一種微生物復合肥及其制備

一種微生物復合肥及其制備
【專利摘要】本發明公開了一種微生物復合肥，重量份數組成為：植物乳桿菌混合菌劑8?20份,混合曲霉培養物10?20份，枯草芽孢桿菌培養物8?15。本產品使用方法簡單，每畝地使用量0.2?0.5公斤，成本僅為80?100元/畝，拌種或生長期灌水前地表噴灑。CGMCC No.940520140702CGMCC NO.1176320151130
【專利說明】
-種微生物復合肥及其制備
技術領域
[0001] 本發明設及一種復合肥，屬于農用肥料技術領域。
【背景技術】
[0002] 微生物肥的功效發揮主要是通過對傳統化肥、有機肥的增效作用，對±壤的改良 活化作用，W及微生物的生理作用等方式來實現的。因此，微生物肥料就有了化肥、有機肥、 有益生物菌的多種肥力和功效，是活化肥料養分、提高肥料效果、改良作物品質、促進農業 增產增效的理想肥料。微生物肥料是活體肥料，它的作用主要靠它含有的大量有益微生物 的生命活動來完成。只有當運些有益微生物的生命活動來完成。只有當運些有益微生物處 于旺盛的繁殖和新陳代謝的情況下，物質轉化和有益代謝產物才能不斷形成。因此，微生物 肥料中有益微生物的種類、生命活動是否旺盛是其有效性的基礎，而不像其它肥料是W氮、 憐、鐘等主要元素的形式和多少為基礎。正因為微生物肥料是活制劑，所W其肥效與活菌數 量、強度及周圍環境條件密切相關，包括溫度、水分、酸堿度、營養條件及原生活在±壤中± 著微生物排斥作用都有一定影響。
[0003] 一株產耐高溫a-淀粉酶的枯草芽抱桿菌，申請號:201310566374.5.本發明公開了 一株產耐高溫Q-淀粉酶的枯草芽抱桿菌，所述枯草芽抱桿菌(Baci Ilussubti Iis )Li-2013- 02于2013年7月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、(CGMCC)，保藏 號為CGMCCNo. 7926。該菌株產耐高溫a-淀粉酶的枯草芽抱桿菌Li-2010經紫外線-氯化裡- 硫酸二乙醋復合誘變篩選獲得，該菌株具有強耐酸、耐熱性，產酶活力高的特點，應用前景 非常廣闊。一株高產纖維素酶的黑曲霉.申請號：201310571925.7.本發明公開了一株高產 纖維素酶的黑曲霉，本發明屬于黑曲霉領域，特別設及高產纖維素酶的黑曲霉菌株。本發明 所提供的黑曲霉(Aspergi Ilusniger )，該菌株保藏于中國普通微生物菌種保藏管理委員會 普通微生物中屯、，保藏編號為CGMCCNo. 7927。發酵罐實驗跟蹤的各項性能指標表明，該菌株 代謝正常，產纖維素酶能力強，是一株優良的纖維素酶高產菌株。
[0004] 由于我國長期在微生物肥料方面研究缺乏投入，使得我國的微生物肥料產業依然 存在整體水平不高、技術創新不足、產品質量與應用效果表現欠穩定的問題。在農業可持續 發展已成為人類共識的今天，運些問題成了微生物肥行業函待打通的"瓶頸"。

【發明內容】

[0005] 本發明所要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種微生物復合肥：
[0006] 重量份數組成為:植物乳桿菌混合菌劑8-20份，混合曲霉培養物10-20份，枯草芽 抱桿菌培養物8-15;
[0007] 所述混合曲霉培養物的組成及重量份數如下：黑曲霉培養物5-9份，泡盛曲霉培養 物1-3份；
[000引所述黑曲霉(Aspergillus niger)為CGMCC NO.7927。
[0009]植物乳桿菌混合菌劑組成及重量份數如下:植物乳桿菌CGMCC 9405菌粉1-2份，植 物乳桿菌CGMCC 11763菌粉5-8份；
[0010] 所述枯草芽抱桿菌培養物制備:從斜面轉接培養枯草芽抱桿菌，逐級擴培后的種 子液轉接入發酵罐中，發酵完畢發酵液經過板框過濾、干燥后獲得枯草芽抱桿菌培養物。
[0011] 植物乳桿菌劑的制備方法:從斜面轉接培養植物乳桿菌，逐級擴培后的種子液轉 接入發酵罐中，發酵完畢發酵液經低溫負壓真空濃縮到原體積的45%，得到菌濃縮液。添加 載體：向濃縮液中添加混合好的載體，混合均勻;濃縮液與載體的重量比為0.5-0.6:1，載體 組成為:化C〇3 20-30份，糊精10-15份。流化床干燥，干燥溫度50°C。
[0012] 泡盛曲霉培養物制備:菌種培養，固體發酵培養:抱子液接種到米曲霉固態發酵培 養料中，26-33 °C培養至菌絲長滿培養料，低溫流化床干燥，粉碎干燥物。
[0013] 黑曲霉培養物制備:菌種培養，采用常見固體發酵培養方法制備:抱子液接種到固 態發酵培養料中，26-33 °C培養至菌絲長滿培養料，干燥，粉碎干燥物。
[0014] 有益效果
[0015] 本發明的肥料能夠增強作物的抗旱能力。本發明的肥料由復合微生物發酵而成， 能夠改善±壤的微生態環境，為農作物的生長提供有益條件。本發明的肥料能夠改良±壤。 肥料中有益微生物能產生糖類物質，占±壤有機質的0.1%，與植物粘液，礦物胚體和有機 膠體結合在一起，可W改善±壤團粒結構，增強±壤的物理性能和減少±壤顆粒的損失，在 一定的條件下，還能參與腐殖質形成。所W施用微生物肥料能改善±壤物理性狀，有利于提 高±壤肥力。
