專利名稱：增效蛋白在原核生物中的表達及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及在原核生物中表達昆蟲病毒增效蛋白N末端截短蛋白，含有昆蟲病毒增效蛋白N末端截短蛋白基因的載體，用這種載體轉化的原核生物(優選大腸桿菌)，在大腸桿菌中產生昆蟲病毒增效蛋白N末端截短蛋白的方法，以及表達的昆蟲病毒增效蛋白N末端截短蛋白在農林業中的應用.
現在已知，昆蟲病毒增效蛋白(enhancin)是由昆蟲病毒基因編碼能顯著提高病毒殺蟲活性的一種功能性蛋白質。1998年，美國學者(Zhong，J.andR.R.Grandos1998.VIIth International Colloguium on Invertebrate Pathology and Microbial ControlIVth Internatiol Conference on Bacillus thuringensis.Ausgust 23-2865)已將粉紋夜蛾顆粒體病毒(Trichoplusia ni granulosis virus簡稱TnGV)增效蛋白基因克隆于核型多角體病毒AcNPV，構建了重組病毒工程毒株，并用該毒株與野生型病毒混合使用，可顯著提高Tn的殺蟲效果。然而，這種工程病毒受到其宿主范圍及其毒力的影響，因此在應用上有著局限。
本發明的目的是提供一種新型的含有昆蟲病毒增效蛋白N末端截短蛋白基因的工程菌株，該菌株的構建方法、用途以及由該菌株生產增效蛋白的方法。
為實現上述目的，本發明所采取的技術方案如下一種工程菌株E.coli M15(pQE-TnGVCp80)，它含有粉紋夜蛾增效蛋白N末端截短蛋白基因，并能在原核生物中高效表達，該菌種命名為E.coli M15(pQE-TnGVCp80)，已于2000年5月17日保藏于湖北省武漢市武漢大學的中國典型培養物保藏中心，登記入冊號為CCTCC M20009。該重組載體主要由下列DNA元件組成(1).粉紋夜蛾昆蟲病毒增效蛋白N末端截短蛋白基因；(2).大腸桿菌質粒復制起始點；(3).氨芐青霉素抗性基因；(4)六個連續組氨酸編碼區。
構建本發明的工程菌株主要所用的原始材料有如下幾種(1)粉紋夜蛾顆粒體病毒(TnGV)，由美國湯姆杰弗遜大學贈送；(2)受體大腸桿菌E.coliM15菌株，購自QIA-REN公司；(3)大腸桿菌質粒骨架，購自Promega公司；(4)pQE載體，購自購自Promega公司。
用來表達昆蟲病毒增效蛋白的載體通過基因工程方法獲得，其構建方法是用BamHI/PstI分別雙酶切質粒pQE和重組質粒pGEM-T/En，并經0.7％低熔點瓊脂糖凝膠電脈純化回收2.18kb目的基因片段，用T4DNA連接酶于16℃水浴連接過夜轉化感受態細胞E.coli M15(pREP4)，經Amp(氨芐青霉素)和Kan(卡那霉素)雙抗平板篩選得到E.coliM15(pQE-TnGVEnCp80)。該工程菌株于2000年5月17日保藏于中國武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心，登記號為CCTCC M20009。該工程茵株攜帶粉紋夜蛾昆蟲病毒增效蛋白N末端截短蛋白基因的表達載體。
其中的重組質粒pGEM-T/En由下面方法構建根據已報道的粉紋夜蛾病毒(TnGV)增效蛋白基因序列[Hashimoto，Y.et.al1991，J.Gen.Virol72(11)2645-2651]，以TnGV基因組DNA作模板，設計引物P15’TCCTCCAATGTTGCACGATT，P25’AACTGACTGTTGAACGTTAT，PCR法擴增增效蛋白基因，得到全長約2.9Kb的片段，與pGEM-T載體用T4DNA酶連接后，得到重組質粒pGEM-T/En。
