轉(zhuǎn)染sv40lt基因構(gòu)建18-三體綜合征細胞模型及其細胞庫的制作方法

轉(zhuǎn)染sv40lt基因構(gòu)建18-三體綜合征細胞模型及其細胞庫的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的SV40LT基因轉(zhuǎn)染18-三體綜合征細胞模型及其細胞庫的構(gòu)建，其主要特征是按常規(guī)以T4DNA連接酶、BamHI、pcDNA3.1(-)DNA及SV40LTag DNA構(gòu)建SV40LTag-pcDNA3.1(-)重組子、以感受態(tài)大腸桿菌純化重組子、以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將其導(dǎo)入經(jīng)膠原酶II消化的離體傳代或呈對數(shù)生長的18-三體綜合征組織細胞，使重組子與細胞的DNA整合，并擴大培養(yǎng)經(jīng)G418篩選含陽性重組子的細胞克隆，篩選細胞形態(tài)、生長曲線、染色體核型、軟瓊脂集落生長、裸鼠致瘤試驗、轉(zhuǎn)染細胞DNA中SV40大T基因檢測、mRNA表達產(chǎn)物測定及DNA序列測定結(jié)果符合永生化細胞特性并與原代細胞相同或相近者作為SV40LT轉(zhuǎn)染18-三體綜合征體外研究細胞模型凍存于液氮中，為在體外從細胞水平長期研究18-三體綜合征的發(fā)病機制奠定基礎(chǔ)。
【專利說明】 轉(zhuǎn)染3^40[了基因構(gòu)建18-三體綜合征細胞模型及其細胞庫

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及猴腎病毒40大I抗原基因(^4011基因)轉(zhuǎn)染(介導(dǎo))18-三體綜合征細胞模型及其細胞庫的構(gòu)建，主要用于生殖健康研究領(lǐng)域，為18-三體綜合征的研究提供細胞模型并保存其科研資源。

【背景技術(shù)】
[0002]18-三體綜合征屬于重大出生缺陷之一，亦名愛德華氏綜合征，即患者多了一條18號染色體，該綜合征主要癥狀表現(xiàn)為患者頭有后凸的枕部、眼裂狹小、耳朵畸形、耳位低下、小頜、胸骨短小等。由于患兒存在嚴(yán)重的智力低下伴多發(fā)畸形，50%在出生后2個月內(nèi)死亡，可活至1年的不到10%，極個別可活到15歲。因缺乏有效的治療手段，一旦患兒出生將會給家庭和社會帶來極大的精神和經(jīng)濟負(fù)擔(dān)，已嚴(yán)重影響我國的人口質(zhì)量，已成為社會發(fā)展的沉重負(fù)擔(dān)和可持續(xù)發(fā)展的嚴(yán)重障礙。
[0003]近年來，國內(nèi)外將18-三體綜合征列為重大出生缺陷之一，作為重點干預(yù)對象，并建立了相應(yīng)的產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷方法。在《國民經(jīng)濟和社會發(fā)展的第十一個五年規(guī)劃綱要》中強調(diào)，要加大18-三體綜合征等出生缺陷的干預(yù)力度，以改善出生人口素質(zhì)；在《國家中長期科學(xué)和技術(shù)發(fā)展規(guī)劃綱要(2006-2020年〉》中將18-三體綜合征等出生缺陷的研究列為優(yōu)先主題。
[0004]目前對18-三體綜合征等出生缺陷的研究主要是針對遺傳、生物、物理、化學(xué)因素與發(fā)病(率)的關(guān)系以及其早期篩查和診斷方面，如國外有大量的文獻報道，18-三體等出生缺陷的發(fā)生與地區(qū)性、受孕時間、有害物接觸史等環(huán)境因素呈顯著相關(guān)；有國外文獻報道，近親婚配時所存在的兩個相同隱性基因與生育18-三體綜合征等出生缺陷患兒有關(guān)；
等報道孕婦的體重、吸煙習(xí)慣、孕產(chǎn)次與18-三體綜合征篩查指標(biāo)有關(guān)；另有國內(nèi)學(xué)者報道孕婦吸煙、微量元素、心理因素、飲食、10--感染等與18-三體綜合征等出生缺陷相關(guān)。
[0005]但是，由于沒有可在體外長期培養(yǎng)的、可用于18-三體綜合征發(fā)病機制研究的永生細胞模型及其細胞庫，就難以從細胞水平在體外研究18-三體綜合征細胞受物理、化學(xué)、生物、遺傳等影響的基因突變、基因表達、功能改變、生理特性、生物傳導(dǎo)等機制，從而嚴(yán)重限制了 18-三體綜合征的進一步研究。
[0006]國外文獻報道，猴腎病毒40 (^40)可以使某些人類細胞發(fā)生永生化。01.1(11118從和311111%?。、堑妊芯勘砻鳎?7401抗原基因的導(dǎo)入能加快轉(zhuǎn)化細胞的生長速率，永生化細胞在體外多次傳代后，仍具有相對穩(wěn)定的增殖特性和功能狀態(tài)，同時也能保留其原始細胞的許多分化表型，可以用于轉(zhuǎn)基因動物模型及人類和動物某些種類的細胞模型的建立，據(jù)此可以借助于研究轉(zhuǎn)基因永生化細胞及動物模型而在體外研究原始細胞的特性，從而研究其發(fā)病機制。
[0007]根據(jù)文獻報道，用猿猴病毒奶仙)大I'抗原基因轉(zhuǎn)化來建立血管平滑肌細胞株，構(gòu)建細胞模型以研究肝素對血管平滑肌的抑制作用機制。811等利用經(jīng)^40轉(zhuǎn)化的角化上皮細胞株，構(gòu)建細胞模型來分析上皮細胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成的調(diào)控作用。11(11161等用^40轉(zhuǎn)化的角化上皮細胞株，作為細胞模型研究層粘連蛋白5介導(dǎo)的細胞粘附作用。161*61'等用經(jīng)^40轉(zhuǎn)化的前列腺上皮細胞株作為細胞模型來研究前列腺上皮細胞的生理功能和分泌功能。辦10118611等用經(jīng)八(112-^40轉(zhuǎn)化腎小管上皮細胞模型來研究近曲小管的損傷和疾病。11011的011等用^40轉(zhuǎn)化建立骨髓基質(zhì)細胞株作為細胞模型以研究在一定培養(yǎng)條件下，細胞具有向脂肪細胞和成骨細胞的雙向分化的潛能，進一步研究骨質(zhì)疏松的機制。
