導(dǎo)入hTERT和SV40LT重組子構(gòu)建愛(ài)德華綜合征細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫(kù)的制作方法

導(dǎo)入hTERT和SV40LT重組子構(gòu)建愛(ài)德華綜合征細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫(kù)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的導(dǎo)入hTERT和SV40LT重組子構(gòu)建愛(ài)德華綜合征細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫(kù)，其主要特征是以T4DNA連接經(jīng)BamHI酶切質(zhì)粒SV40LTag DNA及載體pcDNA3.1(-)DNA的產(chǎn)物，構(gòu)建SV40LTag-pcDNA3.1(-)重組子；并以Ligation Mix連接經(jīng)EcoR I和Xho I雙酶切質(zhì)粒pCIneo-hTERT和載體pLXSNneo的產(chǎn)物，構(gòu)建pLXSNneo-hTERT重組子，兩重組子經(jīng)感受態(tài)細(xì)胞擴(kuò)增純化和鑒定后以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染入愛(ài)德華綜合征細(xì)胞，經(jīng)G418篩選含陽(yáng)性重組子的細(xì)胞克隆并擴(kuò)大培養(yǎng)，篩選符合永生化細(xì)胞特性并與原代細(xì)胞相同或相近者作為SV40LT和hTERT重組子介導(dǎo)愛(ài)德華綜合征體外研究細(xì)胞模型，為從細(xì)胞水平在體外長(zhǎng)期研究其發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
【專利說(shuō)明】導(dǎo)入hTERT和SV40LT重組子構(gòu)建愛(ài)德華綜合征細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫(kù)

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及導(dǎo)入hTERT (端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶催化亞基)和SV40LT (猴腎病毒40大T抗原基因)重組子(SV40LT和hTERT介導(dǎo))構(gòu)建愛(ài)德華綜合征細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫(kù)，主要用于生殖健康研究領(lǐng)域，為愛(ài)德華綜合癥的體外研究提供細(xì)胞模型并保存其科研資源。

【背景技術(shù)】
[0002]愛(ài)德華綜合癥，亦名18-三體癥，即患者多了一條18號(hào)染色體。該綜合征主要癥狀表現(xiàn)為患者頭有后凸的枕部、眼裂狹小、耳朵畸形、耳位低下、小頜、胸骨短小等。由于患兒存在嚴(yán)重的智力低下伴多發(fā)畸形，50%在出生后2個(gè)月內(nèi)死亡，可活至I年的不到10%，極個(gè)別可活到15歲。因缺乏有效的治療手段，一旦患兒出生將會(huì)給家庭和社會(huì)帶來(lái)極大的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，已嚴(yán)重影響我國(guó)的人口質(zhì)量，已成為社會(huì)發(fā)展的沉重負(fù)擔(dān)和可持續(xù)發(fā)展的嚴(yán)重障礙。
[0003]近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外將愛(ài)德華綜合癥列為三大重大出生缺陷之一，作為重點(diǎn)干預(yù)對(duì)象，并建立了相應(yīng)的產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷方法。在《國(guó)民經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展的第十一個(gè)五年規(guī)劃綱要》中強(qiáng)調(diào)，要加大愛(ài)德華綜合癥等出生缺陷的干預(yù)力度，以改善出生人口素質(zhì)；在《國(guó)家中長(zhǎng)期科學(xué)和技術(shù)發(fā)展規(guī)劃綱要(2006-2020年)》中將愛(ài)德華綜合癥等出生缺陷的研究列為優(yōu)先主題。
[0004]目前對(duì)愛(ài)德華綜合癥等出生缺陷的研究主要是針對(duì)遺傳、生物、物理、化學(xué)因素與發(fā)病(率)的關(guān)系以及其早期篩查和診斷方面，如國(guó)外有大量的文獻(xiàn)報(bào)道，18-三體等出生缺陷的發(fā)生與地區(qū)性、受孕時(shí)間、有害物接觸史等環(huán)境因素呈顯著相關(guān)；有國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道，近親婚配時(shí)所存在的兩個(gè)相同隱性基因與生育愛(ài)德華綜合癥等出生缺陷患兒有關(guān)；Graaf、Rudnicka等報(bào)道孕婦的體重、吸煙習(xí)慣、孕產(chǎn)次與愛(ài)德華綜合癥篩查指標(biāo)有關(guān)；另有國(guó)內(nèi)學(xué)者報(bào)道孕婦吸煙、微量元素、心理因素、飲食、TORCH感染等與愛(ài)德華綜合癥等出生缺陷相關(guān)。
[0005]但是，由于沒(méi)有理想的可在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)的、可用于發(fā)病機(jī)制研究的永生細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫(kù)，就難以從細(xì)胞水平(以體外生長(zhǎng)的活細(xì)胞替代人體或動(dòng)物直接試驗(yàn))在體外動(dòng)態(tài)、實(shí)時(shí)研究愛(ài)德華綜合癥受物理、化學(xué)、生物、遺傳等影響的基因突變、基因表達(dá)、功能改變、生理特性、生物傳導(dǎo)等機(jī)制，從而嚴(yán)重限制了愛(ài)德華綜合癥的進(jìn)一步研究。
[0006]國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道，猴腎病毒40 (SV40)可以使某些人類細(xì)胞發(fā)生永生化。Poulin DL、Kung AL和Sulli van CS等研究表明，SV40T抗原基因的導(dǎo)入能加快轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長(zhǎng)速率，永生化細(xì)胞在體外多次傳代后，仍具有相對(duì)穩(wěn)定的增殖特性和功能狀態(tài)，同時(shí)也能保留其原始細(xì)胞的許多分化表型，可以用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型及人類和動(dòng)物某些種類的細(xì)胞模型的建立，據(jù)此可以借助于研究轉(zhuǎn)基因永生化細(xì)胞及動(dòng)物模型而在體外研究原始細(xì)胞的特性，從而研究其發(fā)病機(jī)制。
[0007]但國(guó)外最近有研究發(fā)現(xiàn),SV40Tag轉(zhuǎn)染的細(xì)胞伴隨著DNA損傷修復(fù)機(jī)制的丟失、核型的不穩(wěn)定性以及少數(shù)細(xì)胞致瘤性轉(zhuǎn)化。此外，長(zhǎng)期體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)部分轉(zhuǎn)染SV40Tag的細(xì)胞只是延長(zhǎng)了壽命，或僅僅渡過(guò)了衰老期(MI期)，多數(shù)細(xì)胞會(huì)最終進(jìn)入危機(jī)期(M2期)而死亡，說(shuō)明細(xì)胞并未獲得永生化。同時(shí)SV40病毒具有致瘤性，與某些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，因此SV40Tag轉(zhuǎn)染的細(xì)胞對(duì)某些研究也存在一定程度的限制性。
[0008]國(guó)外研究表明，導(dǎo)入外源性hTERT可以使細(xì)胞保持正常表型及分化特征。近年來(lái)已利用hTERT成功建立了某些細(xì)胞的永生化細(xì)胞系，基本保持染色體穩(wěn)定、分化正常、接觸抑制、無(wú)致瘤性等相對(duì)“正常”的生長(zhǎng)特征。可以用于人類和動(dòng)物某些種類的細(xì)胞模型的建立，對(duì)借助于研究轉(zhuǎn)基因永生化細(xì)胞模型而研究原始細(xì)胞的特性，從而研究其發(fā)病機(jī)制，具有重要的意義。在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，日本學(xué)者Kamata、Fujita和Fujii轉(zhuǎn)染hTERT建立了永生化人牙齦成纖維細(xì)胞、牙周細(xì)胞、牙髓細(xì)胞系和牙囊細(xì)胞系，細(xì)胞群體倍增數(shù)達(dá)150次以上，細(xì)胞均表現(xiàn)原有的生物學(xué)特性，誘導(dǎo)培養(yǎng)后都可以表達(dá)來(lái)源細(xì)胞的相關(guān)蛋白。Kitagawa等轉(zhuǎn)染hTERT建立了人成牙骨質(zhì)細(xì)胞系，細(xì)胞倍增達(dá)200次以上，細(xì)胞分化標(biāo)志物如堿性磷酸酶、I型膠原等表達(dá)穩(wěn)定。因研究工作的需要，幾乎每種疾病都有各自的細(xì)胞模型。如糖尿病細(xì)胞模型、癌細(xì)胞細(xì)胞模型、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型、絕經(jīng)期綜合癥細(xì)胞模型、子宮內(nèi)膜細(xì)胞模型、癲癇細(xì)胞模型、電子細(xì)胞模型、酒精性癡呆細(xì)胞模型、腦水腫細(xì)胞模型。等等。
