專利名稱：一種手性－反－第一菊酸的酶拆分制造方法
技術領域：
本發明涉及手性R(+)-反-第一菊酸，特別提供了一種用酶拆分方法制造手性R(+)-反-第一菊酸的技術。
第一菊酸(又稱菊酸，英文名稱Chrysanthemic acid)是合成擬除蟲菊酯農藥的酸部分組成的重要中間化合物。第一菊酸，即2，2-二甲基3-(2-甲基-1-丙烯基)環丙烷羧酸，如(I)所示 因它的環丙烷環上存在兩個手性碳原子，因此有R(+)和S(-)兩種構型，還有順式和反式兩種異構，共有四種異構體。作為擬除蟲菊酯農藥的酸部組成，不同異構體的第一菊酸，其殺蟲效力表現出顯著的差異。其中手性R(+)第一菊酸是有效體，而手性S(-)第一菊酸是無效體；對順式和反式結構，一般而言，R(+)-反-菊酸效力最高，而R(+)-順-菊酸則次之。當今，合成高效、低毒有益于環境保護的手性農藥已成為重要的發展趨勢。因此在工業上制造R(+)第一菊酸，是生產手性擬除蟲菊酯農藥的重要中間體，具有較高價值。
目前，雖然化學拆分法可以制造手性R(+)第一菊酸，但是需要使用價格很高的光學活性試劑，而且工藝流程比較繁雜。由手性催化劑催化環丙烷化雖然可以得到R(+)-反-第一菊酸，但尚難達到很高的光學活性。因此研究開發方便經濟的生物催化劑拆分法制造R(+)-反-第一菊酸成為一個新的重要途徑。
以生物催化劑動力學拆分法制造R(+)-反-第一菊酸，已報道的文獻有1.豬肝酯酶拆分法(M.Schneider et al.，Angew.Chem.Int.Ed.Eg.，2364(1984))。2.球形節桿菌(Arthobacter globiformis)及其酯酶拆分方法(SMitsuda etal.，Agric.Biol.Chem.，55，2865(1991))。
豬肝酯酶拆分法，使用活力高的酶，得到了R(+)-第一菊酸的光學活性(純度)達70％，但是，豬肝酯酶價格偏高，供生產使用有一定的限制，需通過酶固定化來解決。
球形節稈菌酯酶拆分法，水解率4.0％時，第一菊酸的R(+)-反/R(+)-順＝100，但是，此菌種難以得到，而且未經誘變或基因工程改造的菌株，活力比較低。
本發明的目的在于提供一種手性R(+)-反-第一菊酸的酶拆分制造方法，該方法對目的物手性第一菊酸的選擇性高，而且在生產上可以方便地實施。
本發明提供了一種手性R(+)-反-第一菊酸的酶拆分制造方法，以消旋的(±)-第一菊酸酯為原料，以酯酶為催化劑，催化(±)-第一菊酸酯不對稱水解反應；其特征在于(1)(±)-第一菊酸酯中順式與反式異構體比例在10～90/90～10范圍之間，在反應溶液中(±)-第一菊酸酯濃度在0.1～40％范圍中；(2)酯酶由新鮮豬肝或其他哺乳動物如馬.狗.兔等肝臟或某些細菌或酵母菌提取，活力不低于0.1u/mg，酯酶的用量為底物第一菊酸酯的0.1～10％；(3)加入特定的添加物改變酶反應的微環境，特定添加物選自寡糖、多糖、非離子型表面活性劑之一種或多種，每種添加物在反應體系中的濃度在0.001～0.2％范圍內。
(4)反應介質為無機鹽緩沖溶液、有機鹽緩沖溶液、蒸餾水、脫離子水之一種；(5)水解反應在攪拌或振蕩下進行，水解反應溫度在20～70℃范圍內，水解反應時間6～96小時，控制反應溶液pH在3～11范圍內。
本發明所用的原料為消旋的第一菊酸酯，如(II)所示 R為C1-C4烷基及孟基，其順式與反式比例在10～90/90～10范圍內。
