一種促進成骨細胞增殖、黏附和分化的Ti6Al7Nb表面處理方法
【專利摘要】本發明屬于生物醫用鈦合金表面制備【技術領域】，首次將噴砂/酸蝕的表面處理工藝應用于Ti6Al7Nb表面的處理方法，發明出一種促進成骨細胞增殖、黏附和分化的Ti6Al7Nb表面處理方法。噴砂酸蝕后Ti6Al7Nb表面在微米級的孔洞中偶爾可見納米級孔洞位于其中，增加了表面的多孔形態；促進成骨細胞在樣品表面的增殖、黏附，促進成骨細胞分化；噴砂與酸蝕工藝均不需要高溫、高壓環境，設備簡單，操作步驟簡單易行。
【專利說明】-種促進成骨細胞增殖、黏附和分化的T i6AI 7Nb表面處理 方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物醫用鈦合金表面制備【技術領域】，主要涉及的是一種促進Ti6A17Nb 合金表面成骨細胞增殖、黏附和分化的表面處理方法。
【背景技術】
[0002] 商業純鈦及鈦合金的發展先后經過了以純鈦和Ti6A14V為代表的第一個時代，以 Ti5A12. 5Fe和Ti6A17Nb為代表的第二個時代。隨著鈦及鈦合金在臨床應用的增加，在臨床 應用中的弊端也逐漸顯露，如：純鈦的強度較低，耐磨性較差；Ti6A14V具有較高的硬度、良 好的表面性能、優越的微觀結構，耐磨性優于2、3級純鈦，但是存在與周圍組織結合不佳以 及緩慢釋放合金中的V、A1等有潛在毒性的物質。種植體植入人體后，與骨組織最理想的結 合方式為材料與骨組織在分子水平的化學鍵合，即骨鍵結合，又稱生物活性結合，是在臨床 意義下的植入體與骨組織之間無軟組織中介的、光學顯微鏡水平下的直接接觸，其應力傳 遞是連續的，也是需長期存在體內的植入物的最佳結合模式。
[0003] 近年來材料表面工藝制備理論及技術不斷完善和發展，目前，鈦合金種植體表面 改性的方法達幾十種，有些已經成功應用于臨床，如表面加成法（鈦漿涂層、羥基磷灰石涂 層）和表面減少法（噴砂/酸蝕、可吸收性研磨介質），有些正處于研究階段，如表面轟擊法 和表面氧化法。每種表面處理方法因其原料與工藝不同表現出不同的優缺點，如羥基磷灰 石（HA)涂層可以明顯促進種植體周圍成骨，但是存在結合強度不夠，涂層剝脫的問題；陽 極氧化使鈦氧化層表面的分子黏合能力高并具有親骨性，但是陽極氧化法所形成的氧化膜 與鈦基體結合強度仍然有待進一步提高。噴砂/酸蝕復合處理是目前商業用鈦種植體最廣 泛采用的處理方法，鈦基種植體噴砂/酸蝕復合處理后粗糙多孔的表面有利于引導成骨細 胞趨化，加速骨結合，增強了種植體的抗扭矩的性能，其優越性已經通過臨床實踐證實。
【發明內容】
[0004] 本發明針對上述技術內容的缺陷，首次將噴砂/酸蝕的表面處理工藝應用于 Ti6A17Nb表面的處理方法，發明出一種促進成骨細胞增殖、黏附和分化的Ti6A17Nb表面處 理方法。
[0005] 本發明采取的技術方案：
[0006] 第一步進行預處理：將Ti6A17Nb棒材切割成為Φ 10mmX 10mm的圓柱形試塊，用分 析純丙酮、無水乙醇和去離子水超聲清洗各15分鐘，然后選取一個平整的底面，在自動旋 轉打磨儀上，依次用400#、600#、1200#的防水SiC砂紙將選取的平面逐級打磨，直到獲得劃 痕均勻一致的光滑表面，然后用無水乙醇超聲波清洗15分鐘，將經過打磨后的Ti6A17Nb烘 干后，放入干燥箱內以室溫保存待用；