[0008]因研究工作的需要，幾乎每種疾病都建立了各自的細胞模型。如糖尿病細胞模型、癌細胞細胞模型、轉(zhuǎn)基因細胞模型、絕經(jīng)期綜合癥細胞模型、子宮內(nèi)膜細胞模型、癲癇細胞模型、電子細胞模型、酒精性癡呆細胞模型、腦水腫細胞模型。等等。
[0009]但是，至今尚未見有關(guān)構(gòu)建可用于在體外從細胞水平研究18-三體綜合征發(fā)病機制的永生細胞模型及其細胞庫的文獻報道，也無法開展相關(guān)的研究項目。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]為了解決至今尚未見有關(guān)構(gòu)建可用于在體外從細胞水平研究18-三體綜合征發(fā)病機制的永生細胞模型及其細胞庫的問題，本發(fā)明人提出了本發(fā)明。
[0011]本發(fā)明的目的是要提供以^40口基因轉(zhuǎn)染18-三體綜合征細胞模型及其細胞庫的構(gòu)建方法，另一目的是為在體外從細胞水平研究18-三體綜合征的發(fā)病機制提供37401丁基因轉(zhuǎn)染18-三體綜合征細胞模型及其細胞庫。
[0012]本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的:以了40嫩連接酶連接同時經(jīng)8孤肌酶切的1 (-)0嫩和擴增、瓊脂糖凝膠電泳分離的^4011叫0嫩，構(gòu)建
1 (-)重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化0冊3大腸桿菌感受態(tài)細胞以擴增、純化并挑取耐氨芐青霉素的菌落抽提質(zhì)粒，以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入經(jīng)膠原酶II消化的離體傳代18-三體綜合征懸液組織細胞或在含20%胎牛血清、5?10:^01 / [胰島素的培養(yǎng)液中處于將進入或剛進入對數(shù)生長期、梭形細胞占90%以上、匯合率達55%?65%的貼壁生長18-三體綜合征細胞，使重組子與細胞的0嫩整合，以6418篩選含陽性重組子的細胞，作傳代、擴大培養(yǎng)，篩選細胞形態(tài)、細胞生長曲線、染色體核型、軟瓊脂集落生長試驗、裸鼠致瘤試驗、轉(zhuǎn)染細胞0嫩中^40大I基因檢測、1^嫩表達產(chǎn)物測定及0嫩序列測定結(jié)果符合永生化細胞特性并與原代細胞相同或相近者作為細胞模型凍存于液氮中，以此構(gòu)建^4011基因轉(zhuǎn)染18-三體綜合征細胞模型及其細胞庫。
[0013]本發(fā)明以？⑶擴增、瓊脂糖凝膠電泳提純的^40大I'抗原基因經(jīng)基因載體1)00^3.1和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入18-三體綜合征細胞而構(gòu)建其細胞模型，其組織細胞用0.01%膠原酶II消化而不用常規(guī)的胰蛋白酶消化，以僅使引起細胞粘連的膠原被消化或使細胞懸浮，減少了細胞壁的蛋白質(zhì)被消化而傷及細胞，使細胞培養(yǎng)的成功率由一般的約85%提高到95%以上；選用了含20此/ [胎牛血清、5?10咖01 / [胰島素的特定培養(yǎng)基，使細胞不會生長過快而影響3740大I抗原基因的整合，也不會因缺少營養(yǎng)或細胞生長刺激因子而使細胞在未達到要求的匯合率、未進入對數(shù)生長期前就過早死亡，或?qū)?shù)生長期縮短；制備的細胞系在-1961液氮中凍存1個月后復(fù)蘇培養(yǎng)，均能生長出貼壁細胞；在作細胞系染色體鑒定時，秋水仙素的用量及作用時間是常規(guī)的5?10倍，使染色體分裂相增力口，足以計數(shù)和分析；由此建成的18-三體綜合征細胞模型及其細胞庫，為從細胞水平在體外研究18-三體綜合征的發(fā)病機制奠定基礎(chǔ)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1是本發(fā)明制備的18三體綜合癥細胞模型(貼壁生長)圖。
[0015]如圖1，細胞傳代至第55代、培養(yǎng)至第7天時，呈圓形、梭形、鋪滿瓶底，其細胞生長匯合率達95%以上，此后隨著傳代次數(shù)的增加，細胞生長變慢、變稀疏。

【具體實施方式】
[0016]1、^40大I抗原0嫩的提取:①37400嫩酶切:從市售購買含有大I抗原基因的3乂40冰凍干粉或^40質(zhì)粒，溶解于適量的40或12緩沖液中，加2此10\酶切緩沖液和18111 40，加限制性內(nèi)切酶8肅！1 1(1-5。/呢0嫩)，371溫育1卜，751加熱比時!!，滅活酶，加入511[電泳加樣緩沖液(也可通過加入0.5001 / I ￡01^)終止反應(yīng)以備電泳。②^400嫩電泳:取電泳級瓊脂糖以電泳緩沖液配成10%瓊脂糖凝膠，倒入已封好的凝膠灌制平臺上，插上樣品梳，待膠凝固后從制膠平臺上除去封帶，拔出梳子，放入加有足夠電泳緩沖液的電泳槽中，緩沖液高出凝膠表面約1臟，用適量的10乂加樣緩沖液制備0嫩樣品，然后用移液器將樣品加入樣品孔中，并同時做合適的0嫩分子量標(biāo)準(zhǔn)對照物，接通電極，使0嫩向陽極移動，在1-1(^ /挪凝膠的電壓下電泳至足夠分離0嫩片段的距離時，關(guān)閉電源。③從瓊脂糖中分離約2600恥^40大I抗原0嫩:在300-360=111長波紫外光源下(使用長波紫外光源以防止0嫩損傷)將含目標(biāo)0嫩片段的凝膠條帶切下裝入透析袋中，向透析袋內(nèi)加入201電泳緩沖液，使之浸沒凝膠，并排空汽泡，將透析袋水平放入電泳槽(長度方向與電泳平行)，加入適量緩沖液將透析袋浸沒(約6-7皿)，接通電源，150伏電洗，在紫外燈下觀察待0嫩全部移出凝膠，改變電場方向繼續(xù)通電1分鐘，從透析袋中吸出緩沖液于1-5“
