專利名稱：從植物黃花蒿中分離化合物東莨菪亭的方法
技術領域：
本發明涉及一種從植物黃花蒿(Artemisia annua)和其它植物科中分離用作氧化氮合成抑制劑的化合物東莨菪亭的方法。東莨菪亭屬于香豆素類化合物。東莨菪亭(7-羥基-6-甲氧基香豆素)是苯并-α-吡喃酮香豆素的一種衍生物，已發現它在植物中以游離狀態和苷類兩種形式存在。
天然香豆素類對活的生物體具有不同的和顯著的作用。香豆素類具有許多藥理和生理活性如抗菌、血管舒張和利尿作用、抗凝血特性、保護肝臟和呼吸興奮。東莨菪亭顯示出了非常好的生長抑制特性(Shilling D G和Yoshikawa F,Amerchem.Soc.Symp Series,330:335-342)。最近據報導東莨菪亭在鼠的巨噬細胞中顯示出了對氧化氮(NO)合成的抑制作用。巨噬細胞在最終防御感染和腫瘤發展方面起重要作用，并且這種活性是通過產生幾種中間物來調節的。巨噬細胞產生氧化氮能夠調節殺死腫瘤細胞、細菌、真菌和寄生蟲或其生長抑制劑。所以開發一種有效并經濟的東莨菪亭的來源、iNOs的抑制劑對將來進行有效治療和商業應用是有價值的(Tai-Hyun Kang等東莨菪亭來自矮蒿中的一種可誘發NO合成抑制性活性組份，P1anta Media,65:400-403,1999；來自Ttraxinus rhynchobhyeli的體外可誘發NO合成抑制性活性成分，PlantMedia,65:656-658,1999)。
東莨菪亭廣泛分布于植物王國中并可從植物的不同部位(根、果、葉、莖等)中分離得到，但發現幾種相關成分經常的共存從而使得分離困難。通常，香豆素類的分離最初取決于用極性遞增的溶劑對干燥植物進行的連續提取，常用的溶劑為石油醚(pet ether)、苯、乙醚、丙酮或甲醇。
用于分離香豆素類的常規方法是用95％甲醇/乙醇提取干燥的粉狀物質并用10％堿性溶液處理濃縮過的提取液。用乙醚提取堿性溶液以除去脂肪物質。酸化含水溶液并用乙醚或氯仿提取得到粗的香豆素類。通過硅膠或礬土的柱層析法進一步純化得到純的香豆素類。用升華方法能夠從植物組織中分離到特定的香豆素類(如umbilliferon、東莨菪亭)(Abu-Mustafa,E.A.；E1-Tawil,B.A.H.和M.B.E.Fayez；Phytochemistry,3,701(1964))。
盡管如此，通過酸堿處理分離香豆素的方法還是不理想的，這是因為幾乎不能防止某些香豆素類的降解，從而導致分離出的是人工產物而不是原始的化合物或者造成化合物損失。在另外一種方法中，通過升華進行的純化包括形成人工產物的熱降解。總回收量下降。因此未曾報道過用于商業開發的高東莨菪亭含量的植物和任何大規模分離東莨菪亭的方法。
本發明的一個目的是開發具有高東莨菪亭含量的新植物/植物部位。
本發明的另一目的是選擇用于選擇性提取東莨菪亭的溶劑。
本發明的又一目的是開發一種分離純東莨菪亭的經濟的方法。
因比，本發明提供了一種從植物黃花蒿和其他植物科中分離氧化氮合成抑制劑化合物東莨菪亭的方法，它包括用含水乙腈溶劑提取粉狀植物部位，用氯化溶劑分配，在蒸發溶劑、殘余物層物和結晶之后得到純東莨菪亭。方法的新穎性1．選擇提取東莨菪亭的植物部位，提高了產量并減少了工藝成本。
