專利名稱：白藜蘆醇和白藜蘆醇甙分離方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及白藜蘆醇和白藜蘆醇甙的分離方法及其應用，特別是涉及從中藥虎杖根莖分離白藜蘆醇和白藜蘆醇甙的方法和白藜蘆醇和白藜蘆醇甙作為保健品或食品、飲料、保健添加劑的應用。
早已有人發現，心血管疾病的發生與紅葡萄酒的消費量呈負相關。經研究發現(E.H.Siemann and L.L.CreasyAm.J.Enol.Vitic.4349-50，1992)，紅葡萄酒中對心血管起保護作用的生理活性物質是其中所含的白藜蘆醇(Resveratrol)和白藜蘆醇甙(Polydatin或Piceid)。還有研究發現，這類化合物還具有防止血栓形成、保護肝臟、抗氧化、清除自由基、抗炎癥、抗某些真菌和細菌及抗癌等功效(余傳林等，中藥藥理與臨床，1994，10(2)33；單春文，藥學學報，1988，23(5)394；久保道德等，國外醫學藥學分冊，19823；Meishiang J et al.Science 1997，Vol 275218-220)。但目前獲得白藜蘆醇及其甙主要是化學合成方法，存在著工藝復雜、成本高等問題。
虎杖(Polygonum Caspidatum Sieb et Zace)是我國傳統中草藥，含有較豐富的(含量隨產地不同而異)白藜蘆醇和白藜蘆醇甙。虎杖目前主要用來治療關節痹痛、濕熱黃疸、閉經、咳嗽多痰、水火燙傷、跌撲跌傷、癰腫瘡毒等。虎杖的成份非常復雜，還含有蒽醌類化合物、黃酮類化合物、萘醌、多糖、氨基酸、微量元素、脂肪酸等多種物質。因此，從虎杖中分離并提純白藜蘆醇及白藜蘆醇甙具有較大的難度。從虎杖中提取白藜蘆醇及白藜蘆醇甙僅見于日本專利昭60-9455(1985)，該專利公開的方法提取工藝繁雜，而且使用了危險性較大的乙醚作為溶劑。尤其是，用該專利方法僅能得到含有白藜蘆醇和白藜蘆醇甙混合物的終產物，純度較低。
本發明旨在從虎杖中提取白藜蘆醇及白藜蘆醇甙，提供一種工藝簡便、快速、易操作、純度高、成本低并能大規模生產的分離及提純方法，本發明的另一目的是將白藜蘆醇和白藜蘆醇甙作為藥品、保健品或食品、飲料、保健添加劑的應用。
以下是本發明的具體內容1、提取將干燥虎杖根莖粉碎后，用可與水混溶的有機溶劑提取2次，每次提取溶劑用量為藥粉重量的5倍，合并提取液，減壓蒸餾濃縮至原提取液體積的1/20。所得濃縮物中再加入該濃縮物體積1-2倍的水，用堿性物質調pH至7.5-8.0。再分別用5倍和4倍體積的乙酸乙酯萃取二次，合并兩次萃取液，減壓蒸餾濃縮至萃取液體積的1/15-1/20，最后所得的濃縮物是粗提物，作為進一步純化的原料。
所述與水混溶的有機溶劑系指甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、丙酮以及這些溶劑任意的組合。
2、分離純化用柱層析法和結晶法進行分離及純化，白藜蘆醇及其甙以收集柱層析洗脫液的先后順序不同而分離，先收集的洗脫組分中含有白藜蘆醇，后收集的洗脫組分中含有白藜蘆醇甙。層析柱填充物是硅膠，層析洗脫液為氯仿∶甲醇(乙醇)＝4～8∶1或乙酸乙酯∶乙醇＝90～100∶0～10。
將第一次柱層析中收集到白藜蘆醇甙洗脫組分濃縮后在室溫下靜置，析出結晶，用甲醇—氯仿(1∶8～10)重結晶，可得到純度高達97％以上的結晶。
白藜蘆醇需經二次硅膠柱層析。將第一次柱層析中首先收集到白藜蘆醇洗脫組份濃縮，作為第二次硅膠柱層析的上樣原料進行再次層析，層析洗脫液為三氯甲烷∶乙酸乙酯＝70～100∶20～30，將二次洗脫液濃縮、室溫下靜置，析出白藜蘆醇結晶，用丙酮-氯仿(1∶8～10)重結晶，也得到純度高達97％以上的結晶。
