含有生物活性涂層的鎳鈦合金及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種含有生物活性涂層的鎳鈦合金，首先將鎳鈦合金表面打磨光亮，然后合金浸泡在1～3mg/mL的Tris-鹽酸多巴胺溶液中12～36h，使表面形成聚多巴胺薄膜；再以0.1％～0.5％(v/v)的乙酸為溶劑，配制1～10mg/mL的殼聚糖溶液，用磷酸鹽緩沖溶液配制1～10mg/mL的明膠溶液和100～500ng/mL的內皮細胞生長因子溶液，將處理后的鎳鈦合金浸泡在明膠溶液中12～36h，再逐層自組裝殼聚糖-明膠-內皮細胞生長因子-明膠，每個溶液中浸泡5～20min，逐層自組裝共循環4～10次，最后用氮氣吹干即可；該涂層可以有效促進內皮細胞在鎳鈦合金表面粘附和生長，從而滿足鎳鈦合金作為心血管植入材料快速內皮化的需求，有效解決鎳鈦合金表面誘發血栓、產生凝血的問題，擴大鎳鈦合金的臨床應用范圍。
【專利說明】含有生物活性涂層的鎳鈦合金及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及金屬材料，特別涉及含有生物活性涂層的鎳鈦合金，還涉及該合金的制備方法及應用。
【背景技術】
[0002]近年來，鎳鈦合金材料由于其獨特的形狀記憶效應、超彈性性能、高耐腐蝕性和良好的生物相容性，被廣泛用作心血管領域的長期植入器件，如心血管支架和心臟封堵器等。但由于存在材料表面容易誘發血栓、產生凝血等問題，鎳鈦合金的臨床應用仍然受限。
[0003]內皮細胞具有抗血栓的特異性能，促進內皮細胞在材料表面的快速生長和包被可以有效減少凝血問題。內皮細胞的微環境在調控細胞生長行為方面發揮著重要作用。近年來，本領域技術人員通過各種方法構筑細胞外微環境以促進心血管植入材料表面快速內皮化，如通過化學或物理方法將細胞外基質中的生物大分子、人工合成的多肽和各種生長因子引入到生物材料表面。然而，由于細胞天然微環境體系的復雜性，現有的僅涉及在植入材料表面引入單一生物活性分子的方法很難模擬內皮細胞外微環境，因而不能夠滿足材料表面快速內皮化的需要。
【發明內容】
[0004]有鑒于此，本發明提供了一種含有生物活性涂層的鎳鈦合金，該合金含有的生物活性涂層具有仿細胞外微環境的特點，可以使鎳鈦合金表面快速內皮化；同時，本發明還提供了該含有生物活性涂層的鎳鈦合金的制備方法及該合金在制備醫用硬組織植入材料中的應用。
[0005]為達到上述目的，本發明采用以下技術方案:
[0006]制備含有生物活性涂層的鎳鈦合金的方法，包括以下步驟:
[0007](I)基材預處理
[0008]將鎳鈦合金打磨至表面光亮，用丙酮超聲清洗，得到潔凈的金屬表面；
[0009](2)沉積聚多巴胺薄膜層
[0010]將步驟(I)處理后的鎳鈦合金在I?3mg/mL的鹽酸多巴胺溶液中浸泡12?36小時，得到表面沉積聚多巴胺薄膜層的鎳鈦合金；所述鹽酸多巴胺溶液用Tris緩沖溶液配制；
[0011](3)逐層自組裝
[0012]將步驟⑵沉積聚多巴胺薄膜層的鎳鈦合金浸泡在I?10mg/mL明膠溶液中12?36小時,然后依次浸入I?10mg/mL殼聚糖溶液、I?10mg/mL明膠溶液、100?500ng/mL內皮細胞生長因子溶液和I?10mg/mL明膠溶液，每個溶液中浸泡5?20分鐘，每次浸泡后用超純水清洗；依次浸泡完殼聚糖溶液、明膠溶液、內皮細胞生長因子溶液和明膠溶液作為一個逐層自組裝循環，共循環4?10次，最后用氮氣吹干，即可；所述殼聚糖溶液用0.1%?
