專利名稱：一種復發鼻咽癌基因芯片檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬于鼻咽癌復發檢測技術領域，尤其涉及一種復發鼻咽癌基因芯片檢測試劑盒。
背景技術：
鼻咽癌是我國南方常見的惡性腫瘤，是指鼻咽粘膜上皮發生的癌變，病理大多為低分化鱗癌，其惡性度高，發病部位隱蔽，特別是在咽隱窩和鼻咽頂部，早期癥狀不明顯因而難以早期發現，誤診誤治率較高，可達12. 2 %。在確診的鼻咽癌中，其5年生存率長期徘徊在50% 60%左右。多年來臨床觀察及實驗研究表明它與遺傳因素、EB病毒、環境因素緊密相關。目前鼻咽癌首選放射治療，然而臨床統計發現鼻咽癌患者即使經過合理放療和規范的綜合治療后，部分患者仍難以避免出現鼻咽局部和(或)頸淋巴結引流區的腫瘤復 發，復發率仍在8. 6-23. 7 %，再放療效果較差，特別是鼻咽癌的中晚期患者，5年生存率不夠理想，因此不少學者正在探索更有效的治療方法。盡管臨床上鼻因癌診斷可以進行后鼻鏡、EB病毒血清學、影像學(如CT、MRI)、電子鼻咽鏡等各項檢查對可疑病人進行鼻咽部活檢以明確診斷，然而針對預測鼻咽癌患者放化療后療效卻缺乏一種簡單、有效的檢測方法。目前研究發現鼻咽癌發生是一個多基因、多階段過程，腫瘤是細胞中多種基因表達改變累積的結果。隨著分子生物醫學技術發展，目前市場上出現利用生物技術制成實用新型的篩查試劑盒，如利用western技術、酶聯免疫吸附實驗技術做成宮頸癌、乳腺癌、直腸癌等體外診斷試劑盒，用于無癥狀人群的癌前期病變及惡性腫瘤早期篩查。
發明內容
本發明提供了一種復發鼻咽癌基因芯片檢測試劑盒，旨在解決現有技術針對預測鼻咽癌患者放化療后療效卻缺乏一種簡單、有效的檢測方法的問題。本發明的目的在于提供一種復發鼻咽癌基因芯片檢測試劑盒，該檢測試劑盒由針對KRT17、S100A8、PI、CLCA2基因設計的DNA探針基因芯片、DNA提取試劑盒、擴增液、雜交和顯色溶液組成。進一步，針對KRT17、S100A8、PI、CLCA2基因設計的DNA探針為寡核苷酸片段，并與被檢測靶DNA互補。進一步，所述擴增液包含了上、下游引物以及PCR反應所需的各種試劑。進一步，所述顯色溶液包括預雜交液、雜交緩沖液、洗液I、洗液2、洗液3、抗體液和顯色液。進一步，針對KRT17、S100A8、PI、CLCA2基因設計的DNA探針基因芯片的制備方法為將KRT17基因、S100A8基因、PI基因、CLCA2基因的DNA探針分別通過特定的高速點樣機器人直接點在芯片上。進一步，所采用的高速點樣機器人有一套計算機控制三維移動裝置多個打印/噴印針的打印/噴印頭，一個減震底座，上面可放內生探針的多孔板和多個芯片，打印/噴印針將探針從多孔板取出直接打印或噴印在芯片上。本發明提供的復發鼻咽癌基因芯片檢測試劑盒，通過采取臨床病人外周血中的DNA,利用PCR進行核酸擴增而獲得大量的DNA序列，并與制備好的復發鼻咽癌相關基因芯片試劑盒進行雜交，通過信號掃描，獲得相關基因的表達情況，為今后復發鼻咽癌的發生提供預測，該檢測試劑盒提供的這種方法操作簡單，方便快捷，可有效檢測出鼻咽癌放化療后復發基因的改變，讓醫護人員快速、直觀的預測鼻咽癌治療后復發的可能，幫助鼻咽癌預測風險而加以預防，做到了早篩查、早診斷，提高了鼻咽癌患者生存率。
圖I是本發明實施例提供的復發鼻咽癌基因芯片的示意圖。
具體實施例方式為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發明進行進一步的詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定發明。圖I示出了本發明實施例提供的復發鼻咽癌基因芯片的結構。為了便于說明，僅不出了與本發明相關的部分。本發明的目的在于提供一種復發鼻因癌基因芯片檢測試劑盒，該檢測試劑盒由針對KRT17、S100A8、PI、CLCA2基因設計的DNA探針基因芯片、DNA提取試劑盒、擴增液、雜交和顯色溶液組成。