專利名稱：一種應用于混合建庫的高通量測序接頭及其建庫方法
技術領域：
本發明涉及高通量測序領域，具體的說，涉及一種節約時間、成本并提高效率的文庫構建方法的改進。
背景技術：
通常用Truseq試劑建庫所需流程簡單，建庫成功率高，但費用昂貴，時間長，在建庫數目多時要消耗大量時間及費用。而NEB試劑建庫雖然費用相對較低，但流程相對繁瑣。
混合建庫是在Truseq試劑和NEB試劑建庫方法上的改進。通過在片段選擇步驟前加上可以識別不同文庫的Index，然后將不同文庫進行混合。該方法與傳統方法比會使后續的切膠進行片段選擇和PCR步驟上節約大量試劑成本、人力成本及時間。該方法特別適用于基因組小的生物基因組重測序及測序深度低的基因組測序。發明內容
本發明的一個目的是合成Illumina公司的雙鏈接頭,并替換Index,增加Index數量。
本發明提供的雙鏈接頭DNA序列分子A，包括正向和反向兩條鏈。正向鏈5’末端到3’末端與Illumina公司的Hiseq2000測序平臺測序序列P7除Index部分6個堿基不同，其余都相同，并在5’末端進行磷酸化修飾；反向鏈與Illumina公司的HiSeq2000測序平臺測序序列P5相同。接頭A的結構如圖I所示。
前述的與illumina公司的Hiseq2000測序平臺測序序列p7相同的寡核苷酸片段，為序列表中序列I的第1-33位和40-63位。
前述的替換的Index部分，為序列1、2、3中的第34-39位。
前述的在正向鏈5’末端進行磷酸化修飾，為序列表中序列1、2、3的第I位的脫氧核糖核苷酸進行的磷酸化修飾。
前述的反向鏈為序列表中序列4。
本發明的第二個目的是運用上述接頭A，混合構建不同樣品文庫；結合Truseq試劑和NEB試劑建庫方法，混合構建文庫包括如下步驟，如圖2所示1)將基因組DNA打碎大小集中在300bp左右；2)對步驟I)得到的打碎產物純化回收之后，進行末端補平。對末端補平的產物進行 3’加dATP，將加dATP的產物連上接頭A ；3)對步驟2)得到的連接產物進行混合后，跑瓊脂糖凝膠電泳分析，如圖3所示；根據所需文庫大小選擇選擇片段，如圖4所示；4)將片段純化并定量后進行PCR擴增，并將擴增產物純化，然后在Illumina公司的 Hiseq2000測序平臺進行測序；5)進行生物信息分析。
前述的運用上述接頭A，混合構建不同樣品文庫的方法，其中步驟I)中，所述的打碎的條件為使用covaris打碎儀器并調整相應的參數。
前述的運用上述接頭A，混合構建不同樣品文庫的方法，其中步驟2)中，所述的回收打碎產物的方法為采用PCR產物回收試劑盒進行回收；所述的末端補平體系為使用NEB 公司的Quick Blunting kit進行；所述的加dATP的體系包括dATP, 10XNEB Buffer 2, Klenow exo-聚合酶,所述的dATP的濃度為100 mM,所述的聚合酶在所述的反應體系中的濃度為25 U/ul ;所述的接頭A的連接體系包括接頭A, 2XQuick Ligation Buffer、Quick T4 DNA Ligase，所述的接頭A的濃度為8 uM。
前述的運用上述接頭A，混合構建不同樣品文庫的方法，其中步驟4)中，所述的純化采用Qiagen公司的膠回收試劑盒進行回收；PCR體系包括引物，聚合酶混合物，以及步驟3)中得到的連接產物。
進一步地，所述PCR體系包括引物，聚合酶混合物，以及步驟3)中得到的連接產物包括引物的濃度為O. 2 uM，所述聚合酶混合物在所述PCR體系中所占的50%的體積。
本發明的實驗證明，本發明提供的接頭分子A，能夠連接到DNA片段的兩端，運用本發明的建庫方法，成功的構建了 DNA文庫，并成功的運用在illumina公司的Hiseq2000 的測序平臺進行測序，新引入的Index能夠將文庫很好的分開；同時，可以實現多個樣本的混合建庫。本發明提供了一種便捷，高效，快速的構建文庫的方法，大量節約了試劑成本，人力成本及時間。
圖I為接頭A的結構示意圖；圖2為建庫流程示意圖；圖3為連完接頭A的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖4為連完接頭A切膠選擇完片段大小的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖5為2100檢測結果；圖6為混合建庫測序質控結果。
具體實施方式
下面將參考附圖并結合實施例來詳細說明本發明。
下述實施例中所述方法如無特別說明均為常規方法，所用核苷酸序列均由上海 Invitrogen生物公司合成。所用試劑如無特別說明均為NEB公司的產品,所用水均為超純水。
一、質量檢測。
I.樣品濃度測定使用Qubit (美國)對樣品DNA濃度測定，進行精準定量，并使用O. 8%瓊脂糖凝膠，120v電壓，電泳I小時，檢測樣品質量，確保基因組DNA樣品完整無降解。
二、基因組片段破碎。
2.將基因組DNA使用covaris (美國)破碎至300 bp左右，使用Qiagen PCR試劑盒回收打碎產物，具體步驟按照Qiagen試劑盒操作說明書進行。
3.對上述回收產物進行末端補平；反應體系和反應條件如下打碎產物DNA 30μ , IOXBlunting Buffer 5 M-I, I mM dNTP 10 M-I, Quick Blunting kit Enzyme Mix, I μ JPH2O 9 μ ，總體系50 μ ;反應條件30 °C孵育30 min。用I. 6倍體積的Ampure XP beads對補平產物進行純化。
三、打碎片段末端修復、加dATP。
4.對步驟3中的純化產物進行加dATP ;反應體系和條件如下步驟3中的補平產物，20 μ1，100 mM dATP I μ , 10ΧΝΕΒ Buffer 2 3 μ , Klenow exo- (NEB) (50,000 units/ ml) 0. 5 μ1，Η20 5.5 μ ，總體積 30 μ ;反應條件充分混勻，37 °C孵育 30 min, 75 °C 20 min熱失活。
