專利名稱：新型溶栓藥物重組葡激酶抗體的制備和檢測方法
技術領域：
本發明一種新型溶栓藥物重組葡激酶抗體的制備和檢測方法，屬于生物醫學的抗體制備和檢測技術領域。
新型溶栓藥物重組葡激酶是90年代誕生的一種新型生物技術治療藥物，是金黃色葡萄球菌分泌的一種胞外蛋白質，它類似尿激酶(Uk)和鏈激酶(Sk)，具有溶血栓的特性。新型溶栓藥物重組葡激酶是一種小分子蛋白，分子量約為1.5萬，抗原性較弱；對于類似葡激酶這類肉眼不可見的微量的初級抗原、抗體反應，原理上應該通過標記技術，對免疫學反應進行放大從而測定其ng/ml水平級的含量。免疫標記技術有放射免疫測定，酶聯免疫測定等方法。用常規免疫得到的葡激酶抗體效價低，即使從荷蘭購進的葡激酶抗血清其雙擴效價也僅有1∶2左右，雙擴散效價達不到建立酶聯免疫法的臨界條件，因此不能用酶聯免疫法檢測新型溶栓藥物重組葡激酶在血液中的含量，因而采用放射標記技術的放射免疫測定法測定葡激酶的含量。但放射免疫法存在如下缺點(1)由于用同位素標記的新型溶栓藥物重組葡激酶容易出現衰退和降解，因而不能準確地測定血樣中的新型溶栓藥物重組葡激酶含量；(2)采用放射免疫法需要特殊的測定儀器，成本高；(3)存在標記物容易衰退，檢測準確性差；(4)存在輻射危害等。
本發明的目的在于避免上述已有技術的不足而提供一種血清效價高、成本低、無輻射危害、檢測精度高、無標記物衰退的新型溶栓藥物重組葡激酶免疫血清的制備及利用該血清檢測新型溶栓藥物重組葡激酶的方法。通過對低抗原性新型溶栓藥物重組葡激酶進行化學修飾，增大新型溶栓藥物重組葡激酶的分子量，提高新型溶栓藥物重組葡激酶的抗原性；采用多點注射法、淋巴結內注射法和足背預免疫免疫動物，刺激了免疫動物的抗體產生得到高效價的血清；經純化抗體血清，進一步提高抗體的效價，從而建立酶聯免疫法來檢測新型溶栓藥物重組葡激酶的含量。
本發明可以通過以下技術方案來實現新型溶栓藥物重組葡激酶抗體的制備及利用該抗體檢測新型溶栓藥物重組葡激酶的方法是通過標記技術，對免疫學反應進行放大從而檢測其新型溶栓藥物重組葡激酶的含量，具體步驟是取等量的新型溶栓藥物重組葡激酶純品和牛血清分別用0.2-3倍醋酸鹽緩沖液溶解；在牛血清溶解液中滴加濃度為10％-40％的交聯劑至交聯劑占總量的0.5％-5％，攪拌10-50分鐘，加入透析袋，牛血清溶液濃縮至原體積的1/3以下，然后再加入新型溶栓藥物重組葡激酶溶解液混合，在2～10℃攪拌12小時以上，制成牛血清球蛋白交聯物；在牛血清球蛋白交聯物中加入福氏完全佐劑充分乳化成油包水乳劑，采用多點注射法或淋巴結內注射法或足背預免疫家兔1次以上，每兔每次給藥0.8～3mg，并靜脈采血確定效價。雙擴散效價達1∶16以上時，心臟放血分離血清，制取高效價的免疫血清；用平衡液平衡蛋白柱G，抽取家兔免疫血清加入蛋白柱G內，使血清在柱中停留作用5分鐘以上，再以平衡緩沖液流洗20分鐘以上，然后以洗脫液甘氨酸洗脫免疫球蛋白IgG，以0.1molNaOH堿性溶液中和至中性，得到純化的IgG。
采用碘酸鈉法標記免疫球蛋白IgG制成酶標抗體，以純化的免疫球蛋白IgG包被酶標抗體，洗板后加被檢血樣，在37℃-45℃孵育60-120分鐘，洗板，加酶標抗體在同樣的溫度和時間范圍再孵育，洗板，加底物二氨基聯苯顯色，從而測定被檢血樣中新型溶栓藥物重組葡激酶含量。
