一種采用蘋果木栽培牛樟芝子實體的方法及其培養基的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種采用蘋果木栽培牛樟芝子實體的方法，其包括在適合牛樟芝生長的條件下，在液體種子培養基或固體種子培養基中培養牛樟芝，獲得液體或固體牛樟芝種子；采用蘋果木樁浸泡清洗，裝入聚丙烯菌袋封口扎緊滅菌；在無菌環境下打開裝有蘋果木的菌袋，接入固體或液體牛樟芝種子，封口扎緊；將接種完的菌袋進行暗培養，完成營養生長管理；脫袋培養，牛樟芝子實體長到2cm以上大小，可以進行采收，完成生殖生長管理。其所用胡蘿卜培養基原料包括：胡蘿卜沸水煮后過濾的濾液、葡萄糖、瓊脂，余量水；其所用液體種子培養基原料包括：固形物含量為5%（W/V）的麥芽汁；栽培培養基為蘋果木。本發明操作簡單，培養周期相對較短，原料來源廣泛，成本低廉。
【專利說明】一種采用蘋果木栽培牛樟芝子實體的方法及其培養基
[0001]
技術領域:
本發明一種采用蘋果木栽培牛樟芝子實體的方法及其培養基，涉及到在人工培養條件下，以蘋果木為原料培養牛樟芝形成子實體的方法，屬于食藥用菌栽培技術領域。
[0002]【背景技術】:
牛樟芝(如trodia camphor a ta)又名牛樟燕、樟窟內燕、紅樟芝，隸屬擔子菌亞門(Basid1myco tina)，層菌綱鮮ce tes)，多孔菌科(JcWj^oraceae)，薄孔菌屬U/^roc/ia)，是一種原產于臺灣的珍稀藥用菌。牛樟芝原生于中國臺灣山區海拔450?2000米之間特有的樹齡百年以上的牛樟樹(Ci/1a?o?ea AafieAirai)樹干腐朽心材的內壁，是臺灣的地道藥材，被稱為“臺灣瑰寶”、“臺灣森林中的紅寶石”。牛樟樹由于過度砍伐，目前在中海拔已難得一見，臺灣已立法將牛樟樹列為一級國寶保護樹種，不得任意砍伐，也因此野生牛樟芝子實體取得更為困難，目前黑市價格往往高達每公斤數十萬元臺幣，因此如何以人工栽培開發出和野生樟芝具有相同成分的子實體或菌絲體，已成為學術界及產業界的熱門話題。
[0003]牛樟芝含有豐富的活性物質，樟芝中有超過78種化合物，包括三萜類(terpenoids)、苯酸類(benzenoids)、木脂素(Iignans)、苯醌及其衍生物(benzoquinone derivatives)、琥泊酸與馬來酸及其衍生物( uccinic and maleicderivatives)及多糖體等。近年來樟芝在抗發炎、保肝、抗肝癌、抗肺癌、抗乳癌、抗卵巢癌、抗結腸癌、抗口腔癌、抗氧化、降低系統性紅斑狼瘡性腎炎及抗血小板凝集等方面的研究皆顯示其未來具有高度發展潛力。樟芝也已被證實不具有基因毒性，口服90天亞急性毒性試驗也未顯示其具安全疑慮。
[0004]三萜類物質為牛樟芝的主要活性成分之一，且最為特別，高達200種以上，是其他菇菌無法相比的，具有抗癌、保肝等功效。已有30余種萜類化合物從牛樟芝子實體和菌絲體中得到分離純化，牛樟芝二萜類化合物、三萜類化合物、苯環衍生物化合物等。天然產物三萜的藥理研究表明三萜具有抗癌，抗炎，抗病毒和保肝等多種活性，牛樟芝對于酒后或宿醉的解酒效果非常顯著。近年來已逐漸成為國內外研究和開發的熱點。
[0005]牛樟芝是只生長在臺灣地區的珍稀藥用真菌，具有廣泛的功能活性，有極高的藥用價值，是一種極具開發與發展潛力的藥用真菌。牛樟芝人工培養技術雖得到長足發展，但總體來說，其培養技術及產品的開發與應用還處于初中級階段。
[0006]現有技術的固體培養，是將牛樟芝菌種接種在固體瓊脂培養基或太空包中培養，培養時間通常為幾個月，很難培養成子實體。
