通過早期引入不規則結構,生產生物成像的納米顆粒及其制造方法

專利名稱：通過早期引入不規則結構,生產生物成像的納米顆粒及其制造方法
技術領域：
本發明涉及通過早期引入不規則的表面結構，高產率地制備在水溶液內具 有高度分散性、生物相容性和靶向性的生物成像的納米顆粒的方法。
背景技術：
由于建立了在含表面活性劑的有機溶劑內化學合成具有均勻尺寸分布的疏 水無機納米顆粒的方法，因此，進行了各種嘗試將該方法付諸使用。特別地， 由于在水溶液中制備的納米顆粒顯示出比有機溶劑和水中制備的那些大得多的 非均勻尺寸分布，是最便宜、最環境友好，和地球上存在的最有用的溶劑，因 此在有機溶劑內制備的具有均勻尺寸分布的疏水納米顆粒的表面改性以便穩定 地分散在水溶液內是非常重要的且是研究者的主要關注領域。可溶量子點
(quantum dots )或在其中心處僅僅含單一量子點或單一無機納米顆粒和在其表 面處粘結具有有用官能團的有機材料的可溶的納米顆粒可有效地用作生物成像 材料以及制造一些類型的納米結構，例如生物傳感器或記憶器件的基礎材料。 因此，對這些納米顆粒的表面改性進行了深入的研究。
這種表面改性的常用方法包括下述步驟使疏水納米顆粒與過量含硫醇
(-SH)基的有機配體反應，從而用金屬硫醇鹽(M-S)鍵替代在納米顆粒表面 上的所有表面活性劑配體并向外暴露親水基團，從而導致親水納米顆粒；和在 納米顆粒的親水基團與官能分子，例如靶向生物分子之間形成共價鍵，獲得僅 僅在其中心處包括無機納米顆粒的生物成像的納米顆粒(參見圖l)。這種共價 鍵由在納米顆粒的親水基團和新的官能分子之間的酰胺鍵或酯鍵組成。研究的 主要目的是其中選自胺(NH2)、羧酸(COOH)、硫醇和羥基(OH)中的親 水基團借助烴鏈連接到硫醇基上的極性有機配體。公知這些有機配體與量子點(例如，CdSe、 ZnS,或核/殼CdSe/CdS、 CdSe/ZnS和類似物)、貴金屬納米顆 粒(例如，Au、 Ag)或氧化鐵磁性納米顆粒容易形成金屬-硫醇鹽(M-S)鍵，
所有這些的特征在于在表面上含有豐富的金屬成分。然而，由于在中性或近中 性的溶液內羥基或胺基容易聚集且沉淀，因此沒有進行進一步研究。另一方面， 由于羧酸基在很大程度上以電離狀態存在于中性溶液內，在溶液內顯示出高的 分散性和穩定性，因此它廣泛地用作親水基團以供通過酰胺鍵耦合官能分子到 納米顆粒上。
然而，上述方法必須經歷在弱酸性水溶液內活化在納米顆粒表面上的羧酸 基的步驟，所述弱酸性水溶液將引起許多納米顆粒聚集和沉淀(WC Chan和S Nie, Science 281: 2016, 1998; Wen Jiaiig, et al.， Chem. Mater. 18: 872, 2006 )。特
別地，在其中磁性納米顆粒的情況下，聚集和沉淀更加嚴重。聚集和沉淀的這 種納米顆粒難以在下一步中鍵合到官能分子上，和即使進行鍵合到官能分子上， 官能分子也僅僅鍵合到聚集的納米顆粒表面上(參見圖1的步驟B，右惻的一 組)。這樣制備的納米顆粒太大，以致于無法沿著血管遷移并顯示出顯著降低 的分散性。此外，在使用量子點的情況下，納米顆粒的熒光顯著下降，這歸因 于自猝滅。由于最終必須除去這些沉淀和僅僅使用溶液層的充分地分散的部分， 因此存在大量的納米顆粒損失的嚴重問題。
為了克服聚集和沉淀問題，報道了通過使疏水無機納米顆粒直接與具有硫 醇基的聚乙二醇(PEG)反應，制備具有金屬-硫醇鹽(M-S)鍵的有機/無機 復合納米顆粒的方法(美國專利No.7,041，371)。然而，所公開的該方法仍然具 有反應產率低的問題，這是因為通過長烴鏈連接的親水硫醇基必須滲透到被表 面活性劑包圍的納米顆粒的表面內。
為了嘗試克服現有技術中親水納米顆粒聚集和沉淀的問題，本發明的發明 人發現，因具有均勻結構的親水納米顆粒表面上存在的過量親水基團導致的氫 鍵吸引，引起這種聚集和沉淀。基于上述發現，發明人開發了在結構上阻礙這 種氫鍵吸引并在整個反應工藝過程中固定單獨和獨立的納米顆粒的方法。本發 明的方法可制備生物成像納米顆粒，在沒有引起聚集和沉淀的情況下，它在其中心處含有單一的顆粒，且顯示出優良的物理性能，例如均勻的尺寸分布，高 的分散性和在溶液內的穩定性，生物相容性、耙向性和類似性能。

發明內容
本發明的目的是提供制備生物成像納米顆粒的方法，其中通過借助部分表 面改性，早期引入不規則結構到納米顆粒的表面內，允許在結構上妨礙因納米 顆粒內部氫鍵吸引導致的聚集和沉淀現象，從而在沒有損失納米顆粒的情況下， 高產率地在非極性有機溶劑或水溶液內制備具有高分散性和穩定性的生物成像 的納米顆粒。
本發明的另 一 目的是提供根據本發明方法制備的具有高的分散性和穩定性 的生物成像的納米顆粒。
本發明提供制備生物成像的納米顆粒的制備方法，該方法包括
1) 添加l-30當量含有通過8-20個碳原子的烴鏈連接的硫醇基和親水基的 有機配體到用表面活性劑保護的核或核/殼結構的疏水無機納米顆粒中，從而用 有機配體部分替代表面活性劑和在納米顆粒表面上形成金屬-硫醇鹽(M-S) 鍵，這導致產生其表面僅僅部分改性為親水性質且仍然維持它在非極性有機溶 劑內的單獨的分散性的疏水納米顆粒；
2) 將官能分子鍵合到在步驟l)制備的納米顆粒的表面上引入的親水基團 上，以提供納米顆粒表面官能度和不規則的結構，同時維持它們單獨的分散性； 和
3) 用其中至少兩個親水基團通過1-7個碳原子的烴鏈連接的有機配體替代 在步驟2)制備的納米顆粒表面上殘留的其余表面活性劑，從而將疏水納米顆粒 轉化成親水納米顆粒。
此外，本發明提供根據本發明方法制備的生物成像的納米顆粒，它僅僅在 其中含通過8 - 20個碳原子的烴鏈連接的硫醇基和親水基團的有機配體引入到 用表面活性劑保護的核或核/殼疏水納米顆粒表面內的部分處部分親水，但整體 上仍然疏水，并維持它們在非極性有機溶劑內單獨的分散性。本發明還提供根據本發明方法制備的生物成像的納米顆粒，它具有官能度 和不規則結構，這歸因于在納米顆粒的表面內引入的親水基團鍵合到官能分子 上，且僅僅在其中官能分子鍵合到其上的部分處部分親水，但整體上仍然疏水。