[0009]另有國(guó)外研究表明，人體組織細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)會(huì)在較短時(shí)間內(nèi)死亡而無(wú)法傳代，即在進(jìn)入衰老期(Ml期)前就會(huì)死亡。但猴腎病毒40(SV40)可以使某些人類細(xì)胞發(fā)生永生化，可使細(xì)胞渡過(guò)Ml期后繼續(xù)存活、傳代培養(yǎng)20-30代，然后細(xì)胞又會(huì)進(jìn)入危機(jī)期(M2期)，細(xì)胞死亡率增加并伴染色體異常，分裂的細(xì)胞逐漸減少，絕大多數(shù)細(xì)胞發(fā)生死亡。而hTERT可以維持細(xì)胞染色體端粒的穩(wěn)定，從而使細(xì)胞渡過(guò)危機(jī)期(M2期)，可繼續(xù)存活、傳代達(dá)100-300代以上。所以如果用SV40和hTERT同時(shí)轉(zhuǎn)染人離體組織細(xì)胞建立永生化細(xì)胞系，那么SV40可以使細(xì)胞渡過(guò)Ml期，hTERT可以使細(xì)胞渡過(guò)M2期，比單獨(dú)使用其中之一建立的細(xì)胞系更穩(wěn)定、壽命更長(zhǎng)。
[0010]但是，至今尚未見(jiàn)有關(guān)以猴腎病毒40大T抗原基因(SV40LT)和端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶催化亞基(hTERT)同時(shí)導(dǎo)入細(xì)胞以建立永生細(xì)胞系并以此構(gòu)建可用于在體外從細(xì)胞水平研究愛(ài)德華綜合癥發(fā)病機(jī)制的永生細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫(kù)的文獻(xiàn)報(bào)道，也無(wú)法開(kāi)展相關(guān)項(xiàng)目的研究。為了解決這一問(wèn)題，本發(fā)明人提出了本發(fā)明。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明的目的是要提供導(dǎo)入hTERT(端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶催化亞基)和SV40LT(猴腎病毒40大T抗原基因)重組子(SV40LT和hTERT介導(dǎo))構(gòu)建愛(ài)德華綜合征細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫(kù)的方法，另一目的是為在體外從細(xì)胞水平研究愛(ài)德華綜合癥的發(fā)病機(jī)制提供SV40LT和hTERT介導(dǎo)的愛(ài)德華綜合癥細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫(kù)。
[0012]本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的:以T4DNA連接經(jīng)BamHI酶切質(zhì)粒SV40LTag DNA及載體 pcDNA3.1 (-)DNA 的產(chǎn)物，構(gòu)建 SV40LTag-pcDNA3.1(-)重組子；并以 Ligat1nMix連接經(jīng)EcoR I和Xho I雙酶切質(zhì)粒pCIneo-hTERT和載體pLXSNneo的產(chǎn)物，構(gòu)建pLXSNneo-hTERT重組子，兩重組子經(jīng)感受態(tài)細(xì)胞擴(kuò)增純化和鑒定后以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染入愛(ài)德華綜合癥組織細(xì)胞，經(jīng)G418篩選含陽(yáng)性重組子的細(xì)胞克隆并擴(kuò)大培養(yǎng)，篩選細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)曲線、染色體核型、裸鼠致瘤試驗(yàn)、轉(zhuǎn)染細(xì)胞端粒酶活性、hTERT mRNA表達(dá)產(chǎn)物、免疫組織化學(xué)染色、細(xì)胞增殖周期及細(xì)胞凋亡率符合永生化細(xì)胞特性并與原代細(xì)胞相同或相近者作為SV40LT和hTERT介導(dǎo)愛(ài)德華綜合癥體外研究細(xì)胞模型凍存于液氮中，為從細(xì)胞水平在體外長(zhǎng)期研究其發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
[0013]本發(fā)明以PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳提純SV40LT和hTERT，分別經(jīng)基因載體pcDNA3.1(-)DNA和pLXSNneo以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入愛(ài)德華綜合癥細(xì)胞而構(gòu)建其細(xì)胞模型，其組織細(xì)胞用0.01%膠原酶II消化而不用常規(guī)的胰蛋白酶消化，以僅使引起細(xì)胞粘連的膠原被消化或使細(xì)胞懸浮，減少了細(xì)胞壁的蛋白質(zhì)被消化而傷及細(xì)胞，使細(xì)胞培養(yǎng)的成功率由一般的約85%提高到95%以上；選用了含20mL/L胎牛血清、5?lOnmol/L胰島素的特定培養(yǎng)基，使細(xì)胞不會(huì)生長(zhǎng)過(guò)快而影響hTERT基因的整合，也不會(huì)因缺少營(yíng)養(yǎng)或細(xì)胞生長(zhǎng)刺激因子而使細(xì)胞在未達(dá)到要求的匯合率、未進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期前就過(guò)早死亡，或?qū)?shù)生長(zhǎng)期縮短；制備的細(xì)胞系在_196°C液氮中凍存I個(gè)月后復(fù)蘇培養(yǎng)，均能生長(zhǎng)出貼壁細(xì)胞；在作細(xì)胞系染色體鑒定時(shí)，秋水仙素的用量及作用時(shí)間是常規(guī)的5?10倍，使染色體分裂相增加，足以計(jì)數(shù)和分析；此外，用SV40LT和hTERT同時(shí)轉(zhuǎn)染人離體組織細(xì)胞建立永生化細(xì)胞系，SV40可以使細(xì)胞渡過(guò)Ml期，hTERT可以使細(xì)胞渡過(guò)M2期，比單獨(dú)使用其中之一建立的細(xì)胞系更穩(wěn)定、壽命更長(zhǎng)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1是本發(fā)明制備的愛(ài)德華綜合癥細(xì)胞模型(貼壁生長(zhǎng))圖。
[0015]如圖1，細(xì)胞傳代至第158代、培養(yǎng)至第8天時(shí)，呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)、圓形、梭形、鋪滿瓶底，其細(xì)胞生長(zhǎng)匯合率達(dá)95%以上，此后隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞生長(zhǎng)變慢、變稀疏。

【具體實(shí)施方式】
[0016]1、SV40LT和hTERT的提取:(I)酶切SV40LT和hTERT:①酶切SV40LT:從市售購(gòu)買含有大T抗原基因的SV40冰凍干粉或SV40質(zhì)粒，溶解于適量的H2O或TE緩沖液中，加2uL10X酶切緩沖液、18uL H2O和限制性內(nèi)切酶BamH I (l_5U/ugDNA)，37°C溫育lh，75°C加熱15min，滅活酶，加入5uL電泳加樣緩沖液(也可通過(guò)加入0.5mol/L EDTA)終止反應(yīng)以備電泳。②酶切hTERT:hTERT位于質(zhì)粒pClneo-hTERT的EcoRI與SalI位點(diǎn)之間，pLXSNneo載體多克隆位點(diǎn)(MCS)含EcoRI與XhoI酶切位點(diǎn)。從市售購(gòu)買pCIneo-hTERT質(zhì)粒，溶解于適量的超凈H2O或TE緩沖液中，加2uL10X酶切緩沖液和18uL H2O,加入限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xho I各0.5ul，37°C溫育lh，75°C加熱15min，滅活酶，加入5uL電泳加樣緩沖液(也可通過(guò)加入0.5mol/L EDTA)終止反應(yīng)，按常規(guī)PCR法擴(kuò)增hTERT后，收取擴(kuò)增物以備電泳。(2) SV40LT和hTERT電泳:①SV40LT (SV40DNA)電泳:取電泳級(jí)瓊脂糖以電泳緩沖液配成10%瓊脂糖凝膠，倒入已封好的凝膠灌制平臺(tái)上，插上樣品梳，待膠凝固后從制膠平臺(tái)上除去封帶，拔出梳子，放入加有足夠電泳緩沖液的電泳槽中，緩沖液高出凝膠表面約1mm，用適量的1X加樣緩沖液制備DNA樣品，然后用移液器將樣品加入樣品孔中，并同時(shí)做合適的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照物，接通電極，使DNA向陽(yáng)極移動(dòng)，在1-lOV/cm凝膠的電壓下電泳至足夠分離DNA片段的距離時(shí)，關(guān)閉電源。②hTERT電泳:取電泳級(jí)瓊脂糖以電泳緩沖液配成10%瓊脂糖凝膠，倒入已封好的凝膠灌制平臺(tái)上，插上樣品梳，待膠凝固后從制膠平臺(tái)上除去封帶，拔出梳子，放入加有足夠電泳緩沖液的電泳槽中，緩沖液高出凝膠表面約1mm，用適量的1X加樣緩沖液制備hTERT酶切樣品，然后用移液器將樣品加入樣品孔中，并同時(shí)做合適的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照物，接通電極，使hTERT向陽(yáng)極移動(dòng)，在l-10V/cm(80V)凝膠的電壓下電泳至足夠分離hTERT片段的距離時(shí)(30min)，關(guān)閉電源。