[0007]現有技術的液體培養可以在較短時間內獲得大量的菌絲體和發酵液，能大大的提高產量，可以彌補牛樟芝生長緩慢這個缺點，但是其活性產物的含量較低。
[0008]現有技術的椴木栽培法，是將牛樟芝接種在牛樟椴木上，其所獲得的牛樟芝成分和野生牛樟芝所含的生理活性物質的種類相近，可以得到質量較高的牛樟芝子實體，但因為其生長極其緩慢、生產周期較長，而且牛樟樹為臺灣一級保護樹種，資源有限，這些都極大的限制了樟芝的產量。牛樟芝分布范圍有限，牛樟樹生長緩慢，產量低，尋求代替樹種以擴大半人工栽培的范圍，從而提高產量需要做大量的研究。
[0009]
【發明內容】
:
本發明的在于克服上述已有技術的不足而提供一種操作簡單，原料易得，成本低，環保，節省資源，培養周期相對較短的采用蘋果木栽培牛樟芝子實體的方法及其培養基。
[0010]本發明的目的可以通過如下措施來達到:
一種用于采用蘋果木栽培牛樟芝子實體的培養基，其特征在于培養基原料包括:胡蘿卜20%(ff/V)，葡萄糖2%(W/V)，瓊脂1.5%(W/V)，余量水，pH自然；其中胡蘿卜切成I cm3大小，沸水煮20min，過濾取濾液使用。
[0011 ] 一種用于采用蘋果木栽培牛樟芝子實體的液體種子培養基，其特征在于培養基原料包括:固形物含量為5%(W/V)的麥芽汁，pH自然。
[0012]—種采用蘋果木栽培牛樟芝子實體的方法，其特征在于其包括如下步驟:
1)、菌種:牛樟芝菌種，購于廣東微生物菌種保藏中心，保存于PDA斜面培養基上；
2)、在適合牛樟芝生長的條件下，在液體種子培養基或固體種子培養基中培養牛樟芝，獲得液體或固體牛樟芝種子;其中液體牛樟芝種子培養采用液體種子培養基用500ml三角瓶，裝量150ml/500ml瓶;接入活化的牛樟芝菌種，旋轉式搖床，轉速120rpm;溫度28°C，暗培養10-12天;其中固體牛樟芝種子培養采用胡蘿卜培養基，接種斜面牛樟芝菌種后溫度28°C，暗培養20天；
3)、牛樟芝栽培培養基的制備:將老齡的蘋果木鋸成長約30cm的木粧，將鋸好的木粧在水中完全浸沒浸泡7-10天，取出后清洗，裝入聚丙烯菌袋中，用脫脂棉封口，用棉繩扎緊；121 °C，滅菌 120min;
4)、接種:在超凈工作臺中，將液體發酵菌種搖勻，酒精燈的火焰無菌區內將培養基口打開，灼燒瓶口 ；待菌袋冷卻后，打開菌袋，接入固體或液體牛樟芝種子，用脫脂棉封口，用棉繩扎緊;其中每袋接入2-3塊固體牛樟芝種子或每袋接入150ml液體牛樟芝種子，保證液體牛樟芝種子從蘋果段木的各個面流下；
5)、營養生長管理:將接種完的菌袋置于15°C-30tTC培養室中進行暗培養30-60天，菌絲在段木表面蔓延覆蓋，并深入生長到木質內部；
6)、生殖生長管理:脫袋，放置于濕度80-95%、溫度15-25°C°C培養室中進行培養，培養過程中無需光照;脫袋之后培養30天之后，牛樟芝子實體長到2cm以上大小，可以進行采收。
[0013]為了進一步實現本發明的目的，固體牛樟芝種子制備:將上述配制好的胡蘿卜培養基分裝入500ml錐形瓶中，每瓶裝250ml，食用菌專用封口膜封口，在121°C滅菌30min;無菌操作，倒平板，平板涼至室溫后，接種試管菌種;每只試管可以接種12塊平板;接種后的平板放入28 °C培養箱中，暗培養20天，成為固體牛樟芝種子。
[0014]為了進一步實現本發明的目的，液體牛樟芝種子制備包括:1)菌種活化:采用上述配制好的胡蘿卜培養基對保存的菌種進行活化，置于28°C恒溫培養箱中培養15天;將低溫保藏的牛樟芝菌種在無菌條件下接入胡蘿卜培養基，28°C暗培養15天；