[0007] 第二步進行噴砂處理：將吸入式干噴砂機固定在臺虎鉗上，噴砂介質為白剛玉砂， 粒度為60#，尺寸約為250-300 μ m，將Ti6A17Nb固定在平口鉗上，使吸入式干噴砂機的槍頭 和Ti6A17Nb表面保持一定的距離，噴射角度選擇75°，將噴砂機的氣壓調至為0. 3MPa氣 壓，對Ti6A17Nb表面進行噴砂處理，噴砂時間30秒，然后將噴砂處理后的Ti6A17Nb用去離 子水沖洗，再用無水乙醇和去離子水各超聲清洗10分鐘，烘干，得到噴砂處理的Ti6A17Nb ;
[0008] 第三步進行酸蝕處理：先將鹽酸（HC1)、硫酸（H2S04)和水（H 20)體積比按2 :12 : 11的比例混合，配制溶液過程中注意密封處理以防止鹽酸HC1的揮發，然后將配好的酸蝕 溶液加熱至沸騰狀態，保持溫度不變；再將Ti6A17Nb置于溫度為50°C的蒸餾水中保溫2分 鐘；然后置于加熱的酸蝕溶液中，當將Ti6A17Nb放入酸蝕溶液初期時，Ti6A17Nb表面會有 氣泡產生，隨著酸蝕時間的不斷增加，Ti6A17Nb表面產生的氣泡越來越多，并且觀察到酸蝕 溶液由無色變成紫色；
[0009] 第四步進行清洗處理：將酸蝕處理后的Ti6A17Nb用去離子水超聲清洗10分鐘，烘 干，得到酸蝕出來的Ti6A17Nb ;
[0010] 第五步細胞增殖：調整細胞密度為lX105cells/ml，每個鈦片表面接種 lX104cells/disc，100ul培養基，接種4h后每孔補加 lml完全培養基，37°C，孵育1天、3 天、5天，棄舊培養基，每孔添加50ul MTT與450ul的無血清培養基的混合液，MTT濃度5mg/ ml，37°C孵育4小時，棄培養基，每孔加750ul DMS0,吹打使結晶溶解后，37°C孵育10分鐘， 將溶解液轉移至96孔板中每孔100ul (約每孔轉移96孔板中的6個孔），測0D值（490nm、 570nm)；
[0011] 第六步細胞在Ti-6Al-7Nb表面黏附形態：消化細胞，制備細胞懸液，計數，調整細 胞濃度為5X10 4cellS/ml，將調整好的細胞輕緩的接種到每個鈦片表面，盡量不要溢出周 邊，每個鈦片接5000個cells，100ul培養基（每接種一個鈦片前都要將細胞吹打均勻），2 小時后，每孔補加500ul完全培養基（沿壁緩慢滴加），待3天后2. 5%戊二醛4°C固定4小 時，棄戊二醛，無水乙醇梯度脫水50 %、70 %、90 %、100 %，兩次，每個梯度脫水30分鐘，完 全干燥后送檢，噴金；
[0012] 第七步成骨細胞在Ti-6Al-7Nb表面黏附：消化細胞，制備細胞懸液，計數濃度調 整至lX10 5cells/ml，每個鈦片表面接種lX104cells，100ul培養基，待4小時后每孔添加 lml完全培養基，待12小時、24小時、48小時后去除舊培養基，PBS沖洗三次，每孔加500ul 染色劑 calcein_AMlmmol/l，37°C下孵育 15 分鐘；
[0013] 第八步成骨細胞在Ti-6Al-7Nb表面分化：消化細胞，制備細胞懸液，計數調整細 胞密度為6X 104cells/ml，每個鈦片表面接種6000cells/disc，100ul培養基，每組3個樣 品，待4小時后補加全培養基2ml/每孔，37°C孵育1天、7天，待1天、7天后將鈦片表面的 細胞用0. 25%的胰酶消化2-3分鐘，加培養基終止消化，用移液器輕輕吹打，將所有液體轉 移至離心管中，然后1500r/min，5分鐘，棄上清，留沉淀細胞，再加入lml PBS輕輕吹打，再 次離心1500r/min，5分鐘，棄上清，留沉淀細胞，在沉淀細胞中加入0. 4ml PBS輕輕吹打，超 聲破碎，將離心管置于超聲水浴鍋中每3-5秒，超聲一次，間隔4次，每次間隔時間30秒左 右，去100 μ 1細胞破碎懸液，置于酶標板上測量520nm波長下的0D值。