最后，本發明提供根據本發明方法制備的生物成像的納米顆粒，其中通過 用至少兩個親水基團借助1-7個碳原子的烴鏈連接的有機配體替代在納米顆粒 表面上殘留的其余表面活性劑，從而在整體上親水，并在水溶液內維持它們單 獨的分散性。
根據本發明的優選實施方案，借助分步的部分表面改性，在合成具有小于 或等于20納米的圓形形狀且具有熒光性能的核或核/殼納米顆粒或氧化鐵磁性 納米顆粒的條件下，在有機溶液內通過按序偶聯長鏈有機配體和官能分子到納 米顆粒上，和固定該顆粒的均勻度，從而制備具有不規則結構的疏水官能的生 物成像的納米顆粒。此外，上述納米顆粒的疏水性轉化成親水性，其中引入到 納米顆粒表面內的來自不規則結構的位阻防止納米顆粒內部的氫鍵吸引，從而
以100%的產率制備能在水溶液內維持單獨的分散性的生物成像的納米顆粒。


參考下述附圖，詳細地描述本發明的實施方案。 圖l描述了制備生物成像的納米顆粒的常規方法以及每一步中獲得的納米
顆粒的結構；
圖2描繪了根據本發明制備生物成像的納米顆粒的方法，以及在每一步中獲 得的納米顆粒的結構；
圖3示出了用作起始材料的量子點和本申請的實施例1 - 5中制備的量子點 的紅外光譜a)用作起始材料的CdSe/CdS-ODA量子點；b)實施例l中制備的 CdSe/CdS-DA量子點;c)實施例2中制備的CdSe/CdS (-DA ) ex (-MUA) 5量 子點；d)實施例3中制備的CdSe/CdS (-DA ) ex (-MUA-en-FA ) 5量子點;e) 實施例4中制備的CdSe/CdS (-MPA) ex (-MUA-aPEGa) 5量子點；f)實施例5 中制備的CdSe/CdS (-MPA) ex (-MUA-aPEGa-FA ) 5的量子點；圖4示出了用作起始材料的量子點和本申請的實施例l-5的量子點的透射 電子顯微圖(TEM) : a)用作起始材料的CdSe/CdS-ODA; b)實施例l中制備 的CdSe/CdS-DA量子點;c)實施例2中制備的CdSe/CdS (-DA) ex (-MUA ) 5 的量子點；d)實施例3中制備的CdSe/CdS (-DA ) ex (畫MUA畫en-FA ) 5的量子 點；e )實施例4中制備的CdSe/CdS (-MPA ) ex (-MUA-aPEGa) 5的量子點;f) 實施例5中制備的CdSe/CdS (-MPA) ex (-MUA-aPEGa-FA ) 5的量子點；
圖5示出了分別用作對照劑和靶向劑的用本申請實施例4和5的量子點處理 的HT1080細胞和KB細胞的熒光顯微圖像QD: CdSe/CdS ( -MPA ) ex (-MUA-aPEGa ) 5量子點用作對照；QD-FA: CdSe/CdS ( -MPA ) ex (-MUA-aPEGa-FA) 5量子點用作靶向劑；+ FA:存在過量游離的FA; -FA: 不存在游離的FA;
圖6示出了本申請的實施例6中制備的量子點的紅外光譜a) CdSe/CdS (-DA) ex (-MUA-aPEGa) 5量子點;b ) CdSe/CdS (-DA) ex ( -MUA-aPEGa) 10量子點;c) CdSe/CdS (-DA) ex (-MUA-aPEGa) 30量子點;
圖7示出了本申請實施例6中制備的量子點的TEM圖像a) CdSe/CdS (-DA ) ex (-MUA-aPEGa) 5量子點；b) CdSe/CdS (-DA) ex (-MUA-aPEGa) IO量子 占.
圖8示出了用作起始材料的磁性納米顆粒和本申請實施例7- ll中制備的磁 性納米顆粒的紅外光譜a)用作起始材料的SPION-OA納米顆粒；b)實施例 7中制備的SPION (-OA) ex ( MHA ) IO納米顆粒；c)實施例8中制備的SPION (-OA ) ex ( MHA-aPEGa-MTX ) 10的納米顆粒;d )實施例9中制備的SPION (隱MPA ) ex ( MHA-aPEGa-MTX) 10納米顆粒；e )實施例10中制備的SPION (-Lys )ex( MHA-aPEGa-MTX ) 10納米顆粒；f)實施例11中制備的SPION( -OA ) ex ( MHA-en-FA) 5納米顆粒；
圖9示出了用作起始材料的磁性納米顆粒和本申請的實施例7-IO中制備的 磁性納米顆粒的TEM圖像a)用作起始材料的SPION-OA納米顆粒；b)實施 例7中制備的SPION ( -OA ) ex ( MHA )10納米顆粒；c)實施例8中制備的SPION(-OA )ex( MHA畫aPEGa-MTX )IO納米顆粒；d )實施例9中制備的SPION(陽MPA ) ex ( MHA-aPEGa-MTX ) IO納米顆粒;e)實施例10中制備的SPION (-Lys ) ex
(MHA-aPEGa-MTX) 10納米顆粒；
圖10示出了用本申請的實施例11中制備的SPION (-OA ) ex ( MHA-en-FA ) 5磁性納米顆粒靶向的KB細胞的核磁共振(NMR)圖像。
具體實施例方式
制備生物成像的納米顆粒的常規表面改性方法導致生產率的顯著下降，這 是因為通過引入親水有機配體到其表面內制備的親水納米顆粒聚集和沉淀，這 種聚集和沉淀歸因于所引入的表面親水基團本身在水溶液內或者在與生物分子 的鍵合反應過程中均勻的結構引起的氫鍵吸引。
發明人已發現，在水溶液內具有均勻尺寸分布的親水納米顆粒的這種聚集 和沉淀歸因于親水有機配體的均勻結構引起的納米顆粒內部的氫鍵吸引。基于 上述發現，發明人開發了高產率地單獨分散在水溶液內的生物成像的納米顆粒 的制備方法，其特征在于借助逐漸的表面改性，早期引入不規則結構的官能有 機物質，例如生物相容的分子、靶向分子、絡合物或其混合物到納米顆粒表面 內，從而制備疏水納米顆粒，所述疏水納米顆粒顯示出生物相容性和/或靶向性； 然后將該疏水納米顆粒轉化成親水納米顆粒，這種轉化導致抑制因官能有機物 質的位阻引起的納米顆粒內部的氫鍵吸引。
特別地，本發明制備生物成像的納米顆粒的方法包括下述步驟
