甾醇類化合物在抑制反硝化微生物脫氮活性中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于農田氮素損失阻控技術研究領域，具體涉及一種留醇類化合物在抑制 反硝化微生物脫氮活性中的應用。
【背景技術】
[0002] 自20世紀70年代以來，我國化肥氮的年使用量快速增加，對我國農業發展發揮了 巨大作用。但是，過量氮肥的施用和大量氮素的流失，不僅造成資源浪費和經濟損失，而且 導致環境污染問題日趨嚴重。我國氮肥在農田去向比例中，作物吸收只占35%、氨揮發損失 11 %、硝化-反硝化損失34 %、淋洗損失2 %、地表徑流損失5 %、未知部分13 %，氮肥利用 率比發達國家低10~20個百分點。因此，在我國農業高度集約化種植條件下，如何通過調 控氮素損失的關鍵過程，提高氮肥利用率，減少氮素損失，同時緩解由此造成的環境問題， 是農田氮素調控領域的研究熱點。
[0003] 反硝化是農田氮素損失的主要途徑之一，是由反硝化微生物將硝酸鹽轉化還原為 氮氣和氧化亞氮的生物學過程。目前針對反硝化氮素損失的調控措施中，主要通過施用硝 化抑制劑來抑制土壤硝化作用，從而減少硝酸鹽產生。但對于已被轉化成硝酸鹽的氮素，需 要抑制其反硝化損失，使更多的硝酸鹽能被作物利用。然而，以往研究大都忽略了自然界中 植物對反硝化的抑制效應。浮萍是一種在農田地區廣泛存在的小型浮葉植物，對農田生態 系統氮素調起了重要作用。植物根系能通過分泌特定的化合物或本身植物殘體，改變根際 微生物的反硝化活性和群落結構。因此，強化植物-微生物的根際效應，如添加能抑制反硝 化微生物脫氮的特定化合物，將有效減少土壤硝酸鹽的反硝化損失，提高氮肥利用率，為農 田氮素調控技術提供新的方法和思路。
[0004] 目前市場上常用的能減少農田硝酸鹽損失的制劑，主要以硝化抑制劑類的化學品 為主，如2-氯-6-三氯甲基吡啶（CP)、雙氰胺（D⑶）、3, 4-二甲基吡唑磷酸鹽（DMPP)，主要 作用是抑制土壤硝化過程，它們對于抑制氮素主要損失的反硝化過程有較大局限性。而且， 這些化合物成本較高，在土壤和水體中易流失和被微生物分解。至今，植物源能抑制微生物 反硝化除氮的特定化合物鮮有報道，而這類"綠色"物質在植物-微生物根際信號傳導過程 起了重要作用，能切實抑制反硝化微生物的活性，在農田氮素損失阻控領域具有廣闊的應 用前景。
【發明內容】
[0005] 解決的技術問題：本發明提供一種留醇類化合物在抑制反硝化微生物脫氮活性中 的應用。該物質能通過抑制反硝化微生物的活性來減弱氮素去除效率，以解決農田生態系 統中大量氮素反硝化損失（氮肥利用率低）的技術難題，同時本發明的"植物源"物質也能 改善外加化學硝化抑制劑易流失和被微生物分解的問題，大大增強對反硝化微生物轉化農 田土壤硝酸鹽的抑制效率，節約外加氮肥增效劑的成本。
[0006] 技術方案：留醇類化合物豆甾醇
[0007]
在抑制反硝化微生物脫氮活性中的應用。
[0008] 所述反硝化微生物為焚光假單胞菌（Pseudomonasfluorescens)。
[0009] 上述留醇類化合物豆留醇抑制熒光假單胞菌的反硝化活性。
[0010] 上述留醇類化合物豆留醇減少農田氮素反硝化損失。
[0011] 上述甾醇類化合物豆甾醇添加濃度為5-60mg·L1。
[0012] 抑制熒光假單胞菌反硝化活性的組合物，有效成分為上述留醇類化合物豆甾醇。
[0013] 減少農田氮素反硝化損失的組合物，有效成分為上述留醇類化合物豆甾醇。
[0014] 有益效果：⑴本發明化合物能在低劑量下高效抑制反硝化微生物的活性，避免 實際應用過程中因抑制有益微生物生長而引起土壤微生物群落結構失衡現象；
