一種使用dna納米結構對疏水性納米粒子相轉換的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物分析W及生物醫學應用領域，具體設及合成一種含有適配體的 DNA納米結構，并將該DNA納米結構用于疏水性納米粒子的相轉換。
【背景技術】
[0002] 疏水性納米顆粒具有特殊的物理和化學性質，隨著納米科學與技術的發展，它們 在生物醫生上的潛在應用價值，引起了各相關領域研究者的關注，例如生物傳感，細胞成像 和癌癥治療等。氧化鐵納米顆粒的高磁敏性、化學穩定性和低毒性已被深入研究，運些特性 使得它不僅可W用作磁共振成像的巧t影劑，而且在藥物遞送，細胞追蹤W及磁熱療等方 面也得到廣泛應用。
[0003] 當前，商業化的納米粒子通常是在水介質中通過共沉淀的方法合成，但是由于水 的沸點低，導致運種條件合成的納米粒子尺寸范圍分布較廣且結晶性能較差。為了制備高 質量且顆粒尺寸分布均勻的納米粒子，很多高沸點的非極性溶劑被用作制備納米顆粒的反 應介質。但是，納米粒子用非極性溶劑合成常常包裹疏水性配體，運些配體不溶于水，導致 氧化鐵納米粒子在生物應用上受到限制。
[0004] 一般方法合成的納米粒子水溶性和生物相容性都較差，且容易團聚，運就使得它 們需要進行表面修飾和功能化之后，才能滿足生物醫學應用上的要求。最近，很多相轉換試 劑通過配體交換的方法來進行疏水性納米粒子的相轉換，比如二琉基下二酸，硅烷等。通過 相轉換方法將疏水性納米粒子轉換成親水性納米粒子，一般都是單功能的，它們必須與生 物基團結合進行進一步的表面功能化修飾才具有分子識別的功能，運樣就使整個過程變得 繁瑣費時。因此，發展一種溫和而通用的疏水性納米粒子的相轉換方法，并且實現納米粒子 表面生物功能化成為一個迫切的需求。本發明提供的相轉換方法在進行疏水性納米粒子轉 換成親水性納米粒子的同時也對納米粒子進行表面生物功能化，方法快速簡便。
[0005] 1990年，Seeman和Mirkin等首先合成功能化的DNA納米結構，很快就掀起了人們 對DNA功能化的興趣。通過DNA自組裝可W形成不同形狀和結構的分子，其中，Ξ維的DNA 四面體納米結構具有極好的機械硬度和結構穩定性。DNA四面體結構類似金字塔，四個面均 為Ξ角形，六條邊由雙鏈DNA組成，可W通過四條單鏈DNA退火而迅速自組裝起來，而且每 個頂點都可W用化學基團或者生物分子進行功能化修飾。利用運些特性，DNA四面體在傳 感構建器，藥物遞送W及分子邏輯學上有著廣泛的應用范圍。本發明將DNA納米結構作為 相轉換試劑進行疏水性納米粒子的相轉換，在國內外有關DNA納米結構方面的文獻和專利 中，還未有用DNA納米結構進行疏水性納米粒子相轉換的報道。
【發明內容】
[0006] 本發明目的在于制備高質量且顆粒尺寸分布均勻的納米粒子，提供了一種使用 DNA納米結構對疏水性納米粒子相轉換的方法。本發明克服了現有相轉換試劑單功能的不 足，成功對疏水性納米粒子進行表面生物功能化，轉換后的親水性納米粒子具有祀向功能， 可w提高被細胞攝取的能力，用于細胞成像。
[0007] 為實現上述目的，本發明采用如下技術方案： 一種使用DNA納米結構對疏水性納米粒子進行相轉換的簡易方法的具體步驟為： (1)制備含有適配體的DNA四面體溶液：用緩沖液將等量的DNA鏈A，B，C，D混合，加熱 到95°C，然后迅速冷卻到4°C，制得DNA四面體溶液。