1 )添加l - 30當量含有通過8 - 20個碳原子的烴鏈連接的硫醇基和親水基的 有機配體到用表面活性劑保護的核或核/殼結構的疏水無機納米顆粒中，從而用 有機配體部分替代表面活性劑和在納米顆粒表面上形成金屬-硫醇鹽(M-S) 鍵，這導致產生其表面僅僅部分改性為親水性質且仍然維持它在非極性有機溶 劑內的單獨的分散性的疏水納米顆粒；
2)將官能分子鍵合到在步驟l)制備的納米顆粒的表面上引入的親水基團 上，以提供納米顆粒表面官能度和不規則的結構，同時維持它們單獨的分散性；和
3)用其中至少兩個親水基團通過1-7個碳原子的烴鏈連接的有機配體替代
在步驟2)制備的納米顆粒表面上殘留的其余表面活性劑，從而將疏水納米顆粒
轉化成親水納米顆粒。
如上所述，常規的方法可通過在含表面活性劑的有機溶液內合成具有均勻 尺寸分布的疏水納米顆粒，在納米顆粒和有機配體(所述有機配體含有用短烴
鏈連接的硫醇基和親水基團)之間形成金屬-硫醇鹽(M-S)鍵，從而允許親
水官能團向外暴露，固定納米顆粒粉末的親水性。然而，具有向外暴露的親水 基團的這些親水納米顆粒極其容易聚集和沉淀，因此該納米顆粒不可能與其他 生物大分子成功地形成酰胺鍵或酯鍵。由于這一原因，沒有關于高產率地成功 制備在其中心處含有單一納米顆粒的生物成像納米顆粒的報道。
發明人已發現，如圖l所示，含具有向外暴露的胺或羧基的親水納米顆粒的 各種親水納米顆粒容易聚集和沉淀，這歸因于在納米顆粒表面上規則地自組裝
的過量親水官能團引起納米顆粒內部的氫鍵吸引。為了防止這一現象，如圖2 所示，本發明通過借助部分表面改性，引入不規則結構到納米顆粒表面內，首 次確立了完全抑制納米顆粒內部氫鍵吸引的最佳條件。在這些條件下，在沒有 引起任何聚集或沉淀的情況下，納米顆粒彼此獨立地分散。首先，在納米顆粒 表面上存在的僅僅一部分表面活性劑被含有通過8-20個碳原子的烴鏈連接的 硫醇基和親水基團的有機配體替代，從而導致在它們之間形成金屬-硫醇鹽 (M-S)鍵。之后，引入到納米顆粒表面上的親水基團與具有生物相容性和靶 向性的官能分子耦合，從而賦予納米顆粒官能度和不規則的結構。如此制備的 疏水官能的納米顆粒本身可有效地用于特定目的的生物成像，例如體外細胞實 驗。隨后，其余表面活性劑被含有通過1-7個碳原子的烴鏈連接的至少兩個親 水基團的有機配體替代，從而將疏水納米顆粒轉化成親水納米顆粒。結果，納 米顆粒內部的氫鍵吸引立體受阻，因此可高產率地制備在其中心處僅僅含有單 一納米顆粒且顯示出改進的分散性和穩定性的生物成像的納米顆粒。 參考圖2，更詳細地描述本發明制備生物成像的納米顆粒的方法。在步驟l)中，對疏水納米顆粒進行部分表面改性(參見圖2的步驟C)。 向含具有核10或核/殼12結構并用表面活性劑14保護的無機納米顆粒的有機溶
液中添加小量有機配體20,所述有機配體20含有能與納米顆粒表面上的金屬元 素形成化學鍵的硫醇基和親水基團，其中這兩個基團通過8-20個碳原子的烴鏈 連接，然后在劇烈攪拌下使該混合物反應。優選添加用量為l-30當量的有機配 體。結果，僅僅一部分表面活性劑被有機配體替代，和被替代的有機配體與納 米顆粒表面上的金屬元素形成金屬-硫醇鹽(M-S鍵)。
在上述步驟中，無機納米顆粒具有核或核/殼結構，其中它們的表面而不是 內部，化學計量地富含金屬元素，和所述金屬元素能與有機配體中的硫醇基借 助金屬-硫醇鹽(M-S)共價鍵化學鍵合。優選地，無機納米顆粒是貴金屬納 米顆粒、氧化鐵磁性納米顆粒或半導體納米顆粒，所述納米顆粒選自由屬于周 期表第II族的鋅、鎘和鉛中的一種元素和選自屬于周期表第VI族的硫、硒和碲 中的一種元素組成。更優選，無機納米顆粒的實例包括CdSe、 ZnS、 CdSe/CdS、 CdSe/ZnS、 PbS、 Au、 Ag、 Fe203、 Fe304和類似物，其中可沒有限制地使用由 能與硫醇基形成共價鍵的物質組成的任何納米顆粒。
由于鍵合到無機納米顆粒表面上的有機配體在分子內含有至少一個硫醇基 和至少一個親水基團，因此它可與無機納米顆粒形成至少一個金屬-硫醇鹽 (M-S)鍵，并提供至少一個鍵合位點以供與其他生物分子18，例如生物相容 分子、靶向分子、絡合物(生物相容-靶向分子)或其混合物耦合。
此外，在有機配體內的烴鏈長度優選范圍為8-20,以便維持納米顆粒的疏 水性。若烴鏈的長度小于8，則納米顆粒存在損失其疏水性的危險。此外，存在 親水基團包埋在表面活性劑下面的危險，這歸因于其鏈長太短，所述危險可引 起包埋的親水基團難以與官能分子形成共價鍵的問題。不存在烴鏈長度超過20 的有機配體，但如果它被開發的話，則也可使用這一配體。所添加的有機配體 的用量范圍優選為1-30當量。在添加小于或等于l當量的情況下，可能的情況 是，在最初狀態下保持的納米顆粒不具有被替代的有機配體，從而引起生產率 下降。在添加大于30當量的情況下，有機配體過度引入到納米顆粒表面上，從而增強了納米顆粒之間的氫鍵吸引，并引起納米顆粒聚集和沉淀。
能借助納米顆粒中的金屬元素和有機配體中的硫醇基之間的金屬-硫醇鹽 (M-S)共價鍵，化學鍵合到無機納米顆粒表面上的有機配體的數量隨粒度而
變化，且范圍可以是1-150。然而，證實若形成大于或等于30個M-S鍵且生物
相容分子鍵合到其上，則納米顆粒簇將形成聚集體，且不會分散在任何種類的 溶劑中。因此，適合于借助納米顆粒中的金屬元素和有機配體中的硫醇基之間
的金屬-硫醇鹽(M-S)共價鍵，化學鍵合到無機納米顆粒表面上的有機配體 的數量范圍優選為1 - 30。在納米顆粒表面處形成不規則結構的有機配體的合適 實例包括，但不限于，巰基十一烷酸、巰基十二烷酸、巰基十六烷酸和類似物。
即使在上述步驟中部分表面改性的無機納米顆粒含有向外暴露的親水基 團，由于親水基團連接到其上的烴鏈長度長，因此它們實際上沒有顯示出親水 性。此外，由于親水基團的數量顯著低于疏水表面活性劑，因此這些納米顆粒 仍然顯示出疏水性，且因此容易分散在無機溶劑內。
在步驟2)中，官能分子，例如生物相容分子、靶向分子、絡合物或其混合 物鍵合到在步驟l)制備的納米顆粒表面上引入的親水基團上，從而產生具有不 規則結構的疏水納米顆粒。由于如此制備的納米顆粒仍然疏水或者為兩性，因 此它們容易分散在非極性溶劑內且可用于生物成像的特定目的，例如體外細胞 實驗中。