管中，加入1.5倍體積正丁醇,混勻抽提去￡8，在臺式離心機上最高速2分鐘，吸去上層正丁醇溶液，如此重復(fù)二次，自下層言0嫩的溶液中加入等體積酚氯仿(2個)抽提2次，上清轉(zhuǎn)入另一管中加入1 / 10倍體積31版1八。、2倍體積預(yù)冷無水乙醇，于
201過夜，120008，41下離心10分鐘，得0嫩沉淀，棄上清，加入70%乙醇洗滌2次后棄干乙醇，加入509 1 12溶解0嫩。此外，還可用低熔點瓊脂糖凝膠法、0嫩濾膜插片法等將目的0嫩片段從凝膠中分離、純化出來。
[0017]2、^40大I'抗原0嫩與嫩3.1基因載體的連接:取9 ^ 1上述0嫩成份(0.1-5^ 12 X連接緩沖液、110臟0171八1？、140嫩連接酶(20?500粘性末端單位)或大腸桿菌0嫩連接酶、嫩3.1空載體混合，151溫育2處，構(gòu)建成37401 / 嫩3.1
重組子。
[0018]3、87401 /1重組子的擴增、分離與鑒定:①大腸桿菌感受態(tài)的制備:其基本方法是用冰預(yù)冷的或多種2價陽離子等處理細菌，使之進入感受態(tài)得以轉(zhuǎn)化，用0^012制備新鮮或冷凍的大腸桿菌感受態(tài)細胞，常用于成批制備感受態(tài)細菌，本法適用于大多數(shù)大腸桿菌菌株，操作過程簡述如下:從371培養(yǎng)16?20卜的新鮮平板中挑取一個單菌落(如大腸桿菌01152)，或101新鮮的16?20卜過夜培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)到一個含有100011^8培養(yǎng)基的或50001燒瓶中，于371劇烈振搖培養(yǎng)約2?3卜(旋轉(zhuǎn)搖床200?3001~ / 111111)，每隔20?300111測量00600值?0.4，在無菌條件下將細菌轉(zhuǎn)移到一個，用冰預(yù)冷的5001聚丙烯離心管中，在冰上放置10?20111111，于41用301^2111(^2轉(zhuǎn)頭(或與其離心管相配的轉(zhuǎn)頭)以40001 / 0111離心10-11，以回收細胞，倒數(shù)培養(yǎng)液，將管倒置加化以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡，以1001用冰預(yù)冷的0.1111103012重懸每份沉淀，放于冰上，于41用301^41(^3轉(zhuǎn)頭(或與其相應(yīng)的轉(zhuǎn)頭)以40001 / 111111離心10-11，以回收細胞，倒出培養(yǎng)液，將管倒置1111111以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡，每501111初始培養(yǎng)物用21111冰預(yù)冷的0.1I 03012重懸每份沉定，此時，可以迅速將細胞分裝成小份，液氮中冰凍，-701貯存?zhèn)溆?，用冷卻的無菌吸頭從每種感受態(tài)細胞懸液中各取2009 1轉(zhuǎn)移到無菌的微量離心管中，在每管中加0嫩或連接反應(yīng)混合物(體積彡10 9 1，0嫩彡50=8)，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，在冰中放置30111111，將離心管放到預(yù)加溫到401的循環(huán)水浴中的試管架上，放置908?2111111，不要搖動試管，快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細胞冷卻1?2111111，每離心管加800^ 130(:培養(yǎng)基，用水浴將培養(yǎng)基加溫到371，然后將管轉(zhuǎn)移到371搖床上，溫育45111111使細菌復(fù)蘇，并且表達質(zhì)粒編碼的抗生素抗性標(biāo)記基因，將適當(dāng)體積(每個洲臟平板可達2009 1)已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)移到含20011111101 / 0^304和相應(yīng)抗生素的308培養(yǎng)基上，將平板置于室溫至液體被吸收，倒置平皿，于371培養(yǎng)，12?16卜后可出現(xiàn)菌落。②重組子的篩選、擴增與提取:用無菌牙簽或滅菌接種針挑選單個菌落接種于5此無菌的⑶培養(yǎng)基或豐富培養(yǎng)基(如超級肉湯或18超級肉湯培養(yǎng)基)中，培養(yǎng)過夜后，再加入到500此含18培養(yǎng)基(含有適當(dāng)抗生素)的21燒瓶中，再于371培養(yǎng)至飽和狀態(tài)(00.^ 4，為提高產(chǎn)量，應(yīng)采用表面積較大及帶折流板的燒瓶以盡量增大通氣度，振搖速度應(yīng)大于4001~ / 111111)，于4X^60008離心10111111,用4此6X1溶液重懸沉淀，并轉(zhuǎn)移到一個容積彡201111的高速離心管中(細菌沉淀可以在-201或/ 111[溶菌酶的以2溶液，重懸沉淀，于室溫放置10111111，加入10此新配版10? / 808溶液，并且輕輕混勻直至液體變得均一、清亮而粘稠，于冰上放置10-??！，加入7.5.111乙酸溶液，用吸管輕輕攪拌直至粘稠度下降并形成大的沉淀，于冰上放置10-11，于41，200008離心10-11，將上清輕輕倒入至另一個干凈的離心管中，如果有可見的飄浮物可用數(shù)層紗布過濾，加入0.6倍體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫放置5?100111，于室溫，15008離心川砧!!，加入2齓70%乙醇輕輕洗滌沉淀，然后短暫快速離心，吸去乙醇，并真空干燥(沉淀可在41長期保存③重組子的鑒定:上述從感受態(tài)大腸桿菌中提取的0嫩(含重組子^401 / 1)00^3.1)，同上法用限制性內(nèi)切酶8肅！1I進行酶切，108 / I瓊脂糖凝膠電泳鑒定，獲得大小約2600^及5600^的2條帶，前者符合中37401片段的大小。
