一種噬菌體展示隨機肽庫的構建方法
【專利摘要】一種噬菌體展示隨機肽庫的構建方法，所述方法采用NNK編碼方式，將編碼隨機肽庫的兩條鏈經退火、延伸補平、雙酶切后，與經同樣雙酶切的5’去磷酸化載體連接，電轉TG1感受態細胞。擴增菌液后進行庫容和多樣性檢驗。利用該肽庫篩選獲得的肽段序列，通過測序分析即可得到與藥物特異性結合的外源蛋白或多肽。該技術廣泛應用于抗原表位的模擬和蛋白、核酸結合特性的研究，同時在藥物篩選和疫苗研制方面也有廣泛的應用。
【專利說明】一種噬菌體展示隨機肽庫的構建方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于分子生物學及生物制藥技術范疇，特別涉及一種噬菌體展示隨機肽庫的構建方法。
【背景技術】
[0002]卩遼菌體展不技術(phagedisplay technology)是由Smith于1985年創建，于20世紀90年代發展起來并得到廣泛應用的新技術。基本原理是噬菌體作為一種表達載體，可以將外源蛋白或多肽呈現在噬菌體表面，利用外源蛋白或多肽與待篩選藥物的特異性親和作用，通過吸附-洗脫-擴增的篩選富集過程，將表達與藥物特異性結合的外源蛋白或多肽的噬菌體大量富集，然后通過測序分析即可得到與藥物特異性結合的外源蛋白或多肽。目前該技術已經廣泛應用于抗原表位的模擬和蛋白、核酸結合特性的研究，同時在藥物篩選和疫苗研制方面也有廣泛的應用。
【發明內容】
[0003]本發明的目的是提供一種噬菌體展示隨機肽庫的構建方法。其特征在于，所述噬菌體展示隨機十五肽庫的構建方法為:
[0004]I 載體(圖1)
[0005]采用噬菌粒pCANTAB5E (見圖1)，pCANTAB5E含有SfiI和NotI兩個酶切位點，可以將外源目的基因通過酶連反應重組進入噬菌粒載體。
[0006]2文庫構建
`[0007]構建文庫多為6~16肽，我們選擇構建15肽庫，采用NNK編碼方式，N代表任意核苷酸，K代表G或T，可指導合成全部20種氨基酸。將編碼隨機肽庫的兩條鏈經退火、延伸補平、雙酶切后，與經同樣雙酶切的5’去磷酸化載體連接，電轉TGl感受態細胞。
[0008]3隨機肽庫庫容和多樣性檢驗
[0009]取I μ I從平板上刮下來的TGl肽庫菌液，梯度稀釋后涂布SOB平板，計算庫容。隨機挑取20個克隆進行測序，對其多樣性進行檢驗。
[0010]本發明的有益效果是所構建的肽庫為噬菌體展示隨機肽庫，噬菌體展示技術研發模式更高效，耗成本更低，并能定向設計出結構更優化的新藥。對于藥物與蛋白作用的研究，在病理學、藥理學等諸多方面具有重要意義。利用噬菌體表面展示技術構建相應的蛋白質或多肽文庫，以此導向、跟蹤，從復雜提取物中找出有效部位或成分，再進行動物試驗，可收到事半功倍的效果。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0011]圖1為PCANTAB5E載體的限制圖譜和多克隆位點。
[0012]圖2為PCR擴增的編碼15肽的雙鏈DNA片段，圖中M為DL2000，I為目的DNA片段。[0013]圖3為PCR擴增的重組載體中的目的片段，圖中M為DL2000，I~10為PCR擴增
的結果。
【具體實施方式】
[0014]本發明提供一種噬菌體展示隨機肽庫的構建方法，所述肽庫的構建方法結合附圖和實施過程以說明。
[0015]I實驗材料:
[0016]E.coli TGl:由中國藥科大學生物制藥教研室保存，Ε.coli TGl:supEhsdΔ5thiΔ (lac-proAB)F， [traD36proAB+lacIq IacZΔΜ15]。
[0017]噬菌粒PCANTAB5E，由中國藥科大學生物制藥教研室保存。
[0018]DNA聚合酶、T4DNA連接酶購自Fermentas公司；堿性磷酸酶CIAP購自TaKaRa公司;限制性內切酶Sfi1、NotI購自NEB公司。
[0019]Plasmid Miniprep kit I, Gel/PCR Extraction kit 購自 Biomiga 公司。
[0020]2噬菌體展示隨機十五肽庫的構建
[0021]2.1線性化載體的制備
[0022]提取pCANTAN5E質粒，Sfi1、NotI進行雙酶切，利用Biomiga膠回收試劑盒回收酶切產物，CIAP酶進行去磷酸化處理。在Eppendorf管中加入適量酶切產物，緩沖液及CIAP酶，去離子水補充至50 μ 1，`混勻后37°C水浴30min，再50°C水浴30min，去磷酸化產物用PCR產物回收試劑盒進行純化，去離子水洗脫后，-200C。
[0023]2.2編碼15肽的隨機DNA片段的制備
[0024]根據載體上Sfil、NotI酶切位點情況及構建隨機肽庫的要求，設計兩條寡核苷酸片段，
[0025]鏈1:5, -GCTGGCCCAGCCGGCC(SfiI)(NNK) 15TAAGCGGCCGC