在本發明實施例中，針對KRT17、S100A8、PI、CLCA2基因設計的DNA探針為寡核苷酸片段，并與被檢測靶DNA互補。在本發明實施例中，擴增液包含了上、下游引物以及PCR反應所需的各種試劑。在本發明實施例中，顯色溶液包括預雜交液、雜交緩沖液、洗液I、洗液2、洗液3、抗體液和顯色液。在本發明實施例中，針對KRT117、S100A8、PI、CLCA2基因設計的DNA探針基因芯片的制備方法為將KRT17基因、S100A8基因、PI基因、CLCA2基因的DNA探針分別通過特定的高速點樣機器人直接點在芯片上。在本發明實施例中，所采用的高速點樣機器人有一套計算機控制三維移動裝置多個打印/噴印針的打印/噴印頭，一個減震底座，上面可放內生探針的多孔板和多個芯片，打印/噴印針將探針從多孔板取出直接打印或噴印在芯片上。下面結合附圖及具體實施例對本發明的應用原理作進一步描述。針對現有臨床上預測鼻咽癌放化療預后的缺陷，本發明目的是提出一種新型檢測鼻咽癌復發可能性的方法。首先采用DNA微陣列芯片技術，大規模、高通量地對復發鼻咽癌患者和初發鼻咽癌患者成千上萬個差異基因進行篩選，設定篩選條件為以組間2倍以上差異表達為條件且P < O. 001對復發鼻咽癌和初發鼻咽癌差異基因進行篩選。利用RT-PCR芯片結果的準確性進行驗證。為獲取基因芯片數據準確性，實驗對樣本進行3次重復基因芯片檢測，取重復性好實驗結果，檢測結果顯示復發鼻咽癌和初發鼻咽癌存在大量差異表達基因，其中篩選到符合條件與rNPC相關的基因104個，從104個差異基因中選擇差異倍數最大的4個差異基因，確定為復發鼻咽癌相關的基因，把這些相關基因探針固定在芯片上制成試劑盒進行臨床檢測。這種方法操作簡單，方便快捷，可以有效檢測出鼻咽癌放化療后復發基因的改變，讓醫護人員快速、直觀的預測鼻咽癌治療后復發的可能，幫助鼻咽癌預測風險而加以預防。做到早篩查、早診斷，對提高鼻咽癌患者生存率是至關重要。(一 )復發鼻咽癌差異基因篩選I、標本來源及實驗分組以初發鼻咽癌和發鼻咽癌為研究對象；復發鼻咽癌患者為首次放療后2 6年發生局部復發，病理確診均為低分化鱗狀細胞癌，經檢查未發現遠處轉移；入選者在電子鼻咽纖維鏡直視下活檢，活檢組織分2份，I份送病理檢查，I份馬上放液氮中凍存備用；2、用分光光度計測量總RNA濃度和純度，判定所提取的為高質量的總RNA ;3、探針 標記利用反轉錄聚合酶鏈反應PCR,經兩輪逆轉錄成c DNA后，純化cDNA和段化單鏈DNA片，加入試劑到片斷化的DNA中，混勻，取2μ I樣品檢測標記效率。然后雜交、洗滌，在1.5ml離心管中準備雜交液,混勻，離心,然后在Affymetrix Fluidics Station450洗漆站中洗滌，每例標本重復三次；4、掃描與分析設定篩選條件為以組間2倍以上差異表達為條件且P < 0.001，分別對？冊(與rNPC差異表達基因進行篩選，從104個差異基因中確定KRT17、S100A8、PI、CLCA2改變可能
會導致鼻咽癌復發；( 二)復發鼻咽癌基因芯片檢測試劑盒的制備I、試劑盒組成基因芯片試劑盒分別由針對KRT17、S100A8、PI、CLCA2基因設計的DNA探針(寡核苷酸片段，與被檢測靶DNA互補)基因芯片、DNA提取試劑盒、擴增液(包含了上、下游引物以及PCR反應所需的各種試劑如dNTP、Mgcl2、H20、Buffer等，Taq酶另管提供)、雜交和顯色溶液(包括預雜交液、雜交緩沖液、洗液I、洗液2、洗液3、抗體液和顯色液)等組分組成。2、制作復發鼻咽癌基因DNA探針的芯片探針一般是以基因文庫中選取某一基因片段，與質粒或噬菌體載體連接進行克隆后，得到該基因的重組質粒，在轉化到適當的細菌體中，提取的質粒經限制酶酶切回收特定基因片段，經標記則成為基因組DNA探針。將KRT17 基因(NCBI 登錄號ΝΜ_000422· 2)、S100A8 基因(NCBI 登錄號NM_002964. 3)、PI 基因(NCBI 登錄號BC010952)、CLCA2 基因基因(NCBI 登錄號NM_006536)的DNA探針分別通過特定的高速點樣機器人直接點在芯片上。采用的機器人有一套計算機控制三維移動裝置多個打印/噴印針的打印/噴印頭，一個減震底座，上面可放內生探針的多孔板和多個芯片。打印/噴印針將探針從多孔板取出直接打印或噴印在芯片上。(三)復發鼻咽癌檢測步驟