[0019]4、^401 /1重組子轉(zhuǎn)染18-三體綜合征組織細胞及其陽性克隆的篩選與擴增:①18-三體綜合征組織細胞的收集與培養(yǎng):以無菌操作提取在作其他實驗或其他檢查后多余、廢棄的18-三體綜合征患兒羊水脫落細胞，以組織細胞終濃度約為1X10^ /此備用，取上述呈單個分散的組織細胞或經(jīng)處理后成為單個分散的細胞接種于含5?101111101 / I胰島素、20%胎牛血清的即111640液中或接種于含20%胎牛血清、5?101111101 / [胰島素的低糖0121細胞培養(yǎng)基中，置于371，體積分?jǐn)?shù)5% (:02培養(yǎng)箱內(nèi)，細胞貼壁培養(yǎng)約3?4天、細胞形態(tài)為梭形、小園形細胞不到10%、貼壁細胞的匯合率達75%?85%、處于剛進入對數(shù)生長期時，即考慮收集培養(yǎng)細胞，先吸干凈培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，加入
1-2010.01%的膠原酶II液(以消化液能覆蓋整個瓶底為準(zhǔn))，靜置2-10-11 (顯微鏡下動態(tài)監(jiān)測)，吸去膠原酶II液，加入低糖0121或即111640培養(yǎng)液，用吸管吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細胞，形成細胞懸液，轉(zhuǎn)入離心管離心沉淀，去上清液，細胞沉淀用上述培養(yǎng)液清洗2次后，制成懸液，用作重組子導(dǎo)入。②37401丨1)00^3.1的導(dǎo)入:方法1:在上法分離所得細胞中，選用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將上述2 X 105個細胞接種于35111111培養(yǎng)皿中，在371 002培養(yǎng)箱培養(yǎng)24?36匕使細胞生成單層、細胞形態(tài)為梭形、尚未見或僅見少于10%小園形細胞、貼壁細胞的匯合率達55%?65%、處于將進入或剛進入對數(shù)生長期時，即考慮轉(zhuǎn)染重組子^401 / 嫩3.1，在1.501微量離心管中制備下列的溶液:即管八，將^40丁 /1)00^3.1溶于100 4 1無血清培養(yǎng)液中；而管8，將20 ^ 1 “即作⑶肅丨加溶于80 ^ 1無血清培養(yǎng)液中，將管八和管8混勻，室溫下置45-1吸去細胞培養(yǎng)液后，用無血清培養(yǎng)液洗滌細胞2次，在[11)0:^6(31:211111116-37401 / ￠101)^3.1混合物中加入11111無血清培養(yǎng)液，輕輕混勻，再滴加至細胞培養(yǎng)皿內(nèi)，然后加入11111無血清培養(yǎng)液，在(?培養(yǎng)箱培養(yǎng)101！，吸出轉(zhuǎn)染液，加401完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)16匕棄去培養(yǎng)液，更換濃度為400呢。171的6418培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，8?10天后選擇單個細胞集落進行亞克隆，擴大培養(yǎng)后再加大6418濃度到800呢。^1,將能在高濃度的6418環(huán)境中穩(wěn)定生長的克隆進行傳代擴增，另外18-三體綜合征細胞與^40或￡8病毒共同培養(yǎng)后，感染了病毒0嫩并發(fā)生整合的18-三體綜合征細胞進行傳代擴增。方法2:吸取1丨10-1 / 40細胞懸液，配制成終濃度為1乂105 / 111[細胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，選擇低糖腫剛或即111640培養(yǎng)基，其中含201^/1胎牛血清、10鹽01 / [胰島素，培養(yǎng)48卜后，使細胞生成單層、細胞形態(tài)為梭形、尚未見或僅見少于10%小園形細胞、貼壁細胞匯合率達55%?65%、處于將進入或剛進入對數(shù)生長期時，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，將重組子37401 / 1)00^3.1轉(zhuǎn)染至18-三體綜合征細胞內(nèi)，或?qū)?740直接感染至18-三體綜合征細胞內(nèi)，用含700呢/1^418的培養(yǎng)液篩選1流，將6418濃度改為300呢/匕至出現(xiàn)陽性克隆，將其轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)瓶進行擴大、傳代培養(yǎng)；方法3:將上述的細胞懸液以低糖0121或即111640培養(yǎng)液配成5 X 1071終濃度的細胞懸液接種于24孔培養(yǎng)板，待細胞長至90%左右融合時用于轉(zhuǎn)染，其方法是將0.2^ 8含量的重組子^401 / 嫩3.1，用腫剛或尺?II1640調(diào)整體積為50 ^ 1，室溫放置5-11 ；脂質(zhì)體6 ^ 1，用0腿1調(diào)整體積為50 ^ 1，室溫放置5111111，兩種試劑輕輕混勻，室溫放置20111111，同時將24孔板內(nèi)的細胞用0121洗3次后，再在每孔加培養(yǎng)液100 9 1，加脂質(zhì)體-^401 / 嫩3.1混合液，輕輕在細胞表面鋪均勻，于371 002培養(yǎng)箱放置6匕隨后用0.018 / I膠原酶將細胞消化，轉(zhuǎn)入6孔板內(nèi)，加入完全培養(yǎng)基，次日加6418抗生素使終濃度為500呢/匕直到有單克隆細胞長出。約10(1后有單克隆細胞集落長出，挑出置于24孔板內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，以300呢/ I的6418維持并穩(wěn)定傳代擴增培養(yǎng)。以此構(gòu)建18-三體綜合征細胞模型。
