(cè)定樣品中酶量或者酶標(biāo)記的被分析物量或標(biāo)記的被分析物的特異結(jié)合對(duì)象的量的方法。很多化學(xué)發(fā)光反應(yīng)方案已發(fā)展成定量的，尤其是定量水解酶的水平。大部分的這些方案是復(fù)雜且昂貴，并需要多種酶或幾種試劑。因而阻礙了大部分的此類方法應(yīng)用于商業(yè)化的大批樣品的測(cè)定。
            
申請(qǐng)人的以參考文獻(xiàn)形式完整地引入本發(fā)明的，同時(shí)待審的08/585,090號(hào)的美國(guó)專利申請(qǐng)，公開(kāi)了帶有一個(gè)磷酸烯醇酯基的雜環(huán)化合物和磷酸酶的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。光發(fā)射因?yàn)殛?yáng)離子表面活性劑的存在下而增加，從而可檢測(cè)出10-18到10-19摩爾水平的磷酸酶。
            
申請(qǐng)人的以參考文獻(xiàn)形式完整地引入本發(fā)明的，同時(shí)待審的08/683,927號(hào)的美國(guó)專利申請(qǐng)，公開(kāi)了使用陽(yáng)離子芳香化合物(CAC′s)，使帶有一個(gè)磷酸烯醇酯基的某種雜環(huán)化合物與磷酸酶的反應(yīng)所發(fā)射的光的量顯著增加。磷酸酶的檢測(cè)限也因此而顯著地降低。
            
b．化學(xué)法和酶法激發(fā)的二氧四節(jié)環(huán)(Dioxetanes)帶有一個(gè)保護(hù)苯酚基的激發(fā)基團(tuán)的穩(wěn)定的1,2-二氧四節(jié)環(huán)，在除去保護(hù)基的條件下，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光分解(A.P.Schaap,T.S.Chen,R.S.Handley,R.DeSilva，和B.P.Giri，四面體通訊(Tetrahedron Lett.),1155(1987)；A.P.Schaap,R.S.Handley，和B.P.Giri,Tetradron Lett.,935(1987)；A.P.Schaap,M.D.Sandison，和R.S.Handley，四面體通訊(Tetrahedron Lett.),1159(1987)；和A.P.Schaap，光化學(xué)和光生物學(xué)(Photochem Photobiol),475,50S(1988))。酶法激發(fā)的二氧四節(jié)環(huán)帶有一個(gè)可用酶法除去的保護(hù)基所封閉的芳醚取代基。其在含水的緩沖液中和水解酶反應(yīng)暴露出芳醚陰離子，而該陰離子按級(jí)數(shù)促進(jìn)該二氧四節(jié)環(huán)的化學(xué)發(fā)光降解率?；瘜W(xué)法激發(fā)的二氧四節(jié)環(huán)帶有一個(gè)用保護(hù)基封閉的芳醚取代基，而該保護(hù)基可用簡(jiǎn)單的化學(xué)試劑除去。例如，用氫氧化物對(duì)乙酰二氧四節(jié)環(huán)脫保護(hù)，或，用氟化物對(duì)甲硅烷氧基二氧四節(jié)環(huán)脫保護(hù)。已公開(kāi)了很多此類可激發(fā)二氧四節(jié)環(huán)，例如，美國(guó)專利4,857,652,5,068,339,4,952,707,5,112,960,5,220,005,5,326,882以及PCT申請(qǐng)WO96/24849,WO94/10258和WO94/26726。然而，一些可激發(fā)二氧四節(jié)環(huán)的固有的缺點(diǎn)是，其在無(wú)酶存在時(shí)通過(guò)緩慢的熱分解或非-酶水解而有產(chǎn)生背景化學(xué)發(fā)光的趨勢(shì)。
            
c．魯米諾(Luminol)衍生物魯米諾的磷酸酯和NAG衍生物是眾所周知的(K.Sasamoto,Y.Ohkura,化學(xué)藥學(xué)雜志(Chem.Pharm.Bull.),38,1323-5(1991)；M.Nakazono,H.Nohta,K.Sasamoto,Y.Ohkura，分析科學(xué)(Anal.Sci.),8,779-83(1992))。用合適的酶處理該魯米諾衍生物釋放出魯米諾，其再和鐵氰化物反應(yīng)而發(fā)光。
            
d．熒光素衍生物磷酸酯和半乳糖苷的螢光熒光素衍生物是眾所周知的(N.Ugarova,Y.Vosny,G.Kutuzova,I.Dementieva,生物發(fā)光和化學(xué)發(fā)光的最新展望(Biolum.and Chemilum.New Perspectives),P.Stanley和L.J.Kricka,eds.,Wiley,Chichester,511-4(1981)；W.Miska,R.Gerger，生物發(fā)光和化學(xué)發(fā)光雜志(J.Biolumin.Chemilumin.),4,119-28(1989))。用合適的酶處理螢光熒光素釋放螢光熒光素，其再和熒光素酶和ATP反應(yīng)而發(fā)光。
            
e．涉及還原劑產(chǎn)生的反應(yīng)用堿性磷酸酶催化磷酸酯而產(chǎn)生還原劑的化學(xué)發(fā)光方法已有報(bào)道。(M.Maeda,A.Tsuji,K.H.Yang,S.Kamada，生物發(fā)光和化學(xué)發(fā)光的目前狀況(Bioluim.and Chemilum.Current Status),119-22(1991)；M.kitamura,M.Maeda,A.Tsuji，生物發(fā)光和化學(xué)發(fā)光雜志(J.Biolumin.Chemilumin.),10,1-7(1995)；H.Sasamoto,M.Maeda,A.Tsuji，分析化學(xué)學(xué)報(bào)(Anal.Chim.Acta),306,161-6(1995))。該還原劑再引起氧和熒光素間的反應(yīng)，而從熒光素中發(fā)生光。典型的還原劑包括維生素C，丙三醇，NADH，二羥基丙酮，氫化可的松和苯甲酰甲醇。這些方法不同于本發(fā)明，本發(fā)明涉及從脫保護(hù)的熒光化合物而不是光澤精中發(fā)光。已知的用酶法產(chǎn)生的，和光澤精反應(yīng)的還原劑的方法都要求了酶和磷酸酯化合物間的單獨(dú)的預(yù)先溫育步驟。這便增添了額外的復(fù)雜性和試驗(yàn)時(shí)間。
            
美國(guó)專利5,589,328(Mahant)公開(kāi)了一個(gè)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，其中的3-吲哚氧基酯，硫代-3-吲哚氧基酯和苯并呋喃酯用酶水解并產(chǎn)生超氧化物。通過(guò)加入化學(xué)發(fā)光產(chǎn)生劑，比如光澤精，而增強(qiáng)發(fā)光效應(yīng)。光澤精通過(guò)和超氧化物反應(yīng)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。
            
f．酶聯(lián)方法已知有很多其它的通過(guò)酶聯(lián)反應(yīng)而檢測(cè)諸如磷酸酯酶的水解酶的方法和試驗(yàn)。此類方法匯編于A.Tsnji,M.Maeda,H.Arakawa，分析科學(xué)(Anal.Sci.),5,497-506(1989)。其它的雙酶化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的例子見(jiàn)于美國(guó)5,306,621和普通的轉(zhuǎn)讓申請(qǐng)08/300,367。前者描述的是酶法產(chǎn)生一個(gè)過(guò)氧化物酶增強(qiáng)因子，以增強(qiáng)過(guò)氧化物酶對(duì)魯米諾的化學(xué)發(fā)光氧化作用；而后者描述的是酶法產(chǎn)生一個(gè)過(guò)氧化物酶增強(qiáng)因子，以增強(qiáng)過(guò)氧化物酶對(duì)9,10-二氫化吖啶酸衍生物的化學(xué)發(fā)光氧化作用。除了酶法-激發(fā)的二氧四節(jié)環(huán)外，前述的每一個(gè)方法均存在需要多種試劑或酶以產(chǎn)生光信號(hào)的缺點(diǎn)。雖然已證實(shí)這些方法具有優(yōu)越的檢測(cè)靈敏度，但這些附加的費(fèi)用或操作上的復(fù)雜性卻阻礙其在商業(yè)上的應(yīng)用。已達(dá)到這樣的靈敏度水平的，但除了酶底物外無(wú)需另外的酶或輔助試劑的，檢測(cè)并定量水解酶的化學(xué)發(fā)光方法是優(yōu)選的。本發(fā)明提供了這樣的方法和化合物。
            
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供化學(xué)發(fā)光檢測(cè)磷酸酶的化合物，該化合物在室溫中具有持久的熱穩(wěn)定性和水解穩(wěn)定性，并能用磷酸酶分解磷酸酯部分。
            
本發(fā)明也有一個(gè)目的是提供新的化合物，該化合物的雙鍵的一個(gè)末端用含有N,O或S的雜環(huán)基取代，另一個(gè)末端用酶法可分解的磷酸酯(O-PO32-)基團(tuán)取代，該磷酸酯基團(tuán)可被激發(fā)降解并發(fā)光。
            
本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一個(gè)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的方法和組合物，該組合物含有上述的可用磷酸酶激發(fā)的新化合物。
            
本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種化合物，其在用于檢測(cè)磷酸酶、免疫測(cè)定和眾所周知的用磷酸酶標(biāo)記測(cè)定待分析物的方法測(cè)定酶聯(lián)核酸，抗體，半抗原和抗原時(shí)，具有優(yōu)越的發(fā)光能力并具有顯著的優(yōu)點(diǎn)。
            
本發(fā)明的上述及其它目的和優(yōu)越性，是通過(guò)具有式Ⅰ的化合物實(shí)現(xiàn)的 其中，Het是一至少含有一個(gè)至少含有一個(gè)選自N,O和S的雜原子的五或六元環(huán)的雜環(huán)系統(tǒng)，Z選自O(shè)和S原子，R6是一個(gè)有機(jī)基團(tuán)，每個(gè)M獨(dú)自選自H和一個(gè)陽(yáng)離子中心，n是一個(gè)可滿足電荷中性的數(shù)字。
            
本發(fā)明的上述和其它目的及優(yōu)點(diǎn)，還要通過(guò)能在磷酸酶存在時(shí)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的組合物試劑的水溶液而實(shí)現(xiàn)一種式Ⅰ化合物和至少一種有效劑量的能增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光的表面活性劑增強(qiáng)因子。
            
本發(fā)明的上述和其它目的及優(yōu)點(diǎn)，還要通過(guò)包括磷酸酶和至少一種式Ⅰ化合物反應(yīng)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的方法而實(shí)現(xiàn)。
            
本發(fā)明的上述和其它目的及優(yōu)點(diǎn)，還要通過(guò)用化學(xué)發(fā)光實(shí)驗(yàn)過(guò)程測(cè)定樣品中的待分析物的方法而實(shí)現(xiàn)，該過(guò)程包括將磷酸酶和至少一種式Ⅰ化合物反應(yīng)產(chǎn)生用于檢測(cè)待分析物的化學(xué)發(fā)光；測(cè)定該化學(xué)發(fā)光；并將化學(xué)發(fā)光量和該待分析物的量在數(shù)學(xué)上聯(lián)系起來(lái)。
            
本發(fā)明的上述和其它目的及優(yōu)點(diǎn)，還要通過(guò)在檢測(cè)過(guò)程中用一個(gè)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)測(cè)定待分析物的方法而實(shí)現(xiàn)，其包括提供一個(gè)能在磷酸酶存在時(shí)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的組合物試劑(它作為一個(gè)水溶液至少含有一種能和磷酸酶反應(yīng)的式Ⅰ化合物，以及有效劑量的用于增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光的表面活性劑增強(qiáng)因子)；磷酸酶和該組合物反應(yīng)以產(chǎn)生用于測(cè)定該待測(cè)物的化學(xué)發(fā)光；并將化學(xué)發(fā)光量和該待分析物的量在數(shù)學(xué)上聯(lián)系起來(lái)。
            
本發(fā)明還有一個(gè)目的是，提供包括一種陽(yáng)離子芳香族化合物和一種可被激發(fā)降解并發(fā)光的式Ⅰ化合物的組合物。
            
本發(fā)明還有一個(gè)目的是，提供一個(gè)改進(jìn)的試劑組合物和磷酸酶反應(yīng)并發(fā)光的方法。
            
本發(fā)明還有一個(gè)目的是，提供一個(gè)能和磷酸酶反應(yīng)而迅速地產(chǎn)生有效的化學(xué)發(fā)光的組合物和方法。
            
本發(fā)明的上述和其它目的及優(yōu)點(diǎn)，要通過(guò)包括一種陽(yáng)離子芳香族化合物和一種式Ⅰ化合物在內(nèi)的試劑組合物，來(lái)實(shí)現(xiàn)。
            
本發(fā)明的上述和其它目的及優(yōu)點(diǎn)，要通過(guò)一種能在磷酸酶存在時(shí)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的試劑組合物而實(shí)現(xiàn)，該試劑組合物作為水溶液包括一種陽(yáng)離子芳香族化合物，一種能和磷酸酶反應(yīng)的式Ⅰ化合物，另結(jié)合了能迅速地產(chǎn)生高效的化學(xué)發(fā)光的有效劑量的至少一種陰離子型表面活性劑和至少一種非離子型表面活性劑。
            
本發(fā)明還有一個(gè)目的就是，提供一個(gè)用于制備能和磷酸酶反應(yīng)并發(fā)光的化學(xué)發(fā)光化合物的合成方法，以及其中有用的中間體。
            
本發(fā)明還有一個(gè)目的就是，提供一個(gè)用于制備式Ⅰ的化學(xué)發(fā)光化合物的方法和中間體，該式Ⅰ化合物包括磷酸烯醇酯基和雜環(huán)基，它能在去除磷酸酯保護(hù)基的情況下和氧反應(yīng)，產(chǎn)生發(fā)光和一個(gè)羰基化合物。
            
本發(fā)明還有一個(gè)目的就是，提供一個(gè)包括磷酸化烯醇的酯或烯醇的硫酯化合物，產(chǎn)生能去除保護(hù)成為磷酸單酯鹽的磷酸二酯或三酯中間體的方法。
            
附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明
            

            
圖1所示的是100μl的試劑在25℃加入8×10-16摩爾的堿性磷酸酶(AP)，激發(fā)產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光的強(qiáng)度-時(shí)間曲線。該試劑含0.33mM的9,10-二氫化吖啶磷酸酯(acridan phosphate)1(9-(苯氧磷酰氧亞甲基)-10-甲基-9,10-二氫化吖啶，二鈉鹽)的pH 8.5的0.1M tris緩沖液的溶液，和0.01mg/ml的增強(qiáng)因子聚乙烯芐基三丁基鏻氯化物共-聚乙烯芐基三辛基鏻氯化物(三丁基∶三辛基基團(tuán)比例約為3∶1)，(增強(qiáng)因子A)。該圖也顯示了由10-甲基-9,10-二氫化吖啶-9-羧酸苯酯代替1的類似的試劑組合物的化學(xué)發(fā)光對(duì)比曲線。
            
圖2所示的是，在室溫下，包括有3毫升的含1的試劑組合物和2.4×10-12摩爾的AP在內(nèi)的反應(yīng)混和物的紫外-可見(jiàn)吸收光譜曲線。標(biāo)有A-F的曲線分別代表加入酶后0,5,10,20,40和60分鐘的掃描結(jié)果。
            
圖3所示的是，由含有1的200μl試劑組合物和8×10-13摩爾AP在室溫反應(yīng)所產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光光譜曲線。
            
圖4所示的是，由含有9,10-二氫化吖啶磷酸酯1的100微升試劑在室溫激發(fā)所發(fā)射的最大化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度相對(duì)于AP量的曲線。該化學(xué)發(fā)光是在室溫通過(guò)將10微升的分別含有8×10-15～8×10-20摩爾酶的AP液加到100微升含有0.33mM的9,10-二氫化吖啶磷酸酯1的tris緩沖液(0.1M,pH8.5)、0.88mM Mg2+和0.01mg/ml的增強(qiáng)因子的溶液的白色微孔板的孔中。該術(shù)語(yǔ)S-B是指有AP存在時(shí)，以相對(duì)光單位(RLU)表示的化學(xué)發(fā)光信號(hào)(S)除去無(wú)AP存在時(shí)的本底化學(xué)發(fā)光(B)。該圖顯示了堿性磷酸酶的線性檢測(cè)。在此條件下，理論上的檢測(cè)限(本底標(biāo)準(zhǔn)差的兩倍)定為8×10-19摩爾。
            
圖5所示的是，由100微升的含有0.33mM的9,10-二氫化吖啶磷酸酯1的0.1Mtris緩沖溶液(pH9),0.88m MgCl2的試劑組合物所發(fā)射的總化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度相對(duì)于AP的量的曲線。將這種組合物于室溫和10μl的含有8×10-15到8×10-20摩爾的酶的AP溶液，或是作為空白試劑的10μl水在黑色的微孔板孔中反應(yīng)。加入含有0.5mg/ml的增強(qiáng)因子A的1N NaOH(100μl)溶液后積分光強(qiáng)度10秒鐘。該圖顯示了堿性磷酸酶的線性檢測(cè)關(guān)系。
            
圖6所示的是Westem-blot實(shí)驗(yàn)的X-射線膠片的數(shù)值掃描圖，該實(shí)驗(yàn)是用化學(xué)發(fā)光試劑組合物通過(guò)AP標(biāo)記的抗體在PVDF膜上檢測(cè)人鐵傳遞蛋白。將分別含有5000,1000,180,30和5pg蛋白的鐵傳遞蛋白稀釋液電泳并轉(zhuǎn)移到膜上。蛋白測(cè)定是將該蛋白斑快速浸入含有0.5mg/ml的增強(qiáng)因子A的0.2M,pH9.6的2-氨基-2-甲基-1-丙醇緩沖溶液，0.88mM MgCl2和0.66mM的9,10-二氫化吖啶磷酸酯1的試劑組合物中，并在保溫10分鐘后暴露于X-射線膠片1分鐘而進(jìn)行的。
            
圖7所示的是加入光澤精到5和堿性磷酸酶(AP)的反應(yīng)溶液后，該反應(yīng)所產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光效應(yīng)曲線。將相同體積的兩種含有5的緩沖液溶液和8×10-16摩爾的堿性磷酸酶(AP)反應(yīng)。其中一個(gè)溶液還含有6.4μM的光澤精。
            
圖8所示的是100μl的試劑A在室溫通過(guò)加入8×10-16摩爾的AP激發(fā)而發(fā)射的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的時(shí)間曲線，其中該試劑A是由0.1M的tris緩沖液(pH8.8),6.4μM光澤精，0.66mM 9,10-二氫化吖啶磷酸酯5(從0.066M的甲醇溶液中1∶100稀釋而來(lái)),1mg/ml十二烷基硫酸鈉SDS,0.01mg/mlNa2SO3,0.033％(w/v)吐溫20和0.88mM MgCl2所組成的。該圖還顯示了含有5和陽(yáng)離子型聚合表面活性劑增強(qiáng)因子(0.25TB/TO)的試劑組合物的對(duì)比的化學(xué)發(fā)光曲線。
            
圖9所示的是由100μl含有9,10-二氫化吖啶磷酸酯5，光澤精，SDS和TWEEN 20的本發(fā)明的組合物試劑在25℃激發(fā)而產(chǎn)生的最大化學(xué)發(fā)光的強(qiáng)度相對(duì)于AP量的曲線。作為對(duì)照，還提供了用試劑組合物(試劑B)在37℃激發(fā)經(jīng)過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)而得到的類似曲線。該試劑B包含有相同的9,10-二氫化吖啶磷酸酯和(0.25TB/TO)，但卻不含光澤精。該化學(xué)發(fā)光的發(fā)射是通過(guò)將10μl的含有8×10-13和8×10-22摩爾的酶的AP溶液加入到100μl的存在于白色微孔板的孔中的各個(gè)試劑組合物中。該S-B是指用相對(duì)光單位(RLU)表示的化學(xué)發(fā)光信號(hào)(S)在AP存在時(shí)的值減去無(wú)AP存在時(shí)的本底化學(xué)發(fā)光(B)值所得的值。該圖顯示了含有光澤精的試劑A對(duì)AP的檢測(cè)限降低了100倍。
            
圖10所示的是由100μl的試劑組合物所發(fā)射的最大化學(xué)發(fā)光的強(qiáng)度相對(duì)于AP的量的曲線圖。該組合物包括0.66mM的9,10-二氫化吖啶磷酸酯7的0.1M tris緩沖液(pH8.8)溶液，6.4μM光澤精，1mg/ml SDS,0.01mg/ml Na2SO3,0.033％(w/v)的TWEEN20和0.88mM MgCl2。該組合物是在黑色微孔板孔中和10μl的含有8×10-15到8×10-22摩爾的酶的AP溶液，或和作為空白對(duì)照的10μl的水室溫反應(yīng)的，并在75秒鐘后進(jìn)行檢測(cè)。
            
圖11所示的是由100μl的試劑組合物所發(fā)射的最大化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度相對(duì)于AP量的曲線圖。該組合物包括0.66mM的9,10-二氫化吖啶磷酸酯8的0.1M tris緩沖液(pH8.8)溶液，6.4μM光澤精，1mg/ml SDS,0.01mg/ml的Na2SO3,0.033％(w/v)的TWEEN20和0.88mM的MgCl2。該組合物是在黑色微孔板孔中和10μl的含有8×10-15到8×10-22摩爾的酶的AP溶液，或和作為空白試劑的10μl的水室溫反應(yīng)并在75秒鐘后進(jìn)行檢測(cè)。
            
圖12所示的是由100μl的試劑在室溫通過(guò)加入8×10-16摩爾的AP而激發(fā)并發(fā)射的化學(xué)發(fā)光的快速產(chǎn)生的曲線(時(shí)間-光強(qiáng)度)。該試劑由0.1MTris緩沖液(pH8.8),6.4μM光澤精，0.66mM9,10-二氫化吖啶磷酸酯7(從其0.066M的甲醇溶液中1∶100稀釋而來(lái)),1mg/ml的SDS,1mg/ml的Na2SO3,0.033％(w/v)的TWEEN20和0.88mM的MgCl2所組成。
            
圖13所示的是用本發(fā)明的檢測(cè)試劑化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定人絨毛膜促性腺的激素(hCG)的結(jié)果的曲線。
            
圖14所示的是本發(fā)明的檢測(cè)試劑快速化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定甲狀腺刺激素(TSH)的結(jié)果的曲線。
            
圖15所示的是用本發(fā)明的檢測(cè)試劑化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定甲狀腺刺激素(TSH)的結(jié)果的曲線。
            
圖16所示的是用本發(fā)明的檢測(cè)試劑化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定雌二醇的結(jié)果曲線。
            
圖17所示的是在一個(gè)樣品中同時(shí)測(cè)定酸性磷酸酶和堿性磷酸酶的能力的曲線。上面的曲線是從含有兩種酶的一個(gè)樣品中發(fā)射的光，下面的曲線則代表從僅含酸性磷酸酶樣品中發(fā)射的光，中間的曲線則代表可歸因于堿性磷酸酶的上述兩曲線的差別。
            
圖18所示的是由100μl的組合物試劑所發(fā)射的最大化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度相對(duì)于AP量的曲線。該組合物包括0.66mM的9,10-二氫化吖啶磷酸酯12的0.1M tris緩沖液(pH8.8)溶液，6.4μM的光澤精，1mg/ml的SDS,0.01mg/ml的Na2SO3,0.033％(w/v)的TWEEN20和10μM的MgCl2。該組合物在黑色微孔板孔中和10μl的含有8×10-15到8×10-22摩爾酶的AP溶液，或和作為空白對(duì)照的10μl水室溫反應(yīng)并在75秒鐘后進(jìn)行檢測(cè)。
            
圖19所示的是由100μl的組合物試劑所發(fā)射的最大化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度相對(duì)于AP量的曲線。該組合物包括0.3mM的9,10-二氫化吖啶磷酸酯13的0.1M tris緩沖液(pH8.8)溶液，3.2μM光澤精，0.016％(w/v)的TWEEN 20和5μM的MgCl2。該組合物是在黑色微孔板孔中和10μl的含有8×10-15到8×10-22摩爾酶的AP溶液，或和作為空白試劑的10μl水室溫反應(yīng)并在75秒鐘后進(jìn)行檢測(cè)。
            
優(yōu)選的實(shí)施方案的說(shuō)明如申請(qǐng)人的同時(shí)待審的美國(guó)專利申請(qǐng)08/585,090所公開(kāi)的那樣，現(xiàn)已意外地發(fā)現(xiàn)，某些新的化合物和磷酸酶反應(yīng)產(chǎn)生易于檢測(cè)的化學(xué)發(fā)光。本發(fā)明的在磷酸酶存在時(shí)能產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的化合物具有通式 其中，Het是一至少含有一個(gè)含有至少一個(gè)選自N,O和S原子的五或六元環(huán)的雜環(huán)系統(tǒng)，Z是一個(gè)O或S原子，R6是允許光產(chǎn)生的機(jī)基團(tuán)，每個(gè)M獨(dú)立選自H和陽(yáng)離子中心，n是可滿足電荷中性的數(shù)字。磷酸酶和化合物Ⅰ在氧存在的條件下反應(yīng)生成電子激發(fā)狀態(tài)的含有羰基的式Ⅵ化合物(Ⅵ*)和去磷酸化的產(chǎn)物Ⅶ。輻射分解該Ⅵ*導(dǎo)致光的發(fā)射。 式Ⅰ的雜環(huán)系統(tǒng)包括至少一個(gè)選自N,O和S原子的雜原子并和帶有外向環(huán)雙鍵的碳環(huán)相聯(lián)。優(yōu)選的雜環(huán)化合物包括下列的式Ⅱ和Ⅲ化合物及其雙鍵異構(gòu)體或異構(gòu)體的混合物。
            