2．用含水乙腈提取該植物部位比使用其他極性溶劑如甲醇或乙醇更經濟并具有更優的東莨菪亭產量。
3．在該方法中，通過避免任何酸堿處理來分離東莨菪亭從而提高產量。
4．將東莨菪亭選擇性地從含水提取液轉到鹵化的非極性相中，從而易于純化和分離純的東莨菪亭。
5．在層析前純化粗提取物得到50％的東莨菪亭結晶。
6．該方法可以重復使用溶劑和硅膠。
7．這些優點是對大規模生產東莨菪亭來說具有顯著的經濟價值。
本發明提供了一種從黃花蒿和其他植物科中分離用作氧化氮合成抑制劑的化合物東莨菪亭的方法，該方法包括a)以1∶5的比例用含水乙腈溶劑提取不同植物部位的干燥粉狀物6-8小時，b)真空濃縮提取過的溶劑到其原始提取液的30％，c)用鹵化溶劑分配濃縮的提取液從而把東莨菪亭轉入非極性鹵化溶劑中，d)在無水硫酸鈉上把鹵化溶劑干燥并蒸發溶劑，e)在甲醇中將殘余物結晶并過濾晶體，f)濃縮濾液并在硅膠上進行層析，g)在氯仿甲醇混合液中洗脫東莨菪亭，結晶含有東莨菪亭的級分得到純的東莨菪亭化合物。
在本發明的一個實施方案中，選用黃花蒿植物來分離東莨菪亭。據報導西班牙的黃花蒿的ariel部位含有0.02％東莨菪亭而英國的(cult)含有0.034％東莨菪亭。據報導中國的整株植物都有東莨菪亭(Brown,G.D.源于黃花蒿的兩種新化合物J.Nat.Prod.58,300(1992)；Marco,J.A.；Sawz,J.F.；Bea,J.F.；Barber,O.黃花蒿中的酚類組份Pharmazie 45,382-383(1990)；Liu,H.M.；Li,G.L.,Wu,H.Z.青蒿成分的研究藥學學報，37,129-143(1979))。
在印度CIMAP,Lucknow已經開發了一種產生高含量青蒿素和生物量(莖和葉)的新種黃花蒿“Jeevan raksha”。據報導青蒿素及其衍生物可以作為對氯喹等多種藥物耐受的和嚴重的復雜瘧疾的有效藥。黃花蒿植物是青蒿素的唯一來源。
采用HPLC對新種黃花蒿植物的所有三個主要部位的東莨菪亭含量進行篩選。在不同部位得到的東莨菪亭的含量為葉0.2％、莖0.3％和根0.004％。東莨菪亭的產量比其他報道的植物的高很多。植物黃花蒿的莖由于不含青蒿素而被視為廢物。植物莖部分的生物量是葉的五倍多。所以，我們已經選擇植物花黃蒿的莖部位分離東莨菪亭。也發現莖的莖髓部分含有較少的有色和脂肪物質，這使分離和純化東莨菪亭變得容易。
在現有技術中，已經發現使用非極性溶劑提取植物原料，會導致香豆素類回收量減少。而且，用于提取香豆素類的極性溶劑(甲醇和乙醇)會得到更多量的具有較多有色和脂肪物質的總提取物。分離脂肪和有色物質是一件困難的工作。在本發明中，我們選擇了含水乙腈溶劑來提取，從而得到更多量的含有較少有色和脂肪物質的東莨菪亭。同時也使得從乙腈中分離水來回收純的溶劑用于重復利用變得非常容易。
在現有技術中，從粗提取物中通過酸堿處理或者通過升華方法純化東莨菪亭，由于它的重排和熱分解的原因導致了東莨菪亭產量的減少。在本發明改良的方法中，通過用氯化溶劑(四氯化碳、二氯甲烷、氯仿)分配含水相選擇性地將香豆素類從含水提取液轉入非極性相中。采用該步驟，把大多數有色和脂肪物質留在了極性相中，從而在非極性相中富集了在粗提取液中自身容易結晶(50-60％)的東莨菪亭。結晶后留在母液中的東莨菪亭只以1∶10的比例經過硅膠柱層析法來完成純東莨菪亭的分離。把東莨菪亭從含水提取液中分配到非極性溶劑減少了60-70％的粗提取液的容積，從而減少了該方法中硅膠和溶劑的用量。