[0020]5、18-三體綜合征細胞模型的傳代、擴增:收集上述經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入3740大X抗原基因的陽性單克隆細胞集落，以低糖0腿1或即111640培養(yǎng)基配成約1 X 105 /此的細胞懸液，接種于數(shù)瓶20?50挪2培養(yǎng)瓶中，加入5此含20此/ [胎牛血清、10咖01 / I胰島素的低糖0121或即111640培養(yǎng)基，至細胞貼壁生長、匯合率達80?85%、處于對數(shù)生長期的前期時收集細胞，再按上述步驟傳代培養(yǎng)，如此反復(fù)傳代接種、培養(yǎng)，記錄代數(shù)并觀察細胞生長特點。如圖1，細胞傳代至第55代、培養(yǎng)至第7天時，呈對數(shù)生長、圓形、梭形、鋪滿瓶底，其細胞生長匯合率達95%以上，此后隨著傳代次數(shù)的增加，細胞生長變慢、變稀疏。其中對數(shù)生長是指細胞生長速度快，細胞數(shù)量的增加與培養(yǎng)時間呈倍增關(guān)系，通常按常規(guī)按種細胞進行培養(yǎng)時，培養(yǎng)1?2天便可在顯微鏡下找到生長的單個細胞；4?5天時可見細胞集落，貼壁生長細胞鋪蓋培養(yǎng)瓶底的1 / 3，培養(yǎng)7?13天時可見貼壁生長細胞鋪蓋培養(yǎng)瓶底的2 / 3以上，甚至細胞重疊、幾乎不留空隙(匯合率達95?100% ),細胞光亮，無顆粒、無粗糙感等老化現(xiàn)象，也可據(jù)細胞計數(shù)與培養(yǎng)時間的關(guān)系來判斷；死亡的細胞少，每周因死亡而漂浮的細胞少于10% [通過臺盼藍染色法鑒別死細胞和活細胞，因為正常的活細胞，胞膜結(jié)構(gòu)完整，能夠排斥，使臺盼藍不能夠進入胞內(nèi)；而喪失活性的細胞，胞膜的通透性增加，可被臺盼藍染成藍色，可判斷為細胞已經(jīng)死亡，方法是每周吸取一定量的細胞培養(yǎng)懸液，與臺盼藍染色劑混合后置室溫5?10分鐘，然后制成細胞薄片，在顯微鏡下計數(shù)1000個細胞總數(shù)，計算著色的死細胞和不著色的活細胞的百分比〕。
[0021]6、18-三體綜合征細胞模型生物學(xué)特性的鑒定:使用^40建立細胞模型(細胞系)后，鑒定的關(guān)鍵問題有:一是要求該細胞具有持續(xù)的增殖能力，即I抗原在細胞系中穩(wěn)定表達；二是要求其形態(tài)、基本生理功能等表型保持不變。①觀察細胞形態(tài):在倒置光學(xué)顯微鏡下每日觀察細胞是否呈典型的上皮細胞樣貼壁生長，是否呈梭形、或小園形生長；②觀察細胞生長曲線:取生長較好的轉(zhuǎn)染細胞，采用0.25胰蛋白酶液消化，制成細胞懸液，經(jīng)計數(shù)，分別取1.4X10^細胞接種于30個含15？83低糖0121培養(yǎng)基培養(yǎng)瓶。每天取2瓶細胞進行計數(shù)，計算均值，連續(xù)觀察直至細胞數(shù)量明顯下降，培養(yǎng)3天后每隔2天給未計數(shù)的細胞換液，采用同樣方法觀察轉(zhuǎn)染細胞在“即如2枷2-3？1無血清培養(yǎng)基中的生長情況。結(jié)果以培養(yǎng)時間為橫軸，細胞數(shù)量為縱軸(對數(shù))，描繪在半對數(shù)座標(biāo)上制成曲線后即成該細胞的生長曲線，永生化細胞系呈典型的“3”特征或“穹隆”形成；③檢查染色體:如果染色體核型為47，XX，+18 ；或47，XI, +18 ；或相同于本發(fā)明采集的原代18三體綜合癥細胞，則說明該細胞系沒有發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化(同時可用流式細胞儀分析細胞系中是否出現(xiàn)異常的0嫩群體，如果沒有，也說明細胞系未出現(xiàn)瘤性特征)。染色體核型分析方法是:在細胞生長密度達85-95% (其中小園形細胞占10%〉、處于對數(shù)生長期的培養(yǎng)物中按5此培養(yǎng)液中加入預(yù)熱的250118 / 1111秋水仙素100111，混勻后置371培養(yǎng)箱4小時，吸干培養(yǎng)液，加入預(yù)熱的
2-301 ￡0171-胰酶消化液，371作用5分鐘，終止消化，洗下貼壁細胞，經(jīng)離心、低滲、固定、制片、6顯帶后分析染色體核型軟瓊脂集落生長試驗:將37401轉(zhuǎn)染后永生化的細胞以5父104 / “接種于直徑為軟瓊脂平皿內(nèi)，觀察三周后，未發(fā)現(xiàn)克隆形成，說明本實驗的37401永生化染色體異常羊水細胞不能在軟瓊脂內(nèi)形成克隆，符合永生化特點；⑤裸鼠致瘤試驗:將37401永生化的細胞以3乂107接種裸鼠背部皮下，2個月后，4只裸鼠均未見腫瘤形成，證明此細胞為非惡化細胞；⑥轉(zhuǎn)染細胞0嫩中^40大I基因檢測:如以免疫組織化學(xué)檢測，3乂40轉(zhuǎn)染的細胞核內(nèi)染色可見大量棕色顆粒，表明3乂401抗原已整合入細胞內(nèi)；也可用奶-？0？法檢測I抗原在細胞中的表達，其中I抗原的引物:上游引物(八4239)5’ -611^16 八丁丁八丁八 ^01 6X1 八 1^-3’，下游引物(34496)5, ^16 IX八 101 似 6八丁-3，；擴增產(chǎn)物長度為 268如，擴增條件為 94。匕 5111111,即:(94^0,1111111:55^0,1111111, -0.5。。/ 循環(huán)；72。。，1111111) X 30、(9400，308 ；40。。，308, 72。。，308) X 15，擴增體系為 50 11 1: 2臟01 丨[、伽1？8200 411101 / [、引物濃度0.4 011101 /匕I叫1 口、模板5^ 1 ；實驗組以第19代細胞的⑶嫩為模板(參照市售⑶嫩第一鏈合成試劑盒進行⑶嫩第一鏈合成，產(chǎn)物-201保存)；陰性對照設(shè)兩個，分別以無菌水、原代細胞的⑶嫩做模板，陽性對照以^400嫩為模板(參照303-蛋白酶1(法提取37400嫩，因為^40病毒無包膜，不使用303破膜，取5 4 1進行1.5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，其余-20 00保存?zhèn)溆?；⑦1111很八表達產(chǎn)物測定:I'抗原很八奶-？0？產(chǎn)物測序:取1009 1體系的擴增產(chǎn)物，用凝膠回收試劑盒(化!^!^，日本)回收產(chǎn)物，取2^ 1 0嫩溶液稀釋100倍，測濃度，余下的0嫩及上、下游引物各10^ 1進行測序。④流式細胞術(shù)檢測:檢測第19代細胞系中合成、分裂的細胞比例，如果其增殖能力明顯比未建系的正常細胞增強，說明是^40大I抗原整合、表達的結(jié)果；@0嫩序列測定:按常規(guī)測序儀檢測，顯示3料0大I抗原0嫩序列。