  其中的Z,M,n和R6如上述定義，而R1～R5如下文定義。
            
作為式Ⅰ化合物的優(yōu)選骨架，典型的含有Het基的環(huán)結(jié)構(gòu)包括下列結(jié)構(gòu)，其中的星號(hào)指示外向環(huán)雙鍵的位置。雖然沒(méi)有清楚地給出所有可能的取代類型，但顯而易見(jiàn)的是，每個(gè)環(huán)位置都可含有除了氫外的取代基。本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員會(huì)理解那些沒(méi)被具體列出的，卻屬于式Ⅰ范圍的其它雜環(huán)化合物。
            
在所有的上述化合物中，R1是一個(gè)有機(jī)基團(tuán)，其除了含有為滿足基團(tuán)中原子價(jià)而必需的H外，還含有1到50個(gè)選自C,N,O,S,P和鹵素的原子。該有機(jī)基團(tuán)優(yōu)選地選自烷基，取代的烷基，芳基，取代的芳基和芳烷基。更優(yōu)選地，R1基團(tuán)包括C1-C4的烷基和苯基。
            
在全部上述化合物中，可以是相同或不同的每個(gè)R2-R5基團(tuán)是H或一個(gè)允許光產(chǎn)生的取代基，并且其一般都帶有1到50個(gè)選自C,N,O,S,P和鹵素的原子?？梢粤谐龅牡湫偷娜〈?但并不限于)烷基，取代烷基，芳基，取代芳基，芳烷基，鏈烯基，炔基，烷氧基，芳氧基，鹵素，氨基，取代氨基，羧基，羰烷氧基，甲酰胺，氰基以及磺酸基。相鄰的基團(tuán)對(duì)的任一個(gè)或兩個(gè)基團(tuán)，即R2-R3或R4-R5都可以聯(lián)成碳環(huán)或雜環(huán)系統(tǒng)。該系統(tǒng)至少含有一個(gè)五或六元環(huán)并和帶有外向環(huán)雙鍵的環(huán)稠合。該稠合的雜環(huán)可以含有1個(gè)或多個(gè)N,O或S原子并且可以在環(huán)碳上用諸如上述的非氫的基團(tuán)所取代。
            
取代基可以不同的數(shù)量在選擇的環(huán)位點(diǎn)引入，以便改良該化合物的特性或?yàn)楹铣勺罱K的磷酸酯化合物提供便利。這些特性包括諸如化學(xué)發(fā)光量子率和酶反應(yīng)率，最大光發(fā)射強(qiáng)度，光發(fā)射的持續(xù)時(shí)間，發(fā)射光的波長(zhǎng)及其在反應(yīng)介質(zhì)中的溶解度。在下列具體的實(shí)施例中闡明了具體的取代基及其效應(yīng)，然而，這卻無(wú)論如何不能認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明范圍的限制。
            
每個(gè)M基團(tuán)分別含有一個(gè)氫原子或一個(gè)陽(yáng)離子中心。陽(yáng)離子中心的意思是諸如鈉原子Na+的帶正電荷的原子，諸如銨離子NH4+的原子團(tuán)或是帶有一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)的正電荷的分子的一部分。后者的例子包括申請(qǐng)人的美國(guó)專利5,451,347中所述的二價(jià)陽(yáng)離子化合物和申請(qǐng)人的美國(guó)專利5,393,469所述的帶有多價(jià)陽(yáng)離子基團(tuán)的聚合化合物。該陽(yáng)離子中心的正電荷可以是任何單位值，即1,2,3等。典型的陽(yáng)離子中心包括，但并不限于，堿金屬離子，堿土離子，季銨離子和季鏻離子，并且它們是按其價(jià)態(tài)所要求的數(shù)量而存在的。如果在式Ⅰ化合物中為了電中性的需要有兩個(gè)基團(tuán)，那么它們可以是相同的或不同的。優(yōu)選的抗衡離子是堿金屬離子。
            
如上所述，該有機(jī)基團(tuán)R6可以是任何允許，或不干擾，光產(chǎn)生的基團(tuán)，并且優(yōu)選地含有1到50個(gè)選自C,N,O,S,P和鹵素的原子，而所必需的H原子的數(shù)目是為了滿足基團(tuán)中原子的價(jià)態(tài)的需要。可以作為R6的基團(tuán)包括(但非限于)烷基，取代烷基，芳基，取代芳基和芳烷基。除了H原子外的諸如離子基團(tuán)或極性基團(tuán)的取代基可以不同的數(shù)目在所選擇的R6碳鏈或環(huán)的位置引入，以便改良該化合物的特性，或?yàn)樽罱K的磷酸酯化合物的合成提供便利。這些特性包括諸如化學(xué)發(fā)光量子率和酶反應(yīng)率，最大發(fā)射光強(qiáng)度，光發(fā)射的持續(xù)時(shí)間，發(fā)射光波長(zhǎng)及其在反應(yīng)介質(zhì)中的溶解度。在下列的具體實(shí)施例中闡明了具體的取代基及其效應(yīng)，但無(wú)論如何卻不能認(rèn)為這是對(duì)本發(fā)明范圍的限制。
            
該化合物的一種優(yōu)選類別具有下式Ⅳ的結(jié)構(gòu)，其中，Ar是帶有至少一個(gè)碳-或雜-芳環(huán)的芳環(huán)基團(tuán)，并且它還可以進(jìn)一步被取代，Z選自O(shè)和S原子，R1如上述定義，M是如上述的H或單價(jià)或二價(jià)陽(yáng)離子的抗衡離子，和n是2或1。 可以是相同或不同的每一個(gè)R7～R14基團(tuán)是H，或是含有1到50個(gè)選自C,N,O,S,P和鹵素的原子并且允許光產(chǎn)生的取代基。這些基團(tuán)可包括(并非限于)烷基，取代烷基，芳基，取代芳基，芳烷基，鏈烯基，炔基，烷氧基，芳氧基，鹵素，氨基，取代氨基，羧基，羰烷氧基，甲酰胺，氰基和磺酸基。相鄰的基團(tuán)，如R7～R8或R8～R9，可以聯(lián)接成含有至少一個(gè)5或6元環(huán)的碳環(huán)或雜環(huán)系統(tǒng)。R7～R14優(yōu)選選自氫和諸如甲氧基，乙氧基，叔-丁氧基的烷氧基及其類似物。特別優(yōu)選的化合物具有式Ⅴ結(jié)構(gòu)，其中的Z是O或S,Ar是苯基、取代苯基、萘基或取代萘基，M和n則如上述定義。
            
本發(fā)明的另一方面是在和磷酸酶反應(yīng)產(chǎn)生可見(jiàn)的化學(xué)發(fā)光的方法中，式Ⅰ-Ⅴ的任何一個(gè)化合物的使用。將式Ⅰ-Ⅴ化合物和磷酸酶在含水緩沖溶液中反應(yīng)產(chǎn)生易于檢測(cè)的化學(xué)發(fā)光。當(dāng)該反應(yīng)于室溫在堿性pH進(jìn)行時(shí)，光強(qiáng)度在數(shù)分鐘內(nèi)達(dá)到最高水平。任選地，該反應(yīng)可在有增強(qiáng)因子存在的條件下進(jìn)行。 盡管在這里不希望束縛于任何對(duì)該發(fā)現(xiàn)的具體的機(jī)理解釋，但分子氧是必需的反應(yīng)物并且該反應(yīng)產(chǎn)物是酮Ⅵ，酯或硫酯Ⅶ，式R6ZH化合物和磷酸根離子。光發(fā)射來(lái)自處于電子激發(fā)態(tài)的Ⅵ。光產(chǎn)生的一個(gè)必要條件是該反應(yīng)在能產(chǎn)生足夠的能量以形成激發(fā)態(tài)的Ⅵ。如果Ⅵ是熒光的，那么化學(xué)發(fā)光通過(guò)激發(fā)態(tài)的Ⅵ發(fā)射而直接從反應(yīng)中產(chǎn)生。一個(gè)特別意外的發(fā)現(xiàn)是式Ⅰ化合物和磷酸酶在中等堿性pH中反應(yīng)所產(chǎn)生的光發(fā)射強(qiáng)度要比，其通過(guò)斷裂磷酸基所形成的烯醇酯中間體(Ⅶ陰離子)的自動(dòng)氧化作用所產(chǎn)生的強(qiáng)度，要高得多。
            
在一個(gè)優(yōu)選的產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的方式中，含有9,10-二氫化吖啶環(huán)的化合物和堿性磷酸酶，在pH介于8到10的堿性緩沖液中反應(yīng)，產(chǎn)生起始于該酶和磷酸酯化合物反應(yīng)的連續(xù)化學(xué)發(fā)光信號(hào)。任何時(shí)間點(diǎn)的光強(qiáng)度都可通過(guò)加入至少一種將在下文中有更為詳細(xì)的說(shuō)明的表面活性劑增強(qiáng)因子而增加到至少40倍。
            
在一個(gè)優(yōu)選的從式Ⅳ化合物和磷酸酶的反應(yīng)中產(chǎn)生光的方法中，該反應(yīng)是在溫度介于5℃到50℃，優(yōu)選介于20℃到40℃,pH介于7到10.5,優(yōu)選介于8.5到10的緩沖水溶液中進(jìn)行的。所用的式Ⅳ化合物的濃度介于1μM到20mM，優(yōu)選介于10μM到1mM。該酶優(yōu)選是堿性磷酸酶或堿性磷酸酶的聯(lián)接物。光是從激發(fā)態(tài)的Ⅷ中發(fā)射的。
            
典型地，本發(fā)明的化合物產(chǎn)生出發(fā)射波段寬度介于100-200nm的光，且其在波長(zhǎng)從近紫外區(qū)到可見(jiàn)區(qū)的電磁波譜中具有最大強(qiáng)度。典型的最大強(qiáng)度波長(zhǎng)λmax介于350-500nm。考慮到可能是，帶有共價(jià)聯(lián)接的但并非和乙烯基磷酸酯部分的雙鍵結(jié)合的熒光團(tuán)的式Ⅰ磷酸酯化合物可以在激發(fā)態(tài)的產(chǎn)物Ⅵ*形成的基礎(chǔ)上進(jìn)行分子內(nèi)的能量轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致激發(fā)態(tài)的熒光團(tuán)在較長(zhǎng)的波長(zhǎng)輻射。
            
可以在一種方法中，同時(shí)使用多于一種的式Ⅰ化合物通過(guò)與磷酸酶的作用而發(fā)光。在一些情況下，同時(shí)使用二種或更多種式Ⅰ化合物和磷酸酶反應(yīng)可能有利。當(dāng)該兩種或更多種化合物具有不同的發(fā)光或物理性質(zhì)時(shí)，可以期望此二者的結(jié)合產(chǎn)生出具有使用任何一種化合物都不易獲得的特征的發(fā)光反應(yīng)。式Ⅰ化合物間可能不同的發(fā)光和物理特性的例子包括發(fā)射光譜，光發(fā)射時(shí)間，酶周轉(zhuǎn)，增長(zhǎng)到最大的輻射的速率，疏水性/親水性以及溶解度。盡管在本方法的式Ⅰ化合物間不同的可能尤其是發(fā)光性質(zhì)，但這些性質(zhì)上的差異并不影響該化合物的基本用途；可以根據(jù)這里所述的指導(dǎo)和方法對(duì)具有合適的特性的特別化合物作出選擇。
            
本方法的光發(fā)射可以用任何已知的合適設(shè)備進(jìn)行檢測(cè)，比如發(fā)光計(jì)，X射線膠片，高速攝相膠片，CCD照相機(jī)，閃爍計(jì)數(shù)器，化學(xué)曝光計(jì)或視覺(jué)方法。每種方式具有不同的光譜敏感性。人眼對(duì)綠光最敏感，CCD照相機(jī)對(duì)紅光最敏感，X射線膠片對(duì)紫外到藍(lán)色的光或?qū)G光最敏感。檢測(cè)設(shè)備的選擇可根據(jù)用途和費(fèi)用、方便性的考慮以及是否需要永久記錄結(jié)果而進(jìn)行。
            
可以考慮，使用熒光能量受體將最大發(fā)射(波長(zhǎng))移至更長(zhǎng)的波長(zhǎng)處(紅移)。各種紅移發(fā)射技術(shù)在光化學(xué)反應(yīng)和試驗(yàn)領(lǐng)域內(nèi)是眾所周知的。如上述的共價(jià)聯(lián)接熒光團(tuán)就是一個(gè)例子。熒光增白劑可作為單獨(dú)的物質(zhì)加入該反應(yīng)液中。熒光增白劑可以和諸如陽(yáng)離子聚合物的增強(qiáng)因子相聯(lián)，或和諸如膠束或聚合物的增強(qiáng)因子相聯(lián)，以便使該熒光增白劑和該化合物緊密接觸?；蛘?，可以在酶反應(yīng)期間，通過(guò)去除磷酸酯基團(tuán)，提供可轉(zhuǎn)化成熒光形式的以非熒光形式存在的熒光增白劑。而后者的例子包括熒光素二磷酸酯，香豆素磷酸酯如4-甲基-7羥基香豆素磷酸酯，苯并噻唑磷酸酯如ATTOPHOS(JBLScientific,San Luis Obispo,California)。
            
在本發(fā)明的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中也可以使用至少一種增強(qiáng)因子化合物以便增加發(fā)射光的量。在本方法中有效的增強(qiáng)因子的作用可以通過(guò)增加發(fā)光的激發(fā)態(tài)產(chǎn)物分子的份額，通過(guò)增加以激發(fā)態(tài)形成的產(chǎn)物分子的份額，通過(guò)增加酶的反應(yīng)或周轉(zhuǎn)率，通過(guò)增加隨后的化學(xué)反應(yīng)步驟的速率，通過(guò)改善酶的穩(wěn)定性，通過(guò)促進(jìn)該酶和式Ⅰ化合物的結(jié)合，通過(guò)抑制或阻止競(jìng)爭(zhēng)性的非發(fā)光副反應(yīng)，或通過(guò)任何這些機(jī)理的組合。使用有效劑量的增強(qiáng)因子以增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光，其劑量在終反應(yīng)液中優(yōu)選介于0.001到5mg/ml間，更優(yōu)選介于0.01到2.5mg/ml間。
            
在本方法的操作中有效的增強(qiáng)因子化合物是典型的表面活性劑化合物，即那些具有表面活性的特性，如表面張力減弱，表面濕潤(rùn)或去污的化合物。表面活性劑包括一個(gè)帶有極性的和/或離子的基團(tuán)的親水區(qū)域和一個(gè)主要含有烴基或亞烷氧基或兩者都有的疏水區(qū)域。表面活性劑可分成陽(yáng)離子型，陰離子型，非離子型和兩性離子型，并可以是單聚的或多聚的。已發(fā)現(xiàn)的在本發(fā)明的實(shí)際操作中有用的陽(yáng)離子型表面活性劑包括帶有季鏻基側(cè)基的聚乙烯型聚合物，這在美國(guó)專利5,393,469中已公開(kāi)，其公開(kāi)內(nèi)容作為參考文獻(xiàn)引入本發(fā)明。這類聚合物的實(shí)例包括聚乙烯芐基三丁基鏻氯化物和聚乙烯芐基三辛基鏻氯化物的共聚物，以及(聚乙烯芐基三丁基鏻氯化物)。帶有季銨側(cè)基的聚乙烯型聚合物也作為增強(qiáng)因子用于本發(fā)明。此類聚合物的實(shí)例公開(kāi)于美國(guó)專利5,112,960，其公開(kāi)內(nèi)容作為參考文獻(xiàn)引入本發(fā)明，并且它包括聚乙烯芐基芐基二甲基銨氯化物和聚乙烯芐基三丁基銨氯化物。
            
另一類已發(fā)現(xiàn)的在本發(fā)明的實(shí)踐中有用的陽(yáng)離子表面活性劑增強(qiáng)因子是，如美國(guó)專利5,451,347(其公開(kāi)內(nèi)容作為參考文獻(xiàn)引入本發(fā)明)中所公開(kāi)的，帶有兩個(gè)季銨基或鏻基的二價(jià)陽(yáng)離子化合物。比如可以使用(二氯化1-三辛基鏻甲基-4-三丁基鏻甲基苯，在按照本發(fā)明的發(fā)光方法中增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光。還有其它一些在本發(fā)明的實(shí)踐中有用的表面活性劑增強(qiáng)因子是，單季銨鹽如十六烷基甲基銨氯化物或溴化物和如十六烷基甲基溴化銨的單季鏻鹽。
            
陰離子型表面活性劑增強(qiáng)因子包括烷基硫酸鹽和烷基磺酸鹽。非離子型表面活性劑增強(qiáng)因子包括聚氧乙烯化的烷基酚，聚氧乙烯化的乙醇，聚氧乙烯化的醚和聚氧乙烯化的山梨醇酯。兩性離子表面活性劑增強(qiáng)因子包括季銨烷基磷酸鹽和磺酸鹽。每類表面活性劑的示范結(jié)構(gòu)的更全面的記錄可參考任何級(jí)別的有關(guān)表面活性劑的論文中。已試驗(yàn)出許多典型的表面活性劑并已發(fā)現(xiàn)其在不同的程度上比其不存在時(shí)可增加光產(chǎn)生的量和強(qiáng)度。特別地，已發(fā)現(xiàn)陽(yáng)離子表面活性劑季銨鹽和季鏻鹽是最有效的增強(qiáng)因子。
            
如上文所述，表面活性劑增強(qiáng)因子還可以通過(guò)靜電作用或疏水作用，帶有共價(jià)結(jié)合或締合的熒光基團(tuán)。
            
在完成本化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的一個(gè)另外的替代方式中，該化學(xué)發(fā)光化合物在沒(méi)有增強(qiáng)因子存在的幾秒鐘到約等于十分鐘的第一段時(shí)間內(nèi)，和緩沖液中的磷酸酶在5.0到9.5的第一個(gè)pH范圍內(nèi)反應(yīng)。忽略在此第一段時(shí)間發(fā)出的所有光。然后立即加入含有增強(qiáng)因子的強(qiáng)堿性激發(fā)溶液并測(cè)定發(fā)射光的峰值，或積分第二個(gè)固定時(shí)間段內(nèi)或直至光發(fā)射終止的光發(fā)射。理想的是，選擇合適的pH和增強(qiáng)因子量以便使全部光在一個(gè)優(yōu)選約為一分鐘或更少的時(shí)間段內(nèi)發(fā)射。該激發(fā)溶液的pH應(yīng)該大于11且優(yōu)選大于12。優(yōu)選的堿是氫氧化鈉和氫氧化鉀。在這種反應(yīng)方式中有用的增強(qiáng)因子是按前述的方法分類的并以有效的劑量使用，以增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光。該劑量?jī)?yōu)選是在終反應(yīng)液中介于0.001到1mg/mL。
            
這種產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的方式可能在同時(shí)處理大量樣品以便在隨后的時(shí)間內(nèi)檢測(cè)的試驗(yàn)中有利。酸性磷酸酶的檢測(cè)也可以按此方式進(jìn)行。一個(gè)也可任選加入該化學(xué)發(fā)光反應(yīng)或試驗(yàn)的步驟是，在第一段時(shí)間后加入一種酶抑制劑到該反應(yīng)體系中，以終止全部的進(jìn)一步的酶反應(yīng)。
            
由于該反應(yīng)是由磷酸酶催化的，極少量的酶足以產(chǎn)生可檢測(cè)的量的光。靈敏度已達(dá)到1×10-18摩爾。這種檢測(cè)如此少量磷酸酶的能力使得本化學(xué)發(fā)光技術(shù)適于測(cè)定許多類型的使用酶聯(lián)檢測(cè)的被分析物。
            
本發(fā)明的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)提供了一個(gè)特別有效的檢測(cè)那些結(jié)合于聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，尼龍膜和硝酸纖維素濾紙和膜上的AP聯(lián)接物的試劑。令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，PVDF膜上的抗體-AP聯(lián)接物和含有化合物1的試劑組合物反應(yīng)，產(chǎn)生了強(qiáng)烈的幾乎立即達(dá)到最高水平的化學(xué)發(fā)光并且它基本上能維持連續(xù)的強(qiáng)度至少兩天。因此，這對(duì)膠片檢測(cè)和優(yōu)化影像強(qiáng)度是特別方便的。 意外地發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)生于PVDF膜上的光發(fā)射在有用的水平上持續(xù)很長(zhǎng)時(shí)間，超過(guò)一個(gè)月。那些本領(lǐng)域熟悉的用于基于膜的檢測(cè)方案的化學(xué)發(fā)光試劑提供了一個(gè)帶有時(shí)間程序的化學(xué)發(fā)光信號(hào)，它表示或迅速衰減，如帶有過(guò)氧化物酶的魯米諾在3-4小時(shí)內(nèi)衰減；或，緩慢上升且漸漸地衰減，如酶激發(fā)的二氧四節(jié)環(huán)類。
            
另一方面，本發(fā)明涉及通過(guò)和磷酸酶反應(yīng)而產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的試劑組合物，其包括一種pH介于大約7到10.5的緩沖水溶液，一種濃度介于0.01到10mM間的式Ⅰ化合物，以及可選擇性加入的，至少一種優(yōu)選介于0.001到10mg/ml間有效效量的用于增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)因子。和堿性磷酸酶進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的配方還可包括0.01-10mM濃度的鎂或鋅鹽以增加酶的活性。
            
一個(gè)優(yōu)選的和堿性磷酸酶反應(yīng)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的試劑組合物包含有一種pH介于大約7到10.5間的緩沖水溶液，濃度介于0.01到10mM的式Ⅳ或Ⅴ的9,10-二氫化吖啶磷酸酯，以及優(yōu)選介于0.001到10mg/ml的有效劑量的用于增強(qiáng)該化學(xué)發(fā)光的表面活性劑增強(qiáng)因子。該配方還包含有濃度介于0.01到10mM的鎂鹽。
            
組合物試劑中的表面活性劑優(yōu)選選自含有銨或鏻基團(tuán)的聚合陽(yáng)離子增強(qiáng)因子和含有銨或鏻基團(tuán)的二價(jià)陽(yáng)離子增強(qiáng)因子。特別優(yōu)選的是在每個(gè)單體單元上帶有一個(gè)三烷基鏻基側(cè)基的聚乙烯聚合物，以及在每個(gè)單體單元上帶有一個(gè)三烷銨基或芐基二烷銨基側(cè)基的聚乙烯聚合物。在一個(gè)給定的應(yīng)用中，可按照常規(guī)的實(shí)驗(yàn)方法選擇增強(qiáng)因子及其量以期發(fā)揮其最佳作用。一個(gè)優(yōu)選的測(cè)定溶液中的AP或聯(lián)接物的組合物包括胺緩沖液(pH8.5),9-(苯氧磷酰氧亞甲基)-10-甲基二氫化吖啶，二鈉鹽化合物，0.1-1mM，鎂鹽化合物，0.1-1mM，以及增強(qiáng)因子A(聚乙烯芐基三丁基鏻氯化物共-聚乙烯芐基三辛基鏻氯化物，三甲基∶三辛基約為3∶1的比率)，0.01-0.1mM。一個(gè)優(yōu)選的測(cè)定膜上的AP或其聯(lián)接物的組合物包括一pH9.6的胺緩沖液，9-(苯氧磷酰氧亞甲基)-10-甲基二氫吖啶，二鈉鹽化合物，0.1-1mM，鎂鹽化合物，0.1-1mM，以及增強(qiáng)因子A,0.1-1mM。
            
申請(qǐng)人的同時(shí)待審的美國(guó)專利申請(qǐng)08/683,927公開(kāi)了在上述反應(yīng)體系中加入陽(yáng)離子芳族化合物(CAC)從而大大地提高了光產(chǎn)生的量和/或強(qiáng)度。而且，將該CAC在無(wú)磷酸酶存在的情況下加入式Ⅰ化合物并沒(méi)有導(dǎo)致相應(yīng)自發(fā)的(背景)化學(xué)發(fā)光的增加，因?yàn)閾?jù)信，該CAC是對(duì)衍生于式Ⅰ化合物的去磷酰化中間體起作用而并非對(duì)式Ⅰ化合物本身起作用。明顯的是，該光發(fā)射連續(xù)產(chǎn)生于激發(fā)態(tài)的Ⅵ而不是CAC。 已發(fā)現(xiàn)各種CAC能對(duì)光產(chǎn)生的量和/或強(qiáng)度的增加起作用。各種CAC(CACs)是在該芳環(huán)或環(huán)體系或其中的一個(gè)環(huán)上一個(gè)取代基上帶有至少一個(gè)正電荷的芳族化合物，前提是該取代基和不飽和環(huán)原子相聯(lián)。
            
本發(fā)明的CACs是那些具有氧化/還原能力的、適于在本發(fā)明的反應(yīng)中引起化學(xué)發(fā)光增加的化合物。作為CACs的化合物的適應(yīng)性可通過(guò)下列具體實(shí)施例所述的方法而容易地確定。不限制于任何具體的機(jī)理解釋，Ⅰ的去磷酰化作用的中間產(chǎn)物將進(jìn)行一個(gè)可逆的或不可逆的氧化還原反應(yīng)。分子氧和該反應(yīng)中的選自CAC、還原態(tài)的CAC或式Ⅰ化合物的去磷?；虚g體、或其氧化態(tài)或還原態(tài)的一種或幾種的反應(yīng)物反應(yīng)，并最終生成衍生于式Ⅰ化合物的氧化反應(yīng)產(chǎn)物。該氧化反應(yīng)產(chǎn)物再進(jìn)行一個(gè)很可能是O-O鍵斷裂的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。
            
本發(fā)明的CACs可以是帶有一個(gè)或多個(gè)單獨(dú)的或稠合的芳環(huán)的雜芳環(huán)化合物，并且該芳環(huán)含有至少一種非碳原子(雜原子)，優(yōu)選含有一個(gè)或多個(gè)氮原子并且該正電荷基本上位于一個(gè)或多個(gè)雜原子上。此類CAC的實(shí)例是花青染料，硫代花青染料，羰花青染料，硫代羰花青染料，硒酸羰花青染料，偶氮染料和下式的吖啶衍生物 其中Q是吸電子基團(tuán)，X-是無(wú)干擾的陰離子抗衡離子，R是可選擇性含有非干擾取代基的烷基或芳烷基。其中的一些環(huán)氫被其它取代基取代的吖啶衍生物也在該CACs的范圍內(nèi)。該吸電子基團(tuán)Q可以是如鹵素(如Cl，氰基，或是諸如酯基-COOR，硫酯基-COSR，酰胺基-COMR1R2的羰基，或是磺酰胺基-CON(R)SO2R’。類似地，該CAC可以是菲啶或菲咯啉化合物的一個(gè)衍生物。
            
