專利名稱：一種捕獲探針的制備方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物樣品的制備與處理，更具體地說，涉及一種捕獲探針的制備方法及其應用。
背景技術：
后基因組時代，對特定片段的序列和功能的了解的需求日益迫切。現有技術中，對于核酸片段的獲取，主要通過微陣列技術捕獲核酸片段，其基本原理如下在微陣列芯片上合成用于捕獲核酸片段的DNA捕獲探針，或是將DNA轉變成RNA制備成捕獲探針，然后將捕獲探針與片段化之后得到的源核酸片段孵育結合，捕獲目標核酸片段。該技術中，捕獲探針的生物素標記是由帶生物素標記的堿基帶入，生物素標記的數量和位置是未知不確定的； 而且該微陣列技術所用的DNA捕獲探針直接在芯片上合成，生產成本高；此外，由于捕獲探針的設計只針對不連續的外顯子區域，因此只能捕獲外顯子區域核酸片段，適用的范圍窄， 對于外顯子區域以外的核酸片段無法捕獲。因此，迫切需要一種新的捕獲探針的制備方法，能夠對捕獲探針所帶的生物素標記的數量和位置進行控制，能夠降低生產成本，同時適用范圍廣，制得的捕獲探針可以針對任意目標區域而不僅僅是外顯子區域的核酸片段進行捕獲。
發明內容
本發明的目的在于提供一種捕獲探針的制備方法，同時提供該捕獲探針在捕獲核酸片段以及測序中的應用方法，旨在解決現有技術中捕獲探針的生物素標記數量和位置不確定，生產成本高以及適用范圍窄的問題。為了實現發明目的，所述捕獲探針的制備方法包括以下步驟A.根據待捕獲核酸片段的核酸序列信息，得到至少一個帶有插入片段的DNA克隆載體；B.以DNA克隆載體為原料，利用生物素標記數量和位置確定的擴增引物或接頭元件制備捕獲探針。其中，所述步驟A中DNA克隆載體，當其數量大于等于2時，則DNA克隆載體所包含的各插入片段之間疊加后能形成完整的待捕獲核酸片段。優選的，所述步驟B利用生物素標記數量和位置確定的擴增引物制備捕獲探針， 包括以下步驟BI.片段化處理DNA克隆載體，得到DNA克隆載體片段；B2.在DNA克隆載體片段兩端接上接頭，得到帶接頭的DNA克隆載體片段；B3.利用生物素標記數量和位置確定的擴增引物對帶接頭的DNA克隆載體片段進行擴增，得到擴增產物；B4.分離提純擴增產物，得到生物素標記數量和位置確定的捕獲探針。優選的，所述步驟B利用生物素化標記數量和位置確定的接頭元件制備捕獲探針，包括以下步驟BI’ .通過DNA克隆載體培養增殖，得到足量的DNA克隆載體群；B2’ .片段化處理DNA克隆載體群，得到DNA克隆載體片段；B3’.在DNA克隆載體片段兩端接上生物素標記數量和位置確定的接頭元件，得到帶生物素標記接頭的DNA克隆載體片段；B4’.分離提純帶生物素標記接頭的DNA克隆載體片段，得到生物素標記數量和位置確定的捕獲探針。其中，上述兩種優選實現方式中，所述DNA克隆載體片段的大小優選在 IOO-IOOObp 之間。優選的，所述分離提純擴增產物或分離提純帶生物素標記接頭的DNA克隆載體片段，通過表面帶有鏈霉親和素或親和素修飾的微珠實現。 更優選的，所述微珠包括但不限于磁珠、玻璃珠或塑料珠。其中，若上述步驟A中的DNA克隆載體數量大于等于2時，則插入片段相互之間疊加能形成完整的待捕猶核Ife片段。為了更好的實現發明目的，所述一種基于上述方法制備的捕獲探針進行核酸片段捕獲的方法包括以下步驟Ml.