[0016] 本產品使用方法簡單，每畝地使用量0.2-0.5公斤，成本僅為80-100元/畝，拌種或 生長期灌水前地表噴灑。
【具體實施方式】
[0017] 下面通過具體的實施方案敘述本發明。除非特別說明，本發明中所用的技術手段 均為本領域技術人員所公知的方法。另外，實施方案應理解為說明性的，而非限制本發明的 范圍，本發明的實質和范圍僅由權利要求書所限定。對于本領域技術人員而言，在不背離本 發明實質和范圍的前提下，對運些實施方案中的物料成分和用量進行的各種改變或改動也 屬于本發明的保護范圍。
[0018] 本發明中植物乳桿菌CGMCC 9405菌株特點如下：在顯微鏡下觀察，該菌株為短桿 狀，革蘭氏染色呈陽性，無鞭毛，不產芽抱;在固體培養基上，該菌菌落為白色，表面光滑，致 密，形態為圓形，邊緣較整齊。
[0019] 理化特征為:過氧化氨酶(-)，明膠液化(-)，嗎I噪實驗( + )，運動性(-)，發酵產氣 (-)，亞硝酸鹽還原(-)，發酵產氣(-)，產硫化氨氣體(-),PH4.0MRS培養基中生長(+ )。
[0020] 本發明植物乳桿菌采用下述流程進行選育：
[0021] 原始出發菌種^試管活化^硫酸二乙醋(DES)誘變^亞硝基脈(NTG)誘變^等離 子體誘變^平板初篩^搖瓶復篩^傳代穩定性試驗。
[0022] 本發明所采用的出發菌株在MRS葡萄糖培養基中，其乳酸的生產速率為1.5g/L/d, 當培養基pH為3.5時幾乎停止生長，對亞硝酸鋼的分解速率為0.34mg/h/kg白菜。出發菌株 為李政采集于寧夏鹽池縣育肥羊場的青儲飼料，采集時間2013年9月15日。
[0023] 為了提高其乳酸生產速率、耐酸能力和亞硝酸鹽的分解速率，依次采用DES和NTG 技術對該菌種進行誘變，誘變后菌株采用MRS碳酸巧平板進行初篩，然后采用500mL搖瓶發 酵，生物傳感器分析儀對高產菌進行復篩，選育優良的植物乳桿菌菌株，然后做傳代實驗， 評價其遺傳穩定性。
[0024] 植物乳桿菌tlj-2014遺傳穩定性結果表明：經過連續傳代十次，各項性能指標都 比較穩定，遺傳性較好，性狀沒有回復，因此把植物乳桿菌tlj-2014作為選育得到的目的菌 株。
[0025] 經驗證發現:該誘變菌株的乳酸生產速率可W達到35g/L/d，該菌株經過71小時發 酵后乳酸濃度達到95g/l;能夠在pH為1.80的條件下存活。降解亞硝酸鹽速度快，分解能力 達到9.8mg/h/kg(自然發酵過程亞硝酸鹽積累的速率大約為1. Img/h/kg)，能夠耐1%膽鹽。
[0026] 因此采用該菌種生產泡菜，整個發酵過程中亞硝酸鹽濃度在5mg/kgW下，遠低于 國家標準GB2714-2003中規定的含量(20mg/kg)。
[0027] 植物乳桿菌(Xactobaci Ilus plantarum) tlj-2014,該菌株已于2014年7月2 日保 藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、（簡稱CGMCC，地址為：中國北京市朝 陽區北辰西路1號院3號，郵編：100101),保藏號為CGMCC NO.9405。
[0028] 1. DES誘變選育
[0029] 1)在超凈臺上取試管斜面上的植物乳桿菌L 一環，接入裝有50mL培養基MRS(無瓊 月旨，葡萄糖20g/L)培養基的250血S角瓶中，200巧m，37°C培養1化左右，使菌體處于對數生 長前期。
[0030] 2)取5mL菌液，500化pm離屯、IOmin收集菌體，用生理鹽水洗涂2次。
[0031] 3)用PH7.0憐酸緩沖液稀釋成IO7個/mL菌懸液。
[0032] 4)取32血PH7.0的憐酸鐘緩沖液、SmL菌懸液、0.4mL DES在預先放入轉子的150mL S角瓶中充分混合，使DES最終濃度為1 % (v/v)。
[0033] 5)在37°C搖床中150rpm反應30min，取ImL混合液，加入0.5mL 25%化2S2O3溶液中 止反應。
[0034] 6)適當稀釋，取最后稀釋度的菌液0.2mL，涂布于碳酸巧篩選培養基(含lOOg/L葡 萄糖的碳酸巧MRS培養基)平皿中。在37°C培養2~3天后，采用影印法將該篩選平板的菌株 轉印到抑為1.5、1.8和2.0的LPHMRS培養基(低抑值改性MRS培養基)上和亞硝酸鋼篩選培養 基(單一氮源為2g/L亞硝酸鋼的改性MRS篩選培養基)上。
[0035] 7)在37 °C培養2~3天后，挑選菌落較大，分別能在LPHMRS培養基、亞硝酸鋼篩選培 養基上生長并且在碳酸巧篩選培養基上。經初步篩選，挑取出的菌落命名為植物乳桿菌L1。
[0036] 2.亞硝基脈誘變
[0037] 1)在超凈臺上取試管斜面上的植物乳桿菌Ll 一環，接入裝有50mL培養基MRS(無瓊 月旨)培養基(葡萄糖濃度為60g/L)的250血S角瓶中，200巧m，37°C培養1化左右，使菌體處于 對數生長前期。
[0038] 2)取5mL菌液5000巧m離屯、IOmin收集菌體，用生理鹽水洗涂2次。