如果該陽(yáng)離子位點(diǎn)是和芳環(huán)相結(jié)合的，本發(fā)明的CACs可以是含有一個(gè)或多個(gè)弧立的或稠合的碳環(huán)的芳環(huán)的芳環(huán)化合物，且該芳環(huán)至少帶有一個(gè)含至少一個(gè)雜原子的陽(yáng)離子取代基。在最新種類的CAC中，該雜原子優(yōu)選是N或S原子。其實(shí)例包括亞甲藍(lán)和尼羅藍(lán)。
            
本發(fā)明的CACs可帶有不止一個(gè)正電荷；如二價(jià)陽(yáng)離子化合物屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)。典型的此類化合物包括俗稱光澤精的N,N′-二甲基二吖啶二硝酸酯，和俗稱二氯化甲基Viologen或二氯化百草枯的1,1′-二甲基-4,4′-二吡啶二氯化物。
            
順便說(shuō)明，在本發(fā)明中用作CAC成分的其它化合物包括表1中的化合物。表1，CACsAlcian黃，堿性藍(lán)41，堿性藍(lán)66，堿性紅29,3-芐基-5-(2-羥乙基)-4-甲基噻唑，高氯酸[2-[2-[2-氯-3-[(1,3-二氫-1,3,3-三甲基-2H-吲哚-2-亞基)亞乙基]-1-環(huán)己烯-1-基]乙烯基]1,3,3-三甲基吲哚,{IR-786高氯酸鹽}，碘化反式-4[4-(二丁基氨基)苯乙烯基]-1-甲基吡啶碘化5,5′-二氯-11-二苯基氨基-3,3′-二乙基-10,12-乙烯硫代三羰花青，{IR-140}，碘化3,3′-二乙基-9-甲基硫代羰花青，
            
碘化1,1′-二乙基-2,2′奎諾三羰花青，碘化3,3′-二乙基硒代羰花青，碘化3,3′-二乙基硫代花青，碘化3,3′-二乙基硫代二羰花青，碘化2-[4-(二甲基氨基)苯乙烯基]-3-乙基苯并噻唑，溴化3,6-二甲基-2-(4-二甲基氨基苯基)-苯并噻唑，碘化3,4-二甲基-5-(2-羥乙基)噻唑，四氫硼酸4-[2-[3-[(2,6-二苯基-4H-噻喃-4-亞基)亞乙基]-2-苯基-1-環(huán)-己烯-1-基]乙烯基]-2,6-二苯基-硫代吡咯，{IR-1040}，碘化5-[3-乙氧基-4-(3-乙基-5-甲基-2(3H)-苯并噻唑基-亞基)-2-亞丁烯基]-3-乙基-2-[(3-乙基-4,5-二苯基-2(3H)-亞噻唑基)甲基]-4,5-二氫-4-氧代噻唑，氯化3-乙基-2-(2-羥基-1-丙烯基)苯并噻唑，碘化3-乙基-2-甲基苯并噻唑，碘化3-乙基-2-甲基苯并噁唑，氯化1-乙基-3-甲基-1H-咪唑，亞甲藍(lán)，尼羅藍(lán)A，以及三磷酸吡啶核苷酸，鈉鹽水合物因此，本發(fā)明的另一方面是在通過(guò)和磷酸酶反應(yīng)而產(chǎn)生可檢測(cè)的化學(xué)發(fā)光的方法中，使用任何一個(gè)式Ⅰ-Ⅴ化合物和CAC。式Ⅰ-Ⅴ化合物和磷酸酶在有CAC存在的含水緩沖液中反應(yīng)，產(chǎn)生出發(fā)自激發(fā)態(tài)的Ⅳ中的易于檢測(cè)的化學(xué)發(fā)光。當(dāng)該反應(yīng)于室溫在堿性pH中進(jìn)行時(shí)，光強(qiáng)度在數(shù)秒到數(shù)分鐘內(nèi)即可達(dá)到最高水平。 在一個(gè)優(yōu)選的產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的方法中，含有一個(gè)9,10-二氫化吖啶環(huán)的式Ⅳ化合物，在有CAC存在且pH介于7到10.5的堿性緩沖液中，和堿性磷酸酶反應(yīng)，產(chǎn)生出起始于該酶反應(yīng)的連續(xù)的化學(xué)發(fā)光信號(hào)，并迅速達(dá)到強(qiáng)度峰值。如同下文中更加詳細(xì)說(shuō)明的那樣，在該組合中加入一種陰離子表面活性劑和一種非離子型表面活性劑將會(huì)進(jìn)一步改進(jìn)該發(fā)光反應(yīng)。 在一個(gè)優(yōu)選的從式Ⅳ化合物和磷酸酶以及CAC的反應(yīng)中發(fā)光的方法中，該反應(yīng)是在溫度介于5℃到50℃，通常介于20℃到40℃,pH介于7到10.5，優(yōu)選介于8到10的緩沖水溶液中進(jìn)行的。由于近乎室溫的溫度對(duì)光強(qiáng)度的影響較小，所以在室溫中進(jìn)行該反應(yīng)特別方便，無(wú)需精確地調(diào)節(jié)溫度。所用的式Ⅳ化合物的濃度介于1μM到20mM，優(yōu)選10μM到10mM。而該酶則優(yōu)選是堿性磷酸酶或其結(jié)合物。
            
可在一個(gè)方法中同時(shí)使用不止一種的式Ⅰ-Ⅴ化合物，其通過(guò)堿性磷酸酶在有CAC存在的條件下的作用而發(fā)光。將兩種或兩種以上的式Ⅰ-Ⅴ化合物同時(shí)和磷酸酶及CAC反應(yīng)在一些情況下可能有利。當(dāng)兩種或兩種以上的化合物具有不同的發(fā)光或物理特性時(shí)，可以要求該組合產(chǎn)生出其特性不易通過(guò)使用任何一個(gè)化合物而獲得的光發(fā)射反應(yīng)。式Ⅰ-Ⅴ化合物間可能不同的發(fā)光和物理特性的實(shí)例包括發(fā)射光譜，發(fā)光持續(xù)時(shí)間，酶周轉(zhuǎn)，最大發(fā)射的發(fā)生率，疏水性/親水性和溶解度。
            
類似地，可在一種方法中同時(shí)使用多于一種的CAC，通過(guò)堿性磷酸酶的作用而發(fā)光。所用的CAC濃度介于10-2M到10-9M間，優(yōu)選10-4到10-7M間。用于本法中具體的CAC的理想濃度可按照下文具體的實(shí)施例中所述方法而方便地確定。
            
另一方面，本發(fā)明涉及一種通過(guò)和堿性磷酸酶反應(yīng)而產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的試劑組合物，其包括一種pH介于大約7到10.5的緩沖水溶液，一種式Ⅰ-Ⅴ化合物以及能提供可增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光水平的有效量的CAC。
            
另外，已發(fā)現(xiàn)在式Ⅰ-Ⅴ化合物及CAC和堿性磷酸酶的反應(yīng)中加入某種添加劑將進(jìn)一步對(duì)該發(fā)光反應(yīng)產(chǎn)生有利的改進(jìn)。因此，本發(fā)明還有一方面是涉及含有一種式Ⅰ-Ⅴ化合物，一種CAC，一種有效劑量的陰離子表面活性劑和一種有效量的非離子型表面活性劑的試劑組合物。陰離子型表面活性劑實(shí)際上起著提高達(dá)到最大化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的速度的作用。非離子型表面活性劑則實(shí)際上起著增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光產(chǎn)生的量和強(qiáng)度的作用。使用后者組合物對(duì)提供可迅速達(dá)到并維持光強(qiáng)度峰值的增強(qiáng)的光發(fā)射尤其有利。
            
和其中的陽(yáng)離子表面活性劑能增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光的產(chǎn)生的申請(qǐng)人的同時(shí)待審的申請(qǐng)08/585,090的方法相反，無(wú)論加入單體的或聚合的陽(yáng)離子型表面活性劑，都不能促進(jìn)需要CAC存在的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。在一些情況下，含有陽(yáng)離子型表面活性劑實(shí)際上會(huì)抑制光的產(chǎn)生。本方法和組合物中的陽(yáng)離子型表面活性劑的相反的作用，更支持和說(shuō)明了本化學(xué)發(fā)光反應(yīng)方法的引用CAC的獨(dú)到之處。
            
在含有一種CAC的組合物中使用的陰離子型表面活性劑包括具有至少十個(gè)碳原子的烷基的烷基硫酸鹽和烷基磺酸鹽。優(yōu)選的化合物是十二烷基磺酸鈉(SDS)。所用的陰離子型表面活性劑的量?jī)?yōu)選為大約10m/ml到10μg/ml。
            
用于含有一種CAC的組合物中的非離子型表面活性劑包括聚氧乙烯化的烷基酚，聚氧乙烯化的乙醇，聚氧乙烯化的醚以及聚氧乙烯化的山梨醇酯。優(yōu)選的非離子型表面活性劑包括TWEEN 20和TRITON X-100。所用的非離子型表面活性劑的量?jī)?yōu)選介于該組合物的大約1.0％到0.001％的重量百分比。
            
各類表面活性劑的示解結(jié)構(gòu)的更為廣泛的記錄可參考有關(guān)表面活性劑的任何級(jí)別的論文，并且這也是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所共知的。申請(qǐng)人已試驗(yàn)了許多代表性的表面活性劑，并發(fā)現(xiàn)，和其不存在時(shí)相比，它們能在不同程度上增加光產(chǎn)生的量和強(qiáng)度。
            
本發(fā)明還有一個(gè)方面是一種試劑組合物，其包括一種式Ⅰ-Ⅴ的化合物，一種CAC，一種有效量的陰離子型表面活性劑，一種有效量的非離子型表面活性劑，以及一種有效量的能減少在無(wú)堿性磷酸酶存在時(shí)的組合物中光產(chǎn)生(背景化學(xué)發(fā)光)的背景抑制劑。
            
背景抑制劑是那些能減少無(wú)堿性磷酸酶存在的組合物中光產(chǎn)生的化合物。這種抑制劑也能起著防止背景化學(xué)發(fā)光在一段時(shí)間內(nèi)的累聚作用。這種抑制劑還能起著改善由該組合物和堿性磷酸酶的反應(yīng)所產(chǎn)生的特異信號(hào)和背景化學(xué)發(fā)光的比率(信噪比)的作用。優(yōu)選的能有效地減少背景化學(xué)發(fā)光的量的化合物包括，諸如亞硫酸鋰，亞硫酸鈉和亞硫酸鉀等亞硫酸鹽。
            
一個(gè)優(yōu)選的檢測(cè)溶液中的AP或聯(lián)接物的組合物包括一種胺緩沖液，pH8.5-9,0.1-1000μM的光澤精，0.1-1.0mM的化合物5,0.1-5mg/ml SDS,1-100μg/ml Na2SO3,0.01-0.1％(w/v)TWEEN 20和0.1-1.0mM鎂鹽。一個(gè)優(yōu)選的檢測(cè)膜上的AP或聯(lián)接物的組合物包括一種胺緩沖液，pH-8.5-9,0.1-1000μM的光澤精，0.1-1.0mM化合物5,0.1-5mg/ml SDS,1-100μg/ml Na2SO3,0.01-0.1％(w/v)TWEEN 20和0.1-1.0mM鎂鹽。
            
在本方法中有效的組合物發(fā)揮作用，可以通過(guò)增加發(fā)光的激發(fā)態(tài)產(chǎn)物分子的份額，通過(guò)增加用于形成激發(fā)態(tài)的產(chǎn)物分子的份額，通過(guò)增加酶的反應(yīng)率或周轉(zhuǎn)率，通過(guò)增加隨后的化學(xué)反應(yīng)步驟的速率，通過(guò)改善該酶的穩(wěn)定性，通過(guò)促進(jìn)該酶和式Ⅰ化合物的結(jié)合，通過(guò)抑制或阻止競(jìng)爭(zhēng)性的非發(fā)光副反應(yīng)，或通過(guò)其它還不清楚的機(jī)理。
            
考慮到的是，能使用熒光能量受體將最大發(fā)射移至較長(zhǎng)的波長(zhǎng)區(qū)(紅-移)。各種有關(guān)發(fā)射紅-移的技術(shù)在化學(xué)發(fā)光反應(yīng)和檢測(cè)領(lǐng)域內(nèi)是共知的。熒光增白劑能和式Ⅰ-Ⅴ化合物共價(jià)聯(lián)接，從而使得相應(yīng)的激發(fā)態(tài)化合物Ⅵ能進(jìn)行分子內(nèi)的能量轉(zhuǎn)移，進(jìn)而可在較長(zhǎng)的波長(zhǎng)處發(fā)射光。熒光增白劑可作為單獨(dú)的物質(zhì)加入該反應(yīng)液中。熒光增白劑可以和能形成膠束的陰離子型或非離子型表面活性劑相聯(lián)，以便使熒光增白劑和該發(fā)光物緊密接觸?；蛘?，熒光增白劑可以能在酶反應(yīng)期間通過(guò)去除磷酸基而轉(zhuǎn)化成熒光形式的非熒光形式存在。而后種類型的化合物的實(shí)例包括熒光素二磷酸酯，香豆素磷酸酯如4-甲基-7-羥基香豆素磷酸酯和苯并噻唑磷酸酯如ATTOPHOS(JBLScientific,San Lais Obispo,California)。
            
本化學(xué)發(fā)光方法的一個(gè)重要用途是，通過(guò)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)在一個(gè)試驗(yàn)步驟中檢測(cè)待分析物的存在或含量。該方法的步驟包括，將可能含有被分析物的樣品和本發(fā)明的化學(xué)發(fā)光化合物及堿性磷酸酶接觸，用定性方法檢測(cè)光的產(chǎn)生，并且若需要定量分析，則進(jìn)一步建立起光產(chǎn)生量和被分析物的量之間的數(shù)學(xué)關(guān)系。而這種光強(qiáng)度和待分析物量之間的關(guān)系，可以容易地通過(guò)用已知量的被分析物所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線而得出。該化學(xué)發(fā)光化合物所用的濃度一般大約為10-5M到10-3M，優(yōu)選介于大約10-4M到10-3M之間。當(dāng)在溶液中檢測(cè)時(shí)，該堿性磷酸酶的濃度優(yōu)選大約低于10-9M。用該化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的方法分析的樣品一般是諸如血液，血漿，血清，尿和精液等體液。
            
這里所說(shuō)的被分析物(與待分析物通用)是指能在一樣品中檢測(cè)其存在或含量的物質(zhì)。用本法檢測(cè)的被分析物可以包括磷酸酶，當(dāng)然在此檢測(cè)中不需另外加入磷酸酶。被分析物可以是磷酸酶抑制劑。被分析物可以是那些能用本領(lǐng)域共知的包括免疫試驗(yàn)，核酸探針試驗(yàn)，細(xì)胞受體試驗(yàn)及其類似試驗(yàn)的配體-結(jié)合試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)的各種類型的有機(jī)和生物分子。在這些試驗(yàn)中，該被分析物是用磷酸酶標(biāo)記或通過(guò)磷酸酶標(biāo)記的特異的結(jié)合對(duì)象，而被特異地檢測(cè)。磷酸酶可作為被分析物結(jié)合化合物的標(biāo)記物而直接結(jié)合?；颍环治鑫锝Y(jié)合化合物可以和至少一種磷酸酶標(biāo)記的該分析物結(jié)合化合物的特異結(jié)合物結(jié)合?；?，該被分析物結(jié)合化合物可用至少一種第二特異結(jié)合物標(biāo)記并再和磷酸酶標(biāo)記的第二特異結(jié)合物的結(jié)合物結(jié)合。磷酸酶也可以作為配體類似物如競(jìng)爭(zhēng)性試驗(yàn)中的酶-半抗原聯(lián)接物上的標(biāo)記物而被提供。
            
能進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的磷酸酶包括來(lái)源于諸如E.coli的細(xì)菌的堿性磷酸酶，或哺乳動(dòng)物的堿性磷酸酶，或來(lái)源于植物或哺乳動(dòng)物的酸性磷酸酶。磷酸酶和生物分子的結(jié)合物也可以用于本方法中以產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，唯一的條件是該結(jié)合物表現(xiàn)出磷酸酶活性，即水解磷酸單酯的能力。能和一個(gè)或多個(gè)磷酸酶分子結(jié)合的生物分子包括DNA,RNA，寡聚核苷酸，抗體，抗體片段，抗體-DNA嵌合體，抗原，半抗原，蛋白質(zhì)，植物凝血素，抗生物素蛋白，鏈霉抗生物素蛋白和生物素。作為生物分子的連接物的、含有或結(jié)合有磷酸酶的結(jié)合物，如脂質(zhì)體，膠束，泡囊和聚合物，也可以用于本發(fā)明的方法中。
            
本發(fā)明的組合物和磷酸酶的產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的反應(yīng)構(gòu)成了一個(gè)檢測(cè)磷酸酶的存在和含量的快速且高度靈敏的方法。因此，使用本方法通過(guò)測(cè)定由樣品和式Ⅰ化合物反應(yīng)所產(chǎn)生的光的量或強(qiáng)度而達(dá)到檢測(cè)樣品中磷酸酶的存在和含量的目的。這種檢測(cè)可用于諸如測(cè)定血清中堿性磷酸酶的水平，以作為反映患者肝功能狀況的一個(gè)指標(biāo)，或作為某些疾病的一個(gè)線索。前列腺酸性磷酸酶可作為臨床診斷前列腺癌的一個(gè)線索。
            
本發(fā)明的組合物也用于測(cè)定能產(chǎn)生在2-5秒迅速達(dá)到最大強(qiáng)度并在短時(shí)間內(nèi)衰減的化學(xué)發(fā)光的酸性磷酸酶(AcP)。即使該組合物的pH遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于AcP活性的最適pH，還是可能以良好的靈敏度定量分析該酶。此外，還可通過(guò)本檢測(cè)試劑檢測(cè)有AP存在時(shí)的AcP。由于AcP和AP誘發(fā)的化學(xué)發(fā)光信號(hào)表現(xiàn)出不同的動(dòng)力學(xué)特性，所以有可能在一個(gè)試驗(yàn)中對(duì)相同的樣品同時(shí)測(cè)定AcP和AP的活性。
            
該化學(xué)發(fā)光檢測(cè)磷酸酶活性的應(yīng)用的第二方面是檢測(cè)和測(cè)定酶抑制劑。抑制劑可作為一個(gè)和諸如本發(fā)明的化合物的另一底物競(jìng)爭(zhēng)的底物而可逆地起作用。另一種稱作自殺抑制的抑制作用是通過(guò)使該酶失活而不可逆地起作用。堿性磷酸酶的抑制劑包括無(wú)機(jī)磷酸酶，左旋四咪唑(levamisole)和其外消旋形式的四咪唑及其它咪唑[1,2-b]噻唑，L-苯基丙氨酸和L-高精氨酸，并鑒定于R.B.McComb,G.N.Bowers,S.Posen堿性磷酸酶，Plenum出版社，New York 1979，第268-275,332-334,394-397,410-413頁(yè)。酸性磷酸酶的抑制劑包括氟化物，鉬酸鹽，正磷酸鹽離子，酒石酸，4-(氟代甲基)苯基磷酸鹽和4-(氟代甲基)苯基膦酸鹽(J.K.Myers,T.S.Widlanski，科學(xué)，262,1451-3(1993))。已知一些物質(zhì)只在某些濃度具有抑制作用并且可能只是部分抑制。
            
通過(guò)在能產(chǎn)生可檢測(cè)的產(chǎn)物的底物及一定量的抑制劑存在條件下，檢測(cè)可能含有該酶的樣品中的酶活性的方法，進(jìn)行抑制劑的定量和特性如抑制常數(shù)Ki，或抑制半衰期t1/2的測(cè)定。在一個(gè)按照本發(fā)明的檢測(cè)磷酸酶抑制劑的方法中，式Ⅰ化合物產(chǎn)生出作為可檢測(cè)產(chǎn)物的光。分別在有和無(wú)抑制劑物質(zhì)存在的條件下進(jìn)行磷酸酶和化學(xué)發(fā)光化合物的反應(yīng)并將所得結(jié)果進(jìn)行比較以確定該抑制劑的存在或含量。該抑制劑的效應(yīng)可以是降低光強(qiáng)度，降低光強(qiáng)度增長(zhǎng)的速率或延長(zhǎng)光發(fā)射前的時(shí)間等三者中的一個(gè)或任意幾個(gè)。
            
該化學(xué)發(fā)光檢測(cè)磷酸酶活性的應(yīng)用的第三個(gè)方面是在基因表達(dá)試驗(yàn)中。堿性磷酸酶以及特別是在胎盤中產(chǎn)生并分泌的一種同功酶可用作指示基因(J.Alam,J.Cook，生物分析化學(xué)，188,245-54(1990))。在這種試驗(yàn)中，將表達(dá)一種指示酶的基因通過(guò)質(zhì)檢克隆到生物的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列附近的基因材料中。該啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列在轉(zhuǎn)錄活性上的效應(yīng)是通過(guò)測(cè)定指示酶的產(chǎn)物水平來(lái)判斷的。
            
有關(guān)進(jìn)行酶試驗(yàn)的技術(shù)是眾所周知的。在如本說(shuō)明書(shū)的實(shí)施例所提供的準(zhǔn)則指導(dǎo)下，制備樣品、測(cè)定試劑的合適量和比率、反應(yīng)時(shí)間、建立標(biāo)準(zhǔn)曲線及類似的步驟的各種變化是作為常規(guī)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，屬于普通技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)的。
            
由于用磷酸酶催化該反應(yīng)，所以極少量的酶就足以產(chǎn)生可檢測(cè)量的光。該靈敏度已達(dá)到4×10-21mol。這種檢測(cè)如此小量的磷酸酶的能力使得本化學(xué)發(fā)光技術(shù)適于分析許多類型的用酶聯(lián)試驗(yàn)的被分析物。這種分析和試驗(yàn)要求有檢測(cè)少量磷酸酶的能力，這是由于待分析樣品中被分析物的低豐度或由于樣品量的有限。在這種試驗(yàn)中，堿性磷酸酶聯(lián)接于特異的結(jié)合對(duì)象的一部分。一個(gè)實(shí)例是化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測(cè)如所謂的酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)或ELISA。此試驗(yàn)通常是以手動(dòng)形式和在自動(dòng)多重檢測(cè)免疫試驗(yàn)系統(tǒng)上進(jìn)行的。在一個(gè)典型的免疫檢測(cè)中，通過(guò)測(cè)定被分析物的酶標(biāo)記特異結(jié)合對(duì)象或酶標(biāo)記類似物，而檢測(cè)被分析物半抗原，抗原或抗體。用于進(jìn)行免疫化學(xué)步驟的各種試驗(yàn)形式和方案是本領(lǐng)域內(nèi)所共知的，無(wú)需構(gòu)成本發(fā)明本身的一部分。這些試驗(yàn)廣義上分成兩類。競(jìng)爭(zhēng)性試驗(yàn)，其特征是特異抗體和被分析物及其類似物的免疫結(jié)合，如一種可檢測(cè)地標(biāo)記的被分析物分子。夾心試驗(yàn)，是通過(guò)被分析物順序或同時(shí)結(jié)合其中的一個(gè)已進(jìn)行了可檢測(cè)標(biāo)記的兩種抗體而進(jìn)行的。所得的可檢測(cè)酶標(biāo)記的結(jié)合對(duì)可以用本發(fā)明的化合物和方法檢測(cè)。檢測(cè)可在酶標(biāo)記物吸附于諸如本領(lǐng)域常用的包括小珠，試管，微孔，磁粒，試驗(yàn)條帶，膜和濾紙的固相表面或支持物上的情況下進(jìn)行。該可檢測(cè)的酶標(biāo)記物也可游離于溶液中而存在，或包裹于諸如脂質(zhì)體的有機(jī)裝置中，不過(guò)后者則需要一種溶解劑以溶解該脂質(zhì)體并釋放該可檢測(cè)酶。
            
另一個(gè)典型應(yīng)用是通過(guò)Western blotting技術(shù)檢測(cè)蛋白質(zhì)。將作為被分析物的包含待測(cè)蛋白的樣品電泳分離。將該分離的蛋白通過(guò)毛細(xì)管作用或借助電場(chǎng)而轉(zhuǎn)移至吸滲膜上(blotting membrane)。這種轉(zhuǎn)膜蛋白一般是用特異的第一抗體和酶標(biāo)記的能識(shí)別并結(jié)合于第一抗體的第二抗體進(jìn)行檢測(cè)。標(biāo)記酶的顯色活性反映了被分析蛋白的存在。為了適應(yīng)本發(fā)明的Western blotting方法，可使用一種AP聯(lián)接的第二抗體并用本發(fā)明的化合物作為化學(xué)發(fā)光劑的化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)AP的活性。本技術(shù)的變化形式，如使用生物素化的抗體和抗生物素蛋白-AP都屬于使用本法能進(jìn)行的試驗(yàn)的范圍之內(nèi)。
            
除了上述的抗原-抗體，半抗原-抗體或抗體-抗體對(duì)外，特異的結(jié)合對(duì)也包括補(bǔ)充的寡核苷酸或多核苷酸，抗生素蛋白-生物素，鏈霉抗生物素蛋白-生物素，激素-受體，植物凝血素-碳水化合物，IgG-蛋白A，核酸-核酸結(jié)合蛋白以及核酸-抗核酸抗體。
            