(3) SV40LT和hTERT純化與回收:①SV40LT純化與回收:從瓊脂糖中分離出約2600bp SV40大T抗原DNA:在300_360nm長(zhǎng)波紫外光源下(使用長(zhǎng)波紫外光源以防止DNA損傷)將含目標(biāo)DNA片段的凝膠條帶切下裝入透析袋中，向透析袋內(nèi)加入2ml電泳緩沖液，使之浸沒(méi)凝膠，并排空汽泡，將透析袋水平放入電泳槽(長(zhǎng)度方向與電泳平行)，加入適量緩沖液將透析袋浸沒(méi)(約6-7mm)，接通電源，150伏電洗，在紫外燈下觀察待DNA全部移出凝膠，改變電場(chǎng)方向繼續(xù)通電I分鐘，從透析袋中吸出緩沖液于l_5ml Eppendorf管中，加入1.5倍體積正丁醇,混勻抽提去EB,在臺(tái)式離心機(jī)上最高速2分鐘，吸去上層正丁醇溶液，如此重復(fù)二次，在下層DNA的溶液中加入等體積酹氯仿(2個(gè))抽提2次,上清液轉(zhuǎn)入到另一 Eppendorf管中加入1/10倍體積3M NaAc>2倍體積預(yù)冷無(wú)水乙醇，于20°C過(guò)夜，12000g, 4°C下離心10分鐘，得DNA沉淀，棄上清，加入70%乙醇洗滌2次后棄干乙醇，加入50 μ I TE溶解DNA。此外，還可用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠法、DNA濾膜插片法等將目的DNA片段從凝膠中分離、純化出來(lái)。②hTERT純化與回收:從瓊脂糖中分離hTERT條帶:在長(zhǎng)波紫外光源下將含目標(biāo)hTERT片段的凝膠條帶切下裝入透析袋中，向透析袋內(nèi)加入2ml電泳緩沖液，使之浸沒(méi)凝膠，并排空汽泡，將透析袋水平放入電泳槽(長(zhǎng)度方向與電泳平行)，加入適量緩沖液將透析袋浸沒(méi)(約6-7_)，接通電源，150伏電洗，在紫外燈下觀察待hTERT全部移出凝膠，改變電場(chǎng)方向繼續(xù)通電I分鐘，從透析袋中吸出緩沖液于l_5ml Eppendorf管中，加入1.5倍體積正丁醇,混勻抽提去EB,在臺(tái)式離心機(jī)上最高速2分鐘，吸去上層正丁醇溶液，如此重復(fù)二次，自下層hTERT的溶液中加入等體積酹氯仿(2個(gè))抽提2次,上清轉(zhuǎn)入另一 Eppendorf管中加入1/10倍體積3M NaAc>2倍體積預(yù)冷無(wú)水乙醇，于20°C過(guò)夜，12000g，4°C下離心10分鐘，得hTERT沉淀，棄上清，加入70%乙醇洗滌2次后棄干乙醇，加入50 μ I TE溶解hTERT。此外，還可用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠法、hTERT濾膜插片法等將目的hTERT片段從凝膠中分離、純化出來(lái)。
[0017]2、SV40LT 和 hTERT 分別與載體 pcDNA3.1 和 pLXSNneo 構(gòu)建重組子:(I) SV40LT/pcDNA3.1重組子的構(gòu)建:取9 μ I上述DNA成份(0.1-5 μ g)、10 μ 12X連接緩沖液、I μ 11OmmoI/LATP, T4DNA連接酶(20?500粘性末端單位)或大腸桿菌DNA連接酶、pcDNA3.1 空載體混合，15°C溫育 24h，構(gòu)建成 SV40LT/pcDNA3.1 重組子。(2) pLXSNneo-hTERT重組子的構(gòu)建:取9 μ I上述純化的hTERT成份(0.1-5 μ g)、I μ 110mmol/L ATP、1ulLigat1n Mix或大腸桿菌DNA連接酶、2ul pLXSNneo空載體混合，15 °C溫育24h，構(gòu)建pLXSNneo-hTERT 重組子。
[0018]3、重組子的純化、擴(kuò)增、鑒定:(I) SV40LT/pcDNA3.1重組子的擴(kuò)增、分離與鑒定:①大腸桿菌感受態(tài)的制備:其基本方法是用冰預(yù)冷的CaCl2或多種2價(jià)陽(yáng)離子等處理細(xì)菌，使之進(jìn)入感受態(tài)得以轉(zhuǎn)化，用CaCl2制備新鮮或冷凍的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，常用于成批制備感受態(tài)細(xì)菌，本法適用于大多數(shù)大腸桿菌菌株，操作過(guò)程簡(jiǎn)述如下:從37°C培養(yǎng)16?20h的新鮮平板中挑取一個(gè)單菌落(如大腸桿菌DH52)，或Iml新鮮的16?20h過(guò)夜培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)到一個(gè)含有10mlLB培養(yǎng)基的IL或500ml燒瓶中，于37°C劇烈振搖培養(yǎng)約2?3h(旋轉(zhuǎn)搖床200?300r/min)，每隔20?30min測(cè)量0D600值& 0.4，在無(wú)菌條件下將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個(gè)，用冰預(yù)冷的50ml聚丙烯離心管中，在冰上放置10?20min后，于4°C用SorvallGS2轉(zhuǎn)頭(或與其離心管相配的轉(zhuǎn)頭)以4000r/min離心lOmin，以回收細(xì)胞，倒數(shù)培養(yǎng)液，將管倒置Imin以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡，以1ml用冰預(yù)冷的0.1mMCaCl2重懸每份沉淀，放于冰上，于4°C用SorvallGS3轉(zhuǎn)頭(或與其相應(yīng)的轉(zhuǎn)頭)以4000r/min離心1min,以回收細(xì)胞，倒出培養(yǎng)液，將管倒置Imin以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡，每50ml初始培養(yǎng)物用2ml冰預(yù)冷的0.1M CaCl2重懸每份沉定，此時(shí)，可以迅速將細(xì)胞分裝成小份，液氮中冰凍，_70°C貯存?zhèn)溆?，用冷卻的無(wú)菌吸頭從每種感受態(tài)細(xì)胞懸液中各取200 μ I轉(zhuǎn)移到無(wú)菌的微量離心管中，每管加DNA或連接反應(yīng)混合物(體積彡10 μ 1，DNA彡50ng)，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物,在冰中放置30min，將離心管放到預(yù)加溫到40°C的循環(huán)水浴中的試管架上，放置90s?2min，不要搖動(dòng)試管，快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻I?2min，每離心管加800 μ ISOC培養(yǎng)基，用水浴將培養(yǎng)基加溫到37°C，然后將管轉(zhuǎn)移到37°C搖床上，溫育45min使細(xì)菌復(fù)蘇，并且表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性標(biāo)記基因，將適當(dāng)體積(每個(gè)90mm平板可達(dá)200 μ I)已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含200mmol/LMgS04和相應(yīng)抗生素的SOB培養(yǎng)基上，將平板置于室溫至液體被吸收，倒置平皿，于37°C培養(yǎng)，12?16h后可出現(xiàn)菌落。②重組子的篩選、擴(kuò)增與提取:用無(wú)菌牙簽或滅菌接種針挑選單個(gè)菌落接種于5mL無(wú)菌的LB培養(yǎng)基或豐富培養(yǎng)基(如超級(jí)肉湯或TB超級(jí)肉湯培養(yǎng)基)中，培養(yǎng)過(guò)夜后，再加入到500mL含LB培養(yǎng)基(含有適當(dāng)抗生素)的2L燒瓶中，再于37°C培養(yǎng)至飽和狀態(tài)(OD6c4，為提高產(chǎn)量，應(yīng)采用表面積較大及帶折流板的燒瓶以盡量增大通氣度，振搖速度應(yīng)大于400r/min)，于4°C，6000g離心lOmin，用4mL GTL溶液重懸沉淀，并轉(zhuǎn)移到一個(gè)容積彡20mL的高速離心管中(細(xì)菌沉淀可以在_20°C或_70°C無(wú)限期保存)，加入ImL新配的含25mg/mL溶菌酶的GTE溶液，重懸沉淀，于室溫放置lOmin，加入1mL新配NaOH/SDS溶液，并且輕輕混勻直至液體變得均一、清亮而粘稠，于冰上放置10min，WA 7.5mL乙酸溶液，用吸管輕輕攪拌直至粘稠度下降并形成大的沉淀，于冰上放置lOmin，于4°C，20000g離心lOmin，將上清輕輕倒入至另一個(gè)干凈的離心管中，如果有可見(jiàn)的飄浮物可用數(shù)層紗布過(guò)濾，加入0.6倍體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫放置5?1min,于室溫，1500g離心1min,加入211^70%乙醇輕輕洗滌沉淀，然后短暫快速離心，吸去乙醇，并真空干燥(沉淀可在4°C長(zhǎng)期保存)。③重組子的鑒定:上述從感受態(tài)大腸桿菌中提取的DNA(含SV40T/pcDNA3.1)，同上法用限制性內(nèi)切酶BamH I進(jìn)行酶切，10g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，獲得大小約2600bp及5600bp的2條帶，前者符合GenBank中SV40T片段的大小。