0.5% (v/v)的乙酸配制，所述明膠溶液和的內皮細胞生長因子溶液用磷酸鹽緩沖溶液配制。
[0013]優選的，所述步驟(2)為:將步驟(I)處理后的鎳鈦合金在2mg/mL的鹽酸多巴胺溶液中浸泡24小時，鹽酸多巴胺溶液用lOmM，pH值為8.5的Tris緩沖溶液配制。
[0014]優選的，所述步驟(3)中，將步驟(2)制得的沉積聚多巴胺薄膜層的鎳鈦合金在5mg/mL明膠溶液中浸泡24小時，然后依次浸入5mg/mL殼聚糖溶液、5mg/mL明膠溶液、200ng/mL內皮細胞生長因子溶液和5mg/mL明膠溶液中，每個溶液浸泡10分鐘，每次浸泡后用超純水清洗I分鐘；依次浸泡完殼聚糖溶液、明膠溶液、內皮細胞生長因子溶液和明膠溶液作為一個逐層自組裝循環，共循環5次，最后用氮氣吹干，即可。
[0015]根據上述方法制備得到含有生物活性涂層的鎳鈦合金。
[0016]將上述方法制得的含有生物活性涂層的鎳鈦合金作為心血管植入材料。
[0017]本發明的有益效果在于:本發明通過逐層自組裝在鎳鈦合金表面構筑仿細胞外微環境生物活性涂層，該涂層由聚多巴胺-明膠-殼聚糖-明膠-內皮細胞生長因子-明膠構成，其中殼聚糖-明膠-內皮細胞生長因子-明膠至少有四層。該涂層可以有效促進內皮細胞在鎳鈦合金表面粘附和生長，從而滿足鎳鈦合金作為心血管植入材料快速內皮化的需求，有效解決鎳鈦合金表面誘發血栓、產生凝血的問題，擴大鎳鈦合金的臨床應用范圍，增加臨床應用的長期有效性。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]為了使本發明的目的、技術方案和有益效果更加清楚，本發明提供如下附圖:
[0019]圖1未涂層的鎳鈦合金的掃描電鏡圖；
[0020]圖2表面形成仿細胞外微環境生物活性涂層的鎳鈦合金的掃描電鏡圖；
[0021]圖3未涂層的鎳鈦合金的原子力顯微鏡圖；
[0022]圖4表面形成仿細胞外微環境生物活性涂層的鎳鈦合金的原子力顯微鏡圖；
[0023]圖5表面接觸角對比圖；
[0024]圖6內皮細胞在合金表面生長的細胞活性圖；
[0025]圖7內皮細胞在合金表面生長的NO釋放圖。
【具體實施方式】
[0026]下面將結合附圖，對本發明的優選實施例進行詳細的描述。
[0027]實施例1
[0028]取鎳鈦合金片，按以下操作步驟構筑仿細胞外微環境生物活性涂層:
[0029](I)基材預處理
[0030]將鎳鈦合金片依次用100目、300目和2000目的砂紙打磨至表面光亮，用丙酮超聲清洗5分鐘，得到潔凈的金屬表面；
[0031](2)沉積聚多巴胺薄膜層
[0032]用lOmM，pH值為8.5的Tris緩沖溶液配制2mg/mL的鹽酸多巴胺溶液，將步驟(I)處理后的鎳鈦合金在該溶液中浸泡24小時，得到表面沉積聚多巴胺薄膜層的鎳鈦合金；
[0033](3)逐層自組裝
[0034]以0.3% (v/v)的乙酸為溶劑,配制5mg/mL的殼聚糖溶液；以pH = 7.4的磷酸鹽緩沖溶液配制5mg/mL的明膠溶液和200ng/mL的內皮細胞生長因子溶液；將步驟(2)沉積聚多巴胺薄膜層的鎳鈦合金浸泡在明膠溶液中24小時，然后依次浸入殼聚糖溶液、明膠溶液、內皮細胞生長因子溶液和明膠溶液，每個溶液中浸泡10分鐘，每次浸泡后用超純水清洗I分鐘；
[0035]依次浸泡完殼聚糖溶液、明膠溶液、內皮細胞生長因子溶液和明膠溶液作為一個逐層自組裝循環，共循環5次，最后用氮氣吹干，得到表面形成仿細胞外微環境生物活性涂層的鎳鈦合金。
[0036]實施例2
[0037]本實施例步驟(2)用20mM，pH值為7.2的Tris緩沖溶液配制lmg/mL的鹽酸多巴胺溶液，將步驟(I)處理后的鎳鈦合金在該溶液中浸泡12小時，得到表面沉積聚多巴胺薄膜層的鎳鈦合金；
[0038]本實施例步驟(3)以0.5% (v/v)的乙酸為溶劑，配制lmg/mL的殼聚糖溶液；以PH值為8的磷酸鹽緩沖溶液配制lmg/mL的明膠溶液和100ng/mL的內皮細胞生長因子溶液；將步驟(2)沉積聚多巴胺薄膜層的鎳鈦合金浸泡在明膠溶液中36小時，然后依次浸入殼聚糖溶液、明膠溶液、內皮細胞生長因子溶液和明膠溶液，每個溶液中浸泡20分鐘，每次浸泡后用超純水清洗I分鐘；