本發明所用的酯酶(EC.3.1.1.1)是由新鮮的哺乳動物(如豬、馬、狗、兔等)的肝臟提取的酯酶粗提物，如日本天野酶公司的產品，美國Sigma化學公司的產品和本實驗室的提取物，或由細菌和酵母菌提取的酯酶粗提物。酯酶活力在0.1-20u(國際單位)/mg范圍內。酯酶可以固態或液態形態使用，可以吸附或共價鍵合方法固定于無機或有機載體上使用，固定化酶便于酶回收反復使用。
本發明所用的特定添加物為寡糖及多糖類化合物(如乳糖、蔗糖、麥芽糖、棉子糖、葡聚糖、瓊脂糖、糊精等)和非離子型表面活性劑(如蓖麻油聚氧乙烯、脂肪醇聚氧乙烯醚、壬基酚聚氧乙烯醚、失水梨糖脂肪酸酯、聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯等)。
本發明中消旋第一菊酸酯的濃度范圍最好為1～10％；添加物的濃度范圍0.01～0.1％；豬肝酯酶的用量最好為底物第一菊酸酯的0.5～5％；水解反應溫度最好為30～50℃，水解反應過程中反應介質的pH最好為6～8。
一般地說為改進酶的功能，如提高酶反應速度和對映體及非對映體選擇性，有二種途徑改變酶反應的微環境或定位改變酶的某些氨基酸殘基(蛋白質工程或基因工程方法)。酯酶為一種糖蛋白，加入寡糖及多糖化合物，可能經過化學誘導作用，提高了酯酶的對映體和非對映體的選擇性。本發明方法所用的特定的改變酶反應微環境的添加物，可以明顯地加快酯酶催化水解第一菊酸酯的水解速度，同時可以提高對映體及非對映體的空間選擇性。水解反應速度可加快一倍以上，R(+)-反-第一菊酸在四種異構體中的含量可提高5-20％。而且，這種通過添加物改變酶反應微環境以提高酶的功能的方法，比之通過化學鍵合改變酶的某些氨基酸殘基以提高酶的功能的方法要簡便得多，更適合工業上應用。總之本發明基于酶催化水解動力學拆分法，使用特定的添加劑改變酶反應的微環境，提高催化水解反應速度和手性第一菊酸的光學活性，為制造手性R(+)-反-第一菊酸提供了一種方便經濟的方法。
下面通過實施例詳述本發明。
水解反應生成的第一菊酸與未水解的第一菊酸酯的含量用高壓液相色譜法測定。產物第一菊酸的四種異構體含量用氣相色譜法測定。
實施例1取10ml，0.1M，PH＝8.0的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液置入一三角瓶中，加入消旋的第一菊酸乙酯(順式/反式＝10/90)1.00g(5.04mM)，非離子型表面活性劑tween80，50mg，豬肝酯酶(Sigma化學公司粗酶，活力20u/mg)10mg，于40℃下振蕩(～200轉/分)反應48小時，加濃鹽酸至PH＜2.0，用4-甲基-2-戊酮萃取(10ml，2次)。萃取液用HPCL法(C18柱，6.4×200mm，甲醇/水＝11，PH＝3.0，1ml/min，254nm)，測定反應生成的第一菊酸和未水解的第一菊酸乙酯的含量，由之計算水解率為25.71％。之后，向萃取液中加入等體積1NNaOH水溶液，搖動分相，使水解生成的第一菊酸形成鈉鹽進入水相，第一菊酸乙酯留在有機相中。水相再用36％鹽酸酸化，調到PH＜2.0再用4-甲基-2-戊酮萃取第一菊酸。真空除去萃取溶劑(回收)，得第一菊酸240mg，對水解率25.71％應得的第一菊酸計，收率為93.35％。第一菊酸的四個異構體含量用GC法測定(10％QF-1柱，5m，氫火焰鑒測器)。取第一菊酸樣品50mg，加等克分子的氯化亞砜、吡啶和(-)-孟醇的甲苯溶液，于100℃回流1小時衍生化后，進行測定，得到R(+)-反-第一菊酸80.09％，S(-)-反-第一菊酸19.91％，沒檢測出S(-)和R(+)的順式第一菊酸。