(2)pLXSNneo-hTERT重組子的純化、擴(kuò)增、鑒定:①大腸桿菌感受態(tài)的制備:其基本方法是用冰預(yù)冷的CaCl2或多種2價(jià)陽(yáng)離子等處理細(xì)菌，使之進(jìn)入感受態(tài)得以轉(zhuǎn)化，用CaCl2制備新鮮或冷凍的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，常用于成批制備感受態(tài)細(xì)菌，本法適用于大多數(shù)大腸桿菌菌株，操作過(guò)程簡(jiǎn)述如下:從37°C培養(yǎng)16?20h的新鮮平板中挑取一個(gè)單菌落(如大腸桿菌DH52)，或Iml新鮮的16?20h過(guò)夜培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)到一個(gè)含有10mlLB培養(yǎng)基的IL或500ml燒瓶中，于37°C劇烈振搖培養(yǎng)約2?3h(旋轉(zhuǎn)搖床200?300r/min)，每隔20?30min測(cè)量0D600值& 0.4，在無(wú)菌條件下將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個(gè)，用冰預(yù)冷的50ml聚丙烯離心管中，在冰上放置10?20min，于4°C用SorvallGS2轉(zhuǎn)頭(或與其離心管相配的轉(zhuǎn)頭)以4000r/min離心lOmin，以回收細(xì)胞，倒數(shù)培養(yǎng)液，將管倒置Imin以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡，以1ml用冰預(yù)冷的0.1mMCaCl2重懸每份沉淀，放于冰上，于4°C用SorvallGS3轉(zhuǎn)頭(或與其相應(yīng)的轉(zhuǎn)頭)以4000r/min離心1min,以回收細(xì)胞，倒出培養(yǎng)液，將管倒置Imin以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡，每50ml初始培養(yǎng)物用2ml冰預(yù)冷的0.1M CaCl2重懸每份沉定，此時(shí)，可以迅速將細(xì)胞分裝成小份，液氮中冰凍，-70°C貯存?zhèn)溆?。②以感受態(tài)大腸桿菌純化和擴(kuò)增pLXSNneo-hTERT重組子:用冷卻的無(wú)菌吸頭從每種感受態(tài)細(xì)胞懸液中分別取200 μ I轉(zhuǎn)移到無(wú)菌的微量離心管中，在每管中加DNA或連接反應(yīng)混合物(體積< 10 μ 1，DNAS 50ng)，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，在冰中放置30min，將離心管放到預(yù)加溫到40°C的循環(huán)水浴中的試管架上，放置90s?2min，不要搖動(dòng)試管，快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻I?2min，每離心管加800 μ ISOC培養(yǎng)基，用水浴將培養(yǎng)基加溫到37°C，然后將管轉(zhuǎn)移到37°C搖床上，溫育45min使細(xì)菌復(fù)蘇，并且表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性標(biāo)記基因，將適當(dāng)體積(每90mm平板可達(dá)200μ I)已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含200mmol/LMgS04和相應(yīng)抗生素的SOB培養(yǎng)基上，將平板置于室溫至液體被吸收，倒置平皿，于37°C培養(yǎng)，12?16h后可出現(xiàn)菌落。③篩選、擴(kuò)增重組子:用無(wú)菌牙簽或滅菌接種針挑選單個(gè)菌落接種于5mL無(wú)菌的LB培養(yǎng)基或豐富培養(yǎng)基(如超級(jí)肉湯或TB超級(jí)肉湯培養(yǎng)基)中，培養(yǎng)過(guò)夜后，再加入到500mL含LB培養(yǎng)基(含有適當(dāng)抗生素)的2L燒瓶中，再于37°C培養(yǎng)至飽和狀態(tài)(0D_ ^ 4，為提高產(chǎn)量，應(yīng)采用表面積較大及帶折流板的燒瓶以盡量增大通氣度，振搖速度應(yīng)大于400r/min)，于4°C，6000g離心lOmin，用4mL GTL溶液重懸沉淀，并轉(zhuǎn)移到一個(gè)容積彡20mL的高速離心管中(細(xì)菌沉淀可以在_20°C或_70°C無(wú)限期保存)，加入ImL新配的含25mg/mL溶菌酶的GTE溶液，重懸沉淀，于室溫放置lOmin，加入1mL新配NaOH/SDS溶液，并且輕輕混勻直至液體變得均一、清亮而粘稠，于冰上放置10min，WA 7.5mL乙酸溶液，用吸管輕輕攪拌直至粘稠度下降并形成大的沉淀，于冰上放置lOmin，于4°C，20000g離心lOmin，將上清輕輕倒入至另一個(gè)干凈的離心管中，如果有可見(jiàn)的飄浮物可用數(shù)層紗布過(guò)濾，加入0.6倍體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫放置5?lOmin，于室溫，1500g離心1minJPA 2mL70%乙醇輕輕洗滌沉淀，然后短暫快速離心，吸去乙醇，并真空干燥(沉淀可在4°C長(zhǎng)期保存)。④重組質(zhì)粒的鑒定與擴(kuò)增:挑取平皿上的單菌落，接種于3ml含100ug/ml氨芐青霉素LB培養(yǎng)基中，37°C，250r/min搖床中培養(yǎng)，14h后收集培養(yǎng)物，4°C、10000r/min離心5min,按試劑盒說(shuō)明書小量提取并純化重組質(zhì)粒；以EcoRI和HindIII雙酶切重組質(zhì)粒反應(yīng)體系:限制性內(nèi)切酶各0.5ul、10Xbuffer2ul、重組質(zhì)粒1ul、加水補(bǔ)足至20ul，37°C酶切Ih。酶切產(chǎn)物于80V電壓條件下進(jìn)行0.8%瓊脂糖電泳，時(shí)間30min，凝膠成像系統(tǒng)拍照；按常規(guī)測(cè)定重組質(zhì)粒的序列；重組質(zhì)粒經(jīng)酶切、測(cè)序鑒定準(zhǔn)確后，將含有該質(zhì)粒的細(xì)菌接種至LB培養(yǎng)液中，擴(kuò)增培養(yǎng)，按大劑量質(zhì)粒抽提試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行大劑量質(zhì)粒抽提純化，紫外分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒濃度及純度后備用。
[0019]4、重組子SV40LT/pcDNA3.1和pLXSNneo-hTERT導(dǎo)入愛(ài)德華綜合癥細(xì)胞及其陽(yáng)性克隆的篩選:(I)愛(ài)德華綜合癥細(xì)胞的收集與培養(yǎng):以無(wú)菌操作提取在作其他實(shí)驗(yàn)或其他檢查后多余、廢棄的愛(ài)德華綜合癥患兒羊水脫落細(xì)胞，以細(xì)胞終濃度約為IXlOVmL備用，取上述呈單個(gè)分散的細(xì)胞或經(jīng)處理后成為單個(gè)分散的細(xì)胞接種于含5?lOnmol/L胰島素、20%胎牛血清的RPMI1640液中或接種于含20%胎牛血清、5?10nmol/L胰島素的低糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基中，置于37°C，體積分?jǐn)?shù)5 % C02培養(yǎng)箱內(nèi)，細(xì)胞貼壁培養(yǎng)約3?4天、細(xì)胞形態(tài)為梭形、小園形細(xì)胞不到10%、貼壁細(xì)胞的匯合率達(dá)75%?85%、處于剛進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，即考慮收集培養(yǎng)細(xì)胞，先吸干凈培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，加入l-2ml0.01%的膠原酶II液或胰酶(以消化液能覆蓋整個(gè)瓶底為準(zhǔn))，靜置2-10min (顯微鏡下動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè))，吸去膠原酶II液，加入低糖DMEM或RPMI1640培養(yǎng)液，用吸管吸取瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，使成細(xì)胞懸液，離心沉淀，去上清，沉淀用上述培養(yǎng)液清洗2次后，制成懸液，用作重組子導(dǎo)入。(2)重組子SV40LT/pcDNA3.1和pLXSNneo-hTERT導(dǎo)入愛(ài)德華綜合癥細(xì)胞:方法1:選用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，取上法分離所得細(xì)胞的2X 15個(gè)細(xì)胞接種于35mm培養(yǎng)皿中，在37°C CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24?36h，使細(xì)胞生成單層、細(xì)胞形態(tài)為梭形、尚未見(jiàn)或僅見(jiàn)少于10%小園形細(xì)胞、貼壁細(xì)胞的匯合率達(dá)55%?65%、處于將進(jìn)入或剛進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)轉(zhuǎn)染SV40LT/pcDNA3.1和pLXSNneo-hTERT。在1.5ml微量離心管中制備下列溶液:管A，將重組子SV40LT/pcDNA3.1溶于50 μ I無(wú)血清培養(yǎng)液中；管B，將重組子pLXSNneo-hTERT溶于50 μ I無(wú)血清培養(yǎng)液中；然后取管C,將20 μ I脂質(zhì)體Lipofectamine溶解于80 μ I無(wú)血清培養(yǎng)液中，管Α、管B和管C混勻，置室溫45min。