[0039] 3)用抑6.0憐酸緩沖液稀釋成IO7個/血菌懸液。
[0040] 4)取10血菌懸液轉移至IOOmL^角瓶中，加入IOmg的NTG，配制成終濃度為lOmg/mL 的NTG溶液，并加入4-5滴丙酬，W利于NTG溶解。
[0041 ] 5)在37°C下200rpm振蕩反應30min，5000rpm離屯、IOmin收集菌體，用無菌生理鹽水 洗涂數次，中止反應。
[0042] 6)適當稀釋，取最后稀釋度的菌液0.2mL，涂布于碳酸巧篩選培養基(含lOOg/L葡 萄糖的碳酸巧MRS培養基)平皿中。在37°C培養2~3天后，采用影印法將該篩選平板的菌株 轉印到抑為1.5、1.8和2.0的LPHMRS培養基(低抑值改性MRS培養基)上和亞硝酸鋼篩選培養 基(單一氮源為2g/L亞硝酸鋼的改性MRS篩選培養基)上。
[0043] 7)挑選菌株方法:挑選菌落較大，分別能在LPHMRS培養基、亞硝酸鋼篩選培養基上 生長并且在碳酸巧篩選培養基上。經初步篩選，挑取100支符合W上條件的菌落。
[0044] 3.搖瓶復篩
[0045] 1)在超凈臺上分別取各試管斜面上的植物乳桿菌一環，接入裝有50mL培養基MRS (無瓊脂)培養基(葡萄糖濃度為lOOg/L)的250mLS角瓶中，200rpm，37°C培養1加左右，使菌 體處于對數生長中期。
[0046] 2)分別取5mL菌液，接入裝有50mL碳酸巧篩選液體培養基(含250g/L葡萄糖的碳酸 巧MRS培養基)平皿中、抑為1.5、1.8和2.0的LPHMRS液體培養基(低抑值改性MRS培養基）和 亞硝酸鋼液體篩選培養基（單一氮源為2g/L亞硝酸鋼的改性MRS篩選培養基）上（注:采用 250mLS角瓶）。20化pm，37°C培養3-4天，每天分別檢測碳酸巧篩選液體培養基中k乳酸產 生速率、LP麗RS液體培養基中的生物量和亞硝酸鋼液體篩選培養基中亞硝酸鹽的消耗速 率。發酵結束后，比較100株菌種的碳酸巧篩選液體培養基中心乳酸產生速率、LP歷RS液體 培養基中的生物量和亞硝酸鋼液體篩選培養基中亞硝酸鹽的消耗速率。
[0047] 3)選擇兼具高k乳酸產生速率、耐受低抑(該菌種僅能在最低為抑1.8的培養基中 生長)和亞硝酸鹽的消耗速率高的菌株，將其命名為L2菌。
[004引 4.遺傳穩定性試驗
[0049]將L2菌在斜面上連續十次傳代，并用搖瓶復篩的方法檢測每次傳代后的發酵情 況。實驗發現，在斜面上連續十次傳代，該菌種性狀沒有明顯變化，各項性能指標都正常，說 明該菌種的遺傳穩定性較強。菌株命名為植物乳桿菌化actobacillus plantarumHlj- 2014。
[(K)加]5.化發酵罐試驗
[0051] 1)取斜面上的植物乳桿菌L2-環，接入裝有50mL培養基MRS(無瓊脂）（葡萄糖濃度 為150g/L)培養基的250mLS角瓶中，200巧m，37°C培養1化左右，使菌體處于對數生長中期。
[0052] 2)將對數期的菌種接入裝有化MRS液體培養基(初始葡萄糖為150g/L)的化發酵 罐中。接種量為10%，37°C下10化pm培養8小時，對數前期溶氧控制10% (通氣0.化/min)，后 期厭氧培養63小時。發酵結束后，植物乳桿菌L2的乳酸產量達到95g/L。運樣的產乳酸速率 利于泡菜的快速發酵。
[0053] 3)將對數期的菌種接入裝有化pH為1.8的LPHMRS液體培養基(初始葡萄糖為50g/ L)的化發酵罐中。接種量為10%，37°C下10化pm培養8小時，對數前期溶氧控制10 % (通氣 0.化/min)，后期厭氧，整個過程用0.5mol/L的氨氧化鋼將發酵液抑控制在1.8，總培養時間 為48小時。發酵結束后，檢測植物乳桿菌L2的生物量為2.5g/L，說明植物乳桿菌L2能夠在 P化.8的環境中生存。
[0054] 4)將對數期的菌種接入裝有化亞硝酸鋼液體篩選培養基(單一氮源為2g/L亞硝酸 鋼的改性MRS篩選培養基）的化發酵罐中。接種量為10 %，37 °C下10化pm培養8小時，對數前 期溶氧控制10 % (通氣O.化/min)，后期厭氧，發酵過程根據亞硝酸鹽的消耗速率流加20g/L 的亞硝酸鋼溶液，培養2-3天。發酵結束后，計算發酵過程植物乳桿菌L2對亞硝酸鋼的降解 速率。結果發現:在該條件下，L2對亞硝酸鋼的降解速率可W達到563mg/h/L。
[0055] 5)將對數期的菌種IOmL接入裝有化g預處理過的白菜中，按照傳統泡菜方法進行 加工，每12小時測定泡菜中的亞硝酸鹽含量。結果發現，在整個發酵過程中，L2菌對亞硝酸 鋼的分解速率為9.8mg/h/kg白菜。泡菜中的亞硝酸鋼含量始終低于5mg/kg，遠低于國家標 準GB2714-2003中規定的含量(20mg/kg)。
[0化6] 發明所述植物乳桿菌（LactobaciIlus plantarunOXH于2015年11月30日保藏于中 國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、(簡稱CGMCC)，保藏號為CGMCC NO. 11763,保 藏地址為：中國北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編：100101。 [0化7] 植物乳桿菌益生特性如下：