實施例2取豬肝酯酶液(日本天野制藥公司產品，85u/ml)1ml，tween80 50mg，右旋糖苷100mg加入到10ml，0.1MNaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液(pH8.0)中，搖勻，加入消旋的第一菊酸乙酯(順式/反式＝10/90)1.0g(5.05mM)，于40℃，振蕩(～200轉/分)反應48小時。按實施例1所述方法，測定水解率9.64％，得第一菊酸88mg，對此水解率下應得之第一菊酸(96.4mg)計，收率91.29％；測定第一菊酸結晶的四種異構體的含量為R(+)-反-第一菊酸75.35％，S(-)-反-第一菊酸24.65％，R(+)和S(-)-順-第一菊酸0％。
實施例3取豬肝酯酶(Sigma化學公司粗酶，20u/mg)10mg，乳糖50mg，加入到10ml 0.1MNaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液(pH8.0)中，搖勻后，加入消旋的第一菊酸乙酯(順式/反式＝10/90)1.0g(5.05mM)，于40℃，振蕩(～200轉/分)反應48小時。按實施例1所述的方法，測定水解率為13.83％，得第一菊酸結晶128mg，對此水解率下應得第一菊酸量計，收率為92.55％；測定第一菊酸的四個異構體的含量為R(+)-反-第一菊酸72.28％，S(-)-反-第一菊酸27.72％，R(+)和S(-)-順-第一菊酸0％。
實施例4取細菌酯酶(來源于Candida lipolytica菌，Fluka化學公司產品，0.1u/mg)10mg，Tween80 50mg，加入到10m10.1MNaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液(pH8.0)中，搖勻后，加入消旋的第一菊酸乙酯(順式/反式＝10/90)1.0g(5.05mM)，于40℃，振蕩(～200轉/分)反應48小時。按實施例1所述的方法，測定水解率為10.11％，得第一菊酸結晶81mg，對此水解率下應得第一菊酸量計，收率為80.19；測定第一菊酸的四個異構體的含量為R(+)-反-第一菊酸80.38％，S(-)-反-第一菊酸19.62％，R(+)和S(-)-順-第一菊酸0％。
比較例1取10ml，0.1MNaH2PO4～Na2HPO4緩沖溶液(pH8.0)置入一三角瓶中，加入消旋的第一菊酸乙酯(順式/反式＝10/90)1.0g(5.05mM)，搖勻，再加入豬肝酯酶(Sigma化學公司粗酶，活力20u/mg)10mg，于40℃下振蕩(～200轉/分)反應48小時。按實施例1所述的方法，測定水解率為9.77％，得第一菊酸90mg，對此水解率下應得之第一菊酸量計，收率為92.12％。測定第一菊酸的四個異構體的含量為R(+)-反-第一菊酸68.22％，S(-)-反-第一菊酸31.78％，R(+)和S(-)-順-二氯菊酸0％。