以上各操作中的溶劑、洗脫劑回收容易，并可反復使用，從而降低了成本。
各次重結晶后的母液均可留待與下次虎杖粉提取液合并后，再次分離純化用。
3、制劑將白藜蘆醇甙或白藜蘆醇或兩者混合物與食品或藥品上可接受的輔劑、賦形劑混合后，用適當工藝制成各種劑型，如粉劑、顆粒劑、片劑、膠囊劑、溶液劑、油膏劑、霜劑等，作為藥品、保健品、化妝品等。也可以作為食品添加劑加入食品、飲料、制成各種形式的保健食品、飲料、酒類。
本發明提供的分離純化方法工藝簡便、操作容易、安全，成本低廉，便于大規模生產，所得產物純度高。
以下實施例進一步對本發明進行詳述，使有助于理解本發明內容。實施例11、提取將干燥虎杖根莖粉碎過40目篩后，稱取300g，加入1500ml丙酮，室溫攪拌浸泡24小時，然后進行抽濾，濾渣再用1500ml丙酮按同樣的方法浸泡、提取一次，將兩次濾液合并。經高壓液相色譜定量分析得知上述所得濾液中含白藜蘆醇0.75g，白藜蘆醇甙5.16g。
將上述所得濾液加熱減壓濃縮至180ml，加入300ml蒸餾水，再用2NNaOH調pH至8.0。然后用2.5L、2.0L乙酸乙酯萃取兩次，合并兩次的萃取液，濃縮至200ml。經高壓液相色譜定量分析得知此濾液中含白藜蘆醇0.70g，白藜蘆醇甙4.81g。
2、層析稱取460g柱層析用硅膠(100-200目)，用乙酸乙酯懸浮裝入一根直徑為60mm，長500mm的玻璃層析柱中，用乙酸乙酯平衡柱后，把步驟1中200ml乙酸乙酯提取濃縮液加到此柱上，用乙酸乙酯洗脫，洗脫劑流速為20-25ml/min，至色素剛開始洗出時開始收集洗脫液，每瓶收集300ml，前3瓶含有白藜蘆醇和黃色素。第6瓶開始白藜蘆醇甙被洗出，第16瓶白藜蘆醇甙洗脫幾乎完全。
合并7-12瓶的高濃度洗脫液濃縮至500ml，室溫黑暗處靜置24hr以上，可見容器中有大量結晶析出。傾出母液(該母液及13-16瓶洗脫液可留待與下一批乙酯萃取液合并后再濃縮，上柱分離，如此循環操作)，得結晶3.82g，用甲醇—氯仿(1∶10)重結晶、可得白藜蘆醇甙3.25g(收率63％)，經高壓液相色譜分析，純度為98％。
稱取120g柱層析用硅膠(100-200目)，用三氯甲烷∶乙酸乙酯(4∶1)懸浮裝入一根直徑為30mm，長500mm的玻璃層析柱中，柱子經平衡后，將第一次柱層析中收集的1-3瓶洗脫液濃縮成25ml加到該柱子上，用三氯甲烷∶乙酸乙酯(4∶1)進行洗脫，洗脫液流速控制在5ml/min，收集含有白藜蘆醇的洗脫液，然后將洗脫液濃縮至結晶析出，室溫黑暗處靜置，待結晶完全時傾出母液，結晶再用丙酮—三氯甲烷(1∶10)重結晶，得純度為97.5％的白藜蘆醇0.54g(收率72％)。實施例2稱取460g柱層析用硅膠(100-200目)，用三氯甲烷∶甲醇(5∶1)懸浮液裝入一根直徑為60mm，長500mm的玻璃層析柱中，平衡后按實施例1方法所得到的乙酸乙酯提取濃縮液50ml加到此柱上，洗脫速度為25ml/min。分別收集白藜蘆醇及白藜蘆醇甙的洗脫液，白藜蘆醇甙的收集液經濃縮結晶析出，析出的結晶再經甲醇—氯仿(1∶10)反復重結晶二次，得純度98.6％白藜蘆醇甙0.81g。實施例31、提取將干燥虎杖根莖粉碎過40目篩后，稱取1kg，加入5L95％乙醇，60℃攪拌浸泡24小時，然后進行抽濾，濾渣再用5L95％乙醇按同樣的方法浸泡、提取一次，將兩次濾液合并。經高壓液相色譜定量分析得知上述所得濾液中含白藜蘆醇2.63g，白藜蘆醇甙16.80g。
將上述所得濾液加熱減壓濃縮至600ml，加入1000ml蒸餾水，再用2NNaOH調pH至7.8。然后用8L、6.5L乙酸乙酯萃取兩次，合并兩次的萃取液，減壓濃縮至785ml。經高壓液相色譜定量分析得知此濃縮液中含白藜蘆醇2.5g，白藜蘆醇甙15.6g。