本檢測(cè)方法的一個(gè)特別有用的應(yīng)用是，通過(guò)使用酶標(biāo)記的核酸探針而檢測(cè)核酸。使用酶標(biāo)記化學(xué)發(fā)光檢測(cè)和分析核酸的方法如雜交檢測(cè)，Southernblotting檢測(cè)DNA,Northern blotting檢測(cè)RNA,DNA序列測(cè)定，DNA指紋測(cè)定，菌落雜交及plaque lifts都是相當(dāng)成熟的技術(shù)。該酶標(biāo)記(如Ap)可以探針寡核苷酸或俘獲寡核苷酸的直接聯(lián)接物形式存在，或它也可通過(guò)眾所周知的間接聯(lián)接方式而結(jié)合。間接聯(lián)接方式的實(shí)例包括使用半抗原標(biāo)記的寡核苷酸和抗-半抗原-AP聯(lián)接物或生物素化的寡核苷酸和抗生物素蛋白-AP聯(lián)接物。這種核酸檢測(cè)可在吸滲(blotting)膜上或在寡核苷酸吸附于固相表面的溶液中進(jìn)行，而該固相表面包括眾所周知的小珠，試管，微孔，磁粒，試驗(yàn)條帶?；衔铫?Ⅳ的制備方法本發(fā)明的化學(xué)發(fā)光的磷酸鹽化合物Ⅰ-Ⅳ的制備方法和有用的中間體的公開(kāi)和實(shí)施，均在同時(shí)待審的585,090申請(qǐng)中。為了詳細(xì)說(shuō)明更多的典型方法和條件，下文提供了其它的說(shuō)明信息。
            
簡(jiǎn)單地說(shuō)，該方法包括雜環(huán)酯或硫代酯化合物Ⅷ，和堿反應(yīng)生成Ⅷ的烯醇酯；通過(guò)該烯醇酯和磷酸化劑反應(yīng)，磷酸化該Ⅷ烯醇酯，形成保護(hù)的烯醇磷酸酯Ⅸ，通過(guò)將Ⅸ和至少一種脫保護(hù)劑在陽(yáng)離子物質(zhì)M存在的條件下，如果該陽(yáng)離子物質(zhì)并非該保護(hù)劑的一部分，反應(yīng)，從而去除該烯醇磷酸酯的保護(hù)基生成烯醇磷酸鹽化合物Ⅰ。 在一個(gè)實(shí)施例中，該保護(hù)的烯醇磷酸酯Ⅸ首先是通過(guò)化合物Ⅷ的烯醇酯和磷酰鹵化合物POW3(其中的W是選自F,Cl,Br和I的鹵原子)反應(yīng)而生成烯醇二鹵化磷酸酯Ⅹ。該中間體烯醇二鹵化磷酸酯Ⅹ通過(guò)和至少兩個(gè)當(dāng)量的羥基化合物Y-OH反應(yīng)，轉(zhuǎn)化成保護(hù)的烯醇磷酸酯Ⅸ。然后，該磷酸三酯再和至少一種去保護(hù)劑在陽(yáng)離子物質(zhì)M，如果該陽(yáng)離子物質(zhì)并非該去保護(hù)劑的一部分，存在的條件下反應(yīng)，轉(zhuǎn)化成磷酸鹽Ⅰ。 優(yōu)選的鹵素W是Cl。能作為羥基化物Y-OH的化合物包括但不限于，低級(jí)醇如甲醇和乙醇，取代的低級(jí)醇如3-羥基丙腈(HOCH2CH2CN)和2-三甲基硅乙醇，酚，取代酚，芐醇以及眾所周知的其它物質(zhì)。
            
在另一實(shí)施例中，該被保護(hù)的烯醇磷酸酯Ⅸ可通過(guò)Ⅷ烯醇酯和含有保護(hù)基Y的且具有通式WO-PO(OY)2的磷酸化劑反應(yīng)，直接從Ⅷ中制得。 此磷酸化劑中的O-Y基可以包括烷氧基如OCH3,OCH2CH3，及其類似物，取代烷氧基如氰乙氧基(OCH2CH2CN)或三甲基硅乙氧基(OCH2CH2Si(CH3)3)，苯氧基，取代苯氧基，芐氧基及本領(lǐng)域的有機(jī)化學(xué)技術(shù)人員熟知的其它類似物。該兩個(gè)基團(tuán)O-Y也可結(jié)合在一起作為一個(gè)基團(tuán)而出現(xiàn)在該試劑中  
            
該烯醇酯是在-90℃到25℃的溫度范圍內(nèi)，酯或硫酯化合物Ⅷ和強(qiáng)堿在一種惰性的有機(jī)溶劑中反應(yīng)而生成的。在一個(gè)優(yōu)選的方式中，該反應(yīng)是在干冰/丙酮浴的溫度，亦即-78℃的溫度中，進(jìn)行一段時(shí)間并且隨后再加溫至0到25℃而進(jìn)行第二段時(shí)間，合適的溶劑是那些能和用于生成烯醇酯的強(qiáng)堿相混溶的非質(zhì)子性溶劑，其包括醚和烴類溶劑。優(yōu)選的溶劑是四氫呋喃。該強(qiáng)堿和羰基化合物Ⅷ可以任意順序加入該反應(yīng)器中。
            
該磷酸化步驟是在相同的溶液中于大約-78℃到25℃的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行的。無(wú)論是POW3或是WPO(OY)2的磷酸化劑，都是以可控的方式加入以免引起反應(yīng)液變熱。該磷酸化劑優(yōu)選和胺堿，優(yōu)選吡啶，共同作用。
            
該脫保護(hù)步驟是通過(guò)該被保護(hù)的烯醇磷酸酯Ⅸ和以足以除去該保護(hù)基的量的去保護(hù)劑，在有陽(yáng)離子物質(zhì)M(如果該陽(yáng)離子物質(zhì)并非該脫保護(hù)劑的一部分)存在的條件下，反應(yīng)而完成的。通常要求兩當(dāng)量的脫保護(hù)基，然而為了方便，該脫保護(hù)劑也可以過(guò)量的摩爾數(shù)使用。在某些情況下，該保護(hù)基可以一次除去一個(gè)。例如，在其中的兩個(gè)Y基共同構(gòu)成單個(gè)的-CH2CH2-基團(tuán)并因此而形成一個(gè)五元環(huán)的式Ⅺ化合物中，該第一個(gè)O-CH2鍵可用氰化鹽處理而脫去。所得的化合物Ⅶ再和堿反應(yīng)除去第二個(gè)O-CH2并生成鹽Ⅰ。 脫保護(hù)劑的選擇將部分依賴于待脫去的Y基的性質(zhì)而定。該脫保護(hù)劑還必須不產(chǎn)生諸如水解該乙烯基醚或乙烯基硫醚的基團(tuán)的副反應(yīng)，或引起雜環(huán)基的不良改變。優(yōu)選的脫保護(hù)劑包括有機(jī)的和無(wú)機(jī)的堿如氫氧化鈉，氫氧化鉀，碳酸鉀，甲醇鈉，乙醇鈉，叔-丁醇鈉，氫氧化銨及其類似物。其它優(yōu)選的脫保護(hù)劑包括親核試劑如氰離子，氟離子。
            
據(jù)申請(qǐng)人所知，其中的Het是一個(gè)含有N或S的雜環(huán)的化合物Ⅸ,Ⅹ,Ⅺ和Ⅻ還沒(méi)有被制備出來(lái)。美國(guó)3,130,203雖然公開(kāi)了其中有一個(gè)含氧的內(nèi)酯環(huán)附著于該雙鍵上的烯醇磷酸酯化合物。但是該化合物是用不涉及烯醇酯或硫酯的磷酸化作用的不同方法制備的。
            
實(shí)施例下列描述的式Ⅰ化合物的制備及其化學(xué)發(fā)光反應(yīng)是為了更詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明。 化合物 R7-R14Z   R61  全是H   O   苯基2  全是H   O   3,5-二氟苯基3  R9=OCH3O   苯基4  R9=Cl  O   2,6-二甲基苯基5  全是H   S   苯基6  R11-R12=  O   苯基 7  全是H   S   4-氟苯基8  全是H   S   4-甲氧苯基9  全是H   S   2,6-二甲基苯基10 R8,R13=F S   苯基11 全是H   S   三氟乙基12 全是H   S   4-氯苯基13 全是H   S   2-萘基除非具體指明，R7-R14都是H。
            
每個(gè)化合物1-13都是按照下列合成路線(流程)制備的。要理解的是，可以在上述的合成方法所限制的范圍內(nèi)，進(jìn)行該反應(yīng)條件的改進(jìn)以制備這些和其它的式Ⅰ化合物。
            
流程1 實(shí)施例1．合成9,10-二氫吖啶衍生物1。
            
a．吖啶-9-羧酸苯酯。將吖啶-9-羧酸(1克，4.1毫摩爾)懸浮于亞硫酰氯(5毫升)中，并回流該反應(yīng)混和物3小時(shí)。減壓除去溶劑得到黃色固體，在充氬氣下將其溶于CH2Cl2和吡啶(350μl)中。冰浴冷卻該溶液并滴加苯酚(0.78克，8.2毫摩爾)的CH2Cl2溶液。室溫中攪拌該反應(yīng)混合物過(guò)夜。蒸發(fā)除去溶劑后，將殘留物重新溶解于乙酸乙酯并用水洗滌。用MgSO4干燥該有機(jī)層并濃縮得到粗產(chǎn)物，再用硅膠色譜(30％乙酸乙酯/己烷)處理得到黃色固態(tài)的純產(chǎn)物。1H NMR(CDCl3)δ7.35-7.57(m,5H),7.63-8.37(m,8H)。
            
b．10-甲基吖啶-9-羧酸苯酯的三氟甲磺酸鹽。
            
將吖啶-9-羧酸苯酯(530毫克，1.7毫摩爾)在氬氣氛溶解于CH2Cl2(5毫升)中，并加入三氟甲磺酸甲酯(triflate)(1毫升，8.8毫摩爾)。室溫中攪拌該溶液過(guò)夜，得到粘稠的黃色沉淀。過(guò)濾該沉淀，用醚洗滌并干燥得到黃色晶體產(chǎn)物。1H NMR(丙酮-d6)δ5.22-(S,3H),7.47-7.71(m,5H),8.23-9.07(m,8H)。
            
c．10-甲基-9,10-二氫化吖啶-羧酸苯酯。
            
將10-甲基吖啶-9-羧酸苯酯的三氟甲磺酸鹽(10毫克，0.0216毫摩爾)懸浮于無(wú)水乙醇(10毫升)中并回流該混合物15分鐘得到澄清的溶液。分批將氯化銨(88毫克，1.6毫摩爾)加入該溶液中，再加入鋅(108毫克，1.6毫摩爾)。鋅的加入使得該溶液的黃色立即消失?；亓髟摕o(wú)水溶液2小時(shí)。薄層色譜(TLC)分析該反應(yīng)混和物顯示其徹底地轉(zhuǎn)變成一個(gè)非極性物質(zhì)。將該溶液過(guò)濾并用乙醇(3×20毫升)洗滌沉淀。濃縮該濾液得到灰白的固體，再將其溶解于CH2Cl2并用水(2×15毫升)洗滌。用Na2SO4干燥該有機(jī)層，濃縮得到粗產(chǎn)物，再通過(guò)制備的(preparative)TLC(30％乙酸乙酯∶己烷)純化。所得的純產(chǎn)物是灰白色的固體。
            
1H NMR(CDCl3)δ3.38(s,3H),5.16(s,1H),6.89-7.37(m,13H)；13CNMR(CDCl3)δ33.29,49.72,112.93,120.19,121.36,125.73,128.67,129.16,129.26,142.37,151.04,170.22。
            
d．9-(苯氧磷酰氧亞甲基)-10-甲基-9,10-二氫化吖啶，二(氰乙基)酯。將一只三頸燒瓶充氬氣，并加入5毫升的無(wú)水THF和二異丙胺(0.04毫升，0.29毫摩爾)。將該燒瓶在干冰-丙酮浴中冷卻。將正丁基鋰(0.116毫升，0.29毫摩爾)加入該溶液中。20分鐘后，將步驟(c)所得的9,10-二氫化吖啶酯(70毫克，0.22毫摩爾)的5毫升THF溶液加入到此溶液中，在-78℃連續(xù)攪拌30分鐘。最后再加入POCl3(0.02)毫升，0.29毫摩爾)和吡啶(0.023毫升，0.29毫摩爾)的3毫升THF溶液，并撤去干冰浴。45分鐘后，加入吡啶(0.039毫升，0.58毫摩爾)和3-羥基丙腈(0.094毫升，1.16毫摩爾)，連續(xù)攪拌過(guò)夜。然后，過(guò)濾并從濾液中除去溶劑。用制備的TLC(80％乙酸乙酯/己烷)處理該殘留物得到產(chǎn)物；1H NMR(CDCl3)δ2.35-2.54(m,4H),3.47(s,3H),3.79-3.90(m,2H),3.98-4.08(m,2H),6.825-7.45(m,12H),7.80-7.83(dd,1H)；13CNMR(CDCl3)δ19.12,19.24,33.63,62.19,62.49,88.72,112.40,112.52,115.83,116.07,119.68,120.44,120.71,123.81,126.69,128.03,128.27,128.58,130.09,142.39,143.06,165.73,202.09。
            
e．9-(苯氧磷酰氧亞甲基)-10-甲基-9,10-二氫化吖啶，二鈉鹽(1)。
            
將磷酸二(氰乙基)化合物(2.897克，5.77毫摩爾)的50毫升丙酮溶液充氬氣30分鐘。滴加已氬氣洗過(guò)的479毫克(12毫摩爾)NaOH的7.5毫升水溶液并攪拌該溶液過(guò)夜。過(guò)濾所得沉淀，用50毫升的已用氬氣洗過(guò)的丙酮洗滌，空氣干燥。產(chǎn)物是3.473克含有一些水份的白色固體1。
            
1H NMR(D2O)δ3.326(s,3H),6.825-7.45(m,11H),7.80-7.83(d,1H)；13C NMR(D2O)δ32.95,102.86,102.92,112.30,115.85,120.68,121.01,122.35,122.41,122.62,127.48,127.66,128.23,129.66,143.17,143.32,144.66,156.01；31P NMR(D2O)δ0.581(rel.to ext.H3PO4)。實(shí)施例2．合成9,10-二氫化吖啶衍生物2。 a．吖啶-9-羧酸3′、5′-二氟苯酯。將吖啶-9-羧酸(0.25克)懸浮于10毫升的亞硫酰氯中并回流該反應(yīng)混和物3小時(shí)。減壓除去溶劑得到黃色固體。在充氬氣下將其溶于CH2Cl2和吡啶(0.22克)。滴加3,5-二氟苯酚(0.16克)的CH2Cl2溶液。室溫中攪拌該反應(yīng)混合物過(guò)夜，然后用另加的CH2Cl2(100毫升)稀釋并用水(3×50毫升)洗滌。用Na2SO4干燥該有機(jī)層并濃縮得到產(chǎn)物，再用硅膠色譜純化(30％乙酸乙酯/己烷)，得到乳狀固態(tài)純產(chǎn)物。1HNMR(CDCl3)δ6.84-7.09(m,3H),7.67-8.37(m,8H)。
            
b．10-甲基吖啶-9-羧酸3′,5′-二氟苯酯的三氟甲磺酸鹽。將從步驟(a)所得的吖啶酯(0.20克)在氬氣氛中溶解于CH2Cl2(5毫升)中，并加入三氟甲磺酸甲酯(0.472毫升，7當(dāng)量)。室溫中攪拌該溶液過(guò)夜得到粘稠的黃色沉淀。過(guò)濾該沉淀，用醚洗滌并干燥得到黃色晶體產(chǎn)物。1H NMR(丙酮-d6)δ5.25(s,3H),7.22-7.59(m,3H),8.23-9.09(m,8H)。
            
c．10-甲基-9,10-二氫化吖啶-9-羧酸3′,5′-二氟苯酯。
            
將從步驟(b)所得的吖啶酯(0.10克)溶于10毫升的冰醋酸，得到黃色溶液，加入鋅(1.30克)使溶液立即脫色。室溫中攪拌5分鐘后，TLC分析該反應(yīng)混和物顯示為一非極性材料。傾折醋酸，用CH2Cl2洗滌該固體。蒸發(fā)該合并的有機(jī)溶液得到粗制固體，再將其溶解于CH2Cl2并用2或3份50毫升的水洗滌。將蒸發(fā)CH2Cl2后所得的粗產(chǎn)物用硅膠色譜(20-30％乙酸乙酯/己烷)純化得到白色固態(tài)純產(chǎn)物。1H NMR(CDCl3)δ3.44(s,3H),5.16(s,1H),6.49-6.65(m,3H),6.99-7.36(m,8H)。
            
d．9-(3,5-二甲基苯氧基)磷酰氧亞甲基)-10-甲基-9,10-二氫化吖啶，二(氰乙基)酯。將一只三頸燒瓶用氬氣洗過(guò)并加入4毫升的無(wú)水THF和二異丙胺(0.0494毫升，0.35毫摩爾)。將該燒瓶在干冰-丙酮浴中冷卻。將正丁基鋰(0.141毫升，0.35毫摩爾)加入該溶液中。20分鐘后，將步驟(c)所得的9,10-二氫化吖啶酯(75毫克，0.22毫摩爾)的4毫升THF溶液滴加入此LDA中。漏斗另用4毫升的已用氬氣洗過(guò)的THF洗滌并加入該反應(yīng)液。在-78℃連續(xù)攪拌30分鐘。最后加入POCl3(0.034毫升，0.35毫摩爾)和吡啶(0.057毫升，0.35毫摩爾)的4毫升THF溶液，使該褐色溶液脫色。撤去該干冰浴并連續(xù)攪拌15分鐘。加入吡啶(0.095毫升，1.17毫摩爾)和3-羥基丙腈(0.080毫升，1.17毫摩爾)的4毫升THF溶液并連續(xù)攪拌過(guò)夜。然后，過(guò)濾并從濾液中除去溶劑。用制備的TLC(55％乙酸乙酯/己烷)處理從而分離出少量的純產(chǎn)物；1H NMR(丙酮-d6)δ2.82(m,4H),3.51(s,3H),4.10-4.31(m,3H),6.75-7.93(m,1H)。
            
e．9-(3,5-二甲基苯氧基)磷酰氧亞甲基)-10-甲基-9,10-二氫化吖啶，二鈉鹽(2)。
            
將從步驟(d)所得的磷酸二(氰乙基)酯(5毫克，5.77毫摩爾)的5毫升甲醇溶液冰浴，并用氬氣洗30分鐘。滴加已用氬氣洗過(guò)的6毫克Na2CO3的0.5毫升水溶液并通過(guò)氬氣攪拌過(guò)周。蒸去溶劑并真空干燥固體化合物2。1HNMR(D2O)δ3.34(s,3H),6.66-8.09(m,11H)。實(shí)施例3．合成9,10-二氫吖啶衍生物3 (E/Z混合物)a．N-甲基-3-甲氧靛紅。將溶于900毫升CH2Cl2的3-甲氧二苯胺(250.2克，1.26mol)在氬氣氛中加入草酰氯(140毫升，1.6mol)的1升CH2Cl2的熱熔液中。該加入過(guò)程在兩小時(shí)內(nèi)完成。加入過(guò)程中的加熱暫停，因?yàn)樵摲磻?yīng)所產(chǎn)生的熱足以維持回流。加入胺后，再在回流溫度攪拌30分鐘。蒸發(fā)該所得褐色液以除去過(guò)量的草酰氯。將該褐色固體重新溶于用氬氣洗滌過(guò)的1.8升CH2Cl2。在45分鐘內(nèi)，分批加入氯化鋁(359克，3.69mol)，并將該混和液機(jī)械攪拌。在該加料過(guò)程中，混合物變得粘稠并開(kāi)始回流。在全部的AlCl3都加入后，再回流一小時(shí)。真空蒸發(fā)該冷卻的混和物并用大約4公斤冰，500毫升水和240毫升濃HCl使其驟冷。在冰點(diǎn)攪拌2小時(shí)，將暗色固體小心搗碎成小顆粒。然后，吸濾該固體并用總量達(dá)8升的水洗滌?？諝飧稍锏玫狡渲械囊粋€(gè)異構(gòu)體含量大于90％的靛紅異構(gòu)體的混和物。
            
b．3-甲氧吖啶-9-羧酸。將從步驟(a)所得的靛紅混和物在10％的KOH水溶液中回流大約40小時(shí)。將該溶液冷卻到＜60℃并通過(guò)玻璃棉過(guò)濾到劇烈攪拌著的480毫升的濃HCl和10升冰水的混合液中。一小時(shí)后，抽濾該固體并用8升水洗滌?？諝飧稍镌摴腆w過(guò)夜，然后真空干燥。1HNMR(CD3OD/NaOH)δ4.062(s,3H),7.25-8.18(m,7H)。
            
c．3-甲氧吖啶-9-羧酸苯酯。將甲氧基-吖啶-9-羧酸(0.50克)懸浮于10毫升亞硫酰氯(3-10毫升)中并回流該反應(yīng)混合物3小時(shí)。減壓除去該溶劑得到黃色固體并將其在氬氣氛中溶解于CH2Cl2和吡啶(0.44克)。滴加2,6-二氟苯酚的CH2Cl2溶液。室溫中攪拌該溶液過(guò)夜，然后用另外的CH2Cl2(100毫升)稀釋并用水(3×50毫升)洗滌。用Na2SO4干燥該有機(jī)層，濃縮得到粗產(chǎn)物，再進(jìn)一步用硅膠色譜純化(30％乙酸乙酯/己烷)得到乳油狀固態(tài)的純產(chǎn)物。1H NMR(丙酮-d6)δ4.08(s,3H),7.39-8.29(m,12H)。
            
d．3-甲氧-9,10-二氫化吖啶-9-羧酸苯酯。將氯化銨(3.45克，64毫摩爾)和4.2克鋅64毫摩爾)加入到0.85克(2.5毫摩爾)步驟(c)所得的酯于50毫升乙醇中的經(jīng)氬氣洗過(guò)的懸浮液中?；旌衔飻嚢?小時(shí)，過(guò)濾并用CH2Cl2洗滌該固體。將合并的溶液蒸干得到白色固體，再將其溶于乙酸乙酯中并用3×25毫升的水洗滌。該產(chǎn)物無(wú)需進(jìn)一步純化即可使用。1H NMR(CDCl3)δ3.76(s,3H),5.29(s,1H),6.47-7.36(m,12H),8.21(br,s,1H)。
            
e．3-甲氧基-10-甲基-9,10-二氫化吖啶-9-羧酸苯酯。將前述步驟中所得的9,10-二氫吖啶(0.77克，2.3毫摩爾)溶于CH2Cl2中并加入三氟甲磺酸甲酯(3.8克，23毫摩爾)。攪拌過(guò)夜后，TLC分析表明其已徹底甲基化。蒸去揮發(fā)性組分并用18％的乙酸乙酯/己烷洗脫該柱，色譜純化該殘留物。產(chǎn)物是含0.75克膠粘固體。1H NMR(CDCl3)δ3.41(s,3H),3.84(s,3H),5.13(s,1H),6.52-7.38(m,12H)。
            
f．(E.Z)-9-(苯氧基)磷酰氧亞甲基)-3-甲氧基-10-甲基-9,10-二氫化吖啶，二(氰乙基)酯。
            
基本上按照實(shí)施例2d所述制備LDA溶液。-78℃攪拌25分鐘后，滴加從步驟3e所得的9,10-二氫化吖啶酯(95毫克，0.26毫摩爾)的4毫升THF溶液。最后加入POCl3(0.04毫升)和吡啶(0.05毫升)的4毫升THF溶液，使該黃色溶液脫色。撤去干冰浴并連續(xù)攪拌105分鐘。用冰浴冷卻該溶液并用4毫升的吡啶(0.106毫升)和3-羥基丙腈(0.090毫升)的THF溶液處理。室溫中攪拌20小時(shí)，過(guò)濾該反應(yīng)混合物并用THF洗滌該黃色沉淀。真空蒸去溶劑，殘留物和沉淀結(jié)合。用制備的TLC(60％乙酸乙酯/已烷)處理此材料，分離出少量雙鍵異構(gòu)體混合物形式存在的產(chǎn)物；1H NMR(丙酮-d6)δ2.75-2.82(m,4H),3.52(s,3H),3.82(s),3.91(s),4.00-4.26(m,4H),6.47-7.96(m,12H)。
            
g．(E.Z)-9-(苯氧基)磷酰氧亞甲基)-3-甲氧基-10-甲基-9,10-二氫化吖啶，二鈉鹽(3)。
            
將從步驟3(f)中所得的磷酸二(氰乙基)酯溶解于經(jīng)Ar洗過(guò)的10毫升MeOH中，并冰浴冷卻。滴加已用Ar洗過(guò)的11毫克Na2CO3的1毫升水溶液并攪拌該溶液19小時(shí)。再加入3毫升的甲醇，并再連續(xù)攪拌24小時(shí)使脫保護(hù)進(jìn)行徹底。蒸去溶劑，用CH2Cl2洗滌該固態(tài)化合物3并真空干燥。1HNMR(D2O)δ3.24(s,3H),3.66(s),3.83(s),6.35-8.07(m,12H)。實(shí)施例4．合成9,10-二氫化吖啶衍生物4。 a．3-氯靛紅。在Ar氛的條件下，將溶于250毫升CH2Cl2的3-氯二苯胺(20克，0.98摩爾)加入14.0克(0.11mol)草酰氯的150毫升CH2Cl2溶液中?；亓髟撊芤?0分鐘。蒸去該所得溶液中過(guò)量的草酰氯。將該固體重新溶解于已用Ar氣洗過(guò)的CH2Cl2中。在45分鐘內(nèi)，將氯化鋁(54.48g)分批加入機(jī)械攪拌的溶液中。在該加成過(guò)程中，該混合液變稠并開(kāi)始回流。在全部AlCl3加入后再維持回流一小時(shí)。真空蒸發(fā)該冷卻的混合物，在冰浴中用900毫升的1M HCl急冷。抽濾出固體并用水洗滌。1H NMR(CDCl3)δ 6.8-7.8(m,8H)b．3-氯吖啶羧酸。從步驟(a)所得的靛紅產(chǎn)物在300毫升的10％KOH水溶液中回流大約48小時(shí)。冷卻該溶液并用HCl酸化至pH2-3。一小時(shí)后，抽濾該黃色固體，然后用水洗滌?？諝飧稍镌摴腆w過(guò)夜，用CH2Cl2洗滌，然后空氣干燥得到23.76克的吖啶酸，1H NMR(DMSO-d6)δ7.72-8.30(m,7H)。
            