在步驟3)中，將含有通過l-7個碳原子的烴鏈連接的至少兩個親水基團的 有機配體16加入到步驟2)制備的納米顆粒中，以替代在納米顆粒表面上殘留的 其余表面活性劑，這將導致疏水納米顆粒轉化成親水納米顆粒。在這一步驟中 的有機配體的合適實例包括，但不限于，巰基己酸、巰基乙酸、巰基丙酸、二 巰基琥珀酸、2-巰基乙醇、2-氨基乙二硫醇、賴氨酸、精氨酸、氨基戊酸和類
根據步驟l)和2)引入到納米顆粒表面內的不規則結構在維持單獨的分散 性方面扮演重要的作用，因為基本上防止了可能在步驟3 )中出現的納米顆粒內 部的氫鍵鍵合。此外，在步驟3)中引入的有機配體的1-7個碳原子的短烴鏈增加有機物質的極性，從而改進在水中的分散性。
本發明中所使用的官能分子是合成聚合物或生物成分，它們在沒有引起副 作用的情況下，顯示出高的生物相容性，且根據其條件具有生物降解性和各種 物理狀態，例如溶液、凝膠或膜。由于它們在其一個或兩個端基處含有選自胺 基、醛基和羧酸基中的一個官能團，因此該官能分子可與納米顆粒中的親水基 團形成酰胺或酯鍵。這種官能分子例舉生物相容分子、耙向分子、絡合物(生 物相容-靶向分子)或其混合物。
優選適合于本發明的生物相容分子在其兩個端基處含有選自胺基、醛基和 羧酸基中的一個官能團，或者在一個端基處含有這些官能團之一，和在另一端 基處含有具有1-7個碳原子的烷氧基或羥基。這些生物相容分子的合適實例可
包括，但不限于，聚乙二醇(PEG)、葡聚糖、聚(L-丙交酯)(PLLA)、聚 (DL-丙交酯)(PDLLA)、聚-DL-丙交酯/乙交酯共聚物(PLGA)、殼聚糖、 藻酸、透明質酸、膠原、肝素、聚(e-己內酯)和類似物。
此外，本發明所使用的靶向分子可在體內被特異地識別，含有胺基、醛基、 羧酸基、羥基和硫醇基之一，因此可借助酰胺鍵、酯鍵和硫酯鍵之一，連接到 有機配體或生物相容分子上。這些靶向分子的實例可包括，但不限于，葉酸、 氨甲喋呤(MTX)、對某一細胞具有選擇性的肽(例如RGD肽或tat肽)，或者 與一些抗原選擇性反應的抗體(例如對鏈霉抗生物素蛋白特異的生物素，對PSA 特異的PSA抗體)。
此外，生物相容分子和靶向分子可以以絡合物形式或其混合物形式使用， 其中所述絡合物借助酰胺鍵或酯鍵偶聯它們而制備。
含這些生物相容分子、靶向分子、生物相容-靶向絡合物的官能分子或其 混合物在其一個或兩個端基處含有選自胺基、瞎基和羧酸基中的一個官能團， 因此它們可與步驟2)中單獨地分散的納米顆粒中的羧酸、羥基或胺基形成酰胺 鍵或酯鍵，產生在其表面處具有不規則結構的納米顆粒。
如圖1的步驟B中所述，由于制備納米顆粒的常規方法進行聚集形式的親水 納米顆粒的酰胺或酯鍵鍵合反應，因此官能分子僅僅鍵合到聚集納米顆粒的表面上，且不可能接觸聚集體內部存在的納米顆粒，從而使得不可能進行所得的 鍵合反應。這一問題引起生物成像的納米顆粒的生產率下降且無法執行成像功 能。
然而，如圖2的步驟D中所述，本發明的方法首先通過分步的部分表面改性, 用借助8-20個碳原子的烴鏈連接的有機配體來部分替代納米顆粒表面處存在 的表面活性劑，然后將該官能分子偶聯到在納米顆粒表面內引入的這些有機配 體上，從而制備具有不規則結構的疏水官能的納米顆粒。然后用借助1-7個碳 原子的烴鏈連接的有機配體替代在納米顆粒表面處的其余表面活性劑，從而將 納米顆粒的疏水性轉化成親水性。根據本發明的方法，由于納米顆粒內部的氫 鍵吸引導致的納米顆粒的聚集和沉淀受到在其表面上引入的不規則結構的立體 阻礙，因此容易以100%的產率制備在其中心處含有單一納米顆粒的有機/無機 絡合物納米顆粒，同時在沒有損失量子點的情況下維持其量子效率。
根據本發明的優選實施方案，借助分步的部分表面改性，在合成具有小于 或等于20納米的圓形形狀且具有熒光性能的核或核/殼納米顆粒或氧化鐵磁性 納米顆粒的條件下，在有機溶液內通過按序偶聯長鏈有機配體和官能分子到納 米顆粒上，和固定該顆粒的均勻度，從而制備具有不規則結構的疏水官能的生 物成像的納米顆粒。此外，上述納米顆粒的疏水性轉化成親水性，其中引入到 納米顆粒表面內的來自不規則結構的位阻防止納米顆粒內部的氫鍵吸引，從而 以100%的產率制備能在水溶液內維持單獨的分散性的生物成像的納米顆粒。
此外，根據本發明的方法，只要在納米顆粒表面上的金屬元素可與具有硫 醇基的有機配體形成共價鍵，則與內部無機納米顆粒的組成組分無關，納米顆 粒能借助有機配體的親水基團鍵合到官能分子上。因此，本發明的方法可有效 地用于制備含有各種單一納米顆粒，以及量子點和磁性納米顆粒的有機/無機絡 合物納米顆粒。
另外，即使在無機納米顆粒和有機配體之間的共價鍵不是金屬-硫醇鹽 (M-S)鍵，當借助分步的部分表面改性，使胺基、羧酸基或羥基在引入到納 米顆粒表面內的有機配體末端處暴露時，這種親水基團也可鍵合到官能分子上，形成能立體阻礙納米顆粒內部氫鍵鍵合的不規則結構，然后將上述納米顆粒轉 化成親水納米顆粒。結果，本發明的方法可有效地應用于在轉化成親水納米顆 粒之前和之后，制備各種單獨分散的生物成像的納米顆粒。
此外，本發明提供根據本發明的方法制備的在其中心處含有單一無機納米 顆粒的生物成像的納米顆粒。
由于本發明生物成像的納米顆粒含有長烴鏈鍵合到在其中心處具有核或核 /殼結構的無機納米顆粒表面上的有機配體，因此該納米顆粒僅僅在其中有機配 體鍵合到其上的部分親水，但在其中有機配體沒有鍵合的部分內仍然大多數疏 水(本發明方法的步驟l)。此外，通過形成酰胺鍵或酯鍵，偶聯官能分子到所 述納米顆粒的親水基團上，本發明可制備具有不規則表面結構的疏水納米顆粒 (本發明方法的步驟2)。此外，本發明可提供親水納米顆粒，其中在所述納米 顆粒表面上殘留的其余表面活性劑可被具有至少兩個親水基團的有機配體的短 鏈替代，從而導致將其疏水性轉化成親水性。如此制備的親水納米顆粒可在整 個工序過程中，在水溶液內維持其單獨的分散性，這是因為納米顆粒內部的氫 鍵鍵合受到引入到納米顆粒表面內的不規則結構的位阻干擾(本發明方法的步 驟3 )。