[0026](NotI)AGGTGCATT-3丨，其中N代表A、T、C、G四種堿基，K代表T、G兩種堿基。在Y和:V端引入Sf i 1、NotI酶切位點，用下劃線表示。鏈2:5' -AATGCACCTGCGGCCGCTTA-3'與鏈I的3'端互補，寡核苷酸鏈由上海生工生物工程有限公司合成。
[0027]在一Eppendorf 管中加入 10X 退火 Buffer5 μ I, 20mmol/ml 的 DNA 單鏈各 2 μ I,
2.5mmol/ml 的 dNTPl μ 1，Taq 酶 I μ 1，ddH20 加至 50 μ I。
[0028]PCR擴增條件:94°C預變性 4min ；94°C,lmin ；55°C,30s ;72°C，lmin，共 30 個循環，最后72°C延伸lOmin。
[0029]將退火延伸的隨機片段經Sfil、NotI雙酶切，用PCR回收試劑盒回收目的條帶。
[0030]2.3連接及連接產物的回收處理
[0031]對酶切回收的載體與插入片段進行紫外定量，線性化載體與插入片段按1: 3，I: 5,1: 7,1: 10進行連接，確定最佳連接比例為1: 7。用不同濃度的連接產物進行轉化以確定最佳轉化產物量為0.1 μ g(5 μ I)。利用PCR產物回收試劑盒純化連接產物以除去連接酶和離子。
[0032]2.4電轉化
[0033]有關電轉化感受態細胞的制備見分子克隆實驗指南(第三版)，取5 μ I精制的連接產物與50 μ I電轉感受態細胞輕柔混勻，冰浴I~2min，置于預冷的孔隙為0.1cm的電轉杯，進行電轉。電轉儀參數為1.3KV，25yF，200Q。電擊后，加入Iml SOC培養基，37°C，200rpm振搖45~50min。取少量菌體適量稀釋后涂布SOB (含50 μ g/ml Amp)小平板(直徑IOcm)，其余8000rpm離心3min后涂布SOB (含100 μ g/ml Amp)大平板(直徑15cm)，37°C倒置培養12~16h，以小平板進行計數，大平板上的菌落用LB培養基溶解，并用涂布棒均勻刮下來，加甘油至終濃度20%，分裝成小管，-70°C凍存。
[0034]2.5序列測定及分析
[0035]隨機挑取若干原始細菌克隆，各提取重組質粒，并對重組質粒進行PCR驗證，設計PCR 驗證引物:上游引物 5' -CAGGAAACAGCTATGACC-3' (M13R)，下游引物 5' -GTAAATGAATTTTCTGTATGAGG-3丨(S6)(上海生工生物技術服務有限公司)。PCR陽性的重組質粒，將其測序(上海美吉生物醫藥科技有限公司)，并對構建的隨機肽庫的寡核苷酸的隨機性、庫容及豐度進行評價。
[0036]3文庫的庫容及多樣性評價
[0037]載體與插入片段摩爾比為1: 7，取5μ1精制的連接產物進行電轉，原庫容為1*106,轉化效率為l*107cfu/y g DNA。將多次轉化合并后,庫容為5*108,滿足用于篩選的需要。
[0038]從肽庫中隨機挑取20個克隆，進行序列測定(表1)。結果顯示(表2)，四種核苷酸的出現情況與預先設計的NNK相符，第一、第二核苷酸分別為A/T/G/C中的任一種，其中每一種核苷酸和出現的頻率的理論值為25%，第三位核苷酸為G/T中的任一種，G或T的出現頻率為50%。實際值與理論值存在一定的偏差，可能是由于樣本較小的緣故，隨著測序樣本的增加，這種差異將逐漸減小。
[0039]上述結果表明，所構建的噬菌體隨機肽庫不論從基本框架，還是從庫容及多樣性方面均滿足設計要求。
[0040]表1 15肽庫隨機挑選克隆核苷酸的插入與對應的氨基酸序
[0041]序號序列
【權利要求】
1.一種曬菌體展不隨機肽庫的構建方法,包括: (1)采用NNK編碼方式，其中N代表任意核苷酸，K代表G或T，可指導合成全部20種氨基酸。將編碼隨機肽庫的兩條鏈經退火、延伸后進行雙酶切； (2)將載體經與(I)同樣的雙酶切后，進行5’去磷酸化； (3)將(I)獲得的隨機序列與(2)獲得的脫磷酸載體進行連接，電轉TGl感受態細胞構建隨機肽庫； (4)取擴增后的TGl肽庫菌液，梯度稀釋后涂布SOB平板，計算庫容。隨機挑取克隆進行測序，對其多樣性進行檢驗。
2.根據權利要求1或2所述方法，其特征在于，所述文庫構建為噬菌體展示隨機6-16肽庫。
3.根據權利要求2所述方法，其特征在于步驟(1)中所采用的載體為噬菌粒PCANTAB5E。
4.根據權利要求1-3所述方法構建的噬菌體展示隨機肽庫。
5.權利要求4所述噬菌體展示隨機肽庫的用途，其特征在于:利用該肽庫篩選獲得的肽段序列，通過測序分析即可得到與藥物特異性結合的外源蛋白或多肽。該技術廣泛應用于抗原表位的模擬 和蛋白、核酸結合特性的研究，同時在藥物篩選和疫苗研制方面也有廣泛的應用。
【文檔編號】C40B50/06GK103806112SQ201310244662
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2013年6月9日 優先權日:2013年6月9日
【發明者】張芳, 王筱蒙, 邱鄭, 王旻, 徐春蕾 申請人:南京中醫藥大學