[0008] 其中，所述DNA鏈A、B、C、D序列如SEQIDNO. 1-4所示；所述緩沖液為TM緩沖 液。DNA包括Ξ條具有簇基修飾的DNA鏈(鏈A，B，C)和一條含有適配體序列的DNA鏈(鏈 D)(具體序列見表1)。鏈D含有的適配體序列可W特異性結合在癌細胞膜表面高表達的核 仁蛋白，從而提高了被細胞攝取的能力，并使帶有磁性納米粒子功能化的DNA四面體對癌 細胞具有祀向能力。
[0009] (2)合成DNA四面體功能化的親水性納米粒子：步驟（2)所述合成DNA四面體功 能化的親水性納米粒子具體操作為：將0. 2ml10〇μκ/ιΛ疏水性納米粒子與步驟（1)制得的 0. 2mLΙΟμΜDNA四面體溶液混合，放在4°C下劇烈震蕩1化后，移去有機溶劑，離屯、洗涂，即 得到分散在水溶液中的親水性納米粒子。所述的疏水性納米粒子為氧化鐵納米粒子或稀± 上轉換發光納米粒子。所述的疏水性納米粒子是分散在有機溶劑中的，其中：氧化鐵納米粒 子分散在氯仿中，稀±上轉換發光納米粒子分散在環乙燒中。
[0010] (3)W分散在氯仿中被油酸包裹的氧化鐵納米粒子為例，推測機理為：DNA四面體 的Ξ個頂點存在簇基，簇基對氧化鐵納米粒子表面的Ξ價鐵粒子具有強親和力，因此，DNA 四面體納米結構可W通過配體交換與油酸包裹的氧化鐵納米粒子牢牢結合，從而使顆粒具 有水溶性。
[0011] 本發明的顯著優點在于： 本發明將DNA納米結構作為相轉換試劑，不僅無毒高效，而且在進行相轉換的同時也 完成了對納米粒子的表面功能修飾，快速簡便，轉換后的親水性納米粒子不僅具有祀向功 能，而且提升了被細胞攝取的能力。
[0012] 本發明使用DNA納米結構發展了一種簡易而普遍的方法用于相轉換的同時也將 疏水性納米粒子進行了表面生物功能化。所設計的DNA四面體納米結構不僅可W將氧化鐵 納米粒子從有機相拖到水相，而且給予了它們特殊的祀向性。值得關注的是，該方法基本上 可W適用于不同類型的疏水性納米粒子，比如上轉換稀±納米粒子。此外，功能核酸比如適 配體，DNAzymes，siRNA，或反義DNA都可W很容易被修飾到所要的四面體DNA納米結構中去 構建多功能的相轉換試劑。基于運些顯著的優點，本發明提供的相轉換方法將為擴大疏水 性納米粒子在生物醫學上的應用提供一個新的機遇。
【附圖說明】
[0013] 圖1為12. 5%聚丙締酷胺凝膠電泳分析圖。
[0014] 圖2 (a)為相轉換之前氧化鐵納米粒子分散在氯仿中的透射電鏡圖；（b)為相轉 換之后氧化鐵納米粒子分散在水中的透射電鏡圖；（C)相轉換前后氧化鐵納米粒子在溶劑 中的分散性。（d)相轉換后親水性氧化鐵納米粒子的磁分離現象。
【具體實施方式】
[0015] 為了驗證設計的可行性，下面結合【具體實施方式】對本發明所述的技術方案做進一 步的說明，但是本發明應用不僅限于此。
[001引實施例1 合成功能化的DNA四面體 將DNA鏈A，B，C和D在TM緩沖液（10mlTris-肥l，50mMMgClz，抑8. 0)中等摩爾混 合，終濃度為10μΜ。將DNA混合后加熱到95°C再迅速冷卻到4°C，即可得到含有適配 體的DNA四面體溶液。通過聚丙締酷胺凝膠電泳可驗證已形成DNA四面體納米結構（見圖 1)。
[0017] 表1本發明所用到的DNA序列詳細信息
實施例2 分散在氯仿中的氧化鐵磁性納米粒子的相轉換 將含有100μκ/ηΙ氧化鐵納米粒子的0.2mL氯仿溶液(從美國大洋納米科技公司 (Springdale,AR，USA)購買)緩慢加入0.2血含有10μΜDNA四面體溶液中，混合液劇烈 震蕩反應12h之后，氧化鐵納米粒子就從氯仿層轉到水層。然后將水溶液移到微型管中， 用TM緩沖液離屯、分離洗涂后，重新分散在TM緩沖液中即得水溶性氧化鐵納米粒子。