[005引本發明所提供的植物乳桿菌CGMCC NO. 11763經實驗發現能夠在抑為1.50的條件 下存活，在1 %膽鹽培養4小時后仍處于存活狀態;植物乳桿菌CGMCC NO. 11763降解亞硝酸 鹽速度快，分解能力達到10.9mg/h/kg，該菌種在生產泡菜時，整個發酵過程中亞硝酸鹽濃 度在4.8mg/kgW下；CGMCC NO. 11763在發酵60h小時后，對膽固醇降解率可達到64.76%。 CGMCC NO. 11763黏附能力測定的自凝集率為95.71 %。
[0化9] CGMCC NO. 11763對膽固醇降解能力研究和測定：
[0060] 取Iml CGMCC NO. 11763母液接種于IOmL的MRS膽固醇液體培養基（膽固醇含量 O.lmg/ml，抑6.2)中，37°C的恒溫靜置分別培養20h、40h、60h備用，W接入1血無菌水的MRS 膽固醇培養基為對照，取W上培養不同時間的菌液樣品及對照液各lml，9000r/min，4°C下 離屯、lOmin，得到發酵上清液，鄰苯二甲醒法測定上清液中膽固醇含量(具體為:取各上清液 0 . Iml于相應的試管中，加冰醋酸0.3ml，Img/ml的鄰苯二甲醒0.15ml，緩緩加入濃硫酸 1.Oml，混合均勻。室溫靜置IOmin，于550nm下測吸光值）。每一處理3個重復，W同樣方法制 作膽固醇標準曲線，計算上清液中膽固醇含量及降解率，結果見表1。可知，CGMCC NO. 11763 對膽固醇有很好的降解作用，在發酵60h小時后，降解率可達到64.76%。
[0061 ]表1對膽固醇的降解情況
[0062]
[0063] CGMCC NO. 11763菌株的耐膽鹽試驗：
[0064] 取CGMCCN0.11763菌液ImL接種菌種于含有不同膽鹽（含量梯度為0.0%、0.2%、 0.4%、0.6%、0.8%、l%)的10血MRS液體培養基(PH=6.4)，置于37°C下分別培養0、2、4h， 每個處理3個重復。各取Iml樣品菌液于9ml生理鹽水中混勻，制備稀釋度溶液，取0.1ml稀釋 液于MRS中涂布，于37°C生化培養箱中倒置培養48小時(每個稀釋度做3個平行)記錄計算平 板上的菌數個數。結果見表2。可知該菌在膽鹽濃度為1 %處理4h后菌的生長量依然達到 0.59±0.92 X 107(cfu/ml)，有很好的耐膽鹽能力。
[0065] 表2耐膽鹽能力檢測[(±s) X 107cfu/ml]
[0066]
[0067] CGMCC NO. 11763菌株的耐酸試驗
[0068] 取CGMCC NO. 11763母液按Iml接種菌種于不同抑值(抑梯度為1.5、2.0、2.5、3.0、 3.5、4.0)的10血MRS液體培養基，置于37°C下分別培養0、2、4h，每一處理3個重復。各取Iml 樣品菌液于9ml生理鹽水中混勻，制備稀釋溶液，取0.1 ml稀釋液于MRS中涂布，于37 °C生化 培養箱中倒置培養48小時(每個稀釋度做3個平行)記錄平板上的菌落個數。結果見表3。說 明該菌具有很強的耐酸能力。
[0069] 表3耐酸能力檢測[(±s) X 107cfu/ml]
[00701
[0071] CGMCC NO. 11763菌株的黏附能力測定
[0072] 培養CGMCC NO. 11763(MRS液體培養基）、大腸桿菌D冊a(LB液體培養基)24h得發酵 液，分別置于3000r/min、4°C下離屯、IOmin，收集菌泥，分別用抑=7.0的無菌憐酸鹽緩沖液 (PBS)洗涂菌泥2次（即在菌落中加入PBS，震蕩混合均勻后，置于3000r/min、4°C下離屯、 IOmin，收集菌體）。自凝集率（％ ):用無菌的PBS將菌泥CGMCC NO. 11763制成在波長600皿處 的吸光值為〇.4±0. UA 0)的懸浮菌液及菌懸液，靜置24h后測定吸光值A 24,自凝集率 (%)公式為(4 0-4 24)心0。；他凝集率（％):將〔610：^).11763和大腸桿菌0冊〇的懸菌 液調節成在波長600皿處的吸光值為0.6±0.1 (A 0)的混合懸浮菌液。靜置24H后測定吸光 值A 24,他凝集率（％ )公式為(A 0 -A 24VA 0。測定結果見表4,可知CGMCC NO. 11763的 自凝集率為95.71 %，有很強的黏附能力。
[0073] 表4黏附能力表
[0074]
[00巧]菌株生理特性
[0076] 所述植物乳桿菌(Xactobaci Ilus plantarunOXH于2015年11月30日保藏于中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、(簡稱CGMCC)，保藏號為CGMCC NO. 11763,保藏地 址為：中國北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編：100101。