本發明的親水生物成像的納米顆粒含有能在單一的納米顆粒表面處形成氫 鍵的許多親水有機配體，但官能分子在納米顆粒的一些部分處偶聯到有機配體 的長烴鏈上，這些部分將得使納米顆粒具有不規則結構。由于這種不規則結構 顯示出對在納米顆粒當中形成氫鍵的位阻效應，因此可制備具有均勻尺寸分布、 高的化學穩定性、在水溶液內的分散性、生物相容性、靶向性、光度和光穩定 性的納米顆粒且沒有因聚集和沉淀導致損失納米顆粒。
因此，本發明的納米顆粒不僅可有效地用作生物成像材料，而且作為基礎 醫療材料用于高效診斷和治療疾病上。
詳細地參考下述實施例，描述本發明，這些實施例不打算限制本發明的范圍。
在下述實施例中，具有核/殼結構的疏水納米顆粒CdSe/CdS-ODA用作量子點用起始材料，它具有在其表面上配位的十八烷基胺(ODA)表面活性劑。根 據JJ Li等人，Journal of the American Chemical Society 125: 12567-12575 ( 2003 ) 和WWYu等人，Chemistry of Materials 15: 2854-2860 (2003 )所述的方法，在 CdSe核納米顆粒表面上各自按序生長Cd、 S、 Cd、 S和Cd,其中各自為0.5層(總 計2.5層)。
此外，在下述實施例中，疏水氧化鐵納米顆粒Fe203-OA用作磁性納米顆粒 用起始材料，它具有在其表面上配位的油酸(OA)表面活性劑。根據K. Woo,等 人，Chemistry of Materials 16: 2814-2818( 2004 )和K. Woo等人，IEEE Transactions onmagnetics41,4137-4139(2005 )所述的方法，在惰性氛圍內合成Fe203或Fe304 納米顆粒并與10mol。/。前體Fe (CO) 5混合，從而制備在其表面處含有化學計量 地過量的鐵成分的磁性納米顆粒。然而，對于本領域的技術人員來說，顯而易 見的是，與制備方法無關，若疏水納米顆粒在其表面處的金屬成分比化學計量 的豐富，則可沒有區分地在實施例1 _ 11中使用它們。
此外，在下述實施例中的術語(-DA) ex和(-OA) ex是代表在納米顆粒表 面處過量癸胺或油酸的符號。盡管它們當中的一些配體被具有硫醇基的其他配 體替代，但由于其下降效果不顯著，和仍然存在過量的DA或OA,因此，它們 被沒有區分地描述為(-DA) ex或(-OA) ex。
實施例l:通過表面配體交換，制備半導體納米顆粒CdSe/CdS-DA
真空蒸發5ml CdSe/CdS-ODA疏水量子點溶液(8xl(T5M)，以除去溶劑， 并分散在20ml氯仿內。向這一分散體中添加1000當量癸胺(DA),并在黑暗的 惰性氛圍內攪拌該混合物2天。混合所得溶液與丙酮，并離心，分離沉淀。如此 制備的沉淀分散在氯仿內，制備20ml CdSe/CdS-DA溶液(2xlO-5M)。用紅夕卜 分光計和透射電子顯微鏡(TEM)分析CdSe/CdS-DA樣品，其中分別在圖3 (b) 和圖4(b)中示出了結果。通過在TEM圖像內，CdSe/CdS-DA量子點比 CdSe/CdS-ODA之間的距離短，來證實發生了表面配體的交換。
實施例2:制備部分表面改性的半導體納米顆粒CdSe/CdS(-DA)ex(-MUA)向17ml實施例1制備的CdSe/CdS-DA溶液中添加5當量巰基十 一 烷酸 (MUA),并在黑暗的惰性氛圍內攪拌19小時。濃縮所得溶液，并與丙酮混合， 和離心分離沉淀。如此制備的沉淀分散在氯仿內，制備17mlCdSe/CdS (-DA) ex (-MUA) 5溶液(2xlO-5M)。用紅外分光計和透射電子顯微鏡(TEM )分 析所得樣品，其中分別在圖3 (c)和圖4 (c)中示出了結果。TEM圖像證實， 不再發生納米顆粒的自組裝，這歸因于部分替代MUA引起的其均勻結構的破 壞，正如圖2的步驟C所示。
實施例3:制備靶向疏水的半導體納米顆粒CdSe/CdS ( -DA ) ex (-MUA-en-FA) 5
用氯仿稀釋2ml實施例2制備的CdSe/CdS (-DA) ex (-MUA) 5溶液到10ml 的最終體積。在添加5當量的二環己基碳二亞胺(DCC )到該稀釋劑中并在黑暗 的惰性氛圍內攪拌3小時之后，向其中添加50當量如下所述制備的en-FA并進一 步攪拌2小時。濃縮所得溶液，并與丙酮混合，和離心分離沉淀。將如此制備的 沉淀分散在氯仿內，制備10ml CdSe/CdS (-DA ) ex (-MUA-en-FA ) 5溶液 (4xlO—6M)。用紅外分光計和TEM分析en-FA鍵合到MUA上，其中分別在圖3 (d)和圖4 (d)中示出了結果。
制備靶向分子葉酸(FA)和乙二胺(en)的絡合物en-FA 將441mg ( lmmol)葉酸加入到10ml干餾的甲苯中，攪拌l小時，然后進行 真空蒸發，除去甲苯和濕氣。在將所得殘渣溶解在二甲基甲酰胺(DMF)內之 后，將含該混合物的燒瓶浸泡在冰洛中并攪拌10分鐘。將226mg( l.lmmol)DCC 加入到該混合物中，并進一步攪拌18小時。將2.5ml乙二胺(en)溶解在20ml DMF 內，向其中添加所述混合物，然后攪拌3小時，向所得溶液中添加水和乙腈，形 成沉淀，并用相同的溶劑重結晶，從而獲得224mgen-FA。
實施例4:制備生物相容和水溶性半導體納米顆粒CdSe/CdS (-MPA ) ex (-MUA-aPEGa) 5
用氯仿稀釋0.5ml實施例2制備的CdSe/CdS (-DA ) ex (-MUA ) 5溶液到最 終2.5ml的體積。在將6當量的DCC加入到稀釋劑中并在黑暗的惰性氛圍內攪拌3小時之后，向其中添加7當量的0，0，-雙(2-氨乙基)聚乙二醇(aPEGa， MW 1,000) 并進一步攪拌16小時。濃縮所得溶液，與丙酮混合，并離心，分離沉淀。將如 此制備的沉淀分散在氯仿內，制備10mlCdSe/CdS (-DA) ex (-MUA-aPEGa) 5 溶液(lxlo-6M)。