[0014] 有益效果：噴砂酸蝕后Ti6A17Nb表面在微米級的孔洞中偶爾可見納米級孔洞位 于其中，增加了表面的多孔形態；微米級多孔表面促進成骨細胞在樣品表面的增殖、黏附， 促進成骨細胞分化；噴砂與酸蝕工藝均不需要高溫、高壓環境，設備簡單，操作步驟簡單易 行。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015] 圖lTi6A17Nb預處理后表面形貌
[0016] 圖2Ti6A17Nb打磨和噴砂酸蝕之后樣品形貌
[0017] 圖3Ti6A17Nb噴砂酸蝕后的表面形貌
[0018] 圖4成骨細胞在Ti6A17Nb表面的增殖，TA1:純Ti，TC20 :Ti6A17Ni，SLA :噴砂酸 蝕處理，Polishing:光滑表面（**Ρ〈0· 01)
[0019] 圖5成骨細胞在純Ti和Ti6A17Ni表面黏附的形態，（a)TiX500,（b) Ti6A17NiX500,（c)TiX 1000,（d)Ti6A17NiX 1000,（e)TiX 2000,（f)Ti6A17NiX 2000,（g) Τ?Χ3000, (h)Ti6A17NiX3000
[0020] 圖6成骨細胞在Ti6A17Nb表面黏附的數量，（a) Ti, (b) Ti6A17Ni
[0021] 圖7成骨細胞在樣品表面生長時的堿性磷酸酶的0D值，TA1:純Ti， TC20Ti6A17Ni，SLA :噴砂酸蝕處理，Polishing:光滑表面（**Ρ〈0· 01)
【具體實施方式】
[0022] 本發明結合附圖1、附圖2、附圖3、附圖4、附圖5、附圖6、附圖7進行實施例中所 述的一種促進成骨細胞增殖、黏附和分化的Ti6A17Nb表面處理方法，本發明采取的技術方 案：
[0023] 第一步進行預處理：將Ti6A17Nb棒材切割成為Φ 10mmX 10mm的圓柱形試塊，用分 析純丙酮、無水乙醇和去離子水超聲清洗各15min，然后選取一個平整的底面，在自動旋轉 打磨儀上，依次用400#、600#、1200#的防水SiC砂紙將選取的平面逐級打磨，直到獲得劃痕 均勻一致的光滑表面，然后用無水乙醇超聲波清洗15分鐘，將經過打磨后的Ti6A17Nb烘干 后，放入干燥箱內以室溫保存待用，如圖1 ;
[0024] 第二步進行噴砂處理：將吸入式干噴砂機固定在臺虎鉗上，噴砂介質為白剛玉砂， 粒度為60#，尺寸約為250-300 μ m，將Ti6A17Nb固定在平口鉗上，使吸入式干噴砂機的槍頭 和Ti6A17Nb表面保持一定的距離，噴射角度選擇75°，將噴砂機的氣壓調至為0. 3MPa氣 壓，對Ti6A17Nb表面進行噴砂處理，噴砂時間30秒，然后將噴砂處理后的Ti6A17Nb用去離 子水沖洗，再用無水乙醇和去離子水各超聲清洗10分鐘，烘干，得到噴砂處理的Ti6A17Nb ;
[0025] 第三步進行酸蝕處理：先將鹽酸（HC1)、硫酸（H2S04)和水（H 20)按體積比2 :12 : 11的比例混合，配制溶液過程中注意密封處理以防止HC1的揮發，然后將配好的酸蝕溶液 加熱至沸騰狀態，保持溫度不變；再將Ti6A17Nb置于溫度為50°C的蒸餾水中保溫2分鐘； 然后置于加熱的酸蝕溶液中，當將Ti6A17Nb放入酸蝕溶液初期時，Ti6A17Nb表面會有氣泡 產生，隨著酸蝕時間的不斷增加，Ti6A17Nb表面產生的氣泡越來越多，并且觀察到酸蝕溶液 由無色變成紫色，如圖2、圖3 ;
[0026] 第四步進行清洗處理：將酸蝕處理后的Ti6A17Nb用去離子水超聲清洗10分鐘，烘 干，得到酸蝕出來的Ti6A17Nb ;