將重組獲得的攜帶粉紋夜蛾昆蟲病毒增效蛋白N末端截短蛋白的工程菌株CCTCC M99103單菌落挑到內含100μg/ml的Amp(氨芐青霉素)和25μg/ml Kan(卡那霉素)的LB培養基中(25ml)，37℃，200rpm過夜培養，以1∶20比例接種到含上述雙抗500ml LB培養基中繼續培養，當其濃度達到OD600＝0.7-0.9時，加入IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)到終濃度1mM，于37℃，200rpm誘導表達5hr，收獲菌液，4000rpm離心10min，收集菌體沉淀，再按常規方法即可獲得昆蟲病毒增效蛋白質N末端截短蛋白。
利用攜帶昆蟲病毒增效蛋白N末端截短蛋白基因的大腸桿菌發酵生產的增效蛋白可作為有效成份提高病毒殺蟲劑、BT殺蟲劑、阿維菌素等生物殺蟲劑的殺蟲效果或單獨用于轉基因抗蟲棉。
本發明提供了一種增效蛋白工程菌株E.coli M15(pQE-TnGVCp80)，該菌株的用途和構建方法，以及由此工程菌株生產昆蟲病毒增效蛋白，該菌株含有TnGV增效蛋白部分截短全長基因，能在原核生物中復制，從而獲得昆蟲病毒增效蛋白，可作為有效成份提高病毒殺蟲劑，BT殺蟲劑，阿維菌素等生物殺蟲劑的殺蟲效果，可使害蟲死率明顯提高，半數致死時間也明顯減少。這種昆蟲病毒增效蛋白也可單獨用于轉基因抗蟲棉。
圖1為構建本發明的重組質粒pQE-TnGVCp80示意圖，圖2為構建本發明的重組質粒pGEM-T/En示意圖。
以下結合附圖和具體的實施方案對本發明的技術方案作進一步的說明，這些實施方案無意于以任何方式限制本發明權利要求所要求的范圍。
(一)En-TnGV基因的PCR擴增1.TnGV-DNA的提取取TnGV懸液100μL，加等體積0.04mol/L NaOH堿解液及終濃度為1％的SDS，56℃水浴處理10分鐘，待懸液半透明后，用堿性酚，酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1V∶V)混合液，氯仿∶異戊醇(24∶1V∶V)混合液抽提TnGV-DNA各一次，無水乙醇沉淀DNA，-20℃放置過夜，離心后用75％乙醇洗滌DNA沉淀，自然干燥，將DNA溶于TE(Tris·HCl 10mM，EDTA 1mM pH8.0)緩沖液，于4℃保存。
2.En-TnGV基因的PCR擴增取TnGV-DNA 10μL，作10倍稀釋，取2μl，100℃煮6min立即冰浴，按B.M.公司Taq DNA Polymerase試劑(從棲熱水生菌YT-1中提純得到的耐熱的DNA多聚酶)操作手冊，并參見Sambrook等在“分子克隆”(實驗室手冊，冷泉港，1989)的方法，加入(1)10×PCR反應緩沖液10μl，(2)兩種引物各2μl，(3)10mmol/LdNTPs 2μl，(4)Taq DNA polymerase(5U/μl)1μl，(5)補去離子水至100μl反應體積，(6)加石蠟油覆蓋液面，進行PCR擴增。反應條件93.5℃變性60s，50℃退火90s，72.5℃延伸180s，循環30次，最后一次循環在72.5℃延伸7min，經電泳檢測，得到單一的長約2.9kb的En-TnGV基因全長DNA片段。
(二)En-TnGV基因DNA片段的克隆1.En-TnGV基因PCR產物的磷酸化按Promega公司的T4噬菌體多核苷酸激酶操作手冊并參見Sambrook等在“分子克隆”實驗室手冊，冷泉港，1989，在滅菌的0.5ml離心管中(1)加入En-TnGV基因PCR產物1μg，(2)激酶10×緩沖液4μl，(3)0.1mM的ATP2μl(4)T4多核苷酸激酶10U，(5)補加去離子水至40μl，37℃水浴30min，加入2μl 0.5M EDTA終止反應。加40μl苯酚∶氯仿∶異戊醇振蕩1min，8,000rpm離心2min，再用氯仿∶異戊醇抽提1次，轉移上清水相至一干凈離心管，加入1/10體積3M乙酸鈉，2倍體積無水乙醇，混勻，置于-20℃過夜，12,000rpm離心20min，棄上清，自然干燥，重懸DNA于20μL TE緩沖液。