本發明還可以通過以下技術方案來實現新型溶栓藥物重組葡激酶免疫血清的制備及利用該血清檢測新型溶栓藥物重組葡激酶的方法中醋酸鹽緩沖液PH值為3～5，交聯劑為戊二醛；多點注射為多點肌肉注射、多點皮內注射、多點皮下注射；多點注射的總注射點至少為8個點；每個注射點的新型溶栓藥物重組葡激酶注射量為0.1～0.2mg。蛋白柱G用0.05mol/LPH7.2PB的平衡液平衡，血清在柱中的停留時間為10分鐘；洗脫液為鹽酸---甘氨酸，堿性溶液為0.1mol/NaOH；被檢血樣為血清或血漿，酶標抗體以生理鹽水稀釋，濃度為1∶50較好；其中底物為二氨基聯苯氨。
本發明與已有技術相比具有如下優點采用牛血清與純品新型溶栓藥物重組葡激酶交聯，加福氏完全佐劑充分乳化，對低抗原性新型溶栓藥物重組葡激酶進行化學修飾，增大了新型溶栓藥物重組葡激酶的分子量，提高了新型溶栓藥物重組葡激酶的抗原性；采用多點注射法、淋巴結內注射法和足背預免疫免疫動物，刺激了免疫動物的抗體產生。所得抗體血清經純化，可達到建立酶聯免疫測定技術要求的條件。由于本發明的雙抗體夾心酶聯免疫吸附法中的抗原與抗體一一對應，對新型溶栓藥物重組葡激酶的特異性好，對葡激酶在血清中產生的肉眼不可見的微量的初級抗原、抗體采用標記技術，對免疫學反應起到放大作用，實現酶聯免疫法測定葡激酶含量，使其精確度達到ng/ml或pg/ml水平。
本發明建立并采用雙抗夾心ELISA法來檢測r-SAK，借助于特異性抗體的制備以保證方法的特異性，借助于酶的放大作用以保證方法的敏感性，并且檢測時不需要特殊的測定儀器，成本低，不存在標記物容易衰退、輻射危害缺點，檢測精度高。
將上述交聯物加福氏佐劑充分乳化成油包水乳劑，采用多點肌肉注射法或多點皮內或多點皮下或足背預免疫或腋窩淋巴結注射等方法免疫家兔，劑量為每個點注射0.1mg新型溶栓藥物重組葡激酶，總注射點不少于8個點，10天和一個月后加強免疫一次，即可制備出高效價的新型溶栓藥物重組葡激酶免疫血清。
為進一步提高其效價，則進行新型溶栓藥物重組葡激酶抗體的純化即提取新型溶栓藥物重組葡激酶IgG。取蛋白G柱一支，以0.05mol/L、PH7.2PB平衡，將2ml抗血清加于柱上，待血清流入柱中后，關閉流出口，使血清在柱中作用10分鐘，打開流出口，以平衡緩沖流冼，至蛋白流盡后再冼20分鐘(流速為1ml/min)。以鹽酸--甘氨酸緩沖液(0.05mol/L、PH2.8)洗脫IgG，并立即以0.1mol/LNaOH中和至中性即可得到純化的IgG。
采用過碘酸鈉法標記辣根過氧化物酶于純化的IgG上，制成酶標抗體，另以純化的IgG包被酶標板，洗滌后加含新型溶栓藥物重組葡激酶的被測血樣(血清或血漿等)孵育，洗板，然后加酶標抗體孵育，洗板，加底物顯色，顏色深淺與被測血樣中新型溶栓藥物重組葡激酶量成正相關。采用上述雙夾心酶聯免疫吸附法檢測正常人靜脈給予10mg新型溶栓藥物重組葡激酶的血藥濃度，得Vc為4.45±1.62L,AUC0-270為89935±13228min.ng/ml,CL為6.30±1.05L/h,T1/2a為13.30±2.06min，T1/2β為67.94±21.39min。其中AUC0-270為血藥濃度-時間下曲線面積；Vc為中心分布容積；CL為藥物總清除率；T1/2a為分布相半衰期；T1/2β為清除相半衰期。
經棋盤滴定，上述檢測操作中，IgG的濃度以20mg為佳，酶標抗體的濃度用生理鹽水以1∶50稀釋為好。