[0077] 該菌株特點如下:在顯微鏡下觀察，該菌株為短桿狀，革蘭氏染色呈陽性，無鞭毛， 不產芽抱;在固體培養基上，該菌菌落為白色，表面光滑，致密，形態為圓形，邊緣較整齊。
[0078] 理化特征為:過氧化氨酶(-)，明膠液化(-)，嗎I噪實驗( + )，運動性(-)，發酵產氣 (-)，亞硝酸鹽還原(-)，發酵產氣(-)，產硫化氨氣體(-)，pH4.0MRS培養基中生長(+ )。經過 生理生化鑒定為為植物乳桿菌化actobaci Ilus PIantarum)，命名為植物乳桿菌 (Lactobacillus plantarum)XH。
[0079] 菌株能夠在57°C下生長良好，葡萄糖耐受能力為275g/L。
[0080] 本發明植物乳桿菌由采集人李建樹，從新疆維吾爾族老鄉家中酸奶中分離得到， 采集時間2015年6月2日。
[0081 ] 化發酵罐試驗
[0082] (1)取斜面上的植物乳桿菌CGMCC NO. 11763-環，接入裝有50mL培養基MRS(無瓊 脂）（葡萄糖濃度為150g/L)培養基的250mLS角瓶中，200巧m，37°C培養12h左右，使菌體處 于對數生長中期。
[0083] (2)將對數期的菌種接入裝有化MRS液體培養基(初始葡萄糖為150g/L)的化發酵 罐中。接種量為10%，37°C下10化pm培養8小時，對數前期溶氧控制10% (通氣0.化/min)，后 期厭氧培養63小時。發酵結束后，植物乳桿菌CGMCC NO. 11763的乳酸產量達到llOg/L。運樣 的產乳酸速率利于泡菜的快速發酵。
[0084] (4)將對數期的菌種接入裝有化亞硝酸鋼液體篩選培養基（單一氮源為2g/L亞硝 酸鋼的改性MRS篩選培養基）的化發酵罐中。接種量為10%，37°C下10化pm培養8小時，對數 前期溶氧控制10% (通氣0.化/min),后期厭氧，發酵過程根據亞硝酸鹽的消耗速率流加 20g/L的亞硝酸鋼溶液，培養2-3天。發酵結束后，計算發酵過程植物乳桿菌CGMCC NO. 11763 對亞硝酸鋼的降解速率。結果發現:在該條件下，XH對亞硝酸鋼的降解速率可W達到653mg/ h/L。
[0085] (5)將對數期的菌種IOmL接入裝有化g預處理過的白菜中，按照傳統泡菜方法進行 加工，每12小時測定泡菜中的亞硝酸鹽含量。結果發現，在整個發酵過程中，XH菌對亞硝酸 鋼的分解速率為l〇.9mg/h/kg白菜。泡菜中的亞硝酸鋼含量始終低于4.8mg/kg，遠低于國家 標準GB2714-2003中規定的含量(20mg/kg)。
[0086] 本發明提供的黑曲霉菌株(Aspergillus nige;r)Li-2013-03是由實驗室保藏的一 株產纖維素酶產的黑曲霉(Aspergillus niger化i-2010經多輪亞硝基脈誘變，然后對突變 株逐級篩選淘汰，最后對優良菌株經發酵性能測試篩選得到產高活力纖維素酶的黑曲霉菌 株(Aspergillus nigei〇Li-2013-〇3。
[0087] 本發明提供的產高活力纖維素酶的菌株具體為黑曲霉(Aspergillus nigeiOLi- 2013-03。該菌株已于2013年7月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中 屯、（簡稱CGMCC，地址為：中國北京市朝陽區北辰西路1號院3號，郵編100101)，保藏號為 CGMCC NO.7927O
[0088] 產高活力纖維素酶菌株的篩選方法，包括W下步驟：
[0089] 1)斜面培養:將原始黑曲霉菌株(Aspergillus niger化i-2010劃線接種斜面培養 基，3(TC培養2~3d，直至菌絲體成熟、產大量黑色抱子。所述斜面培養基組成如下 麥芽汁1000 mUpH值自然，121°C滅菌20min;
[0090] 2)抱子懸液制備（W下步驟均在無菌條件下操作）：向試管斜面加入15mL無菌水， 把抱子刮下，用濾紙過濾，將濾過液倒入已滅菌、并加有5-10粒無菌玻璃珠的ISOmLS角瓶 中，將立角瓶放入搖床振蕩10-15min，使抱子分散。
[00川 3)亞硝基脈(NTG)誘變
[0092] A.用無菌水將抱子懸浮液調節為稀釋成IO6-IO7個/mL。
[0093] B.取10血菌懸液轉移至IOOmLS角瓶中，加入IOmg的NTG，配制成終濃度為lOmg/mL 的NTG溶液，并加入4-5滴丙酬，W利于NTG溶解。
[0094] C.在30 °C下200rpm振蕩反應30min，SOOOrpm離屯、IOmin收集菌體，用無菌生理鹽水 洗涂數次，中止反應。
[00M] D.適當稀釋將抱子濃度調節為IO3個/mL,取最后稀釋度的菌液0.2mL，稀釋涂布于 纖維素-剛果紅平板篩選培養基上。在30°C培養2~3天后挑取透明圈/菌落直徑較大的菌株 200支。（所述纖維素-剛果紅平板篩選培養基組成如下:纖維素粉lOg、剛果紅0.2g、硫酸錠 5邑、硫酸儀0.25g、憐酸二氨鐘Ig、氯化鋼O.lg、明膠2g、瓊脂20g、自來水定容1000mL，pH值5- 6，12^C滅菌20min)。