[0022]所以，本發(fā)明的細胞模型為①細胞在倒置光學(xué)顯微鏡下呈梭形或小園形的上皮細胞樣貼壁生長；②細胞的生長曲線如以培養(yǎng)時間為橫軸，細胞數(shù)量為縱軸，在“即如21腿-3？1無血清培養(yǎng)基中呈“3”特征或“穹隆”形成逾染色體核型為47，XX，+18 ；或47，XV，+18 ；或相同于本發(fā)明采集的原始唐氏綜合癥細胞；④細胞不能在軟瓊脂內(nèi)生長(形成克隆)；⑤細胞為非惡化細胞，裸鼠致瘤試驗陰性細胞的0嫩中整合了 ^401抗原基因，表達^401抗原1111？嫩產(chǎn)物；@細胞傳代至第55代、培養(yǎng)至第7天時，呈對數(shù)生長、圓形、梭形、鋪滿瓶底，其細胞生長匯合率達95%以上，此后隨著傳代次數(shù)的增加，細胞生長變慢、變稀疏。
[0023]7、874011基因轉(zhuǎn)染18-三體綜合征細胞模型及其細胞庫:篩選并繼續(xù)傳代、擴大培養(yǎng)經(jīng)上述鑒定后符合永生化細胞特性并與原代細胞相同或相近的細胞，取生長狀態(tài)良好、處于對數(shù)生長期的不同世代的貼壁細胞，經(jīng)過消化、終止和離心分離(12001 /
6111111)，用含二甲亞砜的凍存液0.5?11111重懸細胞，細胞密度為5父105個/ 1111，加入凍存管，經(jīng)41,0.51！ ；-2021！ ；-70。〇，過夜，入-1961液氮凍存，以此法構(gòu)建生物學(xué)特性穩(wěn)定的永生化18-三體綜合征細胞模型及其細胞庫，以集中保存遺傳資源，為其他研究提供科研材料，又可直接作為18-三體綜合征發(fā)病機制體外研究的細胞模型，以加速拓展18-三體綜合征研究的新途徑，從細胞水平在體外研究18-三體綜合征細胞受物理、化學(xué)、生物、遺傳等影響的基因突變、基因表達、功能改變、生理特性、生物傳導(dǎo)等機制。
[0024]8、細胞模型應(yīng)用
[0025]1)細胞模型作為科研細胞
[0026]使18三體細胞模型處于人為制造的具有不同含量或濃度的有害物如物理(如X射線〉、化學(xué)(如甲醛、汽油、鉛、汞〉、生物(如風(fēng)疹病毒，巨細胞病毒，皰疹病毒)的條件下培養(yǎng)，然后取體外長期傳代的不同周期的活細胞、傳代過程的凋亡細胞、含有傳代培養(yǎng)中所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物的培養(yǎng)液從不同角度和水平，研究染色體異常、其他異常、正常對照細胞模型對有害物的耐受性、有害物致出生缺陷的機制。例如應(yīng)用常規(guī)方法如基因芯片、1111^芯片、比較基因組雜交芯片(⑶田、差異甲基化雜交芯片(01?)和％？8、等篩選差異的基因及其多態(tài)性、甲基化水平；運用原位雜交$13?)、^01-^1161-11 610扒1？631^11116 ？⑶、⑶I？、21“等技術(shù)檢測基因所在研究細胞模型中的基因轉(zhuǎn)率表達、定位及調(diào)控；利用酶反應(yīng)學(xué)、代謝組學(xué)技術(shù)鑒定細胞模型長期傳代中蛋白質(zhì)代謝過程和關(guān)鍵的代謝產(chǎn)物；應(yīng)用雙向電泳、嫩0)1-10？質(zhì)譜鑒定、酵母雙雜交和免疫共沉淀等技術(shù)研究細胞模型在長期傳代中的蛋白質(zhì)功能及蛋白質(zhì)間的相互作用，從活細胞培養(yǎng)過程動態(tài)、長期研究環(huán)境有害因素致出生缺陷的機制，例如:①環(huán)境中常見的毒性物質(zhì)苯并芘致18三體出生缺陷的研究:使18三體細胞模型和正常對照細胞分別在含有0.1,1.0,5.0,10.0,20.0^1 / I苯并芘的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，檢測在培養(yǎng)2周、4周、6周、8周、16周等不同培養(yǎng)時間的可作為細胞毒性指標(biāo)的細胞凋亡、壞死、雙核細胞率和可作為遺傳毒性指標(biāo)的微核率、核質(zhì)橋率、核芽率，即在光學(xué)顯微鏡下計數(shù)10000個雙核細胞中的微核數(shù)、核質(zhì)橋數(shù)和核芽數(shù)；500個活細胞中的凋亡和壞死細胞數(shù)、雙核細胞數(shù)，以及檢測細胞存活率，即應(yīng)用四甲基偶氮唑鹽比色法(111法)，在吸去原培養(yǎng)液后，在96孔板上加入20%的5呢/ 1111111的無血清培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)處，小心吸棄孔內(nèi)上清液，每孔加入1509[二甲亞砜，振蕩10-！！，使紫色結(jié)晶物充分溶解，本酶標(biāo)儀以490=0測定各孔的吸光度值，計算出細胞存活率。還可以其他常規(guī)實驗方法檢測不同培養(yǎng)時間的含毒性物與不含毒性物、病例與正常細胞中各組細胞的基因突變、蛋白質(zhì)組學(xué)、細胞分泌功能、染色體畸變、細胞存活率(壽命)等，以從活細胞培養(yǎng)過程中從細胞水平動態(tài)、長期研究環(huán)境有害因素致18三體出生缺陷的機制。②以某種病源微生物替換毒性物質(zhì)苯并芘做同樣的研究，即可從活細胞培養(yǎng)過程中從細胞水平動態(tài)、長期研究生物因素致18三體出生缺陷的機制。③將配成濃度梯度的治療藥物與配成濃度梯度的病源微生物或毒性化學(xué)物質(zhì)以及18三體細胞模型共同培養(yǎng)，即可從活細胞培養(yǎng)過程中從細胞水平動態(tài)、長期研究藥物對致18三體出生缺陷因素的治療效果及對出生缺陷的干預(yù)效果。④同樣可用18三體細胞模型研究基因治療的方法，替代某些以人體直接做試驗。