[0039]依次浸泡完殼聚糖溶液、明膠溶液、內皮細胞生長因子溶液和明膠溶液作為一個逐層自組裝循環，共循環4次，最后用氮氣吹干，得到表面形成仿細胞外微環境生物活性涂層的鎳鈦合金。
[0040]其它與實施例1相同。
[0041]實施例3
[0042]本實施例步驟⑵用20mM，pH值為9的Tris緩沖溶液配制3mg/mL的鹽酸多巴胺溶液，將步驟(I)處理后的鎳鈦合金在該溶液中浸泡36小時，得到表面沉積聚多巴胺薄膜層的鎳鈦合金；
[0043]本實施例步驟(3)本實施例步驟(3)以0.5% (v/v)的乙酸為溶劑,配制10mg/mL的殼聚糖溶液；以pH值為6的磷酸鹽緩沖溶液配制10mg/mL的明膠溶液和500ng/mL的內皮細胞生長因子溶液；將步驟(2)沉積聚多巴胺薄膜層的鎳鈦合金浸泡在明膠溶液中12小時，然后依次浸入殼聚糖溶液、明膠溶液、內皮細胞生長因子溶液和明膠溶液，每個溶液中浸泡5分鐘，每次浸泡后用超純水清洗I分鐘；
[0044]依次浸泡完殼聚糖溶液、明膠溶液、內皮細胞生長因子溶液和明膠溶液作為一個逐層自組裝循環，共循環10次，最后用氮氣吹干，得到表面形成仿細胞外微環境生物活性涂層的鎳鈦合金。
[0045]其它與實施例1相同。
[0046]實施例4
[0047]本實施例步驟⑵用20mM，pH值為8.5的Tris緩沖溶液配制3mg/mL的鹽酸多巴胺溶液，將步驟(I)處理后的鎳鈦合金在該溶液中浸泡24小時，得到表面沉積聚多巴胺薄膜層的鎳鈦合金；
[0048]本實施例步驟(3)本實施例步驟(3)以0.1 % (v/v)的乙酸為溶劑,配制8mg/mL的殼聚糖溶液；以PH值為7.4的磷酸鹽緩沖溶液配制8mg/mL的明膠溶液和300ng/mL的內皮細胞生長因子溶液；將步驟(2)沉積聚多巴胺薄膜層的鎳鈦合金浸泡在明膠溶液中20小時，然后依次浸入殼聚糖溶液、明膠溶液、內皮細胞生長因子溶液和明膠溶液，每個溶液中浸泡15分鐘，每次浸泡后用超純水清洗I分鐘；
[0049]依次浸泡完殼聚糖溶液、明膠溶液、內皮細胞生長因子溶液和明膠溶液作為一個逐層自組裝循環，共循環7次，最后用氮氣吹干，得到表面形成仿細胞外微環境生物活性涂層的鎳鈦合金。
[0050]其它與實施例1相同。
[0051]用本發明得到的表面形成仿細胞外微環境生物活性涂層的鎳鈦合金進行以下實驗:
[0052]1、采用掃描電子顯微鏡和原子力顯微鏡觀察鎳鈦合金表面形貌的變化:
[0053]選取未經處理的鎳鈦合金和含有生物活性涂層的鎳鈦合金，采用FEI Nova 400型場發射掃描電鏡(Philips公司)和WET-SPM-9500J3型原子力顯微鏡(Shimadzu公司)在室溫下進行表面形貌表征。
[0054]鎳鈦合金表面形貌變化如圖1?4所示，可見，未涂層的鎳鈦合金表面呈現很多打磨過程中形成的明顯劃痕，而經過逐層自組裝后，劃痕明顯減少，并且出現許多顆粒狀沉積物，形成粗糙表面，更有利于細胞的黏附和生長。
[0055]2、對涂層表面的親疏水性采用接觸角測量儀進行測試:
[0056]選取未經處理的鎳鈦合金和含有生物活性涂層的鎳鈦合金，采用接觸角測量儀(臺灣翰光高科技股份有限公司)進行表面親疏水性能表征。
[0057]結果見圖5，鎳鈦合金表面形成仿細胞外微環境生物活性涂層后表面的接觸角為43°，比未涂層鎳鈦合金表面的接觸角降低了 47°，表明沉積殼聚糖、明膠和內皮細胞生長因子后鎳鈦合金表面呈現出較強的親水性。
[0058]3、采用人臍靜脈內皮細胞，通過MTT法對得到的含仿細胞外微環境生物活性涂層的鎳鈦合金進行細胞相容性測試:
[0059]選取未經處理的鎳鈦合金和含有生物活性涂層的鎳鈦合金，分別在其表面接種人臍靜脈內皮細胞，接種密度為I X 14個/孔，用含10%血清和I %雙抗的RPMI 1640培養基培養，分別培養I天和3天，MTT法測定細胞活性，酶標儀于波長490nm處測定吸光度。結果見圖6。