c．3-氯吖啶羧酸2′6′-二甲基苯酯。
            
將該酸(3.0克)用2,6-二甲基酚(2.24克，1.5當(dāng)量)和吡啶(1.98毫升，2當(dāng)量)的約100毫升CH2Cl2溶液在室溫氮?dú)夥盏臈l件下酯化。蒸去該溶劑并通過(guò)用10-30％乙酸乙酯/己烷的色譜柱純化該殘留物，從而分離出該1-氯(較少)和3-氯異構(gòu)體；1H NMR(CDCl3)δ2.430(s,6H),7.20-7.28(m,3H),7.60-7.75(m,3H),8.28-8.50(m,4H)。
            
d．3-氯-10-甲基吖啶羧酸2′,6′-二甲基苯酯的三氟甲磺酸鹽。將從前述步驟中所得的吖啶化合物(2.47克，6.7毫摩爾)溶于CH2Cl2中并加入三氟甲磺酸甲酯(3.8毫升，5當(dāng)量)。攪拌過(guò)夜后，TLC分析顯示其已徹底甲基化。蒸去揮發(fā)性組分并通過(guò)用5％乙酸乙酯/己烷洗脫該柱色譜純化該殘留物。在CH2Cl2/己烷中重結(jié)晶該產(chǎn)物，得到1.7克白色晶體。
            
e．3-氯-10-甲基-9,10-二氫化吖啶-羧酸2′,6′-二甲基苯酯。將氯化銨(2.91克，64毫摩爾)和3.56克鋅(64毫摩爾)加入已用Ar洗過(guò)的步驟(c)所得的2.00克(5.4毫摩爾)酯的50毫升乙醇的懸浮液中。攪拌該混合物2小時(shí)，過(guò)濾，CH2Cl2洗滌該固體。蒸干該合并的溶液得到白色固體。該產(chǎn)物可以不經(jīng)進(jìn)一步純化而直接使用。1H NMR(CDCl3)δ1.746(s,6H),3.400(s,3H),5.152(s,1H),6.88-7.04(m,7H),7.26-7.39(m,3H)。
            
f．(E.Z)-9-(2,6-二甲基苯氧基)磷酰氫亞甲基)-3-氯-10-甲基-9,10-二氫化吖啶，二(氰乙基)酯。將從步驟(e)中所得的9,10-二氫化吖啶酯(0.100克，0.29毫摩爾)加入到LDA(0.44毫摩爾)的10毫升THF溶液中。-78℃攪拌30分鐘后，加入POCl3(42μl)和吡啶(47μl)的4毫升THF溶液。撤去干冰浴并連續(xù)攪拌30分鐘。TLC(30％乙酸乙酯/己烷)分析顯示起始物已完全反應(yīng)。冰浴冷卻該溶液并用4毫升的吡啶(117μl)和3-羥基丙腈(94μl)的THF溶液處理。室溫?cái)嚢柽^(guò)夜后，濾去沉淀并蒸發(fā)該反應(yīng)溶劑。用制備的TLC(60％乙酸乙酯/己烷)處理該殘留物并從其分離出異構(gòu)體產(chǎn)物；1H NMR(CD3OD)δ(1.91(s),1.95(s)，結(jié)合3H),(2.03(s),2.04(s)，結(jié)合3H),2.69-2.76(m,4H),(3.52(s),3.59(s)，結(jié)合3H),4.16-4.34(m,4H),6.97-7.65(m,10H)。
            
g．(E.Z)-9-(2,6-二甲基苯氧基)磷酰氧亞甲基)-3-氯-10-甲基-9,10-二氫化吖啶，二鈉鹽(4)。將從前述步驟中所得的磷酸二(氰乙基)酯在Ar氛溶于10毫升的甲醇中并用冰浴冷卻。滴加已用Ar洗過(guò)的11毫克Na2CO3的1毫升水溶液，并通氬氣攪拌直至脫保護(hù)進(jìn)行完全。蒸去溶劑，用CH2Cl2洗滌固體并真空干燥得到產(chǎn)物4。實(shí)施例5．合成9,10-二氫化吖啶衍生物5。 a．9-(苯基硫代磷酰氧亞甲基)-10-甲基-9,10-二氫化吖啶，二(氰乙基)酯。將10-甲基-9,10-二氫化吖啶-9-硫代羧酸苯酯(70毫克，0.2毫摩爾)加入LDA(0.24毫摩爾)的THF溶液中。-78℃攪拌30分鐘后，加入4毫升的POCl3(25μl)和吡啶(21μl)的THF溶液。撤去干冰并繼續(xù)攪拌30分鐘。TLC(30％乙酸乙酯/己烷)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)起始反應(yīng)物已徹底反應(yīng)。冰浴冷卻該溶液并用4毫升的吡啶(210μl)和3-羥基丙腈(44μl)的THF溶液處理。室溫?cái)嚢柽^(guò)夜后，濾去沉淀的吡啶-HCl，并真空蒸去該反應(yīng)溶劑。用制備的TLC(乙酸乙酯)處理該殘留物，分離出產(chǎn)物；1HNMR(CDCl3)δ2.4-2.6(m,4H),3.521(s,3H),3.8-4(m,2H),4.0-4.1(m,2H),6.9-7.2(m,4H),7.22-7.5(m,7H),7.75-8(dd,2H)。
            
b．9-(苯基硫代磷酰氧亞甲基)-10-甲基-9,10-二氫化吖啶，二鈉鹽(5)。將磷酸二(氰乙基)酯化合物(0.59克，1.21毫摩爾)的50毫升丙酮溶液用Ar洗滌30分鐘。滴加已用Ar洗過(guò)的104毫克(2.6毫摩爾)NaOH的10毫升水溶液并通氬氣攪拌過(guò)夜。抽濾所得的沉淀，用50毫升Ar洗過(guò)的丙酮洗滌并空氣干燥。產(chǎn)物是含有少許丙酮的0.50克微黃色固體5。
            
1H NMR(D2O)δ3.36(s,3H),6.9-7.4(m,11H),7.75-7.8(d,1H),8.2-8.22(d,1H)；31P NMR(D2O)δ1.85(rel.to ext.H3PO4)。實(shí)施例6．合成苯并[c] 9,10-二氫化吖啶衍生物6。
            
(E/Z混合物)a．苯并[c]吖啶-7-羧酸。在氬氣氛的條件下，將溶于25毫升CS2的1-萘基-苯胺(10克，46毫摩爾)用4.8毫升(55毫摩爾)草酰氯回流。蒸發(fā)該所得褐色溶液，除去過(guò)量的草酰氯。將該黃色固體溶于60毫升的CS2并且其用氬氣鼓泡。分批加入AlCl3(21.4克，160毫摩爾)到該溶液中，并攪拌該混合物。在加料過(guò)程中，該混合物變稠并開(kāi)始回流。該回流在全部AlCl3都加入后再維持兩個(gè)多小時(shí)。真空蒸發(fā)該冷卻的混合物，用1M HCl和冰急冷。將該暗色固體小心搗成小顆粒并吸濾該固體，并用水洗滌。
            
將該靛紅產(chǎn)物在10％KOH水溶液中回流過(guò)夜。冷卻該溶液到＜60℃并用6M HCl和冰中和。抽濾該固體，用水洗滌并空氣干燥。1H NMR(DMSO-d6)δ7.80-8.13(m,8H),8.36-8.39(d,1H),9.38-9.40(m,1H)b．苯并[c]吖啶-7-羧酸苯酯。將苯并[c]吖啶-7羧酸(6.0克)懸浮于75毫升的亞硫酰氯(3-10毫升)中并回流該反應(yīng)混合物4小時(shí)。減壓除去溶劑并將產(chǎn)物溶于75毫升CH2Cl2中。加入吡啶(8.9毫升)和酚(2.27克)并室溫氬氣氛攪拌該溶液。用硅膠色譜(50％CH2Cl2/己烷)純化得到3.05克淺褐紅色固態(tài)的純產(chǎn)物。
            
1H NMR(CDCl3)δ7.40(t,1H),7.48-7.59(m,4H),7.71-8.01(m,7H),8.259(d,1H,J=7.8Hz),8.465(d,1H,J=7.8JHz),9.54-9.57(m,1H)。
            
c．苯并[c]9,10-二氫化吖啶-7-羧酸苯酯。將氯化銨(10克)和10克鋅加入到Ar氣洗過(guò)的1.0克步驟(b)所得的酯在乙醇的懸浮液中。攪拌該混合物2小時(shí)，過(guò)濾并用CH2Cl2洗滌。將該合并的溶液蒸干得到白色固體，再將其溶解于乙酸乙酯并用3×25毫升的水洗滌。使用10％乙酸乙酯/己烷的洗脫液色譜純化該產(chǎn)物。1H NMR(CDCl3)δ5.48(s,1H),5.69-7.27(s,9H),7.41-7.55(m,5H),7.83-7.88(m,2H)。
            
d．12-甲基苯并[c]9,10-二氫化吖啶-7-羧酸苯酯。將從前述步驟中所得的9,10-二氫化吖啶化合物(0.70克)溶于CH2Cl2并加入三氟甲磺酸甲酯(2.3毫升)。攪拌過(guò)夜后，TLC表明其已徹底甲基化。蒸去揮發(fā)性成分并過(guò)使用5％乙酸乙酯/己烷洗脫該柱，色譜純化該殘留物。1H NMR(CDCl3)δ3.75(s,3H),5.21(s,1H),6.92-6.94(d,2H),7.09-7.62(m,11H),7.86-7.89(dd,1H),8.23-8.26(d,1H)；13C NMR(CDCl3)δ45.07,49.99,120.01,121.23,122.66,123.51,124.69,125.30,125.45,125.84,126.33,126.97,128.39,128.64,129.36,134.89,141.20,147.09,151.00,170.89。
            
e．(E.Z)-9-(苯氧基)磷酰氧亞甲基)-12-甲基苯并[c]9,10-二氫化吖啶，二(氰乙基)酯。
            
如上述制備LDA溶液。在-78℃攪拌25分鐘后，滴加苯并9,10-二氫吖啶酯(0.30克)的THF溶液。在-78℃連續(xù)攪拌30分鐘。最后加入POCl3(0.123毫升)和吡啶(0.107毫升)的THF溶液，使得該深紅色的溶液變成橙色。撤去干冰浴并繼續(xù)攪拌1小時(shí)。用冰浴冷卻該溶液并用吡啶(0.213毫升)和3-羥丙腈(0.180毫升)的THF溶液處理。室溫中攪拌過(guò)夜后，過(guò)濾該反應(yīng)溶劑，該殘余物和沉淀結(jié)合。用制備的TLC(60％乙酸乙酯/己烷)處理該物料，從中分離出以雙鍵異構(gòu)體的混合物形式存在的少量產(chǎn)物；1HNMR(CDCl3)δ2.44-2.52(m,4H),3.81-4.10(m,7H),6.89-8.24(m,15H)。
            
f．(E.Z)-9-(苯氧基)磷酰氧亞甲基)-12-甲基苯并[c]9,10-二氫化吖啶，二鈉鹽(6)。將從前述步驟中所得的磷酸二(氰乙基)酯溶于10毫升氬氣洗過(guò)的丙酮中并冰浴冷卻。滴加一種已用Ar氣洗過(guò)的溶液(0.1毫升的2MNaOH水溶液)，并在Ar氣氛中攪拌該溶液過(guò)夜。過(guò)濾該固體，用丙酮洗滌該產(chǎn)物化合物6，干燥。1H NMR(D2O)δ3.52(s,3H),6.85-6.90(t,1H),7.03-7.06(d,2H),7.15-7.23(m,3H),7.33-7.48(m,5H),7.72-7.75(d,1H),7.87-7.89(d,1H),8.10-8.17(t,2H)。實(shí)施例7．合成9,10-二氫化吖啶衍生物7。 a．吖啶-9-硫代羧酸4′-氟苯酯。將吖啶-9-羧酸(10克，45毫摩爾)懸浮于亞硫酰氯(約100毫升)并回流該反應(yīng)混合物2小時(shí)。減壓除去溶劑得到黃色固體，再在氬氣氛條件下溶于100毫升的CH2Cl2中。分別先后加入4-氟苯硫酚(5.25毫升，49毫摩爾)和30毫升吡啶。該反應(yīng)混和物變成淺紅褐色，并升溫至近乎回流。室溫中氬氣氛中攪拌該混合物2天。蒸去溶劑后，用800毫升己烷洗滌該殘留物，然后再用總量為1升的水洗滌。將殘留固體溶于300毫升的CH2Cl2中，通過(guò)Na2SO4/硅膠/Na2SO4填料(plug)。所得的是一黃色固態(tài)硫酯(11.55克)。1H NMR(CDCl3)δ7.20(t,2H),7.60-7.68(m,4H),7.80-7.88(m,2H),8.129(d,2H),8.278(d,2H)。
            
b．10-甲基吖啶-9-硫代羧酸4′-氟苯酯三氟甲磺酸鹽。將吖啶-9-硫代羧酸4′-氟苯酯(11.36克，34毫摩爾)在氬氣氛條件下溶于CH2Cl2(100毫升)中并加入三氟甲磺酸甲酯(20毫升)。該溶液變成褐色并產(chǎn)生黃色沉淀。兩天后，過(guò)濾該沉淀，分別用50毫升CH2Cl2和500毫升己烷洗滌并干燥得到黃色固態(tài)產(chǎn)物(15.3克)。1H NMR(DMSO-d6)δ4.93(s,3H),7.53(t,2H),7.97-8.37(m,2H),8.14(t,2H),8.54(t,2H),8.61(d,2H),8.92(d,2H)。
            
c．10-甲基-9,10-二氫化吖啶-9-硫代羧酸4′-氟苯酯。
            
在室內(nèi)避光條件下，將10-甲基-吖啶-9-硫代羧酸4′-氟苯酯三氟甲磺酸鹽(15.05克，30毫摩爾)懸浮于2-丙醇(150毫升)和2.1毫升的乙酸中。然后，加入10.0克鋅粉。鋅的加入使得該溶液的黃色在數(shù)分鐘內(nèi)消失。攪拌該混和物過(guò)夜。過(guò)濾并用2-丙醇，再用己烷，洗滌所得固體。用CH2Cl2洗滌該殘留固體。由于TLC分析顯示出該固體已熔于兩個(gè)溶液中，濃縮該濾液并結(jié)合得到褐色固體，再將其溶于CH2Cl2并通過(guò)Na2SO4/膠/Na2SO4填料層，用CH2Cl2洗脫。得到了源于酯基轉(zhuǎn)移作用的所需的9,10-二氫化吖啶硫酯和9,10-二氫化吖啶異丙基酯的混合物。用柱色譜(50％CH2Cl2∶己烷)分離該兩產(chǎn)物。從其中一個(gè)餾分中得到白色固態(tài)的純9,10-二氫化吖啶硫酯2.5克。從第二個(gè)餾分中所得是其和該異丙酯的混合物。1H NMR(CDCl3)δ3.45(s,3H),5.08(s,1H),6.94-7.06(m,6H),7.17-7.24(m,2H),7.31-7.39(m,4H)。
            
d．9-(4-氟苯基硫代磷酰氧亞甲基)-10-甲基-9,10-二氫化吖啶，二(氰乙基)酯。在室內(nèi)避光條件下，將10-甲基-9,10-二氫化吖啶-9-硫代羧酸4-氟苯酯(1.00克，2.87毫摩爾)的10毫升無(wú)水THF溶液滴加入-78℃的LDA的THF溶液中。在-78℃攪拌60分鐘后，用POCl3(0.79克)和吡啶(3.0毫升)的10毫升THF溶液處理該黃色溶液25分鐘。-小時(shí)后，撤去干冰浴并繼續(xù)攪拌2小時(shí)。冰浴冷卻該溶液并用3-羥丙腈(0.71毫升)處理，冰浴在加料完成后撤去。室溫中攪拌過(guò)夜后，過(guò)濾該沉淀的吡啶-HCl并用50毫升的THF洗滌。真空蒸發(fā)該合并的濾液。通過(guò)使用50-100％乙酸乙酯/己烷洗脫的柱色譜，分離該殘留物，從中得到0.658克產(chǎn)物；1H NMR(CDCl3)δ2.44-2.64(m,4H),3.49(s,3H),3.86-4.16(m,4H),6.92-7.15(m,6H),7.26-7.46(m,4H),7.786(d,1H),7.906(d,1H)；31PNMR(CDCl3)δ-9.49(p)(rel.to ext.H3PO4)。
            
e．9-(4-氟苯基硫代磷酰氧亞甲基)-10-甲基-9,10-二氫化吖啶，二鈉鹽(7)。在室內(nèi)避光條件下，將溶于20毫升丙酮的磷酸二(氰乙基)酯化合物(0.658克)充氬氣30分鐘。加入116.5毫克NaOH的4.0毫升水溶液并在氬氣氛中攪拌該溶液過(guò)夜。抽濾該所得沉淀，用100毫升丙酮洗滌并空氣干燥。在該濾液中形成了第二固體產(chǎn)物并和第一產(chǎn)物混合。產(chǎn)物是0.545克微黃色固態(tài)的7。1H NMR(D2O)δ3.16(s,3H),6.80-6.98(m,4H),7.06-7.14(m,4H),7.21(t,1H),7.78(t,1H),8.19(d,1H)；31P NMR(D2O)δ1.22(s)(rel.to ext.H3PO4)。實(shí)施例8．合成9,10-二氫化吖啶衍生物8。 a．吖啶-9-硫代羧酸4′-甲氧苯酯。將按前述方法制備的吖啶-9-碳酰氯溶于20毫升的CH2Cl2中。分別先后滴加4-甲氧苯硫酚(1.27克)和1.96克吡啶。室溫中攪拌該反應(yīng)混和物3.5天。收集沉淀，用水洗滌并干燥獲得第一批產(chǎn)物。將該CH2Cl2溶液用3×50毫升水洗滌，干燥并蒸發(fā)得到粗物質(zhì)，再將其在硅膠(乙酸乙酯)色譜上處理獲得第二批純產(chǎn)物。1HNMR(CDCl3)δ3.86(s,3H),7.01(d,1H),7.56(d,2H),7.62-8.28(m,8H)。
            
b．9,10-二氫化吖啶-9-硫代羧酸4′-甲氧苯酯。將吖啶-9-硫代羧酸4′-甲氧苯酯(2.0克)懸浮于2-丙醇(150毫升)中。分別先后分批加入NH4Cl(7.35克)和鋅(8.9克)到該溶液中。室溫中攪拌該溶液2小時(shí)，然后稍微溫?zé)?小時(shí)。TLC分析顯示該反應(yīng)混合物的起始材料已徹底消耗。過(guò)濾該溶液并用CH2Cl2洗滌該沉淀。將濾液和洗滌液濃縮得到一個(gè)粗產(chǎn)物，再將其重新溶于CH2Cl2中并用水(3×50毫升)洗滌。干燥該有機(jī)層并濃縮得到含有少量9,10-二氫化吖啶異丙酯的產(chǎn)物。1H NMR(CDCl3)δ3.74(s,3H),5.19(s,1H),6.29(br,s,1H),6.75-7.31(m,12H)。
            
c．10-甲基-9,10-二氫化吖啶-9-硫代羧酸4′-甲氧苯酯三氟甲磺酸鹽。將9,10-二氫吖啶-9-硫代羧酸4′-甲氧苯酯在氬氣氛條件下溶于CH2Cl2并加入三氟甲磺酸甲酯(6.3克)。室溫中攪拌該溶液過(guò)夜以便使其徹底甲基化。濃縮該反應(yīng)混和物并用柱色譜(30％乙酸乙酯/己烷)分離該殘留物以獲得1.08克產(chǎn)物。1H NMR(CDCl3)δ3.45(s,3H),3.76(s,3H),5.07(br s,1H),6.81-7.36(m,12H)。
            
d．9-(4-甲氧苯基硫代磷酰氧亞甲基)-10-甲基-9,10-二氫化吖啶，二(氰乙基)酯。
            
將10-甲基-9,10-二氫化吖啶-9-硫代羧酸4′-甲氧苯酯(700毫克)的10毫升無(wú)水THF溶液在維持-78℃的條件下，滴加入LDA(1.4當(dāng)量)的10毫升無(wú)水THF溶液中。-78℃攪拌1小時(shí)后，滴加入POCl3(520毫克)和吡啶(1.64克)的4毫升THF溶液。在-78℃連續(xù)攪拌30分鐘，撤去干冰浴并再繼續(xù)攪拌l小時(shí)。再用冰浴冷卻該溶液并滴加入吡啶(1毫升)和3-羥基丙腈(0.86毫升)。室溫?cái)嚢柽^(guò)夜后，濾去沉淀的吡啶-HCl并真空蒸去該反應(yīng)溶劑。將殘留物溶于乙酸乙酯并用水(3×25毫升)洗滌。將該有機(jī)溶液干燥并濃縮，并用柱色譜(30-100％乙酸乙酯/己烷)處理該粗產(chǎn)物，分離出淺黃色固態(tài)產(chǎn)物；1H NMR(CDCl3)δ2.44-2.62(m,4H),3.51(s,3H),3.82(s,3H),3.88-4.11(m,4H),6.53-7.41(m,10H),7.84-7.91(m,2H)；31PNMR(CDCl3)δ-9.63(p)(rel.to ext.H3PO4)。
            
e．9-(4-甲氧苯基硫代磷酰氧亞甲基)-10-甲基-9,10-二氫化吖啶，二鈉鹽(8)。將磷酸二(氰乙基)酯化合物(0.42克)的11毫升丙酮溶液用氬氣鼓泡。滴加入614微升的2.5M的NaOH水溶液并氬氣氛中攪拌該溶液過(guò)夜。抽濾所形成的沉淀并空氣干燥，得到一定量的微黃色固態(tài)產(chǎn)物8。1HNMR(D2O)δ3.32(s,3H),3.70(s,3H),6.69-7.33(m,10H),7.80(d,1H),8.18(d,1H)。實(shí)施例9．合成9,10-二氫化吖啶衍生物9。 a 9,10-二氫化吖啶-9-硫代羧酸2′,6′-二甲苯酯。將吖啶-9-羧酸(2克)懸浮于亞硫酰氯(25毫升)中，并將該反應(yīng)混合物回流2.5小時(shí)。減壓除去溶劑并將所得固體溶于50毫升的CH2Cl2中。冰浴冷卻該溶液并分別先后滴加入2,6-二甲基苯硫酚(1.23克)和3.6毫升吡啶。室溫?cái)嚢柙摷t棕色反應(yīng)混合物1.5小時(shí)。用CH2Cl2稀釋該反應(yīng)混和物并用3×50毫升的水洗滌。干燥該有機(jī)層并濃縮得到橙色產(chǎn)物，再用硅膠色譜(乙酸乙酯)處理得到灰白色固體純產(chǎn)物2.5克。1H NMR(CDCl3)δ2.68(s,6H),7.30-7.41(m,3H),7.63-8.31(m,8H)。
            
b．9,10-二氫化吖啶-9-硫代羧酸2′,6′-二甲苯酯。
            
將吖啶-9-硫代羧酸2′,6′-二甲基苯酯(2.46克)懸浮于2-丙醇(200毫升)中。分別先后分批加入氯化銨(9.6克)和鋅(11.65克)到該溶液中。稍溫?zé)嵩撊芤?小時(shí)。TLC分析該反應(yīng)混和物表明起始材料已徹底消耗完。過(guò)濾該溶液并用CH2Cl2洗滌該沉淀。濃縮該濾液得到白色固體，再將其溶于CH2Cl2中，用水(3×50毫升)洗滌。用Na2SO4干燥該有機(jī)層并濃縮得到白色固體的2.46克產(chǎn)物。1H NMR(CDCl3)δ2.08(s,6H),5.24(s,1H),6.27(br s,1H),6.78-7.31(m,11H)。
            
c．10-甲基-9,10-二氫化吖啶硫代羧酸2′,6′-二甲基苯酯。將9,10-二氫化吖啶-9-硫代羧酸2′,6′-二甲基苯酯在氬氣氛條件下溶于30毫升的CH2Cl2中并加入三氟甲磺酸甲酯(6.6毫升)。室溫中攪拌該溶液3天。蒸干該混合物并用柱色譜(CH2Cl2)純化該粗產(chǎn)物得到1.85克白色固態(tài)產(chǎn)物。1H NMR(CDCl3)δ2.09(s,6H),3.46(s,3H),5.09(s,1H),6.97-7.36(m,11H)。
            
d．9-(2,6-二甲基苯基硫代磺酰氧亞甲基)-10-甲基-9,10-二氫化吖啶，二(氰乙基)酯。將溶于12毫升無(wú)水THF的10-甲基-9,10-二氫化吖啶-9-硫代羧酸2,6-二甲苯酯加入LDA(1.4當(dāng)量)的10毫升無(wú)水THF的-78℃溶液中。-78℃攪拌該橙色溶液60分鐘。滴加入4毫升的POCl3(280μl)和吡啶(1.57毫升)的THF溶液。攪拌該反應(yīng)混和物15分鐘后，撤去干冰浴。繼續(xù)攪拌60分鐘。TLC(30％乙酸乙酯/己烷)顯示大部分起始反應(yīng)物已反應(yīng)。
            