[0027]2)細胞模型作為質(zhì)控細胞
[0028]實驗室的質(zhì)量控制是開展實驗診斷項目的準(zhǔn)入制度，已成為政府行為。18三體細胞模型可用作質(zhì)控細胞，用于室內(nèi)質(zhì)控和室間質(zhì)評。例如用細胞模型同步于臨床標(biāo)本的染色體病實驗診斷方法，作常規(guī)細胞培養(yǎng)、染色體制備、染色體核型分析，以考核實驗過程的試劑質(zhì)量、儀器性能、操作方法等是否可靠，相當(dāng)于實驗中的陽性、陰性對照；可將細胞模型經(jīng)常規(guī)染色體制備、染色體核型分析所得到的圖像作整理后，發(fā)送到各相關(guān)實驗室，以考核各室對各種染色體異常圖像的診斷的準(zhǔn)確性；可將細胞模型發(fā)送到各相關(guān)實驗室，在各室自行作出常規(guī)細胞培養(yǎng)、染色體制片、染色體核型分析后回報結(jié)果，對各室的診斷結(jié)果作室間質(zhì)量評價，通過評比各室的準(zhǔn)確性，以發(fā)現(xiàn)相關(guān)問題、解決問題、提高診斷質(zhì)量；可將18三體細胞模型與各種正常染色體細胞按質(zhì)控所需要的種類及比例混合，制成含有不同種類和比例的混合質(zhì)控細胞，作為熒光原位雜交(巧別)檢測染色體數(shù)目異常室內(nèi)質(zhì)控細胞和室間質(zhì)評細胞，如果某實驗室在作？13?中沒有檢測出(漏診)質(zhì)控細胞的不同種類的染色體異常、沒有準(zhǔn)確檢測出不同種類的染色體異常的比率(％ ),則說明實驗方法存在質(zhì)量問題，應(yīng)找原因改正?，F(xiàn)以幾種染色體異常細胞模型混合后制備的質(zhì)控細胞在熒光原位雜交室間質(zhì)評中的具體應(yīng)用為例說明如下:①準(zhǔn)備質(zhì)控細胞:取1例或數(shù)例18三體及染色體正常細胞模型，按質(zhì)控所需要的例次或比例混合而成質(zhì)控細胞，混合的質(zhì)控細胞還可經(jīng)擴增后發(fā)放使用。如以1例18三體染色體數(shù)目異常細胞模型與1例染色體正常細胞模型等比例細胞數(shù)混合，則18三體染色體數(shù)目異常的細胞與染色體正常細胞各占50%。然后將質(zhì)控細胞發(fā)送到各受試對象做室間質(zhì)量評價。②熒光原位雜交(巧別)檢測質(zhì)控細胞染色體數(shù)目及結(jié)果判定:各受試對象收到質(zhì)控細胞后，可酌情對質(zhì)控細胞株進行傳代擴增后測試，以增加細胞數(shù)。試劑采用瑞士雅培制藥有限公司的八1161^781011試劑盒，完成3條染色體的數(shù)目分析:第 18 號細皿，青色)? X61-0611,綠色)、！
，紅色)號染色體為計數(shù)探針(0^01110801116 ￡111111161? 1:丨叩？1~0136，⑶？)，混合后雜交第1個區(qū)域，方法是取18、X和V染色體探針，將質(zhì)控細胞(與實驗室被檢標(biāo)本)同步，經(jīng)20001- / 111111離心10111111，去上清，留沉淀0.21111，離心管中加入41111膠原酶37。〇溫浴30111111，20001 / 111111離心10111111，去上清，然后加入51111預(yù)溫的1511101 / I %1，在37水浴中低滲25111111, 20001- / 111111離心10111111，去上清。加入新配制的固定液(甲醇:冰醋酸=3:1)固定10111111，離心2000:^ / 111111離心10111111去上清，反復(fù)兩次。滴片，自然干燥老化。將制備好的標(biāo)本片自冰柜中取出，依次放人70 %、85 %、100 %乙醇中脫水，室溫干燥，預(yù)處理好的玻片置731，70%甲酰胺中50111。在暗室中將兩種探針混合液各10 9 1加在玻片的靶區(qū)域，蓋上蓋玻片，避免產(chǎn)生氣泡，封片膠將蓋玻片封好，置暗濕盒中421雜交過夜，清洗，在高倍鏡下觀察雜交效果，每例標(biāo)本計數(shù)60?100個細胞，記錄雜交信號數(shù)目并采集圖像，要求細胞核膜必須完整，核內(nèi)雜交信號明亮清晰無重疊，信號彌散及微弱均不作統(tǒng)計。③測試結(jié)果:經(jīng)探針雜交后，細胞內(nèi)的18號染色體顯示青色的點，每條18號顯示1個青色的點，2條則顯示2個青色的點，3條則顯示3個青色的點；細胞內(nèi)女性)染色體顯示綠色的點，每條X染色體顯示1個綠色的點，2條則顯示2個綠色的點，3條則顯示3個綠色的點；細胞內(nèi)V男性)染色體顯示紅色的點，每條X染色體顯示1個紅色的點，2條則顯示2個紅色的點，3條則顯示3個紅色的點。如果實驗人員技術(shù)、操作、實驗器材、試劑等有質(zhì)量問題，則21號染色體紅色的點、細胞內(nèi)XI:女性)染色體綠色的點、細胞內(nèi)1(男性)染色體紅色的點就沒有信號或難以辯認(rèn)。④另外，病例細胞模型可用于基因芯片、八芯片、比較基因組雜交芯片((--)、差異甲基化雜交芯片(01?)和 ％？8、吣忖116111 1310^^681-^11116 ？⑶、011？、￡13 八等基因檢測技術(shù)的陽性對照，或作為病例資源保存，備作用上述方法作基因突變、基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等檢測，以分析發(fā)病機理。
【權(quán)利要求】