I、復發鼻咽癌患者DNA的提取提取復發鼻咽癌外周血中的基因組DNA，加入一定量的異丙醇或乙醇，基因組的大分子DNA即沉淀形成纖維狀絮團飄浮其中，可用玻棒將其取出，而小分子DNA則只形成顆粒狀沉淀附于壁上及底部，從而達到提取的目的。2、DNA 擴增將擴增液中加Taq酶、抽提好的靶DNA通過PCR反應將靶DNA片段迅速擴大，用于雜交和顯色反應。3、雜交和顯色基因芯片雜交反應是通過靶DNA與基因芯片上針對KRT17、S100A8、PI、CLCA2基因設計的DNA探針進行特異性雜交，再通過顯色反應顯色。
4、檢測將基因芯片上的色斑經信號放大就可以知道樣本DNA序列中單核苷酸，就可以確定與復發鼻咽癌相關基因KRT17、S100A8、PI、CLCA2是否存在，如果存在就說明患者存在復發可能。本發明實施例提供的復發鼻咽癌基因芯片檢測試劑盒，通過采取臨床病人外周血中的DNA，利用PCR進行核酸擴增而獲得大量的DNA序列，并與制備好的復發鼻咽癌相關基因芯片試劑盒進行雜交，通過信號掃描，獲得相關基因的表達情況，為今后復發鼻咽癌的發生提供預測，該檢測試劑盒提供的這種方法操作簡單，方便快捷，可有效檢測出鼻咽癌放化療后復發基因的改變，讓醫護人員快速、直觀的預測鼻咽癌治療后復發的可能，幫助鼻咽癌預測風險而加以預防，做到了早篩查、早診斷，提高了鼻咽癌患者生存率。以上僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
權利要求
1.一種復發鼻咽癌基因芯片檢測試劑盒，其特征在于，該檢測試劑盒由針對KRT17、S100A8、PI、CLCA2基因設計的DNA探針基因芯片、DNA提取試劑盒、擴增液、雜交和顯色溶液組成。
2.如權利要求I所述的檢測試劑盒，其特征在于，針對KRT17、S100A8、PI、CLCA2基因設計的DNA探針為寡核苷酸片段，并與被檢測靶DNA互補。
3.如權利要求I所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述擴增液包含了上、下游引物以及PCR反應所需的各種試劑。
4.如權利要求I所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述顯色溶液包括預雜交液、雜交緩沖液、洗液I、洗液2、洗液3、抗體液和顯色液。
5.如權利要求I所述的檢測試劑盒，其特征在于，針對KRT17、S100A8、PI、CLCA2基因設計的DNA探針基因芯片的制備方法為 將KRT17基因、S100A8基因、PI基因、CLCA2基因的DNA探針分別通過特定的高速點樣機器人直接點在芯片上。
6.如權利要求5所述的檢測試劑盒，其特征在于，所采用的高速點樣機器人有一套計算機控制三維移動裝置多個打印/噴印針的打印/噴印頭，一個減震底座，上面可放內生探針的多孔板和多個芯片，打印/噴印針將探針從多孔板取出直接打印或噴印在芯片上。
全文摘要
本發明屬于鼻咽癌復發檢測技術領域，提供了一種復發鼻咽癌基因芯片檢測試劑盒，通過采取臨床病人外周血中的DNA，利用PCR進行核酸擴增而獲得大量的DNA序列，并與制備好的復發鼻因癌相關基因芯片試劑盒進行雜交，通過信號掃描，獲得相關基因的表達情況，為今后復發鼻咽癌的發生提供預測，該檢測試劑盒提供的這種方法操作簡單，方便快捷，可有效檢測出鼻咽癌放化療后復發基因的改變，讓醫護人員快速、直觀的預測鼻咽癌治療后復發的可能，幫助鼻咽癌預測風險而加以預防，做到了早篩查、早診斷，提高了鼻咽癌患者生存率。
文檔編號C40B40/06GK102827941SQ201210347410
公開日2012年12月19日 申請日期2012年9月6日 優先權日2012年9月6日
發明者廖志蘇, 林森, 李文峰, 林才, 方瀟碧, 張春鴻, 黃振校, 施清圓, 吳麗萍, 夏衛東 申請人:溫州醫學院附屬第一醫院