冰浴冷卻該溶液并用吡啶(1.0毫升)和3-羥基丙腈(666μl)處理。室溫中攪拌過(guò)夜后，過(guò)濾沉淀出的吡啶-HCl并用THF洗滌。真空蒸發(fā)該合并的有機(jī)溶液。干燥該有機(jī)層并濃縮得橙色產(chǎn)物，再將其在硅膠(乙酸乙酯)上色譜分離得到80毫克黃色油狀的純產(chǎn)物。1H NMR(CDCl3)δ2.34-2.43(m,4H),2.47(s,6H),3.47(s,3H),3.42-3.71(m,4H),7.01-8.07(m,11H)；31PNMR(CDCl3)δ-10.207(p)(rel.to ext.H3PO4)。
            
e．9-(2,6-二甲基苯基硫代磷酰氧亞甲基)-10-甲基-9,10-二氫化吖啶，二鈉鹽(9)。將磷酸二(氰乙基)酯化合物(0.80克)的6毫升丙酮溶液氬氣鼓泡洗滌。分別先后滴加1M NaOH的水溶液(293μl)和另外的300μl水，氬氣氛中攪拌該溶液過(guò)夜。抽濾該所得沉淀，用丙酮洗滌并進(jìn)行空氣干燥。產(chǎn)物是0.60克白色固體9。1H NMR(D2O)δ2.13(s,6H),3.19(s,3H),6.60-8.19(m,1H)；31P NMR(D2O)δ1.653(s)(rel.to ext.H3PO4)。實(shí)施例10．合成9,10-二氫化吖啶衍生物10。 a．4-氟代-N-乙酰苯胺。將4-氟代苯胺(20克)溶于25毫升的乙酸中并在冰浴中冷卻。以5毫升為一批分批加入乙酐(25毫升)到該攪拌的溶液中。將所得溶液傾入200毫升的冷水中并濾去沉淀物。用水洗滌該固體并真空干燥。1H NMR(CDCl3)δ2.175(s,3H),7.014(t,2H),7.15(br s,1H),7.43-7.48(m,2H)。
            
b．4,4′-二氟二苯胺。在有11.08克K2CO3和1.61克CuI存在的條件下，將4-氟代-N-乙酰苯胺(12.0克)和1-溴-4-氟苯(21毫升)在190℃縮合90小時(shí)。冷卻后，過(guò)濾該混和物并用CH2Cl2洗滌該固體。真空蒸發(fā)該合并的有機(jī)溶液得到大約20克暗棕色液體。將其溶于100毫升的乙醇并和9克KOH回流24小時(shí)。蒸去乙醇并將該暗色殘留物溶于醚，再用水洗滌(3×100毫升)。干燥并濃縮該醚溶液，再用硅膠柱色譜(15％乙酸乙酯/己烷)純化該粗產(chǎn)物1H NMR(CDCl3)δ5.46(br s,1H),6.947(s,4H),6.97(s,4H)；31C NMR(CDCl3)δ115.86,116.16,119.38,119.47。
            
c．2,7-二氟吖啶-9-羧酸。將溶于50毫升CH2Cl2中的4,4′-二氟二苯胺(5.4克)以維持回流的速度在氬氣氛的條件下，加入到2.52毫升(0.11摩爾)草酰氯的30毫升CH2Cl2溶液中。再回流該混和物35分鐘。蒸去所得溶液中過(guò)量的草酰氯。將該固體重新溶于75毫升的CH2Cl2中并用冰浴冷卻。將該燒瓶以氬氣洗滌排氣，并分批加入Al3Cl3(14.28克)，同時(shí)攪拌該混和物。該混和物在加料過(guò)程中變得粘稠并開(kāi)始回流。在全部AlCl3加入后，再維持回流一小時(shí)。真空蒸發(fā)該冷卻的混和物并用300毫升的3∶1的冰/5MHCl急冷。攪拌該混和物一小時(shí)，抽濾該橙色固體(靛紅)并用水洗滌。1HNMR(丙酮-d6)δ6.92-6.97(m,1H),7.35-7.61(m,6H)。
            
將該靛紅產(chǎn)物在110毫升10％KOH水溶液中回流過(guò)夜。用400毫升1∶1的冰/5m HCl冷卻并酸化該暗綠色混和物。用水洗滌該固體并空氣干燥得到吖啶酸。1H NMR(DMSO-d6)δ7.81-7.94(m,4H),8.31-8.36(m,2H)。
            
d．2,7-二氟吖啶-9-硫代羧酸苯酯。將2,7-二氟吖啶-9-羧酸(1.0克)懸浮于SOCl2(5毫升)，并回流該反應(yīng)混和物3小時(shí)。減壓除去溶劑并將所得棕色固體在氬氣氛的條件下溶于20毫升的CH2Cl2中。先后加入苯硫酚(486毫克)和吡啶(2毫升)。室溫中攪拌該混合物過(guò)夜。以CH2Cl2稀釋該反應(yīng)混和物并用水洗滌(3×50毫升)。該有機(jī)相用MgSO4干燥并濃縮得到粗產(chǎn)物，再用硅膠色譜(40％乙酸乙酯/己烷)純化得到1.2克純產(chǎn)物。1HNMR(CDCl3)δ7.52-7.75(m,9H),8.26-8.30(m,2H)。
            
e．2,7-二氟-9,10-二氫化吖啶-9-硫代羧酸苯酯。將2,7-二氟-9,10-二氫化吖啶-9-硫代羧酸苯酯(1.2克)和NH4Cl(4.57克)一起懸浮于2-丙醇(125毫升)中。加入鋅(5.5克)并加溫該反應(yīng)混和物2.5小時(shí)，隨后置于室溫中1.5小時(shí)。TLC分析該反應(yīng)混和物表明已徹底轉(zhuǎn)變成一個(gè)新物質(zhì)。過(guò)濾該溶液并用CH2Cl2洗滌該沉淀。濃縮該濾液并將淺橙色殘留物重新溶于CH2Cl2中并用水(2×100毫升)洗滌。該有機(jī)層用Na2SO4干燥并濃縮，得到無(wú)需進(jìn)一步純化的粗產(chǎn)物。1H NMR(CDCl3)δ5.12(s,1H),6.19(brs,1H),6.72-7.35(m,11H)。
            
f．2,7-二氟-10-甲基-9,10-二氫化吖啶-9-硫代-羧酸苯酯。將2,7-二氟-9,10-二氫化吖啶-9-硫代-羧酸苯酯在氬氣氛條件下溶于CH2Cl2并加入三氟甲磺酸甲酯(5.29克)。室溫?cái)嚢柙撊芤哼^(guò)夜。TLC分析表明該轉(zhuǎn)化約完成50％，所以另加入2毫升三氟甲磺酸甲酯并繼續(xù)攪拌40小時(shí)。濃縮該反應(yīng)混和物，并使用20-50％CH2Cl2/己烷色譜分離該殘留物，得到帶有少量的9,10-二氫化吖啶羧酸異丙酯副產(chǎn)物的產(chǎn)物。1H NMR(丙酮-d6)δ3.41(s,3H),4.98(s,1H),6.98(s,1H),6.89-7.34(m,11H)。
            
g．9-(苯基硫代磺酰氧亞甲基)-2,7-二氟-10-甲基-9,10-二氫化吖啶，二(氰乙基)酯。將2,7-二氟-10-甲基-9,10-二氫化吖啶-9-硫代羧酸苯酯(500毫克，1.3毫摩爾)加入到-78℃的LDA(1.4毫摩爾)的THF溶液中。攪拌一小時(shí)后，加入4毫升的POCl3(313毫克)和吡啶(1.07克)的THF溶液并將該反應(yīng)混和物保持在-78℃一小時(shí)。撤去該干冰浴并繼續(xù)攪拌一小時(shí)。
            
冰浴冷卻該溶液，滴加吡啶和3-羥基丙腈(484毫克)的4毫升THF溶液處理。室溫中攪拌過(guò)夜后，濾去沉淀出的吡啶-HCl并真空蒸發(fā)該反應(yīng)溶劑。將該殘留物溶于乙酸乙酯中并用4×25毫升水洗滌。干燥并蒸發(fā)該乙酸乙酯后，色譜(75-80％乙酸乙酯/己烷)分離該殘留物獲得產(chǎn)物；1HNMR(CDCl3)δ2.48-2.65(m,4H),3.48(s,3H),4.02-4.16(m,4H),6.91-7.66(m,11H)；31P NMR(CDCl3)δ-9.874(p)(rel.to ext.H3PO4)。
            
h．9-(苯基硫代磷酰氧亞甲基)-2,7-二氟-10-甲基-9,10-二氫化吖啶，二鈉鹽(10)。將磷酸二(氰乙基)酯化合物(0.28克)的17毫升丙酮溶液用冰浴冷卻，并氬氣鼓泡。滴加1.02毫升的1N NaOH水溶液并通氬氣攪拌該溶液16小時(shí)。抽濾所得的沉淀，用丙酮洗滌并真空干燥。產(chǎn)物是0.236克灰白色固體10。1H NMR(D2O)δ3.28(s,3H),6.78-8.21(m,11H),31PNMR(D2O)δ1.006(s)(rel.to ext.H3PO4)。實(shí)施例11．合成9,10-二氫化吖啶衍生物11。 a．吖啶-9-硫代羧酸2′,2′,2′-三氟乙酯。
            
將如上述制備的吖啶-9-碳酰氯(1.89克)在氬氣氛條件下溶于30毫升的CHCl2中。冰浴冷卻該溶液并分別先后滴加2,2,2-三氟乙硫醇(1.0克)和3.23克吡啶。室溫?cái)嚢柙摲磻?yīng)混和物3天。加入水(20毫升)并過(guò)濾殘存沉淀，棄去。用3×25毫升水洗滌該CH2Cl2溶液，干燥并蒸發(fā)獲得純度足以用于下步反應(yīng)的灰白色固體產(chǎn)物。1H NMR(CDCl3)δ4.02-4.10(q,2H),7.61-8.31(m,8H)。
            
b．9,10-二氫化吖啶-9-硫代羧酸2′,2′,2′-三氟乙酯。將9,10-二氫化吖啶-9-硫代羧酸2′,2′,2′-三氟乙酯(1.7克)和NH4Cl(7.08克)一起懸浮于2-丙醇(150毫升)中。加入鋅(8.61克)，在室溫中攪拌該反應(yīng)混和物1.5小時(shí)。TLC分析試反應(yīng)混和物表明其已徹底轉(zhuǎn)化成一個(gè)新的物質(zhì)。過(guò)濾該溶液并用CH2Cl2洗滌該沉淀。濃縮該濾液并將淺橙色殘留物重新溶于CH2Cl2中并用水洗滌(3×50毫升)。該有機(jī)層干燥并濃縮得到純度足以用于下步反應(yīng)的灰白色固態(tài)粗產(chǎn)物。1H NMR(CDCl3)δ3.37-3.47(q,2H),5.206(s,1H),6.27(br s,1H),6.78-7.27(m,8H)。
            
c．10-甲基-9,10-二氫化吖啶-9-硫代羧酸2′,2′,2′-三氟乙酯。將9,10-二氫化吖啶-9-硫代羧酸2′,2′,2′-三氟乙酯在氬氣氛條件下溶于CH2Cl2(20毫升)并加入三氟甲磺酸甲酯(4.06毫升)。室溫?cái)嚢柙撟厣芤?.5天。濃縮該CH2Cl2后，通過(guò)使用50％CH2Cl2/己烷的柱色譜，純化該粗產(chǎn)物。1H NMR(CDCl3)δ3.39-3.43(q,2H),3.43(s,3H),5.04(s,1H),6.98-7.38(m,8H)。
            
d．9-(2′,2′,2′-三氟乙基硫代磷酰亞甲基)-10-甲基-9,10-二氫化吖啶，二(氰乙基)酯。將溶于10毫升的THF中的10-甲基-9,10-二氫化吖啶-9-硫代羧酸2′,2′,2′-三氟乙酯(300毫克)，滴加入-78℃的LDA(1.4當(dāng)量)的10毫升THF溶液中。-78℃攪拌60分鐘后，緩慢加入POCl3(239毫克)和吡啶(703毫克)在4毫升THF中的溶液。30分鐘后，撤去干冰浴并繼續(xù)攪拌60分鐘。冰浴冷卻該溶液并用吡啶(500μl)和3-羥基丙腈(395μl)處理。形成了棕黃色沉淀。室溫中攪拌過(guò)夜后，濾去沉淀并真空蒸發(fā)該反應(yīng)溶劑。將該殘留物溶于乙酸乙酯，用5×25毫升水洗滌，干燥并濃縮。通過(guò)用CH2Cl2洗脫該柱色譜分離該粗產(chǎn)物，然后轉(zhuǎn)換該溶劑成60-100％乙酸乙酯/己烷的梯度洗脫液。分離此兩個(gè)餾分(每個(gè)都是兩個(gè)靠近的洗脫產(chǎn)物的混和物，較慢洗脫的是較少含量的組份)。每個(gè)餾分通過(guò)使用25％乙酸乙酯/己烷的制備的TLC進(jìn)一步分離純化。已證明較慢洗脫的產(chǎn)物是所需的磷酸二(氰乙基)酯。1H NMR(CDCl3)δ2.69(t,4H),3.41-3.54(q,2H),3.49(s,3H),4.04-4.24(m,4H),7.04-7.95(m,8H)；31P NMR-8.66(p)。
            
通過(guò)1H NMR,13C NMR,19F NMR和31P NMR以及同核和異核去偶合試驗(yàn)測(cè)定，其它產(chǎn)物是衍生于SCH2CF3基團(tuán)的HF的消除作用和烯醇酯的磷?；饔玫?-(2′,2-二氟乙烯硫代磷酰氧亞甲基)-10-甲基-9,10-二氫化吖啶，二(氰乙基)酯。1H NMR(CDCl3)δ2.60-2.76(m,4H),3.49(s,3H),4.02-4.26(m,4H),5.17(d,1H),7.03-7.88(m,8H)；19F NMR(CDCl3)δ-76.76(d,J=Hz),-78.88(t,J=Hz)；31P NMR(CDCl3)δ-8.83(p)。
            
在δ5.17處的雙重峰(的irradiation)不影響1H NMR光譜中任何其它信號(hào)。在δ4.02-4.26處的多重峰能將δ2.60-2.76處的多重峰壓并(collapsed)成單峰并將該磷信號(hào)壓并成單峰。在1H光譜中δ5.17處的雙重峰能將19F光譜中的三重峰壓并成雙重峰。
            
e．9-(2′,2′,2′-三氟乙硫基磷酰氧亞甲基)-10-甲基-9,10-二氫化吖啶，二鈉鹽(11)。將磷酸二(氰乙基)酯化合物(15毫克)的4毫升丙酮溶液氬氣鼓泡。分別滴加入1M NaOH的水溶液(58μl)和100微升水，并在氬氣氛條件下攪拌過(guò)夜。TLC分析顯示其已徹底去保護(hù)。濃縮該混合物至干燥得到灰白色固體，再用20％CH2Cl2/丙酮洗滌并空氣干燥。1H NMR(D2O)δ3.399(s,3H),3.45-3.61(m,2H),7.04-8.18(m,8H)；31P NMR(D2O)δ1.465(s)(rel.to ext.H3PO4)。實(shí)施例12．合成9,10-二氫化吖啶衍生物12。 a．吖啶-9-硫代羧酸4′-氯苯酯。將4-氯苯硫酚(4.75克)和7.22克吖啶-9-碳酰氯溶于100毫升的CH2Cl2中，再加入12.1毫升吡啶。該反應(yīng)混和物變成橙棕色。室溫中氬氣氛攪拌該混和物過(guò)夜。蒸去溶劑后，用100毫升的己烷洗滌該固體，過(guò)濾，再用100毫升己烷洗滌，過(guò)濾，再用500毫升的水洗滌，過(guò)濾并空氣干燥。得到微棕黃色固態(tài)的硫酯(8.71克)。1HNMR(CDCl3)δ7.47-7.50(m,2H),7.58-7.67(m,4H),7.81-7.86(m,2H),8.12(d,2H),8.29(d,2H)。
            
b．9,10-二氫化吖啶-9-硫代羧酸4′-氯苯酯。
            
將吖啶-9-硫代羧酸4′-氯苯酯(2.0克)溶于CH2Cl2(25毫升)。將該溶液氬氣鼓泡，然后分別先后加入3.72克鋅粉和0.45毫升的乙酸。TLC分析顯示該起始反應(yīng)物在20分鐘內(nèi)消耗完。過(guò)濾該混和物并用CH2Cl2洗滌該固體。用水(3×50毫升)洗滌該合并的CH2Cl2溶液并干燥。用制備的TLC純化該少量產(chǎn)物以供測(cè)定其特性，而其余產(chǎn)物則無(wú)需進(jìn)一步純化就可使用。1HNMR(CDCl3)δ5.22(s,1H),6.28(s,1H),6.29-7.31(m,12H)。
            
c．10-甲基-9,10-二氫化吖啶-9-硫代羧酸4′-氯苯酯。
            
將9,10-二氫化吖啶-9-硫代羧酸4′-氯苯酯(2.0克)在氬氣氛條件下溶于CH2Cl2(30毫升)中并加入三氟甲磺醇甲酯(6.5克)。蒸發(fā)該棕色溶液并通過(guò)使用30％乙酸乙酯/己烷的柱色譜純化該粗產(chǎn)物。從而獲得純產(chǎn)物(1.8克)。1H NMR(CDCl3)δ3.47(s,3H),5.09(s,1H),7.02-7.39(m,12H)。
            
d．9-(4-氯苯基硫代磷酰氧亞甲基)-10-甲基-9,10-二氫化吖啶，二(氰乙基)酯。
            
將溶于10毫升無(wú)水THF中的10-甲基-9,10-二氫化吖啶-9-硫代羧酸4-氯苯酯滴加入-78℃的LDA(1.4當(dāng)量)的THF溶液中。-78℃攪拌60分鐘后，用POCl3(0.517克)和吡啶(1.52毫升)的4毫升THF溶液緩慢地處理該黃色溶液。30分鐘后，撤去干冰并繼續(xù)攪拌1小時(shí)。該溶液變成黃色并形成沉淀。
            
冰浴冷卻該混和物并用3-羥基丙腈(0.89克)和1.0毫升吡啶處理。該加料完成后，撤去冰浴。室溫中攪拌過(guò)夜后，濾去沉淀出的吡啶-HCl并用THF洗滌。真空蒸發(fā)該合并的濾液，并將所得棕色物溶于乙酸乙酯中，再以4×25毫升水洗滌。干燥并濃縮該乙酸乙酯溶液。使用80-100％乙酸乙酯/己烷柱色譜分離該殘余物并從中分離出0.325克產(chǎn)物；1H NMR(CDCl3)δ2.48-2.64(m,4H),3.53(s,3H),3.86-4.16(m,4H),6.94-7.94(m,12H)；31PNMR(D2O)δ-9.48(p)(rel.to ext.H3PO4)。
            
e．9-(4’-氯苯基硫代苯酰氧亞甲基)-10-甲基-9,10-二氫化吖啶，二鈉鹽(12)。
            
將溶于10毫升丙酮中的磷酸二(氰乙基)酯化合物(0.325克)氬氣鼓泡洗滌。分別先后加入2.5M NaOH(473μl)和500微升水。將該溶液在氬氣氛攪拌過(guò)夜。抽濾該形成的沉淀并空氣干燥。發(fā)現(xiàn)母液中含有單(氰乙基)-保護(hù)的化合物(140毫克)。通過(guò)重復(fù)NaOH脫保護(hù)的步驟，得到第二產(chǎn)物二鈉鹽。1H NMR(D2O)δ3.35(s,3H),6.92-7.36(m,10H),7.78(d,1H),8.20(d,1H)；31PNMR(D2O)δ1.22(s)(rel.to ext.H3PO4)。實(shí)施例13．合成9,10-二氫化吖啶衍生物13。 a．吖啶-9-硫代羧酸萘酯。將2-萘硫酚(48.81克)和，從65.17克吖啶-9-羧酸制備的吖啶-9-碳酰氯，溶于100毫升的CH2Cl2中，隨后加入120毫升的吡啶。室溫氬氣氛條件下攪拌該混和物過(guò)夜。蒸去溶劑后，該固體用500毫升的己烷洗滌，過(guò)濾，再用500毫升的己烷洗滌，過(guò)濾，然后，用600毫升水洗滌，過(guò)濾并空氣干燥過(guò)夜。將該硫酯溶解于1500毫升的CH2Cl2,Na2SO4干燥，過(guò)濾，真空干燥。所得的硫酯是棕色固體。1HNMR(CDCl3)δ7.54-8.00(m,11H),8.17-8.31(m,4H)。
            
b．10-甲基吖啶-9-硫代羧酸萘酯三氟甲磺酸鹽。
            
將吖啶-9-硫代羧酸萘酯(26.38克)懸浮于CH2Cl2(200毫升)中。加入三氟甲磺酸甲酯并攪拌該混和物過(guò)夜。過(guò)濾該混和物并用CH2Cl2(300毫升)和己烷(500毫升)洗滌。空氣干燥后，所得的產(chǎn)品是一黃色固體。1H NMR(丙酮-d6)δ5.20(s,3H),7.66-7.75(m,2H),7.88-7.92(m,1H),8.03-8.09(m,2H),8.15(d,1H),8.26(t,2H),8.48(s,1H),8.61-8.68(m,2H),8.80(d,2H),9.03(d,2H)。
            
c．10-甲基-9,10-二氫化吖啶-9-硫代羧酸萘酯。
            
將10-甲基吖啶-9-硫代羧酸萘酯三氟甲磺酸鹽(65.50克)在氬氣氛條件下懸浮于CH2Cl2(1000毫升)中，并加入冰醋酸(21.2毫升)和鋅(40.43克)。攪拌過(guò)夜后，TLC分析顯示出起始反應(yīng)物已消失并形成了新產(chǎn)物。將該反應(yīng)混和物通過(guò)硅膠床過(guò)濾，并真空除去CH2Cl2。將所得的淺黃色固體在異丙醇(500毫升)中攪拌，過(guò)濾，用多于500毫升的異丙醇洗滌，并空氣干燥。獲得了純產(chǎn)物(46.36克)。1H NMR(CDCl3)δ3.47(s,3H),5.13(s,1H),7.00-7.06(m,4H),7.25-7.49(m,7H),7.70-7.79(m,4H)。
            
d．9-(萘硫代磷酰氧亞甲基)-10-甲基-9,10-二氫化吖啶，二(氰乙基)酯。將溶于600毫升無(wú)水THF中的10-甲基-9,10-二氫化吖啶-9-硫代羧酸萘酯(17.32克)滴加入-78℃的LDA(1.25當(dāng)量)的THF溶液中。-78℃攪拌90分鐘后，用POCl3(20.80克)和吡啶(50毫升)的150毫升THF溶液緩慢地處理該橙棕色溶液。60分鐘后，撤去干冰浴，并繼續(xù)攪拌一小時(shí)。該溶液變成棕色并形成沉淀。
            
用3-羥基丙腈(27.8毫升)處理該混和物。室溫中攪拌過(guò)夜后，濾去沉淀出的吡啶-HCl并用THF洗滌。真空蒸去該合并的濾液并將所得的棕色油狀物用50-100％乙酸乙酯/己烷柱色譜分離，從而得到產(chǎn)物。將該黃色油狀物溶于CH2Cl2(300毫升)，用水(450毫升)洗滌，Na2SO4干燥，過(guò)濾，并真空干燥。所得的產(chǎn)物(17.76克)是黃色固體。1H NMR(CDCl3)δ2.33-2.53(m,4H),3.53(s,3H),3.82-4.06(m,4H),6.93(t,1H),7.03(d,1H),7.10-7.18(m,2H),7.25-7.55(m,5H),7.79-7.92(m,5H),8.02(d,1H)；31P NMR(CDCl3)δ-9.69(p)(rel.to ext.H3PO4)。
            
e．9-(萘硫代磷酰氧亞甲基)-10-甲基-9,10-二氫化吖啶，二鈉鹽(13)。
            
將溶于200毫升丙酮的磷酸二(氰乙基)酯化合物(17.28克)氬氣鼓泡洗滌。加入NaOH(2.76克)的50毫升水溶渡，并在氬氣氛攪拌該溶液過(guò)夜。抽濾所得沉淀，并用20％的水的丙酮(300毫升)溶液洗滌，真空干燥。所得的產(chǎn)物(15.07克)是淺黃色固體。1H NMR(D2O)δ3.22(s,3H),6.67(d,1H),6.87(t,1H),7.01(t,1H),7.08-7.15(m,2H),7.23(d,1H),7.31-44(m,3H),7.51(s,1H),7.59(d,2H),7.73(d,1H),7.86(d,1H),8.25(d,1H)；31P NMR(D2O)δ1.30(s)(rel.to ext. H3PO4)。實(shí)施例14．用化合物1化學(xué)發(fā)光檢測(cè)堿性磷酸酶。
            
一種有效的用于化學(xué)發(fā)光檢測(cè)堿性磷酸酶的試劑組合物，它包括0.1Mtris緩沖液(pH8.5),0.88mM鎂鹽，0.33mM磷酸9,10-二氫化吖啶酯1(從0.03M的甲醇溶液中1∶100稀釋而來(lái))和0.01毫克/毫升增強(qiáng)因子A(聚乙烯芐基三丁基鏻氯化物共-聚乙烯芐基三辛基鏻氯化物，三丁基∶三辛基基團(tuán)的比率是3∶1)。在置于Turner TD-20e發(fā)光計(jì)的試管中，該組合物和10-13摩爾的AP在25℃反應(yīng)，發(fā)出在兩發(fā)鐘內(nèi)達(dá)到最高強(qiáng)度的易于檢測(cè)的藍(lán)色化學(xué)發(fā)光。實(shí)施例15．用化合物2-13檢測(cè)化學(xué)發(fā)光。
            
按照實(shí)施例14的方法，分別含有化合物2-13的組合物和AP在25℃反應(yīng)。每個(gè)反應(yīng)均產(chǎn)生出可分辨于無(wú)AP存在時(shí)測(cè)出的背景的，易于檢測(cè)的，化學(xué)發(fā)光。
            
對(duì)本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，除了這里具體例證的外，式Ⅰ的其它化合物也能以類似的方式在本方法中起作用。實(shí)施例16．用化合物5化學(xué)發(fā)光檢測(cè)堿性磷酸酶。
            