2)液體牛樟芝種子制備:將配制好的液體種子培養基分裝入500ml錐形瓶中，每瓶裝150ml，食用菌專用封口膜封口，在121°C條件下滅菌30min，取出培養基，自然冷卻至20?30°C ;在無菌條件下每瓶接入2粒(黃豆粒大小)活化好的牛樟芝菌種，封口 ；置于旋轉式搖床上轉速120rpm、溫度28°C條件下培養10-12天，成為液體牛樟芝種子。
[0015]本發明同已有技術相比可產生如下積極效果:
1、采用常見的蘋果段木作為牛樟芝生長的宿主，做到了創新的理念。通常牛樟芝的段木栽培都是以臺灣牛樟木作為宿主，但是由于過度砍伐，目前在中海拔已難得一見，臺灣已立法將牛樟樹列為一級國寶保護樹種，不得任意砍伐，資源有限。本發明應用蘋果段木培育的牛樟芝在外觀形態和樟芝三萜含量上，都基本和牛樟木為宿主培養的牛樟芝相近。
[0016]2、牛樟芝子實體的培養時縮短。一般牛樟木培養的牛樟芝子實體生長期大致為2-3年，而采用本發明培育的牛樟芝子實體的生長期大致為120-180天。
[0017]3、選用廢舊老齡的蘋果木，防止焚燒，遵循環保理念，已用過的蘋果段木還可以滅菌處理后重復利用。
[0018]4、原料易得，成本低。
[0019]【具體實施方式】:下面對本發明的【具體實施方式】做詳細說明:
實施例1:以固體菌種為基礎
菌種:牛樟芝菌種，購于廣東微生物菌種保藏中心，保存于PDA斜面培養基上。
[0020]配制胡蘿卜培養基:原料包括:胡蘿卜20%(W/V)，葡萄糖2%(W/V)，瓊脂1.5%(ff/V)，余量水，PH自然;其中胡蘿卜切成I cm3大小，沸水煮20min，過濾取濾液使用。
[0021 ]固體種子制備:將配制好的胡蘿卜培養基分裝入500ml錐形瓶中，每瓶裝250ml，食用菌專用封口膜封口，在121°C滅菌30min。將滅菌的培養皿、接種針、錐形瓶中融化后的培養基、酒精燈放入超凈工作臺中，然后紫外燈消毒30min，打開通風，酒精棉球將手消毒，點燃酒精燈，開始無菌操作，倒平板，平板涼至室溫后，接種試管菌種，每只試管菌種可以接種12塊平板;接種后的平板放入28 °C培養箱中，暗培養20天，成為固體牛樟芝種子。
[0022]牛樟芝栽培培養基的制備:將老齡的蘋果木鋸成長約30cm的木粧，將鋸好的木粧在水中完全浸沒浸泡7-10天，取出后清洗，裝入聚丙烯菌袋中，用脫脂棉封口，用棉繩扎緊；121 °C，滅菌 120min。
[0023]接種:在超凈工作臺中，待菌袋冷卻后，打開菌袋，每袋接入2-3塊固體牛樟芝種子，用脫脂棉封口，用棉繩扎緊。
[0024]營養生長管理:將接種完的菌袋置于30°C培養室中進行暗培養60天，菌絲在蘋果段木表面蔓延覆蓋，并深入生長到木質內部。
[0025]生殖生長管理:脫袋，放置于濕度80%、溫度15°C培養室中進行培養，培養過程中無需光照;脫袋之后培養30天之后，牛樟芝子實體長到2cm以上大小，可以進行采收。
[0026]實施例2:以液體菌種為基礎
菌種:牛樟芝菌種，購于廣東微生物菌種保藏中心，保存于PDA斜面培養基上。
[0027]配制胡蘿卜培養基:原料包括:胡蘿卜20%(W/V)，葡萄糖2%(W/V)，瓊脂1.5%(ff/V)，余量水，PH自然;其中胡蘿卜切成I cm3大小，沸水煮20min，過濾取濾液使用。
[0028]配制液體種子培養基:固形物5%(W/V)的麥芽汁，pH自然。