去培養(yǎng)液后，用無(wú)血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞2 次，在 Lipofectamine_SV40LT/pcDNA3.1 和 Lipofectamine-pLXSNneo-hTERT 混合物中加入Iml無(wú)血清培養(yǎng)液，輕輕混勻，再滴加至細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，然后加入Iml無(wú)血清培養(yǎng)液，在CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)10h，吸出轉(zhuǎn)染液，加4ml完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)16h，棄去培養(yǎng)液，更換濃度為AOOmgT1的G418培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，8?10天后選擇單個(gè)細(xì)胞集落進(jìn)行亞克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)后再加大G418濃度到SOOmg’L—1，將能在高濃度的G418環(huán)境中穩(wěn)定生長(zhǎng)的克隆進(jìn)行傳代擴(kuò)增。方法2:吸取1/10-1/40細(xì)胞懸液，配制成終濃度為I X 105/mL細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，選擇低糖DMEM或RPMI1640培養(yǎng)基，其中含20mL/L胎牛血清、lOnmol/L胰島素，培養(yǎng)48h后，使細(xì)胞生成單層、細(xì)胞形態(tài)為梭形、尚未見(jiàn)或僅見(jiàn)少于10%小園形細(xì)胞、貼壁細(xì)胞匯合率達(dá)55%?65%、處于將進(jìn)入或剛進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，將重組子pLXSNneo-hTERT和SV40LT/pcDNA3.1轉(zhuǎn)染至愛(ài)德華綜合癥細(xì)胞內(nèi)，用含700mg/L G418的培養(yǎng)液篩選lw，將G418濃度改為300mg/L，至出現(xiàn)陽(yáng)性克隆，將其轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)瓶進(jìn)行擴(kuò)大、傳代培養(yǎng)；方法3:將上述的細(xì)胞懸液以低糖DMEM或RPMI1640培養(yǎng)液配成5X 108/L終濃度的細(xì)胞懸液接種于24孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞長(zhǎng)至90%左右融合時(shí)用于轉(zhuǎn)染，將各含0.2 μ g的重組子 SV40LT/pcDNA3.1 和 pLXSNneo-hTERT，用 DMEM 或 RPMI1640 調(diào)整體積為 50 μ 1，室溫放置5min ;脂質(zhì)體15μ 1，用DMEM調(diào)整體積為50 μ 1，室溫放置5min，將上述試劑輕輕混勻，室溫放置20min，將24孔板內(nèi)細(xì)胞用DMEM洗3次，每孔加培養(yǎng)液100 μ 1，然后再加Lipofectamine-SV40LT/pcDNA3.1 和 Lipofectamine-pLXSNneo-hTERT 混合物，輕輕在細(xì)胞表面鋪均勻后，于37°C 5%C02培養(yǎng)箱放置6h，隨后用0.01g/L膠原酶將細(xì)胞消化，轉(zhuǎn)入6孔板內(nèi)，加入完全培養(yǎng)基，次日加G418抗生素使終濃度為500mg/L，直到有單克隆細(xì)胞長(zhǎng)出。約1d后有單克隆細(xì)胞集落長(zhǎng)出，挑取并置于24孔板內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，以300mg/L的G418維持并穩(wěn)定傳代擴(kuò)增培養(yǎng)。以此建立可在體外反復(fù)傳代培養(yǎng)的永生化愛(ài)德華綜合癥細(xì)胞模型。
[0020]5、SV40LT/pcDNA3.1和pLXSNneo-hTERT轉(zhuǎn)染愛(ài)德華綜合癥細(xì)胞模型的傳代擴(kuò)增:收集上述經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入SV40LT/pcDNA3.1和pLXSNneo-hTERT的陽(yáng)性單克隆細(xì)胞集落，以低糖DMEM或RPMI1640培養(yǎng)基配成約I X 105/mL的細(xì)胞懸液，接種于數(shù)瓶20?50cm2培養(yǎng)瓶中，加入5mL含20mL/L胎牛血清、10nmol/L胰島素的低糖DMEM或RPMI1640培養(yǎng)基，至細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)、匯合率達(dá)80?85%、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的前期時(shí)收集細(xì)胞，再按上述步驟傳代培養(yǎng)，如此反復(fù)傳代接種、培養(yǎng)，記錄代數(shù)并觀察細(xì)胞生長(zhǎng)特點(diǎn)，如圖1，細(xì)胞傳代至第158代、培養(yǎng)至第8天時(shí)，呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)、圓形、梭形、鋪滿瓶底，其細(xì)胞生長(zhǎng)匯合率達(dá)95%以上，此后隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞生長(zhǎng)變慢、變稀疏。其中對(duì)數(shù)生長(zhǎng)是指細(xì)胞生長(zhǎng)速度快，細(xì)胞數(shù)量的增加與培養(yǎng)時(shí)間呈倍增關(guān)系，通常按常規(guī)按種細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)I?2天便可在顯微鏡下找到生長(zhǎng)的單個(gè)細(xì)胞；4?5天時(shí)可見(jiàn)細(xì)胞集落，貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞鋪蓋培養(yǎng)瓶底的1/3，培養(yǎng)7?13天時(shí)可見(jiàn)貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞鋪蓋培養(yǎng)瓶底的2/3以上，甚至細(xì)胞重疊、幾乎不留空隙(匯合率達(dá)95?100% )，細(xì)胞光亮，無(wú)顆粒、無(wú)粗糙感等老化現(xiàn)象，也可據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)與培養(yǎng)時(shí)間的關(guān)系來(lái)判斷；死亡的細(xì)胞少，每周因死亡而漂浮的細(xì)胞少于10% [通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色法鑒別死細(xì)胞和活細(xì)胞，因?yàn)檎５幕罴?xì)胞，胞膜結(jié)構(gòu)完整，能夠排斥，使臺(tái)盼藍(lán)不能夠進(jìn)入胞內(nèi)；而喪失活性的細(xì)胞，胞膜的通透性增加，可被臺(tái)盼藍(lán)染成藍(lán)色，可判斷為細(xì)胞已經(jīng)死亡，方法是每周吸取一定量的細(xì)胞培養(yǎng)懸液，與臺(tái)盼藍(lán)染色劑混合后置室溫5?10分鐘，然后制成細(xì)胞薄片，在顯微鏡下計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算著色的死細(xì)胞和不著色的活細(xì)胞的百分比]。
[0021 ] 6、愛(ài)德華綜合癥細(xì)胞模型生物學(xué)特性的鑒定:使用SV40LT/pcDNA3.1和pLXSNneo-hTERT建立的細(xì)胞模型(細(xì)胞系)，鑒定的關(guān)鍵問(wèn)題有:一是要求該細(xì)胞具有持續(xù)的增殖能力；二是要求其形態(tài)、基本生理功能等保持不變。①觀察細(xì)胞形態(tài):在倒置光學(xué)顯微鏡下每日觀察細(xì)胞是否呈典型的上皮細(xì)胞樣貼壁生長(zhǎng)，是否呈梭形、或小園形生長(zhǎng)。本細(xì)胞系傳代擴(kuò)增培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)與正常人成纖維細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯差異觀察細(xì)胞生長(zhǎng)曲線:取生長(zhǎng)較好的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，采用0.25胰蛋白酶液消化，制成細(xì)胞懸液，經(jīng)計(jì)數(shù)，分別取