2.連接En-TnGV基因PCR產物到pGEM-T質粒按Promega公司的pGEM-T載體操作手冊并參見Sambrook等在“分子克隆”，實驗窒手冊，(冷泉港，1989)，在已滅菌干凈的0.5ml離心管中，加入(1)10×T4DNA連接酶緩沖液1μl，(2)50ng/μl的pGEM-T載體，1μl，(3)約50ng的上述處理樣品DNA，(4)3Weiss units/μl T4 DNA連接酶1μl，(5)補加去離子水至10μl，混勻后置4℃連接過夜。
3.連接產物轉化E.Coli TG1，通過SalI或BamHI或KpnI單酶切鑒定其中的重組質粒DNA的正確結構，確定該工程菌株E.Coli TG1(pGEM-T/En)正確建立。
(三)En-TnGV N端截短基因～2.18Kb片段的克隆使用常規技術(參見Sambrook等在“分子克隆”，實驗室手冊，冷泉港，1989)，分離提純質粒pQE和pGEM-T/En。用PstI和BamHI雙酶切pGEM-T/En，獲得～2.18Kb片段，通過低熔點瓊脂糖回收該片段。將該片段連接到PstI和BamHI雙酶切的表達載體pQE中，轉化E.Coli TG1，方法如下(1)大腸桿菌M15菌株感受態細胞的制備和轉化從37℃培養16-20hr的新鮮LB平板中挑取E.coli M15單菌落，置3mlLB液體培養基試管中，37℃，200rpm培養過夜，再將菌液按1∶100比例接種于適量LB培養基中，37℃劇烈振蕩培養約3hr(OD600＝0.3-0.4)，將菌液轉入1.5ml無菌離心管，置冰上10min，待培養物預冷至0℃時，4,000rpm離心10min，收集菌體，倒出培養液以0.5ml冰冷的0.1mol/L CaCl2重懸細胞，置冰上半小時后，4,000rpm離心10min，倒出上清，加入100μl冰冷0.1mol/L CaCl2重懸細胞。所制成感受態細胞置4℃，并在12～24hr內使用。
在100μl E.coli M15菌株感受態細胞中加入8uL待轉化的連接產物DNA(DNA≤50ng)，輕旋以混勻內容物，置冰上30min，于42℃水浴中熱休克90s后，迅速移至冰浴中，待細胞冷卻1-2min后，每管加入900μl SOC培養液(蛋白胨20g，酵母粉5g，NaCl0.5g，250mMKCl 10ml，5MnaOH調pH值至7.0，15磅20分鐘高壓滅菌。臨用前加入5ml已滅菌的2MMgCl2，20ml已滅菌的1M葡萄糖溶液)，置37℃，150rpm溫育45min，將轉化細胞涂布至含100μg/ml氨芐青霉素的LB平板上，37℃培養12-16小時后觀察轉化結果。
(2)重組工程菌株E.Coli M15(pQE-TnGVCp80)的酶切鑒定將小量提取的重組質粒pQE-TnGVCp80用限制性內切酶PstI、BamHI雙酶切和BamHI或PstI單酶切消化，用0.7％瓊脂糖凝膠電泳，經EB染色后觀察，通過與分子量比較DNA片段大小的方法進一步鑒定。
(四)SDS-PAGE電泳分析表達質粒中外源基因的表達1.凝膠的灌制參照參見Sambrook等在“分子克隆”(實驗室手冊，冷泉港，1989)的方法，配制8％的分離膠溶液15ml，依次混合各成分后加入催化劑TEMED(N，N，N’，N’四甲基乙二胺)，立即混勻并灌膠，封一層0.1％SDS(十二烷基硫酸鈉)覆蓋液面，37℃下聚合30min。聚合完全后排凈凝膠上的液體，以同樣方法灌濃縮膠，插入梳子，避免產生氣泡。
2.蛋白質樣品的制備挑含有重組表達載體的細菌M15(pQE-TnGVCp80)單菌落在100μg/mlAmp，25μg/ml Kan的LB培養基中37℃過夜活化，然后以1∶20稀釋接種到含100μg/ml Amp，25μg/ml Kan的LB培養基中繼續培養，當其濃度達到OD600＝0.7～0.9時，取出未經誘導的細菌對照。加入IPTG至終濃度1mM，于42℃，200rpm培養30min后，降至37℃繼續搖床培養5hr后收獲細菌，4,000rpm離心10min，收集菌體沉淀，加入適量去離子水重懸菌體，置-20℃保存備用。