2、層析將785ml濃縮液分成四次進行柱層析，層析和結晶以及重結晶方法按實施例1所述進行。白藜蘆醇和白藜蘆醇甙的重結晶是將四次粗結晶合并后，一次性進行重結晶。
最終從1kg虎杖中得到重結晶的白藜蘆醇甙11.3g(收率67％)，經高壓液相色譜分析，純度為98.3％；得到重結晶的白藜蘆醇1.95g(收率74％)，經高壓液相色譜分析，純度為98.1％。實施例4將白藜蘆醇甙3mg與1g葡萄糖粉混合后制成顆粒劑，裝入鋁箔包裝袋中。實施例5將白藜蘆醇甙3mg與0.25g淀粉混合后裝入暗色膠囊。實施例6將白藜蘆醇2mg與0.25g糊精混合后裝入暗色膠囊。實施例7將白藜蘆醇甙按15mg/L加入紅葡萄酒中。實施例8將白藜蘆醇10mg/L加入葡萄汁中，制成保健飲料。
權利要求
1.從中藥虎杖根莖分離白藜蘆醇和白藜蘆醇甙的方法，其步驟如下a.將虎杖粉用可與水混溶的有機溶劑提取，減壓蒸餾濃縮提取液，再加入蒸餾水，調pH至7.5-8.0；再用乙酸乙酯萃取并減壓蒸餾濃縮，得到粗提物，作為進一步純化的原料；b.用柱層析法和結晶法進行分離及純化，白藜蘆醇及其甙以收集柱層析洗脫液的先后順序不同而分離，先收集的洗脫組分中含有白藜蘆醇，后收集的洗脫組分中含有白藜蘆醇甙；層析柱填充物是硅膠，層析洗脫液為氯仿∶甲醇(或乙醇)＝4～8∶1或乙酸乙酯∶乙醇＝90～100∶0～10；將第一次層析中后收集的白藜蘆醇甙組分的洗脫液濃縮后在室溫下靜置，析出白藜蘆醇甙結晶，然后進行重結晶；將第一次柱層析中首先收集到的白藜蘆醇洗脫組分濃縮，進行第二次層析，層析洗脫液為三氯甲烷∶乙酸乙酯＝70～100∶20～30，將二次洗脫液濃縮、室溫下靜置，析出白藜蘆醇結晶，然后進行重結晶。
2.權利要求1所述的分離白藜蘆醇和白藜蘆醇甙的方法，其中所述提取虎杖所用的與水混溶的有機溶劑系指甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、丙酮以及這些溶劑任意的組合。
3.權利要求1所述的分離白藜蘆醇和白藜蘆醇甙的方法，其中所述的第一次層析洗脫液的最佳成分比例為氯仿∶甲醇(或乙醇)＝5∶1或乙酸乙酯∶乙醇＝95∶5；用于分離白藜蘆醇的第二次層析中，洗脫液的最佳成分比例為三氯甲烷∶乙酸乙酯＝80∶20。
4.權利要求1所述的分離白藜蘆醇和白藜蘆醇甙的方法，其中所述的結晶方法是將洗脫液濃縮，室溫下黑暗處靜置，至結晶析出；白藜蘆醇重結晶所用溶劑為丙酮—氯仿(1∶8～10)；白藜蘆醇甙重結晶所用溶劑為甲醇—氯仿(1∶8～10)。
5.白藜蘆醇和/或白藜蘆醇甙作為藥品、保健品或食品、飲料、保健添加劑的應用將白藜蘆醇甙或白藜蘆醇或兩者混合物與食品或藥品上可接受的輔劑、賦形劑混合后，用適當工藝制成各種劑型，如粉劑、顆粒劑、片劑、膠囊劑、溶液劑、油膏劑、霜劑等，作為藥品、保健品、化妝品；也可以作為食品添加劑加入食品、飲料、制成各種形式的保健食品、飲料、酒類。
全文摘要
本發明涉及從中藥虎杖分離白藜蘆醇和白藜蘆醇甙的方法和白藜蘆醇和白藜蘆醇甙作為藥品、保健品或食品、飲料、保健添加劑的應用。將虎杖根莖用有機溶劑提取,經萃取、濃縮、硅膠柱層析、結晶、重結晶,得到純度高達97%以上的白藜蘆醇和白藜蘆醇甙,且收率高(各為70%以上和60%以上),所得產物可直接作為藥品、保健品使用。本發明提供的分離純化方法工藝簡便、操作容易、安全,成本低廉,便于大規模生產。
文檔編號C07C39/00GK1277954SQ00121100
公開日2000年12月27日 申請日期2000年7月20日 優先權日2000年7月20日
發明者孫狄, 章震興 申請人:北京市孚曼生物技術研究所