1.4X 14細(xì)胞接種于30個(gè)含15FBS低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)瓶。每天取2瓶細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算均值，連續(xù)觀察直至細(xì)胞數(shù)量明顯下降，培養(yǎng)3天后每隔2天給未計(jì)數(shù)的細(xì)胞換液，采用同樣方法觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞在h印ato ZYME-SFM無(wú)血清培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況。結(jié)果以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸，細(xì)胞數(shù)量為縱軸(對(duì)數(shù))，描繪在半對(duì)數(shù)座標(biāo)上制成曲線后即成該細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，永生化細(xì)胞系呈現(xiàn)典型的“S”特征或“穹隆”形成；③檢查染色體:如果染色體核型為47，XX，+18 ;或47，XY, +18 ;或相同于本發(fā)明采集的原代愛(ài)德華綜合癥細(xì)胞，則說(shuō)明該細(xì)胞系沒(méi)有發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化(同時(shí)可用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞系中是否出現(xiàn)異常的DNA群體，如果沒(méi)有，也說(shuō)明細(xì)胞系未出現(xiàn)瘤性特征)。染色體核型分析方法是:在細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)85-95% (其中小園形細(xì)胞占10% )、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的培養(yǎng)物中按5mL培養(yǎng)液中加入預(yù)熱的250ug/ml秋水仙素lOOul，混勻后置37°C培養(yǎng)箱4小時(shí)，吸干培養(yǎng)液，加入預(yù)熱的2_3mLEDTA-胰酶消化液，37°C作用5分鐘，終止消化，洗下貼壁細(xì)胞，經(jīng)離心、低滲、固定、制片、G顯帶后分析染色體核型軟瓊脂集落生長(zhǎng)試驗(yàn):將細(xì)胞以5X104/ml接種于直徑為35mm軟瓊脂平皿內(nèi)，觀察三周后，未發(fā)現(xiàn)克隆形成，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)的永生化細(xì)胞不能在軟瓊脂內(nèi)形成克隆，符合永生化特點(diǎn)裸鼠致瘤試驗(yàn):將永生化細(xì)胞以3X107接種裸鼠背部皮下，2個(gè)月后，4只裸鼠均未見(jiàn)腫瘤形成，證明此細(xì)胞為非惡化細(xì)胞；⑥轉(zhuǎn)染細(xì)胞hTERT mRNA表達(dá)產(chǎn)物測(cè)定:按試劑盒做PCR擴(kuò)增后電泳，檢出hTERT mRNA條帶。如以免疫組織化學(xué)檢測(cè)，hTERT轉(zhuǎn)染的細(xì)胞核內(nèi)染色可見(jiàn)大量棕色顆粒，表明hTERT已整合入細(xì)胞內(nèi)；⑦轉(zhuǎn)染細(xì)胞端粒酶活性:收集細(xì)胞系，按試劑盒說(shuō)明制備裂解液，作PCR擴(kuò)增和電泳分析，以302nm紫外光觀察結(jié)果，可見(jiàn)呈端粒酶陽(yáng)性條帶。⑧流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè):檢測(cè)第19代細(xì)胞系中合成、分裂的細(xì)胞比例，如果其增殖能力明顯比未建系的正常細(xì)胞增強(qiáng)，說(shuō)明是hTERT和SV40LT整合、表達(dá)的結(jié)果；另外以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖周期及細(xì)胞凋亡率,本細(xì)胞系的細(xì)胞增殖指數(shù)較轉(zhuǎn)染前無(wú)明顯改變，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡率較轉(zhuǎn)染前明顯降低；⑨轉(zhuǎn)染細(xì)胞SV40大T基因檢測(cè):如以免疫組織化學(xué)檢測(cè)，SV40轉(zhuǎn)染的細(xì)胞核內(nèi)染色可見(jiàn)大量棕色顆粒，表明SV40T抗原已整合入細(xì)胞內(nèi)；也可用RT-PCR法檢測(cè)T抗原在細(xì)胞中的表達(dá)，其中T抗原的引物:上游引物(A4239)5，-GTT ATG ATT ATA ACT GTT ATG-3’，下游引物(S4496) 5’-GAA ATG CCATCT AGT GAT-3，;擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為 268bp，擴(kuò)增條件為 94°C，5min，即:(94°C，Imin ;55°C，lmin, -0.5°C / 循環(huán)；72°C, lmin) X 30、(94°C，30S ；40°C，30S, 72°C，30S) X 15，擴(kuò)增體系為50 μ 1: [Mg2+]2mmol/L、dNTPs200 μ mol/L、引物濃度 0.4μ mol/L、TaqlU、模板 5 μ I ;實(shí)驗(yàn)組以第19代細(xì)胞的cDNA為模板(參照市售cDNA第一鏈合成試劑盒進(jìn)行cDNA第一鏈合成，產(chǎn)物-20°C保存)；陰性對(duì)照設(shè)兩個(gè)，分別以無(wú)菌水、原代細(xì)胞的cDNA做模板，陽(yáng)性對(duì)照以SV40DNA為模板(參照SDS-蛋白酶K法提取SV40DNA，因?yàn)镾V40病毒無(wú)包膜，不使用SDS破膜，取5 μ I進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，其余_20°C保存?zhèn)溆?;⑩SV40大T基因mRNA表達(dá)產(chǎn)物測(cè)定:T抗原mRNA RT-PCR產(chǎn)物測(cè)序:取100 μ I體系的擴(kuò)增產(chǎn)物，用凝膠回收試劑盒(Takara，日本)回收產(chǎn)物，取2μ I DNA溶液稀釋100倍，測(cè)濃度，余下的DNA及上、下游引物各10 μ I進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果符合SV40大T基因mRNA序列。
[0022]所以，本發(fā)明的細(xì)胞模型為(I)細(xì)胞在倒置光學(xué)顯微鏡下呈梭形或小園形的上皮細(xì)胞樣貼壁生長(zhǎng)；(2)細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線如以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸，細(xì)胞數(shù)量為縱軸，在hepatoZYME-SFM無(wú)血清培養(yǎng)基中呈“S”特征或“穹隆”形成；(3)染色體核型為47，XX，+18 ;或47，XY, +18 ;或相同于本發(fā)明采集的原代愛(ài)德華綜合征細(xì)胞；(4)細(xì)胞不能在軟瓊脂內(nèi)生長(zhǎng)(形成克隆)；(5)細(xì)胞為非惡化細(xì)胞，裸鼠致瘤試驗(yàn)陰性；(6)細(xì)胞的DNA中同時(shí)整合了SV40LT和hTERT基因，同時(shí)表達(dá)SV40LT和hTERT基因的mRNA產(chǎn)物；(7)細(xì)胞傳代至第158代、培養(yǎng)至第8天時(shí)，呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)、圓形、梭形、鋪滿瓶底，其細(xì)胞生長(zhǎng)匯合率達(dá)95%以上，此后隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞生長(zhǎng)變慢、變稀疏；(8)能反復(fù)凍溶、傳代培養(yǎng)158代以上；(9)作為細(xì)胞模型用于體外從細(xì)胞水平研究愛(ài)德華綜合征的病理機(jī)制；(10)可再生性地保存SV40LT和hTERT同時(shí)整合的愛(ài)德華綜合征的遺傳資源。
[0023]7、SV40LT和hTERT介導(dǎo)愛(ài)德華綜合癥細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫(kù):篩選并擴(kuò)大培養(yǎng)經(jīng)上述鑒定后符合永生化細(xì)胞特性并與原代細(xì)胞相同或相近的細(xì)胞，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的不同世代的貼壁細(xì)胞，經(jīng)過(guò)消化、終止和離心分離(1200r/min，6min)，用含二甲亞砜的凍存液0.5?Iml重懸細(xì)胞，細(xì)胞密度為5X 15個(gè)/ml，加入凍存管，分裝、標(biāo)注，經(jīng)4°C,0.5h ；-20°C,2h ;-70°C，過(guò)夜，入_196°C液氮凍存。以此法構(gòu)建生物學(xué)特性穩(wěn)定的永生化愛(ài)德華綜合癥細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫(kù)，以集中保存遺傳資源，為其他研究提供科研材料，并作為愛(ài)德華綜合癥發(fā)病機(jī)制體外研究的細(xì)胞模型，以加速拓展愛(ài)德華綜合癥研究的新途徑、從細(xì)胞水平在體外長(zhǎng)期研究愛(ài)德華綜合癥細(xì)胞受物理、化學(xué)、生物、遺傳等影響的基因突變、基因表達(dá)、功能改變、生理特性、生物傳導(dǎo)等機(jī)制。
[0024]8、細(xì)胞模型應(yīng)用
[0025]I)細(xì)胞模型作為科研細(xì)胞:使愛(ài)德華綜合癥細(xì)胞模型處于人為制造的具有不同含量或濃度的有害物如物理(如X射線)、化學(xué)(如甲醛、汽油、鉛、汞)、生物(如風(fēng)疹病毒，巨細(xì)胞病毒，皰疹病毒)的條件下培養(yǎng)，然后取體外長(zhǎng)期傳代的不同周期的活細(xì)胞、傳代過(guò)程的凋亡細(xì)胞、含有傳代培養(yǎng)中所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物的培養(yǎng)液從不同角度和水平，研究染色體異常、其他異常、正常對(duì)照細(xì)胞模型對(duì)有害物的耐受性、有害物致出生缺陷的機(jī)制。例如應(yīng)用常規(guī)方法如基因芯片、miRNA芯片、比較基因組雜交芯片(CGH)、差異甲基化雜交芯片(DMH)和SNPs、等篩選差異的基因及其多態(tài)性、甲基化水平；運(yùn)用原位雜交(FISH)、Northern blot,Real-time PCR、CHIP、EMSA等技術(shù)檢測(cè)基因所在研究細(xì)胞模型中的基因轉(zhuǎn)率表達(dá)、定位及調(diào)控；利用酶反應(yīng)學(xué)、代謝組學(xué)技術(shù)鑒定細(xì)胞模型長(zhǎng)期傳代中蛋白質(zhì)代謝過(guò)程和關(guān)鍵的代謝產(chǎn)物；應(yīng)用雙向電泳、MALD1-TOF質(zhì)譜鑒定、酵母雙雜交和免疫共沉淀等技術(shù)研究細(xì)胞模型在長(zhǎng)期傳代中的蛋白質(zhì)功能及蛋白質(zhì)間的相互作用，從活細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程動(dòng)態(tài)、長(zhǎng)期研究環(huán)境有害因素致出生缺陷的機(jī)制，例如:①環(huán)境中常見(jiàn)的毒性物質(zhì)苯并芘致愛(ài)德華綜合癥出生缺陷的研究:使愛(ài)德華綜合癥細(xì)胞模型和正常對(duì)照細(xì)胞分別在含有0.1、