如
圖1所示，為抗r-SAK血清效價測定及特異性分析。在凝固的厚度為1.5～2mm、1.5％的瓊脂板上打孔，孔徑3mm，孔距4～5mm。測定抗血清效價時，中央孔加1μg的新型溶栓藥物重組葡激酶，周圍各孔分別加不同稀釋度的兔抗新型溶栓藥物重組葡激酶血清10μ1,37℃濕盒中擴散24小時，以出現沉淀線的最高稀釋度為該抗血清的效價。結果所制兔抗新型溶栓藥物重組葡激酶抗體血清效價達1∶16。
如圖2所示，抗r-SAK血清效價特異性分析。在凝固的厚度為1.5～2mm、1.5％的瓊脂板上打孔，孔徑3mm，孔距4～5mm。中央孔加原倍的抗血清10μl，周圍各孔加新型溶栓藥物重組葡激酶、人血漿、小牛血清等，沉淀線只出現在中央孔與新型溶栓藥物重組葡激酶孔之間為合格。結果所制兔抗新型溶栓藥物重組葡激酶抗體血清僅與r-SAK之間有沉淀線，與人血漿、小牛血清等之間無交叉反應。
取蛋白G柱一支(pharmacia產品，批號243395)以0.05mol/L,PH7.2PB平衡，將2ml抗血清加于柱上，待血清流入柱中后關閉流出口使血清在柱中作用10min，打開流出口，平方公里平衡緩沖液流冼，至蛋白流盡后再冼20min，流速約為1ml/min。以0.05mol/L,PH2.8的鹽酸--甘氨酸緩沖液冼脫IgG，并立即以0.1mol/LNaOH中和至中性。于280nm處比色，根據公式IgG濃度(mg/ml)=0.62A1cm280cm，計算IgG的濃度。
采用過碘酸鈉法標記新型溶栓藥物重組葡激酶免疫球蛋白IgG制成辣根過氧化物酶標。
檢測程序是將一定量的新型溶栓藥物重組葡激酶免疫球蛋白IgG溶于PH9.6,0.01mol/L碳酸鹽緩沖液中，加入到酶標反應板(Nunc-Immuno Module，批號038891，丹麥產品)各孔中，每孔100μl,4℃包被13小時，然后以0.02mol/L,PH7.4,Tween20酶標洗滌液常規洗板三次。加入適當稀釋的標準品或被測血漿。每孔100μl，混勻，37℃2小時，取出洗板三次。各孔加底物溶液(即8mg鄰苯二胺加入10mlPH5.0檸檬酸磷酸鹽緩沖液中，再加3％H2O2,0.05ml，臨用時配制)100μl,37℃30min，每孔加2mol/L H2SO4一滴中止反應，于492nm比色(CliniBio128C,Ansfra生產)。根據檢測孔的吸光度查標準曲線即得相應的新型溶栓藥物重組葡激酶含量。
檢測最佳條件的選擇，采用棋盤滴定法選擇包被抗體和酶標抗體的濃度，試驗結果顯示包被抗體的濃度以20μg/ml為好，酶標抗體用生理鹽水以1∶50稀釋為好。
實施例3標準曲線的制備將r-SAK標準品(20μg/支，1000活性單位，批號97衛生參字01號)復溶后，以正常從枸櫞酸抗凝血漿稀釋成50、100、200、400、800、1200、1600、和2000ng/ml不同濃度，與被檢血漿標本同樣以酶標稀釋液(含15％小牛血清的酶標洗滌液)1∶20稀釋，加入到已包被的酶標板孔中，按上述實施例3檢測程序操作，每一稀釋度均做復孔，取吸光度均值(Y)對濃度(X)作回歸曲線。當待測標本中r-SAK濃度低于50ng/ml時，另作一標準曲線，標準品濃度取10、20、30、40、50ng/ml，與血漿標本同時1∶4稀釋后按上述程序操作并繪制曲線。
權利要求