[0027] 第五步成骨細胞增殖：調整細胞密度為lX105CellS/ml，每個鈦片表面接種 1 X 104cells/disc，100ul培養基，接種4小時后每孔補加 lml完全培養基，37°C，孵育1天、3 天、5天，棄舊培養基，每孔添加50ul MTT與450ul的無血清培養基的混合液，MTT濃度5mg/ ml，37°C孵育4小時，棄培養基，每孔加750ul DMSO,吹打使結晶溶解后，37°C孵育10分鐘， 將溶解液轉移至96孔板中每孔100ul (約每孔轉移96孔板中的6個孔），測0D值（490nm、 570nm)，如圖 4 ;
[0028] 第六步成骨細胞在Ti-6Al_7Nb表面黏附形態：消化細胞，制備細胞懸液，計數，調 整細胞濃度為5X10 4cellS/ml，將調整好的細胞輕緩的接種到每個鈦片表面，盡量不要溢 出周邊，每個鈦片接5000個cells，100ul培養基（每接種一個鈦片前都要將細胞吹打均 勻），2小時后，每孔補加50〇111完全培養基（沿壁緩慢滴加），待3天后2.5%戊二醛41：固 定4小時，棄戊二醛，無水乙醇梯度脫水50 %、70 %、90 %、100 %，兩次，每個梯度脫水30分 鐘，完全干燥后送檢，噴金，如圖5 ;
[0029] 第七步觀察成骨細胞在Ti-6Al_7Nb表面黏附：消化細胞，制備細胞懸液，計數濃 度調整至lX10 5cells/ml，每個鈦片表面接種lX104cells，100ul培養基，待4小時后每孔 添加 lml完全培養基，待12小時、24小時、48小時后去除舊培養基，PBS沖洗三次，每孔加 500ul 染色劑 calcein-AMlmmol/l，37°C下孵育 15 分鐘，如圖 6 ;
[0030] 第八步成骨細胞在Ti-6Al-7Nb表面分化：消化細胞，制備細胞懸液，計數調整細 胞密度為6X 104cells/ml，每個鈦片表面接種6000cells/disc，100ul培養基，每組3個樣 品，待4小時后補加全培養基2ml/每孔，37°C孵育1天、7天，待1天、7天后將鈦片表面的 細胞用0. 25%的胰酶消化2-3分鐘，加培養基終止消化，用移液器輕輕吹打，將所有液體轉 移至離心管中，然后1500r/min，5分鐘，棄上清，留沉淀細胞，再加入lml PBS輕輕吹打，再 次離心1500r/min，5分鐘，棄上清，留沉淀細胞，在沉淀細胞中加入0. 4ml PBS輕輕吹打，超 聲破碎，將離心管置于超聲水浴鍋中每3-5秒，超聲一次，間隔4次，每次間隔時間30秒左 右，去100 μ 1細胞破碎懸液，置于酶標板上測量520nm波長下的0D值，如圖7。
【權利要求】
1. 一種促進成骨細胞增殖、黏附和分化的Ti6A17Nb表面處理方法，其特征在于：本發 明采取以下步驟： 第一步進行預處理：將Ti6A17Nb棒材切割成為Φ lOmmX 10mm的圓柱形試塊，用分析 純丙酮、無水乙醇和去離子水超聲清洗各15分鐘，然后選取一個平整的底面，在自動旋轉 打磨儀上，依次用400#、600#、1200#的防水SiC砂紙將選取的平面逐級打磨，直到獲得劃痕 均勻一致的光滑表面，然后用無水乙醇超聲波清洗15分鐘，將經過打磨后的Ti6A17Nb烘干 后，放入干燥箱內以室溫保存待用； 第二步進行噴砂處理：將吸入式干噴砂機固定在臺虎鉗上，噴砂介質為白剛玉砂，粒度 為60#，尺寸約為250-300 μ m，將Ti6A17Nb固定在平口鉗上，使吸入式干噴砂機的槍頭和 Ti6A17Nb表面保持一定的距離，噴射角度選擇75°，將噴砂機的氣壓調至為0. 