[0060]從圖6中可知，人臍靜脈內皮細胞在含仿細胞外微環境生物活性涂層的鎳鈦合金表面培養I天和3天后，其細胞活性均高于未涂層鎳鈦合金，并且培養3天后，與未涂層鎳鈦合金相比，結果呈現出顯著性差異，表明本發明形成的仿細胞外微環境生物活性涂層可以有效地提高鎳鈦合金的細胞相容性。
[0061]4、采用NO檢測試劑盒測定含仿細胞外微環境生物活性涂層的鎳鈦合金表面人臍靜脈內皮細胞的NO釋放量:
[0062]選取未經處理的鎳鈦合金和含有生物活性涂層的鎳鈦合金，分別在其表面接種人臍靜脈內皮細胞，接種密度為I X 14個/孔，用含10%血清、I %雙抗的RPMI 1640培養基培養，分別培養I天和3天，收集各孔板中的細胞培養液,離心并收集上清液,用NO試劑盒進行NO表達水平檢測，酶標儀于波長540nm處測定吸光度。結果見圖7。
[0063]測試結果見圖7。由圖7可見，人臍靜脈內皮細胞在本發明得到的含有仿細胞外微環境生物活性涂層的鎳鈦合金表面培養I天和3天的NO釋放量均高于未涂層的鎳鈦合金，而且兩者相比，實驗結果具有顯著性差異。NO具有促進血管新生的作用，內皮細胞來源的NO能促進胚胎細胞參與血管的形成。因此，NO測定結果表明本發明得到的含有仿細胞外微環境生物活性涂層的鎳鈦合金可以促進血管新生。
[0064]最后說明的是，以上優選實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管通過上述優選實施例已經對本發明進行了詳細的描述，但本領域技術人員應當理解，可以在形式上和細節上對其作出各種各樣的改變，而不偏離本發明權利要求書所限定的范圍。
【權利要求】
1.制備含有生物活性涂層的鎳鈦合金的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)基材預處理 將鎳鈦合金打磨至表面光亮，用丙酮超聲清洗，得到潔凈的金屬表面； (2)沉積聚多巴胺薄膜層 將步驟(I)處理后的鎳鈦合金在I?3mg/mL的鹽酸多巴胺溶液中浸泡12?36小時，得到表面沉積聚多巴胺薄膜層的鎳鈦合金；所述鹽酸多巴胺溶液用Tris緩沖溶液配制； (3)逐層自組裝 將步驟(2)沉積聚多巴胺薄膜層的鎳鈦合金浸泡在I?10mg/mL明膠溶液中12?36小時，然后依次浸入I?10mg/mL殼聚糖溶液、I?10mg/mL明膠溶液、100?500ng/mL內皮細胞生長因子溶液和I?10mg/mL明膠溶液，每種溶液中浸泡5?20分鐘，每次浸泡后用超純水清洗；依次浸泡完殼聚糖溶液、明膠溶液、內皮細胞生長因子溶液和明膠溶液作為一個逐層自組裝循環，共循環4?10次，最后用氮氣吹干，即可；所述殼聚糖溶液用0.1%?0.5% (v/v)的乙酸配制，所述明膠溶液和內皮細胞生長因子溶液用磷酸鹽緩沖溶液配制。
2.根據權利要求1所述制備含有生物活性涂層的鎳鈦合金的方法，其特征在于，所述步驟(2)為:將步驟(I)處理后的鎳鈦合金在2mg/mL的鹽酸多巴胺溶液中浸泡24小時，鹽酸多巴胺溶液用10mM，pH值為8.5的Tris緩沖溶液配制。
3.根據權利要求1或2所述制備含有生物活性涂層的鎳鈦合金的方法，其特征在于，所述步驟(3)中，將步驟(2)制得的沉積聚多巴胺薄膜層的鎳鈦合金在5mg/mL明膠溶液中浸泡24小時，然后依次浸入5mg/mL殼聚糖溶液、5mg/mL明膠溶液、200ng/mL內皮細胞生長因子溶液和5mg/mL明膠溶液中，每種溶液浸泡10分鐘，每次浸泡后用超純水清洗I分鐘；依次浸泡完殼聚糖溶液、明膠溶液、內皮細胞生長因子溶液和明膠溶液作為一個逐層自組裝循環，共循環5次，最后用氮氣吹干，即可。
4.由權利要求1?3任一項所述制備含有生物活性涂層的鎳鈦合金的方法制得的含有生物活性涂層的鎳鈦合金。
5.權利要求4所述含有生物活性涂層的鎳鈦合金作為心血管植入材料的應用。
【文檔編號】C23C26/00GK104129113SQ201410359270
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年7月25日 優先權日:2014年7月25日
【發明者】劉鵬, 趙永春 申請人:重慶大學