[0096] E.復篩:將獲得的200株菌分別用無菌牙簽接種于斜面培養基，3(TC培養至抱子鋪 滿斜面。分別將抱子W無菌水洗下接種于裝有50mL復篩培養基的250mLS角瓶中進行發酵， 接種量10%(v/v)，3(rC、100r/min培養96h，分別測定各菌株的纖維素酶活性。（所述復篩培 養基組成如下：纖維素粉50g、硫酸錠5g、硫酸儀0.25g、憐酸二氨鐘Ig、氯化鋼0.1 g、自來水 定容1000 mL, pH值5-6,121°C滅菌20min)。選取纖維素酶酶活力最高的菌株進行放大實驗。
[0097] 4)遺傳穩定性試驗
[0098] 將Li-2013-03菌株在斜面上連續十次傳代，并用搖瓶復篩的方法檢測每次傳代后 的發酵情況。實驗發現，在斜面上連續十次傳代，該菌種性狀沒有明顯變化，各項性能指標 都正常，說明該菌種的遺傳穩定性較強。
[0099] 5)放大試驗
[0100] ①種子培養:將纖維素酶酶活力最高的菌株Aspergillus niger Li-2013-03接入 SOOmLS角瓶中，種子培養基裝量100毫升，30°C、150巧m搖床培養72-9化。
[0101] ③種子罐培養:將種子液WlO % (v/v)接種量接入裝有7.化發酵液的IOL發酵罐 中，控制抑值恒定為6.0 ± 0.2，培養溫度30 ± 0. rC，攬拌速度300巧m，通風量(v/v) 1:0.8- 1.2,培養時間96h，溶解氧20-30%。所述發酵培養基組成為:纖維素粉lOOg、硫酸錠5g、硫酸 儀0.25g、憐酸二氨鐘Ig、氯化鋼O.lg、自來水定容100〇111^9巧直5-6，121°(：滅菌2〇111111。
[0102] 發酵結束后，取發酵上清液(粗酶液)進行酶活力檢測經測定，菌株Aspergillus niger Li-2013-03的外切(6-葡聚糖酶、內切(6-葡聚糖酶、(6-葡萄糖巧酶和濾紙酶活力分別 達到620U/mL、1289U/血、45抓/mL和732U/血，分別比出發菌株Aspergillus nigerLi-2010 提高了9.21倍、7.43倍、8.15倍和10.31倍。
[0103] 本發明提供的枯草芽抱桿菌(Baci Ilus subtil is化i-2013-02。該菌株已于2013 年7月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、(簡稱CGMCC，地址為：中 國北京市朝陽區北辰西路1號院3號），保藏號為CGMCC No.7926。
[0104] 所述菌株特點如下：
[0105] 所述菌株在固體平板上菌落顏色為乳白色，表面干燥不透明，邊緣整齊，為具有運 動性的好氧菌。鏡檢為長桿狀，革蘭氏染色呈陽性。該菌可利用巧樣酸鹽，硝酸還原、V-P實 驗成陽性。
[0106] 所述枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)Li-2013-02由一株保藏于本實驗室的產 耐高溫Q-淀粉酶的枯草芽抱桿菌Li-2013經紫外線-氯化裡-硫酸二乙醋復合誘變篩選獲 得，具體篩選步驟如下：
[0107] (1)菌懸液的制備
[0108] 將在平板劃線分離后長出的Li-2013單菌落接入種子培養基中，100r/min，40°C培 養1化后，取ImL培養液離屯、后用生理鹽水洗涂兩次，并重懸與9mL生理鹽水中。
[0109] (2)紫外線-氯化裡-硫酸二乙醋復合誘變
[0110] 將菌懸液置于無菌平板中，在距離為30cm，功率15w的紫外燈下攬拌照射100s。將 經過照射的菌液經梯度稀釋后涂布于氯化裡平板，并W未經紫外照射的菌液稀釋涂平板做 對照。將上述涂布均勻的平板，用黑色的布或報紙包好，置4(TC培養4她，在長出菌落的平板 上篩選出水解圈與菌落直徑比值最大者挑至斜面保存，純化后配制成菌懸液，經梯度稀釋 后與硫酸二乙醋原液充分混合，并于40°C震蕩處理40min，將處理過的菌液經梯度稀釋后涂 布于氯化裡平板。
[0111] (3)高產菌種的初篩
[0112] 將上述涂布均勻的平板，置4(TC培養4她，在長出菌落的平板上初篩出水解圈與菌 落直徑比值較大者挑至斜面保存，純化后獲得=株菌Li-2013-01，Li-2013-02，Li-2013-03
[0113] (4)搖瓶發酵復篩
[0114] 將獲得的S株菌^-2013-01，^-2013-02，^-2013-03在含有301111^發酵培養基的 250mL搖瓶中進行搖瓶發酵，種子接種量10% (V/V)，40°C、lOOr/min培養72h，離屯、取發酵上 清液制得粗酶液。
[011引（5)酶活測定
[0116]酶活單位的定義：ImL粗酶液，于105°C、pH 4.2條件下，Imin液化Img可溶性淀粉， 即為1個酶活力單位，WlVmL表示。
[0117] 經測定，菌株Li-2013-02,為穩定的最高產菌株，且酶活達到30000U/mL，比原始菌 株酶活提高1.6倍。
[0118] 所述氯化裡平板：淀粉1 %，蛋白腺1 %，（NH)2S040.4%瓜冊〇4〇. 8%，CaCl2〇. 2%， 氯化裡0.9%，瓊脂2%。
[0119] 所述的種子培養基:酵母粉0.5%，蛋白腺1%，可溶性淀粉1% ,NaCl 1%。