3MPa氣壓， 對Ti6A17Nb表面進行噴砂處理，噴砂時間30秒，然后將噴砂處理后的Ti6A17Nb用去離子 水沖洗，再用無水乙醇和去離子水各超聲清洗10分鐘，烘干，得到噴砂處理的Ti6A17Nb ; 第三步進行酸蝕處理：先將鹽酸、硫酸和水按體積比2 :12 :11的比例混合，配制溶液過 程中注意密封處理以防止HC1的揮發，然后將配好的酸蝕溶液加熱至沸騰狀態，保持溫度 不變；再將Ti6A17Nb置于溫度為50°C的蒸餾水中保溫2分鐘；然后置于加熱的酸蝕溶液 中，當將Ti6A17Nb放入酸蝕溶液初期時，Ti6A17Nb表面會有氣泡產生，隨著酸蝕時間的不 斷增加，Ti6A17Nb表面產生的氣泡越來越多，并且觀察到酸蝕溶液由無色變成紫色； 第四步進行清洗處理：將酸蝕處理后的Ti6A17Nb用去離子水超聲清洗10分鐘，烘干， 得到酸蝕出來的Ti6A17Nb ; 第五步細胞增殖：調整細胞密度為1 X l〇5cells/ml，每個鈦片表面接種1 X 104Cells/ disc，lOOul培養基，接種4小時后每孔補加 lml完全培養基，37°C，孵育1天、3天、5天，棄 舊培養基，每孔添加50ul MTT與450ul的無血清培養基的混合液，MTT濃度5mg/ml，37°C孵 育4小時，棄培養基，每孔加750ul DMS0,吹打使結晶溶解后，37°C孵育10分鐘，將溶解液轉 移至96孔板中每孔100ul，每孔轉移96孔板中的6個孔，測0D值是490nm、570nm ; 第六步觀察細胞在Ti-6Al-7Nb表面黏附形態：消化細胞，制備細胞懸液，計數，調整細 胞濃度為5X104cellS/ml，將調整好的細胞輕緩的接種到每個鈦片表面，盡量不要溢出周 邊，每個鈦片接5000個cells，100ul培養基，每接種一個鈦片前都要將細胞吹打均勻，2小 時后，每孔補加500ul完全培養基，沿壁緩慢滴加，待3天后2. 5%戊二醛4°C固定4小時， 棄戊二醛，無水乙醇梯度脫水50 %、70 %、90 %、100 %，兩次，每個梯度脫水30分鐘，完全干 燥后送檢，噴金； 第七步成骨細胞在Ti-6Al-7Nb表面黏附：消化細胞，制備細胞懸液，計數濃度調整至 lX105cells/ml，每個鈦片表面接種lX104cells，100ul培養基，待4小時后每孔添加 lml 完全培養基，待12小時、24小時、48小時后去除舊培養基，PBS沖洗三次，每孔加500ul染 色劑 calcein_AMlmmol/l，37°C下孵育 15 分鐘； 第八步成骨細胞在Ti-6Al-7Nb表面分化：消化細胞，制備細胞懸液，計數調整細胞密 度為6X 104cells/ml，每個鈦片表面接種6000cells/disc，100ul培養基，每組3個樣品， 待4小時后補加全培養基2ml/每孔，37°C孵育1天、7天，待1天、7天后將鈦片表面的細胞 用0. 25%的胰酶消化2-3分鐘，加培養基終止消化，用移液器輕輕吹打，將所有液體轉移至 離心管中，然后1500r/min，5分鐘，棄上清，留沉淀細胞，再加入lml PBS輕輕吹打，再次離 心1500r/min，5分鐘，棄上清，留沉淀細胞，在沉淀細胞中加入0. 4ml PBS輕輕吹打，超聲破 碎，將離心管置于超聲水浴鍋中每3-5秒，超聲一次，間隔4次，每次間隔時間30秒左右，去 100 μ 1細胞破碎懸液，置于酶標板上測量520nm波長下的OD值。
【文檔編號】C23F1/26GK104147636SQ201410334787
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年7月14日 優先權日:2014年7月14日
【發明者】張靜瑩 申請人:大連大學