3.上樣及電泳在樣品中加等體積2×SDS凝膠加樣緩沖液，于100℃加熱3-5min變性，按順序加樣，最后在所有不用的加樣孔中加上等體積的加樣緩沖液，以100V電泳至溴酚蘭進入分離膠，提高電壓至150V，當溴酚蘭到達底部前約1cm處結束電泳(約需4hr)。
4.固定，染色和脫色剝膠后以5倍體積染液固定并染色過夜(至少4小時以上)，將凝膠浸泡于脫色液中平緩搖動4hr以上，其間更換脫色液3次，脫色完全后即可進行觀察和照相。
(五)純化表達質粒中目的基因表達產物1.目的基因的表達挑含待表達質粒的細菌M15[pREP4]單菌落在100μg/ml的Amp和25μg/mlKan的25mlLB培養基中37℃，200rpm過夜活化，然后以1∶20比例接種到含100μg/ml Amp和25μg/ml LB培養基中繼續培養，當其濃度達到OD600＝0.7-0.9時，加入IPTG至終濃度1mM，于42℃，200rpm誘導表達30min后，降至37℃，繼續培養5hr，收獲菌液，4,000rpm離心10min，收集菌體沉淀，保存于-20℃備用。
2.確定目的基因表達產物的形式在細菌沉淀中加入2-5倍體積的聲波處理液，反復凍融3次，置于冰中用超聲波破碎細菌。置于光學顯微鏡高倍物鏡觀察，有大量晶體，然后置于電子顯微鏡下觀察，進一步確定目的基因表達產物以包涵體形式存在。
3.不溶性蛋白的變性純化把上述處理后的表達產物經30％-60％蔗糖梯度離心，取出包涵體帶，洗糖三次，8,000rpm離心10min收集沉淀。每克沉淀重懸于5ml BufferB(8M尿素，0.1M磷酸鈉，0.01M Tris·Cl，pH8.0)，在室溫中攪拌沉淀1hr，10,000rpm離心15min，收集上清，加入8ml 50％Ni-NTA樹脂(已在Buffer B中預平衡)，在室溫中攪45min，然后小心加到直徑為1.6柱中，用120mlBufferB沖洗，至流液A280＜0.01，再用Buffer C(8M尿素，0.1M磷酸鈉，0.01M Tris·Cl，pH6.3)沖洗至A280＜0.01，然后用10-20ml BufferD(8M尿素，0.1M磷酸鈉，0.01MTris·Cl，pH5.9)洗脫重組蛋白質，最后用10-20ml BufferE(8M尿素，0.1M磷酸鈉，0.01M Tris·Cl，pH4.5)洗脫，每3ml收集一管洗脫液，進行SDS-PAGE電泳分析。
(九)表達產物的生物活性測定將蔗糖梯度離心純化的包涵體進行稀釋，在光學顯微鏡下計數，以102OBs/larva和104IB/larva分別與10PIB/larva AcMNPV混合，滴在適量人工飼料上，單頭添食感染3齡銀紋夜蛾幼蟲，共感染36頭，二個重復，設AcMNPV單獨感染對照，菌體蛋白加入AcMNPV混合感染對照及健康幼蟲對照。置于27±1℃，濕度70％的培養箱中，每日記錄死活蟲數，統計其死亡率。結果表明102OBs/larva和104OBs/larva的包涵體，使得10PIB/larva的AcMNPV感染銀紋夜蛾LT50均減少2.8天，死亡率提高了37.3％(十)增效蛋白與各種生物殺生劑混合使用的實施例1.對病毒增效實施例將蔗糖梯度離心純化的包涵體進行稀釋[來源于E.coli M15(pQE-TnGVCp80)]，在光學顯微鏡下計數，以102OBs/larva和104OBs/larva分別與10P1B/larva AcMNPV混合，滴在適量人工飼料上，單頭添食感染3齡銀紋夜蛾幼蟲，共感染36頭，二個重復，設AcMNPV單獨感染對照，菌體蛋白加入AcMNPV混合感染對照及健康幼蟲對照，置27±1℃，濕度70％培養箱中，每日記錄死活蟲數，統計其死亡率。結果，實驗組的LT50比對照組減少2.8天，較正死亡率提高37.3％2.對Bt增效實施例將Bt菌粉(16000IU/mg)作1∶1000，1∶2000，1∶4000倍比稀釋成三個不同濃度，人工飼料添食感染2齡棉鈴蟲幼蟲，每個稀釋度30頭，2個重復，同時設立正常對照，根據統計結果，求得Bt對2齡棉鈴蟲幼蟲，致死中濃度為LC50為0.652g/L取致死中濃度Bt稀釋液與1×102OBs/mlTnGVCp80增效蛋白復配，人工飼料添食感染2齡棉鈴蟲幼蟲，每個稀釋度30頭，2個重復，同時設立單獨Bt對照，結果，試驗組比對照組提高Bt對棉鈴蟲幼蟲死亡率為32.2％。