該方法由下列操作組成1．在陰暗處干燥和研碎黃花蒿的莖。2．通過冷滲法用含水乙腈溶劑提取粉狀黃花蒿莖。3．真空濃縮總提取液。4．用鹵化溶劑分配含水乙腈相。5．從總鹵化提取液中除去水分。6．蒸餾鹵化溶劑得到殘余提取液。7．從殘余提取液中結晶東莨菪亭。8．過濾并濃縮母液。9．在硅膠柱上層析母液獲得純東莨菪亭。
本發明提供了一種從植物黃花蒿中提取和分離東莨菪亭的方法以克服現存方法的缺陷。本發明更具體地提供了一種從天然原料中獲得更為便宜和更高產量的氧化氮合成抑制劑化合物東莨菪亭的方法。
所以，本發明提供了一種從黃花蒿中提取和分離東莨菪亭的方法，該方法包括以1∶5的比例用含水乙腈溶劑提取植物部位，優選為黃花蒿的干燥莖粉；真空濃縮提取液，用非極性鹵化溶劑分配經濃縮的提取液，蒸發鹵化溶劑，在甲醇中結晶殘留物，過濾東莨菪亭，濃縮母液并在硅膠上層析得到純東莨菪亭。
在本發明的一個實施方案中，用于提取的溶劑選自1∶9到9∶1的不同比例的乙腈∶水。
在本發明的另一個實施方案中，用于分配的鹵化溶劑選自二氯甲烷、四氯化碳、氯仿等。在本發明的又一個實施方案中，提取東莨菪亭的植物部分選自莖、葉、根等。
在本發明的又一個實施方案中，在硅膠上分離東莨菪亭，其粗提取液與硅膠之比選自1∶5到1∶20，優選為1∶5,1∶10或1∶20。
下列實施例中所提供的本發明的細節只是用于詳細說明而不是為了限定本本發明的又一個實施方案中，從植物科如傘形科、蕓香科、菊科、豆科、桑科、石竹科等提取和分離東莨菪亭。
在本發明又一實施方案中，東莨菪亭是在選自氯仿、丙酮、甲醇及其混合物的溶劑中結晶的。
在本發明的另一個實施方案中，從黃花蒿不同部位分離的東莨菪亭是莖中0.25-0.30％，葉中0.16-0.20％和根中0.003-0.004％。
實施例-1選擇提取的植物部位對黃花蒿不同部位(葉、莖、根)中東莨菪亭含量進行了對比研究。用甲醇提取0.1gm的干粉樣品。過濾提取液并將溶劑蒸干。把提取物溶于1ml的甲醇中。在下列操作條件下采用配有光二極管陣列檢測器的LC8A Shimadzu HPLC對每個樣品中東莨菪亭的含量進行評估流動相乙腈水(30∶70)；流動速率0.8ml/min，在230nm處檢測，柱-C18 Lichrosorb,10um Merck德國。用配制成1mg/5ml甲醇的標準東莨菪亭溶液的標準曲線進行定量。在不同植物部位中評估的東莨菪亭含量如下葉(0.16)，莖(0.2)和根(0.003)。
實施例-2選擇提取溶劑用10ml的不同溶劑(二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、甲醇、乙腈、水、甲醇∶水(9∶1)、乙醇∶水(9∶1)和乙腈∶水(9∶1))提取黃花蒿的莖粉狀樣品(0.1gm),冷滲24小時。過濾各提取液并真空蒸發。將各提取物溶于1ml的HPLC級的甲醇中并用實施例-1中所述的HPLC方法評估東莨宕亭的含量。在不同溶劑中記錄的黃花蒿莖中的東莨菪亭含量如下二氯甲烷(0.016％)、氯仿(0.16％)、乙酸乙酯(0.09％)、甲醇(0.2％)、乙醇(0.24％)、乙腈(0.22％)、水(0.28％)、甲醇∶水(9∶1；0.16％)、乙醇∶水(9∶1；0.23％)和乙腈∶水(9∶1；0.30％)。