一種有效的用于化學(xué)發(fā)光檢測(cè)堿性磷酸酶的試劑組合物包括0.2M的2-甲基-2-氨基-1-丙醇緩沖液(pH9.6),0.88mM的Mg2+,0.66mM磷酸9,10-二氫化吖啶酯5(從0.033M的甲醇溶液中以1∶100稀釋而來(lái))和0.5毫克/毫升增強(qiáng)因子A。在置于Turner TD-20e發(fā)光計(jì)的試管中，100微升該組合物和10-13摩爾AP在25℃反應(yīng)產(chǎn)生出易于檢測(cè)的且在2分鐘內(nèi)達(dá)到最高強(qiáng)度的藍(lán)色化學(xué)發(fā)光。在1到10分鐘內(nèi)測(cè)定的光強(qiáng)度和8×10-14摩爾到8×10-18摩爾范圍內(nèi)的酶的量相關(guān)。實(shí)施例17．化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的動(dòng)力學(xué)分布。
            
圖1的曲線顯示了含有磷酸9,10-二氫化吖啶酯1的組合物所達(dá)到的快速檢測(cè)速度。100微升的實(shí)施例14的試劑組合物和8×10-6摩爾的AP在25℃反應(yīng)引起光的突然發(fā)射并在大約2分鐘內(nèi)達(dá)到最高強(qiáng)度。該圖也顯示了類似于實(shí)施例14所述的，以10-甲基-9,10-二氫化吖啶-9-羧酸苯酯代替1的試劑組合物的化學(xué)發(fā)光的對(duì)比分布曲線。在該后者的酯溶液中加入AP沒(méi)有什么效果。該酯的自發(fā)的自氧化作用的過(guò)低的光強(qiáng)度和過(guò)慢的產(chǎn)生時(shí)間不相容于反應(yīng)1的發(fā)射情況，這是僅因?yàn)橥ㄟ^(guò)AP(從磷酸烯醇酯上除去磷酸酯保護(hù)基)產(chǎn)生酯，隨后該酯產(chǎn)生自氧化作用。實(shí)施例18．化合物1和AP反應(yīng)的光譜學(xué)研究。
            
用帶有二極管系統(tǒng)檢測(cè)器的UV-可見(jiàn)分光光度計(jì)監(jiān)測(cè)實(shí)施例14的試劑組合物和2.4×10-12摩爾的AP在室溫中的反應(yīng)進(jìn)程。以5分鐘的間隔測(cè)定該光譜。圖2顯示的光譜演變表明了由多種中間體和產(chǎn)物所構(gòu)成的復(fù)雜圖譜。標(biāo)有A-F的曲線代表在加入酶后0,5,10,20,40和60分鐘的掃描圖。實(shí)施例19．化學(xué)發(fā)光光譜。
            
使用由Luingon的Barry Schoenfelner博士所制的裝置得到化學(xué)發(fā)光光譜。實(shí)施例14的試劑組合物在由置于光密閉盒的試管所構(gòu)成的樣品箱中和AP(8×10-13mol)反應(yīng)。該發(fā)射光用透鏡收集，并通過(guò)單色光柵分散到CCD成像器件上。由于該系統(tǒng)同時(shí)成像了全部波長(zhǎng)的可見(jiàn)光，所以無(wú)需修正光強(qiáng)度隨著時(shí)間的改變。圖3所示的發(fā)射光光譜是在大約430nm處有最大強(qiáng)度的寬發(fā)射。該光譜類似于N-甲基吖啶酮的熒光。光譜中明顯的細(xì)微結(jié)構(gòu)是儀器噪音的結(jié)果。實(shí)施例20．pH對(duì)化合物1和堿性磷酸酶的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的影響。
            
本發(fā)明的用9,10-二氫化吖啶化學(xué)發(fā)光檢測(cè)堿性磷酸酶的方法可以在寬范圍的pH下完成。制備含有0.1M緩沖液(無(wú)論是tris或2-甲基-2-氨基-1-丙醇，221),pH7-10.5,0.88mM的Mg2+,0.33mM磷酸9,10-二氫化吖啶酯1(從0.33M甲醇溶液中1∶100稀釋而來(lái))和0.01毫克/毫升的增強(qiáng)因子的溶液并在25℃10分鐘后測(cè)定背景光發(fā)射。加入含有8×10-16摩爾酶的AP溶液并監(jiān)測(cè)光強(qiáng)度直到最大強(qiáng)度。S/B代表最大光強(qiáng)度對(duì)無(wú)酶存在時(shí)的光強(qiáng)度的比值。
            
表2項(xiàng)目pH緩沖液   S/B1   7.0   tris  372   7.5   tris 1443   8.0   tris 2734   8.5   tris 2805   9.0   tris 1956   9.0   221  2007   9.5   221   878   10.0  221   139   10.5  221  1.3實(shí)施例21．用表面活性劑增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光。定義為在無(wú)檢測(cè)物質(zhì)存在的水平上增加光強(qiáng)度的增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光，是在有各種表面活性劑化合物存在的標(biāo)準(zhǔn)的試驗(yàn)條件下，在9,10-二氫化吖啶1和AP的反應(yīng)中測(cè)定的。分別測(cè)定每個(gè)表面活性劑產(chǎn)生最大增強(qiáng)效應(yīng)的濃度。在標(biāo)有S/B列的值代表有10-16摩爾AP存在時(shí)的光強(qiáng)度和無(wú)酶存在時(shí)的光強(qiáng)度的比率。標(biāo)有Rel的列提供了有增強(qiáng)因子存在的條件下的光強(qiáng)度對(duì)無(wú)增強(qiáng)因子時(shí)的光強(qiáng)度(第11項(xiàng))的歸一化比率。
            
表3項(xiàng)目表面活性劑濃度   S/B   Rel1   A 0.01克/升  562   40.12   B 0.01   431   30.83   C 0.01   389   27.84   D 0.25   295   21.15   E 0.10   162   11.66   F 0.05   1208.67   G 0.10634.58   H 0.10261.99   I 0.43241.710   J 0.10171.211  無(wú) ----14  1* 2分鐘時(shí)測(cè)定A．聚(乙烯芐基三丁基鏻氯化物)-共-聚-(乙烯芐基三辛基鏻氯化物)(三丁基∶三辛基基團(tuán)的比率為3∶1)B．聚乙烯芐基芐基二甲基銨氯化物C．聚(乙烯芐基三丁基鏻氯化物)-共-聚-(乙烯芐基三辛基鏻氯化物)-共-聚(乙烯-芐基熒光素)(75∶25∶1)D．聚(乙烯芐基三丁基鏻氯化物)E．1-三辛基鏻甲基-4-三丁基鏻-甲苯二氯化物F．TweenTM20，聚氧乙烯(20)脫水山梨醇單月桂酸酯G．1-三辛基鏻甲基-4-三丁基銨-甲苯，混和溴氯化物H．SDS，十二烷基硫酸鈉I．CTAB，十六烷基三甲基溴化銨J．二氯化1-三辛基銨甲基-4-三丁基銨甲苯由于在使用4-11項(xiàng)的增強(qiáng)因子后，光強(qiáng)度連續(xù)增長(zhǎng)超過(guò)一小時(shí)，所以4-11項(xiàng)的S/B值并不代表所得的最大增強(qiáng)效應(yīng)。實(shí)施例22．增強(qiáng)因子A的濃度對(duì)光強(qiáng)度以及磷酸9,10-二氫化吖啶酯的動(dòng)力學(xué)的影響。進(jìn)行濃度依賴性研究是為了測(cè)定在9,10-二氫化吖啶和AP的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中產(chǎn)生最高的信號(hào)/背景(S/B)水平的增強(qiáng)因子A的量。制備含有0.88mM的Mg2+和0.5,0.25,0.1,0.05或0.025毫克/毫升增強(qiáng)因子A的1的0.1M tris緩沖溶液(pH8.5)。取等份試液(100μl)在25℃平衡，并和8×10-16摩爾的AP反應(yīng)。列于表4的S/B值顯示了用0.005-0.01g/L增強(qiáng)因子時(shí)，產(chǎn)生了最大光增強(qiáng)效應(yīng)。
            
表4項(xiàng)目   濃度S/B2分鐘S/B10分鐘1 0.0025g/L  431  2622 0.005  714  5003 0.010  660  5624 0.025  399  3605 0.050  247  2406 0.10   212  1637 0.5040   84實(shí)施例23．用磷酸9,10-二氫化吖啶酯1檢測(cè)堿性磷酸酶的線性和靈敏性。使用本發(fā)明的含有磷酸9,10-二氫化吖啶酯1的試劑組合物測(cè)定對(duì)AP檢測(cè)的靈敏度和線性。在一塊96孔的白色微孔板的每3孔中，加入含有8×10-15摩爾到8×10-20摩爾范圍的酶的10微升的AP稀釋液。每孔加入100微升的含有0.3mM的溶于0.1M tris緩沖液(pH8.5)的磷酸9,10-二氫吖啶酯1的溶液，0.88mM的MgCl2,0.01毫克/毫升增強(qiáng)因子A和1％甲醇的檢測(cè)試劑。2.5分鐘后，測(cè)定光強(qiáng)度。圖4顯示了堿性磷酸酶的線性檢測(cè)。術(shù)語(yǔ)S-B是指有AP存在時(shí)，以相對(duì)光單位(RLU)表示的化學(xué)發(fā)光信號(hào)(s)減去沒(méi)有AP存在時(shí)的本底化學(xué)發(fā)光信號(hào)(B)。在這些情況下，測(cè)定的理論檢測(cè)限(本底標(biāo)準(zhǔn)差的兩倍)是1.2×10-19摩爾。十分鐘后，光強(qiáng)度檢測(cè)可得到類似結(jié)果。實(shí)施例24．通過(guò)pH改變的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)AP。另一個(gè)可供選擇的通過(guò)AP和1的反應(yīng)檢測(cè)光發(fā)射的方法是，先在無(wú)增強(qiáng)因子存在的第一pH的條件下培育含1的試劑組合物和AP，然后再通過(guò)加入含有增強(qiáng)因子的強(qiáng)堿溶液，迅速升高pH導(dǎo)致光發(fā)射的突然發(fā)生。設(shè)計(jì)一套可檢測(cè)＜10-18的AP的實(shí)驗(yàn)條件。
            
含有溶于0.1M tris緩沖液(pH 9)的0.33mM磷酸9,10-二氫化吖啶酯1,0.88mM的MgCl2的試劑組合物(100μl)，和10微升AP(8×10-15-8×10-20mol)或10微升水(作為空白試劑)，在黑色微孔板中室溫反應(yīng)4分鐘。加入含有溶于1N NaOH的0.5毫克/毫升增強(qiáng)因子A的溶液(100μl)，并光強(qiáng)度10秒鐘內(nèi)積分。如圖5所示，光強(qiáng)度在8×10-15到8×10-19摩爾AP的范圍內(nèi)是AP量的線性函數(shù)。實(shí)施例25．酸性磷酸酶的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)及酒石酸抑制作用。用于化學(xué)發(fā)光檢測(cè)酸性磷酸酶(AcP)的試劑組合物包括0.1M tris緩沖液(pH7),0.33mM磷酸9,10-二氫化吖啶酯1(從0.033M的甲醇溶液中1∶100稀釋而來(lái))以及0.01-0.1％增強(qiáng)因子A。在置于Turner TD-20e發(fā)光計(jì)的試管中，100微升的該組合物和AcP(Sigma AcP LIN-TROL，重組到2.0毫升，83U/L)，在室溫中反應(yīng)，產(chǎn)生出幾乎立即達(dá)到最大光強(qiáng)度并幾乎連續(xù)保持幾分鐘的化學(xué)發(fā)光。加入0.1％的胎牛血清白蛋白到該檢測(cè)試劑中能顯著地延長(zhǎng)光發(fā)射的時(shí)間。
            
加入5微升的0.04M的酒石酸的檸檬酸鹽緩沖液(0.09M,pH4.8)中，引起光發(fā)射的徹底消失。這是由于酒石酸(一種前列腺酸性磷酸酶的特異抑制劑)對(duì)酶的抑制作用。由于加入10微升的檸檬酸鹽緩沖液只引起光強(qiáng)度降低25％，所以該發(fā)射的驟滅并不是因?yàn)閜H的降低。實(shí)施例26．通過(guò)pH改變的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)AcP。
            
一種可供選擇的通過(guò)AcP和1反應(yīng)檢測(cè)光發(fā)射的方法是，先在第一pH的條件下培育含1和增強(qiáng)因子的試劑組合物和AcP，然后通過(guò)加入強(qiáng)堿溶液而迅速升高pH引起光的突然發(fā)射。含有溶于0.1M tris緩沖液(pH 7.0)的0.33mM的磷酸9,10-二氫化吖啶酯1,0.1％BSA和0.01％增強(qiáng)因子A的試劑組合物(100μl)和3微升AcP(Sigma AcP LIN-TROL，重組到2.0毫升，83U/L)在一試管中室溫反應(yīng)8分鐘。加入1N NaOH(50μl)溶液并在4分鐘積分光強(qiáng)度。光強(qiáng)度是空白試劑的3倍。實(shí)施例27．使用PVDF膜的Western Blot檢測(cè)。
            
本發(fā)明的組合物在Western blot中是通過(guò)AP標(biāo)記的抗體(反應(yīng))，而用于檢測(cè)和定量聚偏氟乙烯(PVDF)上的蛋白質(zhì)，人鐵轉(zhuǎn)移蛋白。將分別含有5000,1000,180,30和5pg的蛋白質(zhì)的鐵轉(zhuǎn)移蛋白稀釋液電泳，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(Millipore,Beford,MA)。該鐵轉(zhuǎn)移蛋白帶分別先后用羊抗人鐵轉(zhuǎn)移蛋白和兔抗羊AP聯(lián)接物封閉和反應(yīng)。將該膜簡(jiǎn)短地浸于含有0.2M的221緩沖液(pH9.6),0.88mM的MgCl2,0.66mM的磷酸9,10-二氫化吖啶酯1和0.1到1毫克/毫升的增強(qiáng)因子A的試劑中。將該膜置于透明塑料紙間并暴露于X-射線膠片。圖6顯示了使用含有0.1毫升/毫升的增強(qiáng)因子的試劑組合物浸泡15分鐘后再暴露于X-射線膠片一分鐘的人鐵轉(zhuǎn)移蛋白的檢測(cè)。使用這些帶有不同量的增強(qiáng)因子的組合物產(chǎn)生的光導(dǎo)致了能在至少2周的時(shí)間內(nèi)成像的強(qiáng)烈的光發(fā)射。
            
令人驚奇地發(fā)現(xiàn)含有0.5毫克/毫升的增強(qiáng)因子A的組合物產(chǎn)生出在相對(duì)帶強(qiáng)度上連續(xù)四天幾乎沒(méi)有強(qiáng)度變化的光發(fā)射。在PVDF膜產(chǎn)生的光發(fā)射能維持在有用的水平上很長(zhǎng)的超過(guò)一個(gè)月的時(shí)間。5pg帶在5周后只暴光20分鐘還可以成像。這個(gè)維持在有用水平上的發(fā)射時(shí)間是沒(méi)有先例的。實(shí)施例28．使用硝酸纖維膜的Wlestern Blot。
            
按照實(shí)施例27的步驟的Western blot檢測(cè)還可以使用硝酸纖維素膜作為固相支持物而完成。使用5000-30pg的鐵轉(zhuǎn)移蛋白的標(biāo)準(zhǔn)品。可以檢測(cè)全部水平的蛋白質(zhì)的檢測(cè)試劑包括0.2M的22緩沖液(pH9.6),0.88mM的MgCl2,0.33mM的磷酸9,10-二氫化吖啶酯和0.5毫克/毫升的增強(qiáng)因子A。該檢測(cè)可以在幾小時(shí)內(nèi)完成。實(shí)施例29．用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)的Southern Blot分析。
            
下面的實(shí)施例闡明了使用本發(fā)明的組合物通過(guò)Southern blotting技術(shù)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)硝酸纖維素膜上的DNA。
            
抗生物蛋白-AP聯(lián)接物是來(lái)自Cappel的產(chǎn)品(Durham,NC)。胎牛血清白蛋白(熱激)購(gòu)自Sigma化學(xué)公司(St.Louis,MO)。人基因組DNA和人鐵轉(zhuǎn)移蛋白受體cDNA購(gòu)自Clontech(Palo Alto,CA)。生物素化的λDNA/HindⅢ片段，生物素-7-dATP和缺口平移試劑盒(Nick Translation kit)來(lái)自LifeTeehnologies，限制性核酸內(nèi)切酶HindⅢ來(lái)自于Boehringer-Mannheim(Indianapolis,IN)，而硝酸纖維素膜來(lái)自Schleicher&Schuell公司(Keene,NH)。X-射線膠片是來(lái)自Kodak(Rochester,NY)的X-OMAT AR。
            
用HindⅢ徹底剪切人基因組DNA(19.5μg)并分成13微克和6.5微克部分。限制的DNA通過(guò)苯酚/氯仿萃取及乙醇沉淀而純化。該純化的DNA在0.75％的瓊脂糖凝膠上用40毫摩爾/升的Tris-乙酸鹽，2毫摩爾/升的EDTA(pH8.0)作為洗脫緩沖液電泳分離。電泳后，用水漂洗該凝膠，在0.25M的HCl中平衡12分鐘，再用水漂洗，在0.5MNaOH,1.5M的NaCl中培育15分鐘，再換成新鮮的相同溶液培育30分鐘，用水漂洗，再在1Mtris,1.5MNaOH的溶液中培育，換液三次，每次15分鐘。
            
將該硝酸纖維素膜先后浸于水中兩分鐘，10X SSC中30分鐘。DNA通過(guò)毛細(xì)管吸附作用在10X SSC中過(guò)夜轉(zhuǎn)移到膜上。將該膜在輕輕振蕩的條件下用10X SSC室溫洗滌十分鐘并在Whatman 3MM吸滲(blotting)紙上空氣干燥30分鐘并于80℃真空烘2小時(shí)。
            
將該膜浸于6X SSPE(20X SSPE是3M NaCl,0.2M NaH2PO4,20MEDTA,pH7.4)，隨后用預(yù)雜交液(6X SSPE，新鮮去離子的50％甲酰胺，過(guò)濾的5×Denhardt＇s液(50X是1％Ficoll 400,1％PVP,1％BSA(熱激的初始組分))，過(guò)濾的1％SDS和200μg/毫升切變鯡魚(yú)精子DNA)在42℃預(yù)雜交。按照使用說(shuō)明書(shū)的方法，通過(guò)缺口平移技術(shù)用生物素-7-dATP標(biāo)記該雜交探針即人鐵轉(zhuǎn)移蛋白受體cDNA?；蚪MDNA和300μg/毫升變性的生物素化探針在6X SSPE,45％甲酰胺，過(guò)濾的5X Denharts,1％SDS,200μg/毫升鯡魚(yú)精子DNA中42℃雜交過(guò)夜。該生物素化探針是通過(guò)煮沸4分鐘再在0℃冷卻10分鐘而變性。將該膜在25℃的0.5X SSC,0.4％SDS中洗滌兩次，每次5分鐘，在55℃的0.5X SSC,0.4％SDS中洗滌三次，每次10分鐘，在25℃的2X SSC中洗滌一次，5分鐘，在TBS(50mM Tris-HCl,pH7.4,0.15M NaCl)中洗滌兩次，每次3分鐘。洗滌后，將該膜在過(guò)濾的3％BSA,100mM Tris-HCl,pH7.4,0.15M NaCl中63℃封閉一小時(shí)并在T-TBS(0.05％Tween 20的TBS溶液)中洗滌一分鐘。
            
將該封閉的膜和1∶2000稀釋的抗生物素蛋白-AP的T-TBS溶液共同培育12分鐘，隨后換成新鮮的T-TBS四次，分別培育5,10,15,20分鐘，最后再用TBS洗滌5分鐘。傾去過(guò)量的緩沖液并將核酸斑點(diǎn)(blots)浸入如實(shí)施例27所述的檢測(cè)試劑中3分鐘。傾去過(guò)量的試劑，將雜交斑點(diǎn)置于透明紙間并暴露于X-射線膠片。
            
通過(guò)將膜浸入檢測(cè)試劑并暴露于X-射線膠片不同長(zhǎng)短的時(shí)間可檢測(cè)10.5和5.2kbp的單拷貝基因。用本發(fā)明的試劑培育12分鐘后，暴露于膠片分鐘即可在兩側(cè)見(jiàn)到對(duì)應(yīng)于該單拷貝基因的帶。稍短一些的培育時(shí)間也能產(chǎn)生出色的影像。在一天中，很容易進(jìn)行多重暴光。實(shí)施例30．光澤精對(duì)化學(xué)發(fā)光曲線的影響。
            
圖7的曲線顯示了通過(guò)將光澤精加入到磷酸9,10-二氫化吖啶酯5和AP的反應(yīng)中獲得了較高的光強(qiáng)度。含有0.8mM的MgCl2的100微升的5(0.66mM)的0.1M tris緩沖溶液(pH8.8)和8×10-16摩爾AP在25℃的反應(yīng)在有或無(wú)6.4μM光澤精的條件下分別進(jìn)行。圖7表明加入光澤精到該溶液中可以產(chǎn)生出較高的光強(qiáng)度。實(shí)施例31．用化合物5化學(xué)發(fā)光檢測(cè)堿性磷酸酶。一種用于化學(xué)發(fā)光檢測(cè)堿性磷酸酶的高效試劑組合物包括0.1M tris緩沖液，pH8.8,6.4μM光澤精，0.66mM化合物5,1毫克/毫升SDS,0.01毫克/毫升Na2SO3,0.033％(w/v)TWEEN 20和0.88mM的MgCl2。100微升的該組合物和8×10-16摩爾的AP在25℃反應(yīng)，產(chǎn)生出在2分鐘內(nèi)達(dá)到最大強(qiáng)度的化學(xué)發(fā)光。圖8顯示了含有5和陽(yáng)離子型聚合表面活性劑增強(qiáng)因子，聚(乙烯芐基三丁基鏻氯化物)-共-聚-(乙烯芐基三辛基鏻氯化物)(三丁基∶三辛基基團(tuán)的比率約3∶1)，的試劑組合物在37℃激發(fā)的光強(qiáng)度對(duì)比曲線。以前只是發(fā)現(xiàn)，含有后者的聚合表面活性劑的組合物所產(chǎn)生的是在無(wú)CAC存在時(shí)的最高水平的化學(xué)發(fā)光。實(shí)施例32．檢測(cè)堿性磷酸酶的線性和靈敏度。
            
AP的檢測(cè)靈敏度和線性是通過(guò)使用含有化合物5和光澤精(試劑A)的試劑組合物并將所得的結(jié)果和使用含有化合物5及0.25TB/TO(試劑B)的試劑組合物的比較而測(cè)定的。該試劑具有如下組成試劑A 試劑B化合物5,0.66mM化合物5,0.66mM0.1M tris緩沖液，pH8.80.2M 221緩沖液，pH9.60.01或0.88mM MgCl20.88mM MgCl2光澤精，6.4μM0.25TB/TO,0.5毫克/毫升SDS,1毫克/毫升Na2SO3,0.01毫克/毫升TWEEN 20,0.033％(W/V)在96孔白色微孔板的每3孔中，將10微升的分別含有8×10-13摩爾到8×10-22摩爾酶的AP稀釋液加入到每份100微升的檢測(cè)試A或B中。2.5分鐘后，測(cè)定光強(qiáng)度。圖9顯示了堿性磷酸酶的線性檢測(cè)。試劑A的理論檢測(cè)限(本底標(biāo)準(zhǔn)差的兩倍)測(cè)定為3.5×10-21摩爾，試劑B的為1.2×10-19摩爾。實(shí)施例33．用化合物1-13進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。
            
按照實(shí)施例30的方法，分別含有0.66mM化合物1-13的且?guī)в?及6.4μM光澤精的組合物，和8×10-16摩爾的AP在25℃反應(yīng)。它們的每個(gè)反應(yīng)都顯著地證明，加入光澤精到該反應(yīng)液中時(shí)，可以產(chǎn)生出更為強(qiáng)烈的化學(xué)發(fā)光。實(shí)施例34．用化合物7-12檢測(cè)AP的靈敏度和線性。
            
除了以分別為0.66mM的化合物7-12代替化合物5外，按照實(shí)施例32的方法，根據(jù)試劑A的組成制備試劑。將10微升的含有8×10-16摩爾到8×10-22摩爾酶的AP稀釋液或10微升的作為空白試劑的水加入到每份100微升的這些試劑中。在每個(gè)反應(yīng)中，含有8×10-21摩爾的酶的反應(yīng)液在約兩分鐘內(nèi)產(chǎn)生出比空白值更高的峰信號(hào)。圖10、11和18分別描述了化合物7,8和12的結(jié)果。實(shí)施例35．化合物7化學(xué)發(fā)光的時(shí)間曲線。
            
下列試驗(yàn)證明了含有化合物7的試劑組合物所發(fā)射化學(xué)發(fā)光的快速產(chǎn)生。每份100微升的由0.1M tris緩沖液，pH8.8,6.4μM光澤精，0.66mM磷酸9,10-二氫化吖啶酯7,1毫克/毫升十二烷基硫酸鈉，0.01毫克/毫升Na2SO3,0.033％(w/v)TWEEN 20和0.88mM的MgCl2所組成的試劑，和8×10-16摩爾AP在室溫中反應(yīng)。如圖12所示，該化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度在5秒內(nèi)達(dá)到穩(wěn)定的平臺(tái)期。實(shí)施例36．用各種CACs增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。
            
制備含有21mM的CACl-11的DMSO溶液的試驗(yàn)液。將它們按1∶1000稀釋到含有0.88mM的MgCl2的磷酸9,10-二氫化吖啶酯5的0.1M tris緩沖液溶液(pH8.8)中。在一白色微孔板中，一式三份每份100微升，所制備的試劑組合物和4×10-16摩爾的AP在室溫反應(yīng)。表5顯示了每個(gè)CAC在36分鐘測(cè)定的平臺(tái)強(qiáng)度(S)效應(yīng)以及信號(hào)/背景(S/B)。每個(gè)CAC都產(chǎn)生出比沒(méi)有CAC的對(duì)照組更高的峰信號(hào)S和S/B。
            