1.一種用于醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的SV40LT基因轉(zhuǎn)染18-三體綜合征細胞模型及其細胞庫的構(gòu)建，其主要特征是按常規(guī)以T4DNA連接酶、BamH1、pcDNA3.1 (-)DNA及SV40LTag DNA構(gòu)建SV40LTag-pcDNA3.1 (-)重組子、以感受態(tài)大腸桿菌純化重組子、以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將其導(dǎo)入經(jīng)膠原酶II消化的離體傳代或呈對數(shù)生長的18-三體綜合征組織細胞，使重組子與細胞的DNA整合，并擴大培養(yǎng)經(jīng)G418篩選含陽性重組子的細胞克隆，篩選細胞形態(tài)、生長曲線、染色體核型、軟瓊脂集落生長、裸鼠致瘤試驗、轉(zhuǎn)染細胞DNA中SV40大T基因檢測、mRNA表達產(chǎn)物測定及DNA序列測定結(jié)果符合永生化細胞特性并與原代細胞相同或相近者作為SV40LT抗原基因介導(dǎo)18-三體綜合征體外研究細胞模型凍存于液氮中，為在體外從細胞水平長期研究18-三體綜合征的發(fā)病機制奠定基礎(chǔ)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的SV40LT基因轉(zhuǎn)染18-三體綜合征細胞模型及其細胞庫的構(gòu)建，其特征是所指細胞模型(I)細胞在倒置光學(xué)顯微鏡下呈梭形或小園形的上皮細胞樣貼壁生長；(2)細胞的生長曲線如以培養(yǎng)時間為橫軸，細胞數(shù)量為縱軸，在h印ato ZYME-SFM無血清培養(yǎng)基中呈“S”特征或“穹隆”形成；(3)染色體核型為47，XX(XY)，+18 ;(4)細胞不能在軟瓊脂內(nèi)生長(不形成克隆)；(5)細胞為非惡化細胞，裸鼠致瘤試驗陰性；(6)細胞的DNA中整合了 SV40LT基因，表達SV40LTmRNA產(chǎn)物；(7)細胞傳代至第55代、培養(yǎng)至第7天，仍呈對數(shù)生長、圓形、梭形；(8)作為細胞模型用于在體外從細胞水平(替代人體或動物直接試驗)研究18-三體綜合征的發(fā)病機制、遺傳資源貯存、實驗對照及質(zhì)控細胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的SV40LT基因轉(zhuǎn)染18-三體綜合征細胞模型及其細胞庫的構(gòu)建，其特征是取自因其他實驗所需而采集的、并在其他實驗后多余、廢棄的18-三體綜合征患兒羊水脫落細胞構(gòu)建之。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的SV40LT基因轉(zhuǎn)染18-三體綜合征細胞模型及其細胞庫的構(gòu)建，其特征是所用的培養(yǎng)液為含有20%胎牛血清、5?lOnmol/L胰島素的RPMI1640或含有20mL / L胎牛血清、5?1nmol / L胰島素的低糖DMEM培養(yǎng)液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的SV40LT基因轉(zhuǎn)染18-三體綜合征細胞模型及其細胞庫的構(gòu)建，其特征是用作傳代培養(yǎng)以備脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入重組子的18-三體綜合征組織細胞，在原代擴增培養(yǎng)中，其收集指標(biāo)是細胞貼壁培養(yǎng)約3?4天、細胞形態(tài)為梭形、小園形細胞不到10%、貼壁細胞的匯合率達75%?85%、處于剛進入對數(shù)生長期時收集細胞；用作脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入重組子的傳代18-三體綜合征組織細胞，其時機選擇的指標(biāo)是細胞形態(tài)為梭形、尚未見或僅見少于10%小園形細胞、貼壁細胞的匯合率達55%?65%、處于將進入或剛進入對數(shù)生長期時的培養(yǎng)細胞；傳代細胞系收集的指標(biāo)是選擇細胞貼壁生長的匯合率達80?85%、處于對數(shù)生長期的前期時收集細胞；染色體核型分析的細胞收集指標(biāo)是細胞生長密度達85-95 %、小園形細胞占10 %以上、處于對數(shù)生長期的細胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的SV40LT基因轉(zhuǎn)染18-三體綜合征細胞模型及其細胞庫的構(gòu)建，其特征是以0.01%膠原酶II消化貼壁生長的18-三體綜合征組織細胞，作染色體核型分析時，每5mL培養(yǎng)液中加入250ug / ml秋水仙素lOOul，混勻后置37°C培養(yǎng)箱4小時。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的SV40LT基因轉(zhuǎn)染18-三體綜合征細胞模型及其細胞庫的構(gòu)建，其特征是細胞庫的構(gòu)建包括(I)篩選經(jīng)鑒定后符合永生化細胞特性并與原代細胞相同或相近的SV40LT基因轉(zhuǎn)染的18-三體綜合征細胞；(2)作傳代、擴大培養(yǎng)，取生長狀態(tài)良好、處于對數(shù)生長期的不同世代的貼壁細胞；(3)經(jīng)消化、終止、離心(1200r / min,6min)步驟收獲細胞；(4)用含二甲亞砜的凍存液配制密度為5父105個/ ml的細胞懸液；(5)按照4°C，0.5h ；-20°C,2h ;-70°C，過夜；入_196°C液氮的程序凍存細胞；(6)可再生性地長期保存SV40LT基因轉(zhuǎn)染18-三體綜合征細胞模型，備作遺傳資源和科研材料。
【文檔編號】C40B40/02GK104419684SQ201310415253
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年9月1日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月1日
【發(fā)明者】翁炳煥, 黃荷鳳, 陳松長, 李曉, 劉蓓, 陳雁 申請人:翁炳煥