[0015] (2)本發明化合物是一種脂溶性化合物，在土壤和水體中不易流失，能保證應用的 穩定性和高效性。
[0016] (3)本發明提供一種"綠色"反硝化抑制劑，可以減少農田生態系統中硝酸鹽的反 硝化損失，從而提高土壤肥力。
【附圖說明】
[0017] 圖1為本發明的浮萍提取物活性組分的GC/MS分析譜圖。本發明抑制劑豆甾醇為 30.llmin出峰的物質；
[0018] 圖2為本發明脫氮抑制物質與其他甾醇抑制率的比較（mean土SE，n= 3)，不同的 小寫字母表示組間有顯著差異（P〈〇. 05,LSDtest);
[0019] 圖3為本發明脫氮抑制物質劑量-熒光假單胞菌脫氮效率抑制率關系曲線 (mean土SE，η= 3) 〇
【具體實施方式】
[0020] 下面的實施例可使本專業技術人員更全面地理解本發明，但不以任何方式限制本 發明。
[0021] 對太湖地區篩選到紫背浮萍（Spirodelapolyrrhiza)的提取物進行提取、分離和 生物活性檢測，并對活性組分進行GC/MS鑒定。在紫背浮萍提取物活性組分中分離鑒定到 3種留醇類化合物，其中豆留醇stigmastero1 (分子量：412. 70)，具有顯著的反硝化抑制效 果。本發明中的反硝化微生物為常見的熒光假單胞菌。該化合物在添加濃度為5-60π^·?/ 時，可對熒光假單胞菌脫氮率有約5-25 %的抑制效果。本發明的植物源化合物在微生物脫 氮過程中主要起化學信號作用，抑制了反硝化微生物的活性，而不是抑制了反硝化微生物 的生長。
[0022] 實施例1高效抑制反硝化的甾醇類化合物與同類物質間的效果比較
[0023] 1. 1實驗設計
[0024](1)標準品：3種甾醇類化合物，豆甾醇（Stigmasterol)，菜油甾醇（Campesterol) 和β-谷留醇（β-sitosterol)，均購于Sigma-Aldrich公司（St.Louis,M0，USA)，并溶解 于CH2C12 中。
[0025] (2)微生物菌株：熒光假單胞菌（ACCC01047)，購于中國農業微生物菌種保藏管 理中心。
[0026] (3)LB培養基：10g/Ltryptone，5g/Lyeastextract，10g/LNaCl，pH7.0〇
[0027] (4)反硝化培養基：0· 72g/LKN03,1.Og/LKH2P04,0.20g/LMgS04·7H20,2. 8g/L C4H4Na204 · 6H20,pH7. 0〇
[0028] (5)生物活性實驗
[0029]收集在LB培養液中活化20h的熒光假單胞菌，離心lOmin(5, 000g，4°C)，然后重 新懸浮于無菌的反硝化培養液中。lmL熒光假單胞菌菌液和20μL各作用物質，添加到含 有19mL反硝化培養液的50mL三角瓶中，使得最終作用物質的濃度為20mg·L\在搖床中 30°C，120rpm培養。對照為添加20yL CH2C12，實驗設置3個重復。培養72h后，吸取lmL菌 液離心lOmin(10, 000g)，上清液測定總氮含量（堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法）。菌 液的生物量用比濁法測定，即用分光光度計（Bio-Rad3000 ;USA)測定菌體在600nm處吸光 度。熒光假單胞菌脫氮率（％)和抑制率（％)的計算方法如下：
[0032] (6)數據分析
[0033] 數據處理結果均以（mean土SE)表示，采用SPSS18.0統計軟件進行單因素方差分 析及組間兩兩比較。
[0034] 1. 2實驗結果