隨后，向如此制備的CdSe/CdS (-DA) ex (-MUA-aPEGa) 5溶液中添加100 當量，其中0.05 M NaOH和0.05 M巰基丙酸(MPA )在其內溶解的甲醇溶液并 攪拌。在將蒸餾水加入到所得溶液中，提取產物之后，向其中添加甲醇/乙酸乙 酯(l/4)的混合溶劑，并離心，以沉淀形式分離產物。將如此制備的沉淀分散 在PBS緩沖液(pH 7.4)內，制備10ml、 1xl(y6M的CdSe/CdS (-MPA ) ex (-MUA-aPEGa) 5溶液。通過紅外分光計和TEM證實了 aPEGa有利地鍵合到 MUA上且用MPA成功地取代可DA,其中圖3 (e)和圖4 (e)分別示出了結果。
實施例5:制備靶向、生物相容和水溶性半導體納米顆粒CdSe/CdS(-MPA) ex (-MUA-aPEGa-FA ) 5和利用它的生物成像
用氯仿稀釋2ml實施例2制備的CdSe/CdS (-DA) ex (-MUA) 5溶液到最終 10ml的體積。在將6當量的DCC加入到稀釋劑中并在黑暗的惰性氛圍內撹拌3小 時之后，向其中添加15當量如下所述制備的aPEGa-FA并進一步攪拌16小時。濃 縮所得溶液，與丙酮和甲醇混合，并離心，分離沉淀。將如此制備的沉淀分散 在氯仿中,制備4ml CdSe/CdS (-DA) ex (-MUA-aPEGa-FA ) 5溶液(1 x 1(T5M )。
隨后，將100當量通過溶解0.05M NaOH和0.05M MPA制備的甲醇溶液加入 到CdSe/CdS (-DA ) ex (-MUA-aPEGa-FA) 5溶液中并攪拌。在將蒸餾水加入 到所得溶液中提取產物之后，向其中添加甲醇/乙酸乙烯酯(1/4)的混合溶劑， 并離心，以沉淀形式分離產物。將如此制備的沉淀分散在PBS緩沖液(pH7.4) 內，制備10ml、 4xlO-6M的CdSe/CdS (-MPA ) ex (-MUA-aPEGa-FA ) 5溶液。 通過紅外分光計和TEM證實了 aPEGa-FA有利地鍵合到MUA上且用MPA成功地 取代DA，其中分別在圖3 (f)和圖4 (f)中示出了結果。
為了檢驗以上制備的FA-鍵合的量子點CdSe/CdS ( -MPA ) ex (-MUA-aPEGa-FA ) 5是否對某些細胞系顯示出選擇性，分別在存在或不存在FA ( 9x 10-6 M )的情況下，在含FA-鍵合的量子點CdSe/CdS ( -MPA ) ex (-MUA-aPEGa-FA ) 5 (2xl(T7M)或不含FA的量子點CdSe/CdS (-MPA ) ex (-MUA-aPEGa) 5 (2xl(T7M)的PBS溶液內，培養具有葉酸受體的KB細胞(人 纖維肉瘤細胞，ATCC， Manassas, VA)和不具有葉酸受體的HT1080細胞(人皮 樣肉瘤癌細胞，ATCC, Manassas, VA)，并在37。C下保溫15小時。在完成培養 之后，用PBS溶液洗滌細胞三次，并固定在載玻片的表面上。釆用熒光顯微鏡 觀察細胞，其中圖5示出了結果。
如圖5所示，當在培養溶液內不存在游離FA時，與沒有顯示出靶向性的量 子點CdSe/CdS ( -MPA ) ex (畫MUA-aPEGa ) 5相比，顯示出耙向性的量子點 CdSe/CdS (-MPA ) ex (-MUA-aPEGa-FA ) 5被較大量地選擇性轉移到具有FA 受體的KB細胞內。另一方面，當在培養溶液內存在豐富的游離FA時，在KB細 胞和HT 1080細胞之間不存在選擇性，這是因為大多數游離FA鍵合到相應的受 體上。
通過鍵合生物相容分子aPEGa和耙向分子FA,制備aPEGa-FA 將441mg ( lmmol) FA加入到10ml干餾甲苯中，撹拌l小時，然后進行真空 蒸發，除去甲苯和濕氣。在將所得殘渣溶解在14mlDMF內之后，將含該混合物 的燒瓶浸泡在冰洛內并攪拌10分鐘。在將226mg ( l.lmmol) DCC加入到該混合 物中并攪拌18小時之后，向其中添加lmmolaPEGa并進一步攪拌3小時。將二乙 醚加入到所得溶液中，形成沉淀，并用相同的溶劑重結晶，獲得179mg aPEGa-FA。
實施例6:制備半導體納米顆粒CdSe/CdS (-DA ) ex (-MUA-aPEGa) n ( n=5 、 10或30)
用氯仿稀釋0.5ml實施例l制備的CdSe/CdS-DA溶液，制備最終體積為10ml 的三種稀釋劑。向每一稀釋劑中分別添加5、 10和30當量MUA,并在黑暗的惰 性氛圍內攪拌19小時。濃縮每一溶液，與甲醇混合，形成沉淀，然后離心，分 離它。將如此制備的沉淀溶解在氯仿中，制備2.5ml每一CdSe/CdS (-DA) ex (-MUA) n ( n=5 、 10或30)溶液(4xlO—6M)。向以上制備的每一CdSe/CdS (陽DA ) ex (-MUA ) n (n=5、 10或30)溶液 中分別添加5.5、 11和33當量的DCC，并在黑暗的惰性氛圍內攪拌3小時。隨后， 向每一溶液中添加6、 12和36當量的aPEGa并進一步攪拌16小時。濃縮每一溶液， 與甲醇混合，形成沉淀，并離心，分離它。將如此制備的沉淀分散在氯仿內， 制備10ml每一CdSe/CdS (-DA ) ex (-MUA-aPEGa ) n (n=5、 10或30)溶液 (lxl(T6M)。通過紅外光譜(圖6)證實在所有這三種情況下，aPEGa成功地 鍵合到MUA上。
此外，在圖7的TEM圖像中發現，盡管在CdSe/CdS(-DA)ex(-MUA-aPEG) 5情況下，納米顆粒內部的氫鍵鍵合吸引不明顯，但在CdSe/CdS (-DA) ex (-MUA-aPEG) IO情況下，這種作用足夠強，以致于誘導納米顆粒聚集。在上 式中，當n為5和10時，納米顆粒充分地分散在氯仿內，但當n為30時，納米顆粒 形成不溶于任何溶劑內的聚集體，這是因為納米顆粒內部的氫鍵吸引太強，結 果不可能產生聚集的納米顆粒的TEM圖像。根據這些結果，證實當在納米顆粒 的表面處具有均勻結構的親水基團的數量增加時，納米顆粒內部的氫鍵吸引可 能不可控地增加。
還發現，在棄置的上清液內不存在可檢測的熒光，這表明產率為100%,所 述上清液通過在實施例l-6中的反應之后添加不溶性溶劑到量子點溶液內并離 心所得溶液而獲得。
實施例7:制備部分表面改性的磁性納米顆粒SPION (-OA) ex (-MHA )
10