實施例-3從莖中提取和分離東莨菪亭把黃花蒿莖研成粉狀。用10％的含水乙腈(5×500ml)在滲濾器中提取粉狀物質(100gm)6-8小時。把總提取液真空濃縮到其最初量的30％。用氯仿(5×200ml)分配濃縮過的含水提取液。在無水硫酸鈉上干燥氯仿提取液并蒸發溶劑得到殘余物2.0gm。把殘余物再溶于25ml甲醇中并在冰箱中放置4-5小時結晶。過濾晶體化合物并干燥得到純東莨菪亭。結晶步驟重復兩次得到60％的純化合物。以(1∶20)的比例硅膠柱色譜法分離濾液中的剩余東莨菪亭，采用4％的甲醇氯仿溶液洗脫。蒸發含有東莨菪亭的級分并結晶得到純東莨菪亭。從100gm含有0.3％東莨菪亭含量的莖粉中得到85％的純東莨菪亭。用mp,IR,1H,13C NMR和質譜數據來鑒別該東莨菪亭，如文獻中報道的那樣。
實施例-4從莖中提取和分離東莨菪亭把黃花蒿莖研成粉狀。在滲濾器中用30％的含水乙腈(5×500ml)對粉狀物質(100gm)提取6-8小時。把總提取液真空濃縮到其最初量的30％。用氯仿(5×200ml)分配濃縮過的含水提取液。在無水硫酸鈉上干燥氯仿提取液并蒸發溶劑得到2.1gm。把殘余物再溶于25ml甲醇中并在冰箱中放置4-5小時結晶。過濾晶體化合物并干燥得到純東莨菪亭。結晶步驟重復兩次得到50％的純化合物。用(1∶10)的比例硅膠柱色譜法分離濾液中的剩余東莨菪亭，用2％的甲醇氯仿溶液洗脫。蒸發含有東莨菪亭的級分并結晶得到純東莨菪亭。從100gm含有0.3％東莨菪亭含量的莖粉中分離得到82％的純東莨菪亭。
實施例-5從莖中提取和分離東莨菪亭把黃花蒿莖研成粉狀。在滲濾器中用70％的含水乙腈(5×500ml)對粉狀物質(100gm)進行提取6-8小時。把總提取液真空濃縮到其最初量的30％。用氯仿(5×200ml)分配濃縮過的含水提取液。在無水硫酸鈉上干燥氯仿提取液并蒸發溶劑得到殘余物2.30gm。把殘余物再溶于25ml甲醇中并在冰箱中放置4-5小時結晶。過濾晶體化合物并干燥得到純東莨菪亭。結晶步驟重復兩次得到40％的純化合物。以(1∶5)的比例硅膠柱色譜法分離濾液中的剩余東莨菪亭，用氯仿洗脫東莨菪亭。蒸發含有東莨菪亭的級分并結晶得到純東莨菪亭。從100gm含有0.3％東莨菪亭含量的莖粉中分離得到80％純東莨菪亭。
實施例-6從葉中提取和分離東莨菪亭把黃花蒿葉研成粉狀。用己烷(5×400ml)給粉狀物質(100gm)脫脂。給葉脫脂后，再在滲濾器中用70％含水乙腈(5×500ml)對剩余的殘渣提取6-8小時。把總提取液真空濃縮到其最初量的30％。用氯仿(5×200ml)分配濃縮過的含水提取液。在無水硫酸鈉上干燥氯仿提取液并蒸發溶劑得到殘余物2.0gm。把殘余物再溶于25ml甲醇中并在冰箱中放置4-5小時結晶。過濾晶體化合物并干燥得到純東莨菪亭。結晶步驟重復兩次得到30％的純化合物。以(1∶20)的比例的硅膠柱色譜法分離濾液中的剩余東莨菪亭，用4％的甲醇氯仿溶液洗脫。蒸發含有東莨菪亭的級分并結晶得到純東莨菪亭。從100gm含有0.23％東莨菪亭含量的葉粉中得到80％的純東莨菪亭。