[0120] 所述的發酵培養基：玉米粉5%~15%，豆餅粉4%~10%，（NH)2S040.4%， K2HP040.8%，CaC120.2%。
[0121] 所述的搖瓶培養條件：該菌在含有30mL發酵培養基的250mL搖瓶中，接種量10% (V/V)，100r/min、40°C發酵培養72h。
[0122] 由菌株Li-2013-02發酵獲得了一種耐高溫的a-淀粉酶，其酶學性質如下：
[0123] (1)該酶溫度適應范圍較寬，最適作用溫度在1〇5-115°(：之間，且在110°(：^下保存 的溫度穩定性較好，而115°C W上保存長時間溫度穩定性較差。
[0124] (2)該酶最適反應pH值為4.2。在pH值3.0-7.0之間均有較高酶活力，在抑值為3.0 時酶活完全穩定。
[0125] (3)酶活性：由本發明所提供的突變株Li-2013-02,制備的耐高溫a-淀粉酶酶活力 為30000-35000U/ml。
[0126] 1、本發明使用紫外線-氯化裡-硫酸二乙醋復合誘變的方法獲得了一株高產耐高 溫曰-淀粉酶的枯草芽抱桿菌Li-2013-02,該菌株具有強耐酸、耐熱性，產酶活力高的特點。
[0127] 2、有該菌株生產所得的耐高溫a-淀粉酶酶活力高達30000-35000u/ml，；適用溫度 范圍為25-115°C，最適反應溫度110°C，在110°C酶活完全穩定;適用反應pH值范圍為3.0- 7.0，在pH值為3.0時酶活完全穩定，最適反應pH值為4.2，比現有的耐高溫a-淀粉酶酶活力 高，酶作用最適抑值范圍寬泛，耐溫度高，特別適合反應溫度高、液化工藝與糖化工藝并存 的工業化需求。
[012引實施例1
[0129] 本發明所要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種微生物復合肥：
[0130] 重量份數組成為:植物乳桿菌混合菌劑16份，混合曲霉培養物18份，枯草芽抱桿菌 培養物10;
[0131] 所述混合曲霉培養物的組成及重量份數如下：黑曲霉培養物9份，泡盛曲霉培養物 1份；
[0132] 所述黑曲霉(Aspergillus niger)為CGMCC NO.7927。
[0133] 植物乳桿菌混合菌劑組成及重量份數如下:植物乳桿菌CGMCC 9405菌粉2份，植物 乳桿菌CGMCC 11763菌粉7份；
[0134] 枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis subsp)CGMCC7926
[0135] 泡盛曲霉（Aspergillus awamori)CGMCC3.6484
[0136] 泡盛曲霉菌劑的制備方法：
[0137] 技術方案如下：
[0138] 斜面菌種活化培養:將泡盛曲霉斜面菌種轉接到斜面培養基上，27 °C培養3天。
[0139] 固體一級種子培養:挑取泡盛曲霉斜面菌種接入裝有100克培養基的500毫升S角 瓶中進行種子培養，30°C培養3天即可。
[0140] 固體二級種子培養:將上述培養好的固體一級種子攬拌為碎塊后加入裝有1000克 培養基的5000毫升=角瓶中進行種子培養，培養條件:3(TC培養3天即可。
[0141] 固體發酵培養:將二級搖瓶種子粉碎，加入裝有滅菌培養基的發酵池或托盤中混 合均勻后培養，曲料培養溫度控制在26-35°C，濕度80-90%，每隔10小時翻料一次，培養時 間5-7天；固體曲料的培養采用常用曲料培養技術;待培養料長滿菌絲即可結束培養，培養 基預先經高溫蒸煮滅菌處理，滅菌條件控制溫度i2rc，時間1小時。
[0142] 干燥粉碎:發酵結束培養料在流化床或其他干燥設備上進行干燥，干燥溫度控制 在60°C，干燥到水分含量在10% W下，然后將固體培養料進行粉碎，物料粉碎孔徑在60目W 上。
[0143] 培養基組成：固體原料:教皮80 %，豆餅粉10 %，玉米淀粉10 %，添加等量自來水； 初始抑自然。
[0144] 枯草芽抱桿菌培養物的制備方法：
[0145] 1.發酵液的獲得:采用斜面菌種逐級擴培獲得枯草芽抱桿菌發酵液；
[0146] (1)-級種子培養:將枯草芽抱桿菌斜面菌種接入500毫升搖瓶中，培養基裝量100 毫升，旋轉式搖床180轉/分，培養溫度30°C，培養時間24小時；
[0147] (2)二級種子培養:將一級種子按照10%的接種量接入500毫升二級種子搖瓶中， 培養條件與一級種子相同；
[0148] (3)=級種子培養:將二級種子W10%接種量接入5000毫升=級種子搖瓶中，培養 基裝量1000毫升，旋轉式搖床100轉/分，培養溫度30°C，培養時間24小時；
[0149] (4)-級種子罐培養:將S級種子W10%接種量接入總容積為15化的一級種子罐， 發酵培養基裝量IOOL，培養溫度28°C，攬拌速度100轉/分，通風量（V/V) 1: 0.5，罐壓 0.05Mpa，培養時間24小時；
[0150] (5)發酵培養:將一級種子罐菌種W10%接種量接入總容積為1.5噸二級種子罐， 發酵培養基裝量1噸，培養條件培養溫度28°C，攬拌速度100轉/分，通風量(V/V) 1:0.5，罐壓 0.05Mpa，培養時間24小時。