用乙醇洗滌2ml粒度為8納米的疏水SPION-OA (用油酸保護的超級順磁氧 化鐵納米顆粒)的磁性納米顆粒溶液2次，在20ml甲苯內分散，然后加熱到IOO 'C。向該混合物中添加10當量巰基十六烷酸(MHA)，回流l小時并冷卻。在 濃縮2ml所得溶液之后，向其中添加小量乙醇，然后通過使用磁力分離部分表面 改性的磁性納米顆粒SPION (-OA) ex (-MHA) 10。用紅外分光計和TEM分析 所分離的部分表面改性的磁性納米顆粒，其中分別在圖8 (b)和圖9 (b)中示 出了結果。在TEM圖像中，SPION (-OA ) ex (-MHA ) IO納米顆粒之間的距離類似于SPION-OA的原因是如圖2的步驟C所述，用比OA短2個碳鏈的MHA零星 取代部分OA。此外，紅外光譜證實在約3300cm"處的O-H峰因取代MHA而增力口。 實施例8:制備靶向、生物相容和疏水的磁性納米顆粒SPION (-OA) ex (-MHA-aPEGa-MTX ) 10
向18ml實施例7中制備的SPION (陽OA) ex (-MHA ) 10溶液(3xl(T7M)中 添加30當量DCC并攪拌3小時。在將30當量aPEGa-MTX溶解在小量如下所述制 備的DMF內之后，將所得溶液加入到所述混合物中并攪拌16小時。在濃縮所得 溶液并與乙醇混合之后，通過使用磁力分離SPION ( -OA ) ex (-MHA-aPEGa-MTX ) 10并分散在9ml氯仿內。用紅外分光計和TEM分析1 ml 分散體，其中分別在圖8 (c)和圖9 (c)中示出了結果。在TEM圖像中發現， 磁性納米顆粒打破因自組裝導致的六面體排列，并零星地散射，從而證明引入 了歸因于aPEGa-MTX的不規則結構。此外，在紅外光譜中還證實，分別在約1100 和1630cm"處檢測到PEG和MTX的特征峰。
通過鍵合生物相容分子aPEGa到乾向分子MTX上，制備aPEGa-MTX 在將454mg ( lmmol) MTX (甲氨喋呤，美國參考標準)溶解在14ml干餾 DMF內之后，將含該混合物的燒瓶浸泡在冰洛中并攪拌10分鐘。將226mg (Ummol)DCC加入到燒瓶中并攪拌18小時。向其中添力口lmmol aPEGa并進一 步攪拌3小時。向所得溶液中添加二乙醚，形成沉淀，并用相同的溶劑重結晶， 從而獲得13 8mgaPEGa-MTX 。
實施例9:制備耙向、生物相容和水溶性磁性納米顆粒SPION (-MPA) ex (-MUA-aPEGa-MTX ) 10
向8ml實施例8制備的SPION ( -OA ) ex (國MHA-aPEGa-MTX ) 10溶液 (6xl(T7M )中添加150當量通過溶解0.05M MPA和0.05M NaOH而制備的甲醇溶 液并攪拌2小時。將甲醇加入到所得溶液中并離心，獲得固體SPION (-MPA) ex (-而A-aPEGa-MTX ) 10。將SPION (-MPA ) ex (-MUA曙aPEGa-MTX ) 10 分散在16mlPBS緩沖液(pH7.4)內。用紅外光譜和TEM分析lml的分散體， 其中圖8 (d)和圖9 (d)分別示出了結果。紅外光譜發現，C-H峰的強度顯著下降，這是因為當用MPA替代OA時，碳鏈長度下降。此外，TEM圖像證實， 盡管當制備樣品時，因使用水溶液引起的表面張力導致的疊加效應，但明顯地 觀察到顆粒間的距離。
實施例10:制備乾向、生物相容和水溶性磁性納米顆粒SPION (-Lys) ex
(-MUA-aPEGa-MTX ) 10
向6ml實施例7和8中制備的SPION (-OA ) ex (-MHA-aPEGa-MTX ) IO溶液
(6xl(T7M)中添加1000當量四辛基溴化銨(TOAB)并撹拌16小時。將6ml、 O.IM的賴氨酸(Lys)水溶液加入到該混合物中并攪拌19小時。混合所得溶液 與甲醇，并通過使用磁力分離SPION (-Lys ) ex (-MUA-aPEGa-MTX ) 10納米 顆粒。用5ml甲苯和5ml乙醇洗滌分離的納米顆粒，并分散在PBS緩沖液(pH 7.4 ) 內。用紅外光譜和TEM分析lml分散體，其中圖8(e)和圖9(e)分別示出了結 果。紅外光譜發現，C-H峰的強度顯著下降，這是因為用賴氨酸替代了OA。此 外，TEM圖像證實，盡管當制備樣品時，因使用水溶液引起的表面張力導致的 疊加效應，但明顯地觀察到顆粒間的距離。
實施例ll:制備靶向、生物相容和疏水的磁性納米顆粒SPION (-OA) ex
(-MHA-en-FA) 5和利用它的生物成像
用乙醇洗滌2ml粒度為ll納米的疏水SPION-OA磁性納米顆粒溶液
(3x10-6M) 2次，在20ml甲苯內分散，然后加熱到100'C。將5當量巰基十六烷 酸(MHA)加入到該混合物中，回流l小時并冷卻。向所得溶液中添加15當量 DCC,并在黑暗的惰性氛圍內攪拌3小時。向其中添加16當量通過在小量DMF 內溶解而制備的實施例13制備的en-FA并攪拌16小時。在濃縮所得溶液之后，向 其中添加小量乙醇，并通過使用磁力分離SPION (-OA) ex (-MHA-en-FA) 5 納米顆粒。將分離的納米顆粒分散在10ml氯仿內。在圖8(f)中示出了這些納 米顆粒的紅外光譜，證明在約1630cm"處檢測到FA的特征峰。
在稀釋以上制備的SPION (-OA ) ex (-MHA-en-FA ) 5溶液到1 x 10^M的最 終濃度時，在培養皿內均勻地噴灑lml稀釋劑，并自然干燥。第二天，用70%乙 醇和UV給培養皿滅菌，培養2xl05個細胞的人上皮癌細胞系KB細胞(ATCCManassas, VA )，然后在37。C的恒溫箱中培養細胞16小時。收集培養的細胞并 進一步在未處理的培養皿內培養4小時。為了比較納米顆粒的耙向行為，如上所 述進行相同的實驗，所不同的是將10嗎/ml FA加入到培養溶液中。用磁共振成 像(MRI)分析每一種如此處理的細胞，其中在圖10中示出了結果。定量分析 MR圖像的結果是，證實在細胞表面上共存的過量游離FA占據受體，從而導致 靶向的磁性納米顆粒SPION (-OA) ex (-MHA-en-FA ) 5的乾向性下降10% 。這 些結果暗含疏水磁性納米顆粒通過鍵合的FA顯示出顯著有意義的靶向性。