1.0,5.0、10.0,20.0pmoI/L苯并芘的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，檢測(cè)在培養(yǎng)2周、4周、6周、8周、16周等不同培養(yǎng)時(shí)間的可作為細(xì)胞毒性指標(biāo)的細(xì)胞凋亡、壞死、雙核細(xì)胞率和可作為遺傳毒性指標(biāo)的微核率、核質(zhì)橋率、核芽率，即在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)10000個(gè)雙核細(xì)胞中的微核數(shù)、核質(zhì)橋數(shù)和核芽數(shù)；500個(gè)活細(xì)胞中的凋亡和壞死細(xì)胞數(shù)、雙核細(xì)胞數(shù)，以及檢測(cè)細(xì)胞存活率，即應(yīng)用四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法)，在吸去原培養(yǎng)液后，在96孔板上加入20%的5mg/mlMTT的無(wú)血清培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，小心吸棄孔內(nèi)上清液，每孔加入150 μ L 二甲亞砜，振蕩lOmin，使紫色結(jié)晶物充分溶解，本酶標(biāo)儀以490nm測(cè)定各孔的吸光度值，計(jì)算出細(xì)胞存活率。還可以其他常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)不同培養(yǎng)時(shí)間的含毒性物與不含毒性物、病例與正常細(xì)胞中各組細(xì)胞的基因突變、蛋白質(zhì)組學(xué)、細(xì)胞分泌功能、染色體畸變、細(xì)胞存活率(壽命)等，以從活細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中從細(xì)胞水平動(dòng)態(tài)、長(zhǎng)期研究環(huán)境有害因素致愛(ài)德華綜合癥出生缺陷的機(jī)制。②以某種病源微生物替換毒性物質(zhì)苯并芘做同樣的研究，即可從活細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中從細(xì)胞水平動(dòng)態(tài)、長(zhǎng)期研究生物因素致愛(ài)德華綜合癥出生缺陷的機(jī)制。③將配成濃度梯度的治療藥物與配成濃度梯度的病源微生物或毒性化學(xué)物質(zhì)以及愛(ài)德華綜合癥細(xì)胞模型共同培養(yǎng)，即可從活細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中從細(xì)胞水平動(dòng)態(tài)、長(zhǎng)期研究藥物對(duì)致愛(ài)德華綜合癥出生缺陷因素的治療效果及對(duì)愛(ài)德華綜合癥出生缺陷的干預(yù)效果。④同樣可用愛(ài)德華綜合癥細(xì)胞模型研究基因治療的方法，替代某些以人體直接做試驗(yàn)。
[0026]2)細(xì)胞模型作為質(zhì)控細(xì)胞:實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制是開(kāi)展實(shí)驗(yàn)診斷項(xiàng)目的準(zhǔn)入制度，已成為政府行為。愛(ài)德華綜合癥細(xì)胞模型可用作質(zhì)控細(xì)胞，用于室內(nèi)質(zhì)控和室間質(zhì)評(píng)。例如用細(xì)胞模型同步于臨床標(biāo)本的染色體病實(shí)驗(yàn)診斷方法，作常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)、染色體制備、染色體核型分析，以考核實(shí)驗(yàn)過(guò)程的試劑質(zhì)量、儀器性能、操作方法等是否可靠，相當(dāng)于實(shí)驗(yàn)中的陽(yáng)性、陰性對(duì)照；可將細(xì)胞模型經(jīng)常規(guī)染色體制備、染色體核型分析所得到的圖像作整理后，發(fā)送到各相關(guān)實(shí)驗(yàn)室，以考核各室對(duì)各種染色體異常圖像的診斷的準(zhǔn)確性；可將細(xì)胞模型發(fā)送到各相關(guān)實(shí)驗(yàn)室，在各室自行作出常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)、染色體制片、染色體核型分析后回報(bào)結(jié)果，對(duì)各室的診斷結(jié)果作室間質(zhì)量評(píng)價(jià)，通過(guò)評(píng)比各室的準(zhǔn)確性，以發(fā)現(xiàn)相關(guān)問(wèn)題、解決問(wèn)題、提高診斷質(zhì)量；可將愛(ài)德華綜合癥細(xì)胞模型與各種正常染色體細(xì)胞按質(zhì)控所需要的種類及比例混合，制成含有不同種類和比例的混合質(zhì)控細(xì)胞，作為熒光原位雜交(FISH)檢測(cè)染色體數(shù)目異常室內(nèi)質(zhì)控細(xì)胞和室間質(zhì)評(píng)細(xì)胞，如果某實(shí)驗(yàn)室在作FISH中沒(méi)有檢測(cè)出(漏診)質(zhì)控細(xì)胞的不同種類的染色體異常、沒(méi)有準(zhǔn)確檢測(cè)出不同種類的染色體異常的比率(％)，則說(shuō)明實(shí)驗(yàn)方法存在質(zhì)量問(wèn)題，應(yīng)找原因改正?，F(xiàn)以幾種染色體異常細(xì)胞模型混合后制備的質(zhì)控細(xì)胞在熒光原位雜交室間質(zhì)評(píng)中的具體應(yīng)用為例說(shuō)明如下:①準(zhǔn)備質(zhì)控細(xì)胞:取I例或數(shù)例愛(ài)德華綜合癥及染色體正常細(xì)胞模型，按質(zhì)控所需要的例次或比例混合而成質(zhì)控細(xì)胞，混合的質(zhì)控細(xì)胞還可經(jīng)擴(kuò)增后發(fā)放使用。如以I例愛(ài)德華綜合癥染色體數(shù)目異常細(xì)胞模型與I例染色體正常細(xì)胞模型等比例細(xì)胞數(shù)混合，則愛(ài)德華綜合癥染色體數(shù)目異常的細(xì)胞與染色體正常細(xì)胞各占50%。然后將質(zhì)控細(xì)胞發(fā)送到各受試對(duì)象做室間質(zhì)量評(píng)價(jià)。②熒光原位雜交(FISH)檢測(cè)質(zhì)控細(xì)胞染色體數(shù)目及結(jié)果判定:各受試對(duì)象收到質(zhì)控細(xì)胞后，可酌情對(duì)質(zhì)控細(xì)胞株進(jìn)行傳代擴(kuò)增后測(cè)試，以增加細(xì)胞數(shù)。試劑采用瑞士雅培制藥有限公司的AneuVys1n試劑盒,完成3條染色體的數(shù)目分析:第18號(hào)(SpectrumAqua,青色)、X(Spectrum Green,綠色)、Y (Spectrum Orange,紅色)號(hào)染色體為計(jì)數(shù)探針(Chromosome Enumerating Probe, CEP),混合后雜交第I個(gè)區(qū)域，方法是取18、X和Y染色體探針，將質(zhì)控細(xì)胞(與實(shí)驗(yàn)室被檢標(biāo)本)同步，經(jīng)2000r/min離心1min,去上清，留沉淀
0.2ml,離心管中加入4ml膠原酶37°C溫浴30min, 2000r/min離心lOmin,去上清,然后加入5ml預(yù)溫的15mol/L KCl,在37水浴中低滲25min, 2000r/min離心1min,去上清。加入新配制的固定液(甲醇:冰醋酸=3:1)固定1min,離心2000r/min離心1min去上清,反復(fù)兩次。滴片，自然干燥老化。將制備好的標(biāo)本片自冰柜中取出，依次放人70%、85%、100%乙醇中脫水，室溫干燥，預(yù)處理好的玻片置73°C，70%甲酰胺中5min。在暗室中將兩種探針混合液各10 μ I加在玻片的靶區(qū)域，蓋上蓋玻片，避免產(chǎn)生氣泡，封片膠將蓋玻片封好，置暗濕盒中42°C雜交過(guò)夜，清洗，在高倍鏡下觀察雜交效果，每例標(biāo)本計(jì)數(shù)60?100個(gè)細(xì)胞，記錄雜交信號(hào)數(shù)目并采集圖像，要求細(xì)胞核膜必須完整，核內(nèi)雜交信號(hào)明亮清晰無(wú)重疊，信號(hào)彌散及微弱均不作統(tǒng)計(jì)。③測(cè)試結(jié)果:經(jīng)探針雜交后，細(xì)胞內(nèi)的18號(hào)染色體顯示青色的點(diǎn)，每條18號(hào)顯示I個(gè)青色的點(diǎn),2條則顯示2個(gè)青色的點(diǎn),3條則顯示3個(gè)青色的點(diǎn)；細(xì)胞內(nèi)X(女性)染色體顯示綠色的點(diǎn)，每條X染色體顯示I個(gè)綠色的點(diǎn)，2條則顯示2個(gè)綠色的點(diǎn)，3條則顯示3個(gè)綠色的點(diǎn)；細(xì)胞內(nèi)Y(男性)染色體顯示紅色的點(diǎn)，每條Y染色體顯示I個(gè)紅色的點(diǎn)，2條則顯示2個(gè)紅色的點(diǎn)，3條則顯示3個(gè)紅色的點(diǎn)。如果實(shí)驗(yàn)人員技術(shù)、操作、實(shí)驗(yàn)器材、試劑等有質(zhì)量問(wèn)題，則21號(hào)染色體紅色的點(diǎn)、細(xì)胞內(nèi)X(女性)染色體綠色的點(diǎn)、細(xì)胞內(nèi)Y(男性)染色體紅色的點(diǎn)就沒(méi)有信號(hào)或難以辯認(rèn)。④另外，病例細(xì)胞模型可用于基因芯片、miRNA芯片、比較基因組雜交芯片(CGH)、差異甲基化雜交芯片(DMH)和SNPs、Northern blot、Real-time PCR、CHIP、EMSA等基因檢測(cè)技術(shù)的陽(yáng)性對(duì)照，或作為病例資源保存，備作用上述方法作基因突變、基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等檢測(cè)，以分析發(fā)病機(jī)理。