3.對阿維菌素實施例將阿維菌素(1.8％乳油)作1∶3000，1∶6000，1∶12000倍比稀釋成三個不同濃度，人工飼料添食喂養4齡棉鈴蟲幼蟲，每個稀釋度30頭，2個重復，同時設立正常對照，根據統計結果，求得阿維菌素(1.8％乳油)對老齡棉鈴蟲幼蟲致死中濃度LD50為1∶5800.取致死中濃度阿維菌素稀釋液與1×102OBs/ml TnGVCp80增效蛋白復配，人工飼料添食喂養4齡棉鈴蟲幼蟲，每個稀釋度30頭，2個重復，同時設立單獨阿維菌素對照，結果，試驗組比對照組提高阿維菌素對棉鈴蟲老齡幼蟲死亡率為22.4％。
權利要求
1.一種工程菌株E.ColiM15(pQE-TnGVCp80)，該工程菌株已提交到中國典型培養物保藏中心保藏，其保藏編號為CCTCC M20009。
2.根據權利要求1所述的工程菌株，其特征在于這種菌株含粉紋夜蛾顆粒體病毒增效蛋白N末端截短蛋白基因，并能在原核生物中表達。
3.根據權利要求1或2所述的工程菌株，其特征在于所含的重組表達載體由下列DNA元件構成(1).粉紋夜蛾顆粒體病毒增效蛋白N末端截短蛋白基因；(2).大腸桿菌質粒復制起始點；(3).氨芐青霉素抗性基因；(4)六個連續組氨酸編碼區。
4.一種構建權利要求1-3任意一項所述的工程菌株的方法，其特征在于用BamHI/PstI分別雙酶切質粒pQE和重組質粒pGEM-T/En，并經0.7％低熔點瓊脂糖凝膠電脈純化回收2.18kb目的基因片段，用T4DNA連接酶于16℃水浴連接過夜；轉化感受態細胞E.coli M15(pREP4)，經氨芐青霉素和卡那霉素雙抗平板篩選得到E.coli M15(pQE-TnGVEnCp80)。
5.一種用權利要求1-3所述的工程菌株生產粉紋夜蛾顆粒體病毒增效蛋白的方法，其特征在于將重組獲得的攜帶粉紋夜蛾顆粒體病毒增效蛋白N末端截短蛋白的工程菌株CCTCCM20009單菌落挑到內含100μg/ml的氨芐青霉素和25μg/ml卡那霉素的LB培養基中，37℃，200rpm過夜培養，以1∶20比例接種到含上述雙抗500ml LB培養基中繼續培養，當其濃度達到OD600＝0.7-0.9時，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷至終濃度1mM，于37℃，200rpm誘導表達5hr，收獲菌液，4000rpm離心10min，收集菌體沉淀，再按常規方法即可獲得粉紋夜蛾顆粒體病毒增效蛋白質N末端截短蛋白。
6.權利要求1-3所述的工程菌株與昆蟲病毒、蘇蕓金芽胞桿菌、阿維菌素或其它生物殺蟲劑制備成復合生物殺蟲劑在農林業用于病蟲的生物防治，或單獨用于轉基因抗蟲棉防治棉鈴蟲。
全文摘要
本發明公開了一種通過基因工程手段構建工程菌株:CTCC M20009 E.Coli M15(pQE－TnGVCp80)、工程菌株的構建方法和用途。該菌株是以TnGV為模板,經PCR法產生TnGV增效蛋白基因N末端部分截短的基因片段,與pQE表達載體連接,構成含TnGV增效蛋白基因N末端部分截短的基因的表達載體,轉化至E.Coli M15菌體所得。它攜帶粉紋夜蛾顆粒體病毒增效蛋白基因N末端部分截短的基因片斷,并能夠在原核生物細胞中表達,從而獲得昆蟲病毒增效蛋白,該增效蛋白TnGVCp80可作為有效成份提高病毒殺蟲劑、BT殺蟲劑、阿維菌素等生物殺蟲劑的殺蟲效果或單獨用于轉基因抗蟲棉。
文檔編號C07K14/005GK1331288SQ0011466
公開日2002年1月16日 申請日期2000年6月30日 優先權日2000年6月30日
發明者孟小林, 徐進平 申請人:武漢大學