[0151] 培養基組成:葡萄糖6%，酵母提取物1 %，蛋白腺0.2%，化C031 %，P冊.8。
[0152] 植物乳桿菌劑的制備方法：
[0153] (1)-級種子培養:將植物乳桿菌菌種接入500毫升搖瓶中，培養基裝量100毫升， 培養溫度30°C，培養時間24小時；
[0154] (2)二級種子培養:將一級種子按照10%的接種量接入500毫升二級種子搖瓶中， 培養條件與一級種子相同；
[0K5] (3)=級種子培養:將二級種子W10%接種量接入5000毫升=級種子搖瓶中，培養 基裝量1000毫升，培養溫度30°C，培養時間24小時；
[0156] (4)-級種子罐培養:將S級種子W5%接種量接入總容積為15化的一級種子罐， 發酵培養基裝量10化，培養溫度30°C，罐壓0.05Mpa，培養時間18小時；
[0157] (5)發酵罐培養:將一級種子罐菌種W5%接種量接入總容積為3噸二級種子罐，發 酵培養基裝量2噸，培養條件培養溫度30°C，罐壓0.05Mpa，培養時間22小時。發酵完畢發酵 液經低溫負壓真空濃縮到原體積的45%，得到菌濃縮液。添加載體：向濃縮液中添加混合好 的載體，混合均勻;濃縮液與載體的重量比為0.5:1，載體組成為:CaO)3 25份，糊精12份。流 化床干燥，干燥溫度50°C。
[0158] 培養基組成為:酪蛋白腺1%，牛肉提取物1%，酵母提取物0.5%，葡萄糖0.5%，乙 酸鋼0.5%，巧樣酸二胺0.2%，1'"6611 80 0.1%，1(2冊04 0.2%，]\1邑504.7肥0 0.02%， MnS04.肥0 0.005%,CaCOS 2%,瓊脂 1.5%,P冊.8。
[0159] 實施例2
[0160] 基本同實施例1
[0161] 本發明所要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種微生物復合肥：
[0162] 重量份數組成為:植物乳桿菌混合菌劑20份，混合曲霉培養物10份，枯草芽抱桿菌 培養物8;
[0163] 所述混合曲霉培養物的組成及重量份數如下：黑曲霉培養物6份，泡盛曲霉培養物 2份；
[0164] 所述黑曲霉(Aspergillus niger)為CGMCC NO.7927。
[0165] 植物乳桿菌混合菌劑組成及重量份數如下:植物乳桿菌CGMCC 9405菌粉2份，植物 乳桿菌CGMCC 11763菌粉5份；
[0166] 枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis subsp)CGMCC7926
[0167] 泡盛曲霉（Aspergillus awamori)CGMCC3.6484
[0168] 產品效果實驗
[0169] 試驗地的選擇與試驗設計:試驗于2015年在寧夏鹽池縣進行。
[0170] 試驗田旱地田種植玉米10畝，分別在種植時使用本發明產品每畝0.3公斤，出苗1 個月左右通過働地松±方式使用發明產品0.2公斤，對照組使用市售微生物肥料。
[0171] 發明產品使用玉米地玉米產量達到290公斤，對照組達到110公斤。
【主權項】
1. 一種微生物復合肥，重量份數組成為:植物乳桿菌混合菌劑8-20份，混合曲霉培養物 10-20份，枯草芽孢桿菌培養物8-15。2. 如權利要求1所述一種微生物復合肥，其特征在于，所述混合曲霉培養物的組成及重 量份數如下:黑曲霉培養物5-9份，泡盛曲霉培養物1 -3份。3. 如權利要求2所述一種微生物復合肥，其特征在于，所述黑曲霉（Aspergi Ilus niger)為CGMCC N0.7927。4. 如權利要求1所述一種微生物復合肥，其特征在于，植物乳桿菌混合菌劑組成及重量 份數如下:植物乳桿菌CGMCC 9405菌粉1-2份，植物乳桿菌CGMCC 11763菌粉5-8份。5. 如權利要求1-4任一所述一種微生物復合肥，一種微生物復合肥:重量份數組成為： 植物乳桿菌混合菌劑16份，混合曲霉培養物18份，枯草芽孢桿菌培養物10份。6. 如權利要求5所述一種微生物復合肥，其特征在于，所述混合曲霉培養物的組成及重 量份數如下：黑曲霉培養物9份，泡盛曲霉培養物1份;所述黑曲霉(Aspergi Ilusniger)為 CGMCC NO.7927〇7. 如權利要求5所述一種微生物復合肥，其特征在于，植物乳桿菌混合菌劑組成及重量 份數如下:植物乳桿菌CGMCC 9405菌粉2份，植物乳桿菌CGMCC 11763菌粉7份。8. 如權利要求5所述一種微生物復合肥，其特征在于，枯草芽孢桿菌（Baci Ilus subtilis subsp)CGMCC7926,泡盛曲霉（Aspergillus awamori)CGMCC3.6484〇
【文檔編號】C12R1/125GK105924238SQ201610248607
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年4月20日
【發明人】李秉京
【申請人】義烏市錦鈺信息科技有限公司