【權(quán)利要求】
1.一種用于生殖健康研究領(lǐng)域的導(dǎo)入hTERT和SV40LT重組子構(gòu)建愛(ài)德華綜合征細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫(kù)的方法，其主要特征是以T4DNA連接經(jīng)BamHI酶切質(zhì)粒SV40LTag DNA及載體 pcDNA3.1 (-) DNA 的產(chǎn)物，構(gòu)建 SV40LT_pcDNA3.1 (-)重組子；并以 Ligat1n Mix 連接經(jīng)EcoR I 和 Xho I 雙酶切質(zhì)粒 pCIneo-hTERT 和載體 pLXSNneo 的產(chǎn)物，構(gòu)建 pLXSNneo-hTERT重組子，兩重組子經(jīng)感受態(tài)細(xì)胞擴(kuò)增純化和鑒定后以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染導(dǎo)入愛(ài)德華綜合癥組織細(xì)胞，經(jīng)G418篩選含陽(yáng)性重組子的細(xì)胞克隆并擴(kuò)大培養(yǎng)，篩選細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)曲線、染色體核型、裸鼠致瘤試驗(yàn)、轉(zhuǎn)染細(xì)胞端粒酶活性、hTERT mRNA表達(dá)產(chǎn)物、免疫組織化學(xué)染色、細(xì)胞增殖周期及細(xì)胞凋亡率符合永生化細(xì)胞特性并與原代細(xì)胞相同或相近者作為SV40LT和hTERT重組子介導(dǎo)愛(ài)德華綜合癥體外研究細(xì)胞模型凍存于液氮中，為從細(xì)胞水平(替代人體或動(dòng)物直接試驗(yàn))在體外長(zhǎng)期研究其發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的導(dǎo)入hTERT和SV40LT重組子構(gòu)建愛(ài)德華綜合征細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫(kù)的方法，其特征是所指細(xì)胞模型為(I)細(xì)胞在倒置光學(xué)顯微鏡下呈梭形或小園形的上皮細(xì)胞樣貼壁生長(zhǎng)；(2)細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線如以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸，細(xì)胞數(shù)量為縱軸，在hepato ZYME-SFM無(wú)血清培養(yǎng)基中呈“S”特征或“穹隆”形成；(3)染色體核型為47，XX，+18 ;*47，XY，+18 ;或相同于本發(fā)明采集的原代愛(ài)德華綜合征細(xì)胞；(4)細(xì)胞不能在軟瓊脂內(nèi)生長(zhǎng)(形成克隆)；(5)細(xì)胞為非惡化細(xì)胞，裸鼠致瘤試驗(yàn)陰性；(6)細(xì)胞的DNA中同時(shí)整合了 SV40LT和hTERT基因，同時(shí)表達(dá)SV40LT和hTERT基因的mRNA產(chǎn)物；(7)細(xì)胞傳代至第158代、培養(yǎng)至第8天時(shí)，呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)、圓形、梭形、鋪滿瓶底，其細(xì)胞生長(zhǎng)匯合率達(dá)95%以上，此后隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞生長(zhǎng)變慢、變稀疏；(8)能反復(fù)凍溶、傳代培養(yǎng)158代以上；(9)作為細(xì)胞模型用于體外從細(xì)胞水平研究愛(ài)德華綜合征的病理機(jī)制；(10)可再生性地保存SV40LT和hTERT同時(shí)整合的愛(ài)德華綜合征的遺傳資源。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的導(dǎo)入hTERT和SV40LT重組子構(gòu)建愛(ài)德華綜合征細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫(kù)的方法，其特征是取自因其他實(shí)驗(yàn)所需而采集的、并在其他實(shí)驗(yàn)后多余、廢棄的愛(ài)德華綜合癥患兒羊水脫落細(xì)胞構(gòu)建之。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的導(dǎo)入hTERT和SV40LT重組子構(gòu)建愛(ài)德華綜合征細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫(kù)的方法，其特征是所用的培養(yǎng)液為含有20%胎牛血清、5?lOnmol/L胰島素的RPMI1640或含有20mL/L胎牛血清、5?10nmol/L胰島素的低糖DMEM培養(yǎng)液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的導(dǎo)入hTERT和SV40LT重組子構(gòu)建愛(ài)德華綜合征細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫(kù)的方法，其特征是用作傳代培養(yǎng)以備脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入重組子的愛(ài)德華綜合癥組織細(xì)胞，在原代擴(kuò)增培養(yǎng)中，其收集指標(biāo)是細(xì)胞貼壁培養(yǎng)約3?4天、細(xì)胞形態(tài)為梭形、小園形細(xì)胞不到10%、貼壁細(xì)胞的匯合率達(dá)75%?85%、處于剛進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)收集細(xì)胞；用作脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入重組子的傳代愛(ài)德華綜合癥組織細(xì)胞，其時(shí)機(jī)選擇的指標(biāo)是細(xì)胞形態(tài)為梭形、尚未見(jiàn)或僅見(jiàn)少于10%小園形細(xì)胞、貼壁細(xì)胞的匯合率達(dá)55%?65%、處于將進(jìn)入或剛進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)的培養(yǎng)細(xì)胞；傳代細(xì)胞系收集的指標(biāo)是選擇細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)的匯合率達(dá)80?85%、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的前期時(shí)收集細(xì)胞；染色體核型分析的細(xì)胞收集指標(biāo)是細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)85-95 %、小園形細(xì)胞占10 %以上、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的導(dǎo)入hTERT和SV40LT重組子構(gòu)建愛(ài)德華綜合征細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫(kù)的方法，其特征是以0.01%膠原酶II消化貼壁生長(zhǎng)的愛(ài)德華綜合癥組織細(xì)胞，作染色體核型分析時(shí)，每5mL培養(yǎng)液中加入250ug/ml秋水仙素lOOul，混勻后置37°C培養(yǎng)箱 4小時(shí)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的導(dǎo)入hTERT和SV40LT重組子構(gòu)建愛(ài)德華綜合征細(xì)胞模型及其細(xì)胞庫(kù)的方法，其特征是細(xì)胞庫(kù)的構(gòu)建包括(I)篩選經(jīng)鑒定后符合永生化細(xì)胞特性并與原代細(xì)胞相同或相近的SV40LT和hTERT重組子介導(dǎo)的愛(ài)德華綜合癥細(xì)胞；(2)作傳代、擴(kuò)大培養(yǎng)，取生長(zhǎng)良好、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的不同世代的貼壁細(xì)胞；(3)經(jīng)消化、終止、離心(1200r/min,6min)步驟收獲細(xì)胞；(4)用含二甲亞砜的凍存液配制密度為5 X 15個(gè)/ml的細(xì)胞懸液;(5)按照4°C,0.5h ；-20°C,2h ;_70°C，過(guò)夜;入_196°C液氮的程序凍存細(xì)胞；(6)可再生性地保存SV40LT和hTERT重組子介導(dǎo)的愛(ài)德華綜合癥細(xì)胞模型，備作遺傳資源和科研材料。
【文檔編號(hào)】C40B40/02GK104419678SQ201310407586
【公開(kāi)日】2015年3月18日 申請(qǐng)日期:2013年9月1日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月1日
【發(fā)明者】翁炳煥, 陳松長(zhǎng), 李曉, 舒靜, 張琳, 黃荷鳳 申請(qǐng)人:翁炳煥