[0035] 對浮萍提取物活性組分進行GC/MS分析，鑒定到3種含量高的留醇類化合物，在 30.llmin(圖1)出峰的物質為本發明抑制劑豆留醇。通過3種留醇類化合物的抑制效果反 證實驗，發現在濃度為20mg·L1時，同一類化合物的不同物質對熒光假單胞菌脫氮率有不 同的影響（表1)。在添加濃度20mg·L1本發明抑制劑處理后，豆甾醇對熒光假單胞菌的 脫氮率有最顯著的抑制作用（P〈〇. 05)，抑制率約為19.3% (圖2)。但其他2種作用物質添 加后對熒光假單胞菌的脫氮率無顯著影響。而且，豆留醇的抑制率與其他2種作用物質有 顯著差異（圖2)。結果表明，本發明的抑制劑豆留醇對熒光假單胞菌的脫氮率有特定的抑 制效果。
[0036] 相對于對照，這3種作用物質的添加對熒光假單胞菌的生長基本無影響，各處理 的〇D6。。值在0.45之間（表1)。可見，本發明的抑制劑主要是抑制了熒光假單胞菌的反硝 化活性。
[0037] 另外，由于添加20mg · L 1豆留醇到反硝化培養液中，其總有機碳濃度（T0C)相對 于反硝化培養液中T0C占低于2%的含量，因此，本發明的抑制劑主要是起化學信號作用抑 制反硝化活性，而不是簡單抑制反硝化微生物的生長。
[0038] 表 1
[0039]
[0040] *不同的小寫字母表示組間有顯著差異（P〈0. 05,LSDtest)
[0041] 實施例2抑制劑豆留醇對熒光假單胞菌脫氮效率的抑制作用
[0042] 2. 1實驗設計
[0043] 分別添加5, 10, 20, 40, 60mg·L1的本發明抑制劑豆甾醇于反硝化培養液中，再添 加lmL熒光假單胞菌菌液，于搖床中30°C，120rpm培養，對照為CH2C12。培養72h后，菌液 按照1. 1中方法離心，上清液測定總氮濃度，計算各處理后的脫氮抑制率（％ )。
[0044] 2. 2實驗結果
[0045] 本發明抑制劑在添加濃度為5-60mg*L1時，對熒光假單胞菌的脫氮率有約5-25% 的抑制效果（圖3)。由于在添加40mg*L1濃度時，脫氮抑制率為24. 6%，已基本達到最高 值，所以考慮到成本，建議在應用過程中豆甾醇的添加量為40mg*L1左右，同時為應用于其 他反硝化菌株的劑量作參考。
【主權項】
1. 甾醇類化合物豆甾醇在抑制反硝化微生物脫氮活性中的應用。2. 根據權利要求1所述的應用，其特征在于所述反硝化微生物為熒光假單胞菌 (Pseudomonas fluorescens)〇3. 根據權利要求2所述的應用，其特征在于所述留醇類化合物豆留醇抑制熒光假單胞 菌的反硝化活性。4. 根據權利要求2所述的應用，其特征在于所述留醇類化合物豆留醇減少農田氮素反 硝化損失。5. 根據權利要求1~4任一所述的應用，其特征在于所述留醇類化合物豆留醇添加濃 度為 5_60mg · L ^6. 抑制熒光假單胞菌反硝化活性的組合物，其特征在于有效成分為權利要求1所述的 甾醇類化合物豆甾醇。7. 減少農田氮素反硝化損失的組合物，其特征在于有效成分為權利要求1所述的甾醇 類化合物豆甾醇。
【專利摘要】甾醇類化合物在抑制反硝化微生物脫氮活性中的應用，結構式為，本發明化合物能在低劑量下高效抑制反硝化微生物的活性，避免實際應用過程中因抑制有益微生物生長而引起土壤微生物群落結構失衡現象；本發明化合物是一種脂溶性化合物，在土壤和水體中不易流失，能保證應用的穩定性和高效性；本發明提供一種“綠色”反硝化抑制劑，可以減少農田生態系統中硝酸鹽的反硝化損失，從而提高土壤肥力。
【IPC分類】C05G3/08
【公開號】CN105330493
【申請號】CN201510767401
【發明人】陸玉芳, 施衛明, 孫力
【申請人】中國科學院南京土壤研究所
【公開日】2016年2月17日
【申請日】2015年11月11日