四、加dATP產物加接頭A。
5.對加dATP產物，加入接頭A，接頭A結構如圖I所示；反應體系和條件具體如下連接產物 24 Kl，2XQuick Ligation Buffer 30 μ , Quick Τ4 DNA Ligase I. 2 μ ，8 uM接頭A 5 μ ,總體積60 μ ,室溫下連接30 min。用I. 6倍體積的Ampure XP beads對連接產物進行純化，純化過程嚴格按照使用說明書進行。
6.將步驟5中的連接產物進行Qubit定量，按照測序數據量將不同樣品的連接產物進行等量混合。
7.配制2%的瓊脂糖凝膠電泳，如圖3所示；將混合的連接產物進行切膠選擇片段大小,如圖4所示；采用Qiagen公司的膠回收試劑盒進行回收；對回收產物進行Qubit定量，用于下一步PCR擴增。
五、PCR擴增。
8.將7中回收的產物，精準定量IOng用于PCR反應，得到的PCR產物，即為所構建的文庫。反應體系和條件如下DNA樣品3 μ1，ΡΟ Primer I I Pl，PCR Primer 2 I μ ， 2 X Phusion PCR Master Mix 25 μ1，Η20 20 μ ，總共 50 μ ，應條件為先 98°C預變性 Imin ; 然后 98°C 10 s，60°C 30 s，72°C 30 s，共 10個循環；最后 72°C 延伸 5 minoPrimer I 的序列為 5’ -AATGATACGGCGACCACCGA-3’ ；Primer 2 的序列為 5’ -CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3’。
9.將步驟8中的PCR產物等體積AMP μ re XP Beads純化兩次；純化過程嚴格按照使用說明書進行；取出Iul進行2100檢測，結果表明，得到文庫大小為351 bp，如圖5 所示。
10.將步驟9中的純化產物進行Qy bit精準定量。
六、文庫庫檢和上機。
11.將步驟9中所得的純化產物稀釋到lng/ul，取出Iul用于Agilent2100 (美國Agilent公司)檢測，另外再取Iul用于qPCR (Biorad公司)檢測，根據檢測結果，決定上機濃度。
12.根據步驟I所得的濃度，將文庫稀釋到上機要求后，在Illumina公司的 Hiseq2000測序平臺進行測序。
七、上機結果質控。
利用上述方法對3個蜜蜂重測序樣品進行混合建庫。
結合圖6所示，結果分析如下Q20，Q30 :從圖中可知PoolBee的Q20，Q30達到98%以上，而對于重測序項目:要求Q20 不小于90% ；Q30不小于85%，即便是De novo項目也不過是Q20要求不小于95% ；Q30不小于90%，所以此次測序質量良好。
Adapter 污染率此次混合建庫的 adapter rate 分別為 O. 02%、O. 03%、O. 02%, Adapter rate在5%以下認為正常,所以此次建庫Adapter rate正常。
Duplication :此次混合建庫的 Duplicationl. 85%、2· 26%、2. 53,混合建庫 Duplication 一般較高,此次建庫Duplication在允許范圍內。
數據量此次測序目標數據25M，實際數據20M左右，少了 5M數據。且Poolbee-I、 Poolbee-2, Poolbee-3得到的數據有所差異，這可能與混合樣品時手法及文庫中實際有效濃度有關。
綜上所述此次建庫合格，測序質量良好。
以上所述僅為本發明的優選實施例而已，并不用于限制本發明，對于本領域的技術人員來說，本發明可以有各種更改和變化。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
權利要求
1.一種接頭序列A，其特征在于 由序列表中序列I或2或3和4所示的核苷酸序列組成的接頭。
2.一種運用如權利要求I所述的接頭A，混合構建不同樣品文庫的方法，其特征在于，包括如下步驟 1)將基因組DNA打碎，大小集中在300bp左右； 2)對步驟I)得到的打碎產物純化回收之后，進行末端補平；對末端補平的產物進行3’加dATP ;將加dATP的產物連上接頭A ； 3)對步驟2)得到的連接產物進行混合后，跑瓊脂糖凝膠電泳分析；根據所需文庫大小選擇片段； 4)將片段純化并定量后進行PCR擴增，并將擴增產物純化，然后在Illumina公司的Hiseq2000測序平臺進行測序； 5)進行生物信息分析。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于 結合Truseq試劑和NEB試劑建庫方法，并對多個DNA文庫同時構建。
4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于根據權利要求2所述的方法，其特征在于 通過連接不同的Index接頭A,構建DNA文庫。
5.根據權利要求2所述的方法，其特征在于 其所述的材料DNA來源，是植物，動物或者微生物。
6.根據權利要求2所述的方法，其特征在于 測序平臺為illumina Hiseq2000測序平臺。
全文摘要
本發明基于illumina公司的Hiseq測序平臺原理，設計了含有新的Index序列的接頭，通過結合Truseq試劑建庫和NEB試劑建庫方法，成功建立了一種對多個文庫同時構建的混合建庫方法，從而節約了建庫成本和時間，提高了建庫效率。
文檔編號C40B50/06GK102978206SQ20121048765
公開日2013年3月20日 申請日期2012年11月27日 優先權日2012年11月27日
發明者蔣智, 劉少卿, 吳靜, 彭獻軍 申請人:北京諾禾致源生物信息科技有限公司