1．新型溶栓藥物重組葡激酶的抗體制備和檢測方法，通過標記技術，對免疫學反應進行放大從而測定其葡激酶含量，其特征在于新型溶栓藥物重組葡激酶的抗體制備和檢測采用----取等量的重組藥物葡激酶純品和牛血清分別用0.2-3倍醋酸鹽緩沖液溶解；在牛血清溶解液中滴加濃度為10％-40％的交聯劑至交聯劑占總量的0.5％-5％，攪拌10-50分鐘，加入透析袋，牛血清溶液濃縮至原體積的1/3以下，然后再加入重組藥物葡激酶溶解液混合，在2-10攝氏度攪拌12小時以上，制成牛血清球蛋白交聯物；----在牛血清球蛋白交聯物中加入福氏完全佐劑充分乳化成油包水乳劑，采用多點注射法或淋巴結內注射法或足背預免疫家兔1次以上，每兔每次給藥0.8～3mg，制取高效價的免疫血清；----用平衡液平衡蛋白柱，抽取家兔免疫血清加入蛋白柱內，使血清在柱中停留作用5分鐘以上，再以平衡緩沖液流洗20分鐘以上，然后以洗脫液洗脫免疫球蛋白IgG，以堿性溶液中和至中性，得到純化的IgG。----采用碘酸鈉法標記免疫球蛋白IgG制成酶標抗體，以純化的免疫球蛋白IgG包被酶標抗體，洗板后加被檢血樣在37-45℃孵育60-120分鐘，洗板，加酶標抗體再同樣孵育，洗板，加底物顯色，從而測定被檢血樣中重組藥物葡激酶含量。
2．如權利要求1所述的新型溶栓藥物重組葡激酶的抗體制備和檢測方法，其特征在于醋酸鹽緩沖液PH值為3～5。
3．如權利要求1所述的新型溶栓藥物重組葡激酶的抗體制備和檢測方法，其特征在于交聯劑為戊二醛；
4．如權利要求1所述的新型溶栓藥物重組葡激酶的抗體制備和檢測方法，其特征在于多點注射為多點肌肉注射、多點皮內注射、多點皮下注射。
5．如權利要求4所述的新型溶栓藥物重組葡激酶的抗體制備和檢測方法，其特征在于所述的多點注射的總注射點至少為8個點；
6．如權利要求4或5所述的新型溶栓藥物重組葡激酶免疫血清的制備及利用該血清檢測重組藥物葡激酶的方法，其特征在于所述的每個注射點的重組藥物葡激酶注射量為0.1～0.2mg。
7．如權利要求1所述的新型溶栓藥物重組葡激酶的抗體制備和檢測方法，其特征在于所述蛋白柱用0.05mol/LPH7.2PB的平衡液平衡，血清在柱中的停留時間為10分鐘；
8．如權利要求1所述的新型溶栓藥物重組葡激酶的抗體制備和檢測方法，其特征在于所述洗脫液為鹽酸---甘氨酸，堿性溶液為0.1mol/NaOH。
9．如權利要求1所述的新型溶栓藥物重組葡激酶的抗體制備和檢測方法，其特征在于酶標抗體的濃度為1∶50稀釋為好。
10．如權利要求1所述的新型溶栓藥物重組葡激酶的抗體制備和檢測方法，其特征在于所述的底物為二氨基聯苯氨。
全文摘要
本發明的新型溶栓藥物重組葡激酶的抗體制備和檢測方法，其特征是將重組藥物葡激酶純品和牛血清球蛋白交聯，加福氏佐劑充分乳化，制成油包水乳劑。將該乳劑采用多點肌肉和淋巴結內注射法免疫家兔。以蛋白G柱純化免疫球蛋白IgG部分，碘酸鈉法標記免疫球蛋白IgG制成酶標抗體，再以免疫球蛋白IgG包被酶標抗體，洗板后加被檢血樣孵育，洗板，加酶標抗體孵育，洗板，加底物顯色，從而測定被檢血樣中葡激酶含量。
文檔編號C07K16/18GK1316438SQ0011282
公開日2001年10月10日 申請日期2000年4月5日 優先權日2000年4月5日
發明者童明慶, 王世鵬, 佟彬 申請人:成都金鵬生物技術有限公司, 南京醫科大學第一附屬醫院