表5CAC36分鐘時(shí)的S12602245.33596344645534.7672.3761.6819.19 7811021.111 9.3無(wú) 2.81光澤精2堿性紅293堿性藍(lán)664堿性藍(lán)415碘化3,3′-二乙基-9-甲基硫代二羰花青6碘化3,3′-二乙基-9-甲基硫代羰花青7碘化3,3′-二乙基硒代羰花青8碘化3,3′-二乙基硫代花青9IR-104010碘化5-[3-乙氧基-4-(3-乙基-5-甲基-2(3H)-苯并噻唑-亞基)-2-亞丁烯基]-3-乙基-2-[(3-乙基-4,5-二苯基-2(3H)-亞噻唑基)甲基-4,5-二氫-4-氧代噻唑11IR-786高氯酸鹽實(shí)施例37．CAC濃度對(duì)5和AP化學(xué)發(fā)光影響反應(yīng)的影響。
            
用本發(fā)明的組合物化學(xué)發(fā)光檢測(cè)AP可在CAC的寬濃度范圍內(nèi)進(jìn)行。通過(guò)10倍的系列稀釋貯備光澤精溶液，制備帶有從6.4mM到6.4nM的不同濃度光澤精的，且含有0.66mM化合物5的0.1M tris緩沖液(pH8.8)溶液，0.88mM的MgCl2的組合物。對(duì)照組不含光澤精。在室溫中培育3.5分鐘后，含有6.4mM到6.4nM的光澤精的試驗(yàn)液(100μl，一式五份)和4×10-16摩爾的AP反應(yīng)，產(chǎn)生出高于對(duì)照組的信號(hào)(S)。實(shí)施例38．陰離子型表面活性劑的濃度對(duì)5和AP的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的影響。
            
使用本發(fā)明的組合物化學(xué)發(fā)光檢測(cè)AP可在陰離子型表面活性劑SDS的寬濃度范圍內(nèi)進(jìn)行。制備帶有從10毫克/毫升到10μg/毫升的不同濃度SDS的且含有0.66mM化合物的5和0.88mM的MgCl2的0.1M tris緩沖液溶液的組合物。對(duì)照組則不含SDS。試驗(yàn)液(100μl，一式五份)和4×10-16摩爾的AP在室溫中反應(yīng)，比對(duì)照組更快地產(chǎn)生峰信號(hào)。實(shí)施例39．非離子型表面活性劑對(duì)5和AP的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的影響。
            
使用本發(fā)明的組合物化學(xué)發(fā)光檢測(cè)AP可在非離子型表面活性劑TWEEN 20的寬濃度范圍內(nèi)進(jìn)行。除了帶有21μM的光澤精和從1.0％到0.001％的不同濃度的非離子型表面活性劑而沒(méi)有Na2SO3外，按照實(shí)施例32中的試劑A制備組合物。對(duì)照組不含非離子型表面活性劑。試驗(yàn)液(100μl，一式5份)和對(duì)照組在室溫和4×10-16摩爾的AP反應(yīng)。每個(gè)試驗(yàn)液都能有效地延長(zhǎng)等于或接近于最大強(qiáng)度的化學(xué)發(fā)光的時(shí)間。實(shí)施例40．Na2SO3的濃度對(duì)5和AP的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的影響。
            
使用本發(fā)明的組合物化學(xué)發(fā)光檢測(cè)AP可在寬的Na2SO3濃度范圍內(nèi)進(jìn)行。除了帶有從1.0毫克/毫升到1.0μg/毫升的不同濃度的Na2SO3外，按照實(shí)施例32中的試劑A制備組合物。對(duì)照組則不含Na2SO3。每個(gè)試驗(yàn)液(100μl，一式五份)在無(wú)AP時(shí)產(chǎn)生出比對(duì)照組更低的背景信號(hào)(B)，而在和4×10-16摩爾AP在室溫培育反應(yīng)3.5分鐘后則產(chǎn)生出更高的信號(hào)(S)。在該實(shí)驗(yàn)中，最強(qiáng)信號(hào)是使用1.0μg/毫升的濃度獲得的，最大S/B則是使用1.0毫克/毫升的濃度獲得的。實(shí)施例41．Western Blot檢測(cè)。
            
本發(fā)明的組合物在Western Blot中用標(biāo)記的抗體檢測(cè)和定量聚偏氟乙烯(PVDF)膜上的蛋白質(zhì)，人鐵轉(zhuǎn)移蛋白。將分別含有5000,1000,180,30和5pg蛋白質(zhì)的鐵轉(zhuǎn)移蛋白稀釋電泳并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(Millipore,Bedford,MA)。該鐵轉(zhuǎn)移蛋白帶分別先后用羊抗人鐵轉(zhuǎn)移蛋白和兔抗羊AP聯(lián)接物封閉和反應(yīng)。將該膜簡(jiǎn)短地浸于含有0.1M tris緩沖液(pH8.8),0.88mM的MgCl2,0.66mM化合物5和64μM光澤精的試劑中。再將該膜置于透明的塑料紙間并暴露于X-射線膠片。十分鐘后，用2.5分鐘的曝光時(shí)間檢測(cè)人鐵轉(zhuǎn)移蛋白帶。用該組合物產(chǎn)生的光導(dǎo)致了可在幾小時(shí)內(nèi)成像的強(qiáng)烈的光發(fā)射。
            
用硝酸纖維素吸滲(blotting)膜代替PVDF膜也可獲得類似的結(jié)果。實(shí)施例42．Sonthern Blot檢測(cè)。
            
下面的實(shí)施例闡明了一個(gè)本發(fā)明的試劑在Southern blot檢測(cè)中應(yīng)用的典型的范例。
            
抗生物蛋白-AP聯(lián)接物是來(lái)自CappelProducts(Durham,NC)。胎牛血清白蛋白(熱激)購(gòu)自Sigma化學(xué)公司(St.Louis,MO)。鼠基因組DNA購(gòu)自Clontech(Palo Alto,CA)。生物素化的λDNA/HindⅢ片段，生物素-7-dATP和缺口平移試劑盒購(gòu)自Life Technologies，限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ購(gòu)自Boehringer-Mannheim(Indianapolis,IN)，而尼龍膜購(gòu)自Micron Separation公司(Westborough,MA)。X-射線膠片是購(gòu)自Kodak(Rochester,NY)的X-OMAT AR。
            
周EcoRⅠ徹底地剪切鼠基因組DNA(30μg)。通過(guò)苯酚/氯仿萃取以及乙醇沉淀純化二和四微克部分。該純化的DNA用40mM Tris-乙酸鹽，2mMEDTA(pH8.0)作為洗脫緩沖液，在0.75％的瓊脂糖凝膠上電泳分離。電泳后，用水漂洗凝膠，在0.25M HCl中平衡12分鐘，再用水漂洗，在0.5mM NaOH,1.5M NaCl中培育15分鐘，然后換成新鮮的相同溶液培育30分鐘，用水漂洗，再在1M tris,1.5M NaCl(pH7.5)中培育，換液三次，每次15分鐘。
            
將該尼龍膜先后浸于水中兩分鐘，10X SSC中30分鐘。DNA在10XSSC中通過(guò)毛細(xì)管吸滲作用而過(guò)夜轉(zhuǎn)移到膜上。將該膜在輕輕振蕩的條件下用10X SSC室溫洗滌十分鐘并在Whatman 3MM吸滲(blotting)紙上空氣干燥30分鐘并于80℃真空烘2小時(shí)。
            
將該膜浸于6X SSPE(20X SSPE是3M NaCl,0.2M NaH2PO4,20mMEDTA,pH7.4)，隨后用預(yù)雜交液(6X SSPE，新鮮去離子的50％甲酰胺，過(guò)濾的5X Denhardt′s液(50X是1％Ficoll 400,1％PVP,1％BSA(熱激的初始組分))，過(guò)濾的1％SDS和200μg/毫升切變鯡魚(yú)精子DNA)在42℃預(yù)雜交。按照使用說(shuō)明書(shū)的方法通過(guò)缺口平移技術(shù)用生物素-7-dATP標(biāo)記該雜交探針，即v-mos DNA癌基因探針(Pan Vera公司，Madison,WI)?；蚪MDNA和500ng變性的生物素化探針在6X SSPE,45％甲酰胺，過(guò)濾5XDenhart′s,1％SDS,200μg/毫升鯡魚(yú)精子DNA中于42℃雜交過(guò)夜。該生物素化探針是通過(guò)煮沸4分鐘再在0℃冷卻十分鐘而變性。將該膜在25℃的0.5X SSC,0.4％SDS中洗滌15和35分鐘，在55℃的0.5X SSC,0.4％SDS中洗滌三次，每次十分鐘，在25℃的2X SSC中洗滌一次，5分鐘，在TBS(50mM Tris-HCl,pH7.4,0.15M NaCl)中洗滌兩次，每次3分鐘。然后，該膜在過(guò)濾的3％BSA,100mM Tris-HCl,pH7.4,0.15MNaCl中65℃封閉一小時(shí)并在T-TBS(0.05％Tween20的TBS溶液)中洗滌一分鐘。
            
將該封閉膜的和1∶2000稀釋的抗生物素蛋白-AP的T-TBS溶液共同培育12分鐘，隨后換成新鮮的T-TBS四次并分別培育5,10,15,20分鐘，最后再用TBS洗滌5分鐘。傾去過(guò)量的緩沖液并將核酸雜交斑浸入如實(shí)施例41所述的檢測(cè)試劑中4分鐘。傾去過(guò)量的試劑并將雜交斑點(diǎn)置于透明的紙間并暴露于X-射線膠片。
            
通過(guò)將膜浸入檢測(cè)試劑并以不同的時(shí)間暴露于X-射線膠片可檢測(cè)14.5kbp的單拷貝基因。培育9分鐘后，暴露于膠片5分鐘即可在兩側(cè)見(jiàn)到對(duì)應(yīng)于該單拷貝基因的帶。使用較長(zhǎng)的曝光時(shí)間可在一天內(nèi)進(jìn)行多重曝光。實(shí)施例43．hCG的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。
            
通過(guò)化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)hcG的方法是在IMMULITE自動(dòng)分析儀上，使用Diagnostic Product公司(Los Angeles,CA)供應(yīng)的IMMULITE試劑盒，按照廠商提供的方案而進(jìn)行的。實(shí)施例32的試劑A可以取代試劑盒中供應(yīng)的檢測(cè)試劑。調(diào)整軟件后可以允許底物培育較短的時(shí)間。除了空白組讀數(shù)是樣品稀釋液的5次試驗(yàn)的平均值外，其它全部數(shù)據(jù)值都是三次重復(fù)試驗(yàn)的平均值。通過(guò)特殊的校準(zhǔn)器用試驗(yàn)盒供應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液系列稀釋而制備被分析物。在底物加入1.5分鐘后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。
            
對(duì)加樣裝置的小改進(jìn)可以使管道系統(tǒng)中該化學(xué)發(fā)光試劑的死體積達(dá)到最小。該底物加熱器是可拆的，外尺寸為18″×1/16″的，帶有翻口末端且包裹于黑色絕緣膠布中的透明的聚四氟乙烯管道系統(tǒng)直接連接底物泵和半透明的底物分散噴頭。一個(gè)近似長(zhǎng)度的同樣的聚四氟乙烯管道系統(tǒng)連接于底物泵的入口。此輸入的管道系統(tǒng)置于含有底物的瓶中。無(wú)需預(yù)熱或使底物恒溫。即使在沒(méi)有外部的底物恒溫裝置的情況下，用密封的CV′S也顯示了溫度的不敏感性。
            
在快速讀數(shù)的發(fā)光計(jì)上的獨(dú)立試驗(yàn)證明，該底物的讀數(shù)可在少到10秒的培育時(shí)間的條件下進(jìn)行而沒(méi)有靈敏度或精確度上的損失。圖13所示的檢測(cè)結(jié)果和表6證明了本發(fā)明的組合物在三明治(夾心)型免疫檢測(cè)中的應(yīng)用。
            
表6IMMULITE hCG檢測(cè)的表列數(shù)據(jù)mIU/mL hCG  強(qiáng)度(脈沖/秒) ％CV667547332040  3.8300029174720  1.2100011031867  1.5300 2906560  2.5100  977760  2.630  288883  0.710  133573  6.33   71507  5.91   54738  7.4空白   47634  9.0實(shí)施例44．TSH的快速化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)。
            
通過(guò)化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)TSH的方法是，在IMMULITE自動(dòng)分析儀上，使用Diagnostic Products公司的IMMULITE RTH快速檢測(cè)TSH試劑盒，按照廠商的方案并稍作如實(shí)施例43中所述的改進(jìn)進(jìn)行的。實(shí)施例32中的試劑A可取代該試劑盒中提供的檢測(cè)試劑。
            
該試劑的背景可通過(guò)從第三代TSH檢測(cè)Wedge中除去抗體聯(lián)接物，小心洗滌該Wedge并用1型水(Type 1 water)代替其內(nèi)容物而檢測(cè)。觀察到的底物背景約為每秒5000個(gè)計(jì)數(shù)。這表明非特異性結(jié)合背景是該試劑背景的的幾倍。因此，Wedge中的生物化學(xué)重新優(yōu)化可能明顯增加幾個(gè)檢測(cè)的靈敏度和/或允許該生化培育時(shí)間的降低。該化學(xué)發(fā)光檢測(cè)是在加入底物后1.5分鐘進(jìn)行的。
            
表7IMMULITERTH快速TSH檢測(cè)數(shù)據(jù)uIU/mL TSH   強(qiáng)度(脈沖/秒) ％CV75   17370000   0.9102263413   5.31 202120   2.60.3  72357   2.60.1  36887   1.50.03  25607   2.60.01  22647   5.0空白  20810   2.0圖14所示的檢測(cè)結(jié)果以及表7證明了本發(fā)明的組合物在所提供的快速檢測(cè)中的實(shí)用性。實(shí)施例45．TSH的化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)。
            
通過(guò)化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)TSH的方法是在IMMULITE自動(dòng)分析儀上，使用Diagnostic Products公司的IMMULITE TSH第三代TSH檢測(cè)試劑盒，按照廠商提供的方案并稍作如實(shí)施例43中所述的改進(jìn)而進(jìn)行的。實(shí)施例32中的試劑A可以取代該試劑盒中的檢測(cè)試劑。該化學(xué)發(fā)光檢測(cè)是在加入底物后1.5分鐘時(shí)進(jìn)行的。
            
表8IMMULITE第三代TSH檢測(cè)數(shù)據(jù)uIU/mL TSH 強(qiáng)度(脈沖/秒) ％CV75 25249293   1.610  4265600   1.51   415363   0.30.3   122580   4.30.154070   0.30.0323810   3.70.0117240   0.40.00313900   1.7空白12996   4.4圖15所示的檢測(cè)結(jié)果和表8證明了本發(fā)明的組合物在提供高靈敏度檢測(cè)中的實(shí)用性。實(shí)施例46．雌二醇的化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)。
            
通過(guò)化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)雌二醇的方法是在IMMULITE自動(dòng)分析儀上，使用Diagnostic Products公司供應(yīng)的試劑盒，按照廠商提供的方案稍作如實(shí)施例43所述的改進(jìn)而進(jìn)行的。實(shí)施例32的試劑A可以取代試劑盒中提供的檢測(cè)試劑。該化學(xué)發(fā)光檢測(cè)在加入底物后1.5分鐘進(jìn)行。
            
表9IMMULITEE2雌二醇檢測(cè)數(shù)據(jù)pq/mL  雌二醇強(qiáng)度(脈沖/秒)％CV2000 500300 4.11000 783877 3.33002521788 2.71005398650 2.9308808133 1.810   10036147 2.1空白   10536776 3.9圖16所示的檢測(cè)結(jié)果和表9證明了本組合物在競(jìng)爭(zhēng)型免疫檢測(cè)中的實(shí)用性。實(shí)施例47．化學(xué)發(fā)光檢測(cè)酸性磷酸酶(AcP)。
            
實(shí)施例32中的試劑A可用于檢測(cè)酸性磷酸酶的實(shí)驗(yàn)中。在置于TurnerTD-20e發(fā)光計(jì)的試管中，100微升的該組合物和AcP(Sigma AcP LIN-TROL，重組到2.0毫升，83μ/L)在室溫反應(yīng)產(chǎn)生在2-5秒內(nèi)達(dá)到最大強(qiáng)度并在10-15秒內(nèi)衰變至零的化學(xué)發(fā)光。
            
利用本檢測(cè)試劑還可在有堿性磷酸酶存在時(shí)檢測(cè)酸性磷酸酶。由于AcP誘發(fā)的化學(xué)發(fā)光信號(hào)在數(shù)秒內(nèi)幾乎完全衰變，所以在大約15-20秒后測(cè)定的穩(wěn)定光強(qiáng)度可，如圖17所示，區(qū)分出AP的活性。此法可以在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中對(duì)同一個(gè)樣品同時(shí)進(jìn)行AcP和AP的活性定量分析。AcP可在人全血中方便地檢測(cè)。實(shí)施例48．用化合物13檢測(cè)AP的線性和靈敏度。
            
按照實(shí)施例32的方法，制備下列組合成分的試劑。將含有8×10-16到8×10-22摩爾酶的10微升AP稀釋液，或10微升作為空白試劑的水，加入到每份為100微升的該試劑中。在75秒時(shí)檢測(cè)光強(qiáng)度。圖19顯示了該結(jié)果。
            
試劑化合物13,0.33mM0.1M tris緩沖液，pH8.8MgCl2,5μM光澤精，3.2μMSDS,0.5毫克/毫升Na2SO3,5μg/毫升TWEEN 20,0.15毫克/毫升(w/v)實(shí)施例49還合成了下列化合物，并發(fā)現(xiàn)其在和AP反應(yīng)時(shí)也能產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光 其中的V是叔-丁基，CH3,OCH3,F,Cl,Br,I,COCH3,CN和NO2；和下式化合物 其中的U是p-I,p-CH3,m-OCH3,o-Cl,m-Cl,o-Br,m-Br,p-Br和p-NO2以及帶有3,4-二氯-、2,5-二氯-和2,6-二氯苯基的該式化合物。
            
上文的說(shuō)明和實(shí)施例只是解釋而不能認(rèn)為是限制。應(yīng)理解的是，在未脫離本發(fā)明的精神和范圍下，可以進(jìn)行那些沒(méi)有詳細(xì)公開(kāi)的具體化合物和方法的改進(jìn)。本發(fā)明的范圍只通過(guò)附帶的權(quán)利要求而限定。
            
權(quán)利要求
            
1．一種式Ⅸ化合物 式中的Het是至少含有一個(gè)含有至少一個(gè)N或者S原子的五元或者六元環(huán)的雜環(huán)系統(tǒng)，Z選自O(shè)和S原子，R6是允許化學(xué)發(fā)光產(chǎn)生的有機(jī)基團(tuán)而y則是可除去的以便生成磷酸鹽化合物的保護(hù)基。
            
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其選自下式化合物 式中的R1是含有1到50個(gè)選自C,N,O,S,P和鹵素的原子的并選自烷基，取代烷基，芳基，取代芳基和芳烷基的有機(jī)基團(tuán)，每個(gè)R2-R5是含有1-50個(gè)選自C,H,N,O,S,P和鹵素的原子的并允許化學(xué)發(fā)光產(chǎn)生的取代基，而且相鄰的取代基對(duì)可以連接起來(lái)形成至少含有一個(gè)五或者六環(huán)的碳環(huán)或者雜環(huán)系統(tǒng)，R6含有1-50個(gè)選自C,N,O,S,P和鹵素的原子并選自烷基，取代烷基，芳基，取代芳基和芳烷基。
            
3．根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物，其中R1是C1-4烷基和芐基；相鄰的R2-R3和R4-R5形成5或6元碳環(huán)；R6為乙基、取代乙基，苯基、取代苯基、萘基、取代萘基，所述的取代基F、Cl、Br、I、C1-4烷基或烷氧基、COCH3、CN和NO2；Z選自O(shè)和S原子；
            
4．根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中Het是下式的基團(tuán)
            
5．根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其具有通式 式中的每個(gè)R7-R14分別是含有1-50個(gè)選自C,H,N,O,S,P和鹵素的原子的并允許化學(xué)發(fā)光產(chǎn)生的取代基，而Ar是烷基、芳環(huán)基。
            
6．根據(jù)權(quán)利要求5所述的化合物，其中R7～R14可以相同或不同，選自H、鹵素、C1-4烷基或烷氧基；或者R7～R14相鄰的基團(tuán)聯(lián)接5或6元碳環(huán)；Ar為乙基、取代的乙基、苯基、取代的苯基、萘基或取代的萘基，所述的取代基為F、Cl、Br、I、C1-4烷基或烷氧基、COCH3、CN和NO2。
            
7．根據(jù)權(quán)利要求6所述的化合物，其中R1選自C1-4烷基；R7～R14選自H、鹵素或C1-4烷氧基；或者R7～R14相鄰的兩個(gè)基團(tuán)是 Ar為乙基，萘基、苯基或被F、Cl、Br、I、C1-4烷基或烷氧基取代的苯基。
            
8．根據(jù)權(quán)利要求1-7所述的任何一個(gè)化合物，其中的y下列基團(tuán)CH3,CH2CH3,CH2CH2CN,CH2CH2Si(CH3)3，苯基、取代的苯基，或
            
9．一種式Ⅹ化合物 式中的Het是至少含有一個(gè)含有至少一個(gè)N或S原子的五或者六元環(huán)的雜環(huán)系統(tǒng)，Z選自O(shè)和S原子，R6是允許化學(xué)發(fā)光產(chǎn)生的有機(jī)基團(tuán)，而W是選自F,Cl,Br和I的鹵素原子。
            
10．根據(jù)權(quán)利要求9所述的化合物，其選自下式化合物 式中的R1是含有1到50個(gè)選自C,N,O,S,P和鹵素的原子的并選自烷基，取代烷基，芳基，取代芳基和芳烷基的有機(jī)基團(tuán)，每個(gè)R2-R5是含有1-50個(gè)選自C,H,N,O,S,P和鹵素的原子的并允許化學(xué)發(fā)光產(chǎn)生的取代基，而且相鄰的取代基對(duì)可以連接起來(lái)形成至少含有一個(gè)五或者六環(huán)的碳環(huán)或者雜環(huán)系統(tǒng)，R6含有1-50個(gè)選自C,N,O,S,P和鹵素的原子并選自烷基，取代烷基，芳基，取代芳基和芳烷基。
            
11．根據(jù)權(quán)利要求10所述的化合物，其中R1是C1-4烷基和芐基；相鄰的R2-R3和R4-R5形成5或6元碳環(huán)；R6為乙基、取代乙基，苯基、取代苯基、萘基、取代萘基，所述的取代基F、Cl、Br、I、C1-4烷基或烷氧基、COCH3、CN和NO2；Z選自O(shè)和S原子；
            
12．根據(jù)權(quán)利要求9所述的化合物，其中Het是下式的基團(tuán)
            
13．根據(jù)權(quán)利要求10所述的化合物，其具有通式 式中的每個(gè)R7-R14分別是含有1-50個(gè)選自C,H,N,O,S,P和鹵素的原子的并允許化學(xué)發(fā)光產(chǎn)生的取代基，而Ar是烷基、芳環(huán)基。
            
14．根據(jù)權(quán)利要求13所述的化合物，其中R7～R14可以相同或不同，選自H、鹵素、C1-4烷基或烷氧基；或者R7～R14相鄰的基團(tuán)聯(lián)接5或6元碳環(huán)；Ar為乙基、取代的乙基、苯基、取代的苯基、萘基或取代的萘基，所述的取代基為F、Cl、Br、I、C1-4烷基或烷氧基、COCH3、CN和NO2。
            
15．根據(jù)權(quán)利要求14所述的化合物，其中R1選自C1-4烷基；R7～R14選自H、鹵素或C1-4烷氧基；或者R7～R14相鄰的兩個(gè)基團(tuán)是 Ar為乙基，萘基、苯基或被F、Cl、Br、I、C1-4烷基或烷氧基取代的苯基。
            
16．根據(jù)權(quán)利要求9-15所述的任何一個(gè)化合物，其中的W是F,Cl,Br,I，優(yōu)選為Cl原子。
            
全文摘要
            
本發(fā)明提供了能和磷酸酶反應(yīng)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的新的雜環(huán)化合物及其制備工藝和在其中有用的中間體。該化合物包括一個(gè)含有N,O或者S的并帶有一個(gè)外向環(huán)的碳－碳雙鍵的雜環(huán)系統(tǒng)。該雙鍵的遠(yuǎn)側(cè)碳末端被磷酸基和含有一個(gè)O或者S原子的基團(tuán)取代。本發(fā)明還提供了新的組合物,其除了含有該雜環(huán)磷酸酯化合物外,還含有一種陽(yáng)離子芳香族化合物(CAC)。而在該組合物中加入AC可大大地增加化學(xué)發(fā)光的產(chǎn)生并改善檢測(cè)靈敏度。而那些還含有陰離子型表面活性劑和非離子型表面活性劑的組合物則可進(jìn)一步改善檢測(cè)靈敏度。該新的化學(xué)發(fā)光化合物和組合物可應(yīng)用于發(fā)光的方法中,磷酸酶和酶抑制劑的檢測(cè)中以及那些用酶標(biāo)記的特異結(jié)合對(duì)的檢測(cè)中。
            
文檔編號(hào)C07F9/64GK1312252SQ0012833
            
公開(kāi)日2001年9月12日 申請(qǐng)日期2000年11月17日 優(yōu)先權(quán)日1996年1月16日
            
發(fā)明者哈希姆·阿克哈文-塔夫蒂, 扎拉·阿格哈瓦尼, 倫納卡·戴西爾瓦 申請(qǐng)人:魯米根公司
            
                        
            
                        
            
                        
            
                            
                        
            

                        
                            
                    
            
                    
                    


                     
                        
                        
                    

                
            

                
                
            
                    
            
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