[0029]菌種活化:采用胡蘿卜培養基對保存的菌種進行活化，置于28°C恒溫培養箱中培養15天;將低溫保藏的牛樟芝菌種在無菌條件下接入胡蘿卜培養基，28°C暗培養15天。
[0030]液體牛樟芝種子制備:將配制好的液體種子培養基分裝入500ml錐形瓶中，每瓶裝150ml，食用菌專用封口膜封口，在121°C條件下滅菌30min，取出培養基，自然冷卻至20?30°C ;在無菌條件下每瓶接入2粒(黃豆粒大小)活化好的牛樟芝菌種，封口 ；置于旋轉式搖床上轉速120rpm、溫度28°C條件下培養10-12天，成為液體牛樟芝種子。
[0031]牛樟芝栽培培養基的制備:將老齡的蘋果木鋸成長約30cm的木粧，將鋸好的木粧在水中完全浸沒浸泡7-10天，取出后清洗，裝入聚丙烯菌袋中，用脫脂棉封口，用棉繩扎緊；121 °C，滅菌 120min。
[0032]接種:在超凈工作臺中，將液體發酵菌種搖勻，酒精燈的火焰無菌區內將培養基口打開，灼燒瓶口。待菌袋冷卻后，打開菌袋，每袋接入150ml液體牛樟芝種子，保證牛樟芝種子從蘋果段木的各個面流下，用脫脂棉封口，用棉繩扎緊。
[0033]營養生長管理:將接種完的菌袋置于24°C培養室中進行暗培養40天，菌絲在段木表面蔓延覆蓋，并深入生長到木質內部。
[0034]生殖生長管理:脫袋，放置于濕度85%、溫度20°C培養室中進行培養，培養過程中無需光照。脫袋之后培養30天之后，牛樟芝子實體長到2cm以上大小，可以進行采收。
[0035]實施例3:以液體菌種為基礎
菌種:牛樟芝菌種，購于廣東微生物菌種保藏中心，保存于PDA斜面培養基上。
[0036]配制胡蘿卜培養基:原料包括:胡蘿卜20%(W/V)，葡萄糖2%(W/V)，瓊脂1.5%(ff/V)，余量水，PH自然;其中胡蘿卜切成I cm3大小，沸水煮20min，過濾取濾液使用。
[0037]配制液體種子培養基:固形物5%(W/V)的麥芽汁，pH自然。
[0038]菌種活化:采用胡蘿卜培養基對保存的菌種進行活化，置于28°C恒溫培養箱中培養15天;將低溫保藏的牛樟芝菌種在無菌條件下接入胡蘿卜培養基，28°C暗培養15天。
[0039]液體種子制備:將配制好的液體種子培養基分裝入500ml錐形瓶中，每瓶裝150ml，食用菌專用封口膜封口，在121°C條件下滅菌30min，取出培養基，自然冷卻至20~30°C;在無菌條件下每瓶接入2粒(黃豆粒大小)活化好的牛樟芝菌種，封口；置于旋轉式搖床上轉速120rpm、溫度28°C條件下培養10-12天，成為液體牛樟芝種子。
[0040]牛樟芝栽培培養基的制備:將老齡的蘋果木鋸成長約30cm的木粧，將鋸好的木粧在水中完全浸沒浸泡7-10天，取出后清洗，裝入聚丙烯菌袋中，用脫脂棉封口，用棉繩扎緊。121 °C，滅菌 120min。
[0041 ]接種:在超凈工作臺中，將液體發酵菌種搖勻，酒精燈的火焰無菌區內將培養基口打開，灼燒瓶口。待菌袋冷卻后，打開菌袋，每袋接入150ml液體牛樟芝種子，保證液體牛樟芝種子從蘋果段木的各個面流下，用脫脂棉封口，用棉繩扎緊。
[0042]營養生長管理:將接種完的菌袋置于15°C培養室中進行暗培養30天，菌絲在段木表面蔓延覆蓋，并深入生長到木質內部。
[0043]生殖生長管理:脫袋，放置于濕度95%、溫度25°C培養室中進行培養，培養過程中無需光照。脫袋之后培養30天之后，牛樟芝子實體長到2cm以上大小，可以進行采收。
[0044]以上的實施例僅僅是對本發明的優選實施方式進行描述，并非對本發明的范圍進行限定，在不脫離本發明設計精神的前提下，本領域普通工程技術人員對本發明的技術方案作出的各種變形和改進，均應落入本發明的權利要求書確定的保護范圍內。