比較例2取豬肝酯酶液(天野制藥公司，85u/ml)1ml，加入到10ml 0.1MNaH2PO4～Na2HPO4緩沖溶液(pH8.0)中，加入消旋的第一菊酸乙酯(順式/反式＝10/90)1.0g(5.05mM)，于40℃下振蕩(～200轉/分)反應48小時。按實施例1所述的方法，測定水解率為4.88％，得第一菊酸結晶42mg，對此水解率下應得第一菊酸量計，收率為86.07％。測定第一菊酸的四個異構體的含量為R(+)-反-第一菊酸52.20％，S(-)-反-第一菊酸47.50％，R(+)和S(-)-順-第一菊酸0.30％。
權利要求
1.一種手性R(+)-反-第一菊酸的酶拆分制造方法，以消旋的(±)-第一菊酸酯為原料，以酯酶為催化劑，催化(±)-第一菊酸酯不對稱水解反應；其特征在于(1)(±)-第一菊酸酯中順式與反式異構體比例在10～90/90～10范圍之間，在反應溶液中(±)-第一菊酸酯濃度在0.1～40％范圍中；(2)酯酶由新鮮豬肝或其他哺乳動物如馬.狗.兔等肝臟或某些細菌或酵母菌提取，活力不低于0.1u/mg，酯酶的用量為底物第一菊酸酯的0.1～10％；(3)加入特定的添加物改變酶反應的微環境，特定添加物選自寡糖、多糖、非離子型表面活性劑之一種或多種，每種添加物在反應體系中的濃度在0.001～0.2％范圍內。(4)反應介質為無機鹽緩沖溶液、有機鹽緩沖溶液、蒸餾水、脫離子水之一種；(5)水解反應在攪拌或振蕩下進行，水解反應溫度在20～70℃范圍內，水解反應時間6～96小時，控制反應溶液pH在3～11范圍內。
2.按照權利要求1所述手性R(+)-反-第一菊酸的酶拆分制造方法，其特征在于所述寡糖、多糖為蔗糖、麥芽糖、乳糖、棉子糖、葡聚糖、瓊脂糖、糊精；所述非離子型表面活性劑為蓖麻油聚氧乙烯、脂肪醇聚氧乙烯醚、壬基酚聚氧乙烯醚、失水山梨糖脂肪酸酯、聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯。
3.按照權利要求1所述手性R(+)-反-第一菊酸的酶拆分制造方法，其特征在于所述無機鹽緩沖溶液為磷酸鹽、碳酸鹽、硼酸鹽緩沖溶液；有機鹽緩沖溶液為甘氨酸-氫氧化鈉、巴比妥鈉-鹽酸、Tris-鹽酸等緩沖溶液。
4.按照權利要求1所述手性R(+)-反-第一菊酸的酶拆分制造方法，其特征在于所述酯酶經吸附或共價結合的方法固定化后重復使用。
5.按照權利要求1或2所述手性R(+)-反-第一菊酸的酶拆分制造方法，其特征在于添加物的濃度范圍為0.01～0.1％。
6.按照權利要求1所述手性R(+)-反-第一菊酸的酶拆分制造方法，其特征在于消旋第一菊酸酯的濃度范圍為1～10％。
7.按照權利要求1所述手性R(+)-反-第一菊酸的酶拆分制造方法，其特征在于豬肝酯酶的用量為底物第一菊酸酯的0.5～5％。
8.按照權利要求1所述手性R(+)-反-第一菊酸的酶拆分制造方法，其特征在于水解反應溫度在30～50℃，水解反應過程中反應介質的pH在6～8。
全文摘要
一種手性R(+)－反－第一菊酸的酶拆分制造方法,以消旋的(±)－第一菊酸酯為原料,以酯酶為催化劑,催化(±)－第一菊酸酯不對稱水解反應;其特征在于:加入特定的添加物改變酶反應的微環境,特定添加物選自寡糖、多糖、非離子型表面活性劑之一種或多種,每種添加物在反應體系中的濃度在0.001～0.2%范圍內。本發明對目的物手性第一菊酸的選擇性高,而且在生產上可以方便地實施。
文檔編號C07C61/00GK1334344SQ0011066
公開日2002年2月6日 申請日期2000年7月13日 優先權日2000年7月13日
發明者邵昌平, 劉韌, 潘桂芝, 韓梅, 鄭卓 申請人:中國科學院大連化學物理研究所