本發明的主題提取和分離東莨菪亭的方法具有許多優點。1．在該方法中避免使用會減少東莨菪亭含量的現有技術中分離總香豆素類所用的酸堿處理。2．用含水乙腈溶劑提取比用其他極性溶劑如甲醇、乙醇和水的提取更經濟并且東莨菪亭的產量更高。3．由于在層析前50％的東莨菪亭結晶，所以硅膠量已經減少。4．該方法可以使溶劑重復使用。5．選擇植物莖進行提取提高了東莨菪亭的產量并減少了生產成本，這是因為黃花蒿莖中不含青蒿素，因而它是一種廢物。6．莖中東莨菪亭的含量高，在蒿屬植物中莖生物量是葉的五倍并且在莖部位中含有較少的有色物質，使純化簡單。7．該優點對從黃花蒿中大規模生產東莨菪亭來說具有顯著經濟價值。
權利要求
1.一種從黃花蒿和其他植物科中分離用作氧化氮合成抑制劑的化合物東莨菪亭的方法，該方法包括a)以1∶5的比例用含水乙腈溶劑提取不同植物部位的干燥粉狀物6-8小時，b)真空濃縮提取過的溶劑到其原始提取液的30％，c)用鹵化溶劑分配濃縮的提取液從而把東莨菪亭轉入非極性鹵化溶劑中，d)在無水硫酸鈉上把鹵化溶劑干燥并蒸發溶劑，e)在甲醇中將殘余物結晶并過濾晶體，f)濃縮濾液并在硅膠上進行層析，g)在氯仿甲醇混合液中洗脫東莨菪亭，結晶含有東莨菪亭的級分得到純的東莨菪亭化合物。
2．按照權利要求1的方法，其中其他植物科為傘形科、蕓香科、菊科、豆科、桑科、石竹科等。
3．按照權利要求1的方法，其中用于提取的植物部位選自莖、葉、根等。
4．按照權利要求1的方法，其中乙腈-水溶劑比為9∶1到1∶9。
5．按照權利要求1的方法，其中鹵化溶劑選自氯仿、二氯甲烷、四氯化碳等。
6．按照權利要求1的方法，其中在選自氯仿、丙酮、甲醇及其混合物的溶劑中結晶東莨菪亭。
7．按照權利要求1的方法，其中通過硅膠柱層析法從母液中得到東莨菪亭，其中粗提取液與硅膠的比的范圍為1∶5到1∶20，優選為1∶5、1∶10或1∶20。
8．按照權利要求1的方法，其中從黃花蒿不同部位分離的東莨菪亭的范圍為莖中0.25-0.30％，葉中0.16-0.20％和根中0.003-0.004％。
全文摘要
從黃花蒿和其他植物科中分離用作氧化氮合成抑制劑的化合物東莨菪亭的方法,包括用含水乙腈溶劑以1∶5的比例提取不同植物部位的干燥粉狀物6—8小時,真空濃縮所提取的溶劑到原始提取液的30%,用鹵化溶劑分配濃縮的提取液從而把東莨菪亭轉入非極性鹵化溶劑中,在無水硫酸鈉上把鹵化溶劑干燥并蒸發溶劑,在甲醇中將殘余物結晶并過濾晶體,濃縮濾液并在硅膠上層析,用氯仿甲醇混合液洗脫東莨菪亭,結晶含有東莨菪亭的級分得到純的東莨菪亭化合物。
文檔編號C07D311/16GK1315324SQ00108330
公開日2001年10月3日 申請日期2000年3月30日 優先權日2000年3月30日
發明者D·C·杰恩, N·潘特, M·M·谷普塔, R·S·布哈庫尼, R·K·威馬, S·坦多恩, S·K·谷普塔, A·特瓦里, A·P·卡霍爾, S·庫馬 申請人:科學與工業研究會