【主權項】
1.一種用于采用蘋果木栽培牛樟芝子實體的培養基，其特征在于培養基原料包括:胡蘿卜20%(W/V)，葡萄糖2%(W/V)，瓊脂1.5%(ff/V)，余量水，pH自然;其中胡蘿卜切成I cm3大小，沸水煮20min，過濾取濾液使用。2.—種用于采用蘋果木栽培牛樟芝子實體的液體種子培養基，其特征在于培養基原料包括:固形物含量為5%(W/V)的麥芽汁，pH自然。3.—種采用蘋果木栽培牛樟芝子實體的方法，其特征在于其包括如下步驟: 1)、菌種:牛樟芝菌種，購于廣東微生物菌種保藏中心，保存于PDA斜面培養基上； 2)、在適合牛樟芝生長的條件下，在液體種子培養基或固體種子培養基中培養牛樟芝，獲得液體或固體牛樟芝種子;其中液體牛樟芝種子培養采用液體種子培養基用500ml三角瓶，裝量150ml/500ml瓶;接入活化的牛樟芝菌種，旋轉式搖床，轉速120rpm;溫度28°C，暗培養10-12天;其中固體牛樟芝種子培養采用胡蘿卜培養基，接種斜面牛樟芝菌種后溫度28°C，暗培養20天； 3)、牛樟芝栽培培養基的制備:將老齡的蘋果木鋸成長約30cm的木粧，將鋸好的木粧在水中完全浸沒浸泡7-10天，取出后清洗，裝入聚丙烯菌袋中，用脫脂棉封口，用棉繩扎緊；121 °C，滅菌 120min; 4)、接種:在超凈工作臺中，將液體發酵菌種搖勻，酒精燈的火焰無菌區內將培養基口打開，灼燒瓶口 ；待菌袋冷卻后，打開菌袋，接入固體或液體牛樟芝種子，用脫脂棉封口，用棉繩扎緊;其中每袋接入2-3塊固體牛樟芝種子或每袋接入150ml液體牛樟芝種子，保證液體牛樟芝種子從蘋果段木的各個面流下； 5)、營養生長管理:將接種完的菌袋置于15°C-30tTC培養室中進行暗培養30-60天，菌絲在段木表面蔓延覆蓋，并深入生長到木質內部； 6 )、生殖生長管理:脫袋，放置于濕度80-95%、溫度15-25 °C °C培養室中進行培養，培養過程中無需光照;脫袋之后培養30天之后，牛樟芝子實體長到2cm以上大小，可以進行采收。4.根據權利要求3所述的一種采用蘋果木栽培牛樟芝子實體的方法，其特征在于所述的固體牛樟芝種子制備包括:將上述配制好的胡蘿卜培養基分裝入500ml錐形瓶中，每瓶裝250ml，食用菌專用封口膜封口，在121 °C滅菌30min;無菌操作，倒平板，平板涼至室溫后，接種試管菌種;每只試管可以接種12塊平板;接種后的平板放入28°C培養箱中，暗培養20天，成為固體牛樟芝種子。5.根據權利要求3所述的一種采用蘋果木栽培牛樟芝子實體的方法，其特征在于所述的液體牛樟芝種子制備:I)菌種活化:采用上述配制好的胡蘿卜培養基對保存的菌種進行活化，置于28°C恒溫培養箱中培養15天;將低溫保藏的牛樟芝菌種在無菌條件下接入胡蘿卜培養基，28 °C暗培養15天； 2)液體牛樟芝種子制備:將配制好的液體種子培養基分裝入500ml錐形瓶中，每瓶裝150ml，食用菌專用封口膜封口，在121°C條件下滅菌30min，取出培養基，自然冷卻至20?30°C ;在無菌條件下每瓶接入2粒(黃豆粒大小)活化好的牛樟芝菌種，封口 ；置于旋轉式搖床上轉速120rpm、溫度28°C條件下培養10-12天，成為液體牛樟芝種子。
【文檔編號】C05G3/00GK105906415SQ201610238278
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年4月18日
【發明人】程顯好, 馮路瑤, 劉靜, 孫磊, 郝寶健
【申請人】魯東大學