[0018] 附圖2曰、化是相轉換前后氧化鐵納米顆粒的透射電子顯微鏡圖。附圖2c是相轉 換前后的氧化鐵納米粒子在氯仿中和在水中的分散圖，附圖2d是相轉換后氧化鐵納米粒 子在水溶液中的磁性分離現象圖。
[001引 實施例3 分散在環己燒中的稀±上轉換發光納米粒子的相轉換 將含有100μκ/ιΛ稀±上轉換發光納米粒子的0. 2mL環乙燒溶液緩慢加入0. 2mL包 含10μΜDNA四面體的水溶液中，混合液劇烈攬拌12h之后，稀±上轉換發光納米粒子就 從環乙燒層轉到水層了，將水層溶液轉移到微型管中。多余的DNA四面體通過離屯、分離和 洗涂后，從親水性稀±上轉換發光納米粒子水溶液中移出。最后，將親水性稀±上轉換發光 納米粒子重新分散在TM緩沖液中即得分散在水溶液中的稀±上轉換發光納米粒子。
[0020] W上所述僅為本發明的較佳實施例，凡依本發明申請專利范圍所做的均等變化與 修飾，皆應屬本發明的涵蓋范圍。
【主權項】
1. 一種使用DNA納米結構對疏水性納米粒子相轉換的方法，其特征在于：將DNA四面 體納米結構作為相轉換試劑，與不能在水溶液中分散的疏水性納米粒子充分混合震蕩后， 即將疏水性納米粒子轉換成親水性納米粒子。2. -種使用DNA納米結構對疏水性納米粒子相轉換的方法，其特征在于：具體步驟 為： (1) 制備含有適配體的DNA四面體溶液； (2) 合成DNA四面體功能化的親水性納米粒子。3. 根據權利要求2所述的使用DNA納米結構對疏水性納米粒子相轉換的方法，其特征 在于：步驟（1)所述制備含有適配體的DNA四面體溶液，具體操作為：用緩沖液將等摩爾的 DNA鏈A、B、C、D混合，加熱到95°C，然后迅速冷卻到4°C，制得DNA四面體溶液。4. 根據權利要求3所述的使用DNA納米結構對疏水性納米粒子相轉換的方法，其特征 在于：所述DNA鏈A、B、C、D序列如SEQIDNO. 1-4所示；所述緩沖液為TM緩沖液。5. 根據權利要求2所述的使用DNA納米結構對疏水性納米粒子相轉換的方法，其特 征在于：步驟（2)所述合成DNA四面體功能化的親水性納米粒子具體操作為：將0. 2ml lOOPg/mL疏水性納米粒子與步驟（1)制得的0. 2mL1〇μΜDNA四面體溶液混合，放在4°C下 劇烈震蕩12h后，移去有機溶劑，離心洗滌，即得到分散在水溶液中的親水性納米粒子。6. 根據權利要求5所述的使用DNA納米結構對疏水性納米粒子相轉換的方法，其特征 在于：所述的疏水性納米粒子為氧化鐵納米粒子或稀土上轉換發光納米粒子。7. 根據權利要求5所述的使用DNA納米結構對疏水性納米粒子相轉換的方法，其特征 在于：所述的疏水性納米粒子是分散在有機溶劑中的，其中：氧化鐵納米粒子分散在氯仿 中，稀土上轉換發光納米粒子分散在環乙烷中。
【專利摘要】疏水性納米粒子在生物分析以及生物醫學應用上具有巨大的潛能，本發明提供了一個簡易的方法，使用DNA納米結構作為相轉換試劑，該DNA納米結構是由四條單鏈DNA自組裝而形成的DNA四面體結構，其中三條鏈末端修飾羧基，另外一條單鏈DNA含有適配體，該適配體可以特異性結合癌細胞膜表面高表達的核仁蛋白，從而增加了納米粒子的靶向能力并且提高了細胞的攝取能力。使用DNA四面體作為相轉換試劑，不僅無毒，方便，而且只需進行簡單的分離，便可制得穩定性高和分散性好的親水性納米粒子。
【IPC分類】C01G49/06
【公開號】CN105366730
【申請號】CN201510834218
【發明人】許小平, 吳淑賢, 楊黃浩, 李娟 , 洪誠毅
【申請人】福州大學
【公開日】2016年3月2日
【申請日】2015年11月26日