盡管相對于本發明的優選實施方案描述和闡述了本發明，但對于本領域的 技術人員來說，顯而易見的是，可在沒有脫離本發明的寬泛的原理和教導的情 況下，各種變化和改性是可能的，本發明應當僅僅通過所附的權利要求的范圍 來限制。
權利要求
1、一種通過早期引入不規則結構，生產生物成像納米顆粒的方法，其特征在于，該方法包括1)添加1-30當量含有通過8-20個碳原子的烴鏈連接的硫醇基和親水基的有機配體到用表面活性劑保護的核或核/殼結構的疏水無機納米顆粒中，從而用有機配體部分替代表面活性劑和在納米顆粒表面上形成金屬-硫醇鹽(M-S)鍵，從而導致制備其表面僅僅部分改性為親水性質且仍然維持它在非極性有機溶劑內的單獨的分散性的疏水納米顆粒；2)將官能分子鍵合到在步驟1)制備的納米顆粒的表面上引入的親水基團上，以提供納米顆粒表面官能度和不規則的結構，同時維持它們單獨的分散性；和3)用其中至少兩個親水基團通過1-7個碳原子的烴鏈連接的有機配體替代在步驟2)制備的納米顆粒表面上殘留的其余表面活性劑，從而將疏水納米顆粒轉化成親水納米顆粒。
2、 根據權利要求l所述的通過早期引入不規則結構，生產生物成像納米顆 粒的方法，其特征在于，步驟l)的無機納米顆粒是貴金屬納米顆粒、氧化鐵納 米顆粒或半導體納米顆粒，所述納米顆粒選自由屬于周期表第II族的鋅、鎘和 鉛中的一種元素和選自屬于周期表第VI族的硫、硒和碲中的一種元素組成。
3、 根據權利要求2所述的通過早期引入不規則結構，生產生物成像納米顆 粒的方法，其特征在于，所述無機納米顆粒選自CdSe、 ZnS、 CdSe/CdS、 CdSe/ZnS、 Au、 Ag、 Fe203和Fe304。
4、 根據權利要求l所述的通過早期引入不規則結構，生產生物成像納米顆 粒的方法，其特征在于，步驟l)的有機配體包括在配體分子內的至少一個硫醇 基和至少一個親水基團，其中親水基團選自胺基、羧酸基、羥基和硫醇基。
5、 根據權利要求4所述的通過早期引入不規則結構，生產生物成像納米顆 粒的方法，其特征在于，步驟l)的有機配體選自巰基十一烷酸、巰基十二烷酸和巰基十六烷酸。
6、 根據權利要求l所述的通過早期引入不規則結構，生產生物成像納米顆 粒的方法，其特征在于，能借助金屬-硫醇鹽鍵鍵合到納米顆粒表面上的步驟l)的有機配體數量范圍為1-30。
7、 根據權利要求l所述的通過早期引入不規則結構，生產生物成像納米顆 粒的方法，其特征在于，步驟2)的官能分子是生物相容分子、靶向分子、其絡 合物，或其混合物，它含有與其一個或兩個端基相連的選自胺基、醛基、羧酸 基、羥基和硫醇基中的親水基團。
8、 根據權利要求l所述的通過早期引入不規則結構，生產生物成像納米顆 粒的方法，其特征在于，步驟3)的有機配體含有至少兩個親水基團，其中親水 基團選自胺基、羧酸基、羥基和硫醇基。
9、 根據權利要求8所述的通過早期引入不規則結構，生產生物成像納米顆 粒的方法，其特征在于，步驟3)的有機配體選自巰基己酸、巰基乙酸、巰基丙 酸、二巰基琥珀酸、2-巰基乙醇、2-胺基乙二硫醇、賴氨酸、精氨酸和胺基戊 酸。
10、 根據權利要求7所述的通過早期引入不規則結構，生產生物成像納米顆 粒的方法，其特征在于，生物相容分子在兩個端基處含有選自胺基、醛基和羧 酸基中的親水基團，或者在一個端基處含有選自胺基、醛基和羧酸基的親水基 團和在另一端基處含有具有l-7個碳原子的烷氧基或羥基。
11、 根據權利要求10所述的通過早期引入不規則結構，生產生物成像納米 顆粒的方法，其特征在于，生物相容分子選自聚乙二醇、葡聚糖、聚(L-丙交 酯)、聚(DL-丙交酯)、聚-DL-丙交酯/乙交酯共聚物、殼聚糖、藻酸、透明 質酸、膠原、肝素和聚(s-己內酯)。
12、 根據權利要求7所述的通過早期引入不規則結構，生產生物成像納米顆 粒的方法，其特征在于，靶向分子可在體內特異地識別，含有選自胺基、羧酸 基、羥基和硫醇基中的親水基團，且可通過形成酰胺鍵、酯鍵或硫酯鍵，與生 物相容分子相連。
13、 根據權利要求12所述的通過早期引入不規則結構，生產生物成像納米 顆粒的方法，其特征在于，靶向分子是葉酸、氨甲喋呤、對特定細胞具有選擇 性的肽，或者與特定抗原選擇性反應的抗體。
14、 根據權利要求l所述的通過早期引入不規則結構，生產生物成像納米顆 粒的方法中的步驟l)制備的生物成像的納米顆粒，它僅僅在納米顆粒表面的一部分處親水，其特征在于，含有通過8-20個碳原子的烴鏈連接的硫醇基和親水基的有機配體被引入到用表面活性劑保護的核或核/殼結構的疏水無機納米顆 粒內，但整體上仍然疏水，且維持它們在非極性有機溶劑內單獨的分散性。
15、 根據權利要求l所述的通過早期引入不規則結構，生產生物成像納米顆 粒的方法中的步驟2)制備的生物成像的納米顆粒，其特征在于，它具有歸因于 官能分子鍵合到在權利要求14的納米顆粒表面內引入的親水基團上導致的官能 度和不規則結構，且僅僅在其中官能分子鍵合到其上的納米顆粒的一部分表面 處親水，但整體上仍然疏水。
16、 根據權利要求l所述的通過早期引入不規則結構，生產生物成像納米顆 粒的方法中的步驟3)制備的生物成像的納米顆粒，其特征在于，通過用含至少 兩個親水基團通過1-7個碳原子的烴鏈連接的有機配體替代權利要求15的納米 顆粒表面上殘留的其余表面活性劑，從而將它完全轉化成親水納米顆粒，并維 持它們在水溶液內的單獨的分散性。
全文摘要
本發明公開了一種通過早期引入不規則結構，生產生物成像的納米顆粒及其制造方法。本發明的目的是提供制備生物成像納米顆粒的方法，其中通過借助部分表面改性，早期引入不規則結構到納米顆粒的表面內，允許在結構上妨礙因納米顆粒內部氫鍵吸引導致的聚集和沉淀現象，從而在沒有損失納米顆粒的情況下，高產率地在非極性有機溶劑或水溶液內制備具有高分散性和穩定性的生物成像的納米顆粒。
文檔編號C01G11/02GK101422621SQ20081010046
公開日2009年5月6日 申請日期2008年6月16日 優先權日2007年10月31日
發明者文智炯, 禹庚子 申請人:韓國科學技術研究院