片段化處理源核酸得到源核酸片段庫；M2.利用基于上述方法制備的捕獲探針與源核酸片段庫混合雜交，捕獲目標核酸片段。其中，所述步驟Ml中源核酸片段大小在IOO-IOOObp之間。優選的，所述步驟Ml還包括對得到的源核酸片段庫進行擴增的步驟。優選的，所述步驟M2之后還包括步驟M3.變性解離捕獲的目標核酸片段，形成片段文庫。為了進一步闡述本發明的意義，本發明還提供一種利用上述方法所捕獲的核酸片段進行基因測序的方法，所述方法包括以下步驟Pl.利用上述方法所捕獲的核酸片段形成的片段文庫中加入引物進行擴增，得到捕獲片段擴增產物；P2.分離提純捕獲片段擴增產物，形成測序文庫；P3.利用測序文庫進行測序，得到所捕獲核酸片段的基因序列。其中，所述步驟Pl中的引物是帶生物素標記的擴增引物。優選的，所述步驟P2中，采用鏈霉親和素或親和素修飾的微珠進行分離提純。由上述可知，本發明所述捕獲探針的制備及其應用方法，在制備過程中利用生物素標記數量和位置確定的擴增引物或接頭元件進行捕獲探針上生物素標記的控制，提高生物素標記的效率，降低生產成本；利用DNA克隆載體帶入與待捕獲核酸片段互補或部分互補的片段進行捕獲探針的制備，進一步降低生產成本；此外，通過連續且相鄰之間有重疊部分的插入片段設計，適用范圍廣，使得制備的捕獲探針能實現對任意目標區域而不僅僅是外顯子區域的核酸片段的捕獲。
圖I是本發明一個實施例中捕獲探針的制備方法流程圖；圖2是本發明一個具體實施例中以DNA克隆載體為原料，利用生物素標記數量和位置確定的擴增引物制備捕獲探針的方法流程圖；圖3是本發明另一個具體實施例中以DNA克隆載體為原料，利用生物素標記數量和位置確定的接頭元件制備捕獲探針的方法流程圖；圖4是本發明一個實施例中基于圖I所示方法制備的捕獲探針進行核酸片段捕獲的方法流程圖；圖5是本發明一個實施例中基于圖4所示方法所捕獲的核酸片段進行基因測序的方法流程圖；圖6是本發明利用BAC DNA克隆載體制備捕獲探針用以捕獲核酸片段并制備成測序文庫進行基因測序的方法示意圖。
具體實施例方式為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發明進行進一步詳細說明。本發明提供了一種捕獲探針的制備方法，包括以下步驟首先根據標準核酸序列庫中待捕獲核酸片段的核酸序列信息，將其分成連續且相鄰之間有重疊部分的片段，長度為10 300kb，其長度可視選用的DNA克隆載體而定，得到至少一個帶有插入片段的DNA克隆載體。若DNA克隆載體多于一個，則其內的各插入片段相互疊加能形成完整的待捕獲核酸片段。然后以得到的DNA克隆載體為原料，利用生物素標記數量和位置確定的擴增引物或接頭元件制備捕獲探針。該制備方法的優點在于在捕獲探針制備過程中利用生物素化數量和位置都確定的擴增引物或接頭元件進行數量和位置確定的生物素標記，可以提高捕獲探針生物素標記的效率，降低生產成本，便于后續的應用；通過DNA克隆載體引入與待捕獲核酸片段互補或部分互補的片段進行捕獲探針的制備，進一步降低生產成本；通過相互疊加能形成完整的待捕獲核酸片段的插入片段設計，適用范圍廣，使得制備的捕獲探針能實現對目標區域而不僅僅是外顯子區域的核酸片段的捕獲。圖I示出了本發明一個實施例中制備捕獲探針的方法流程，該方法包括S101.根據待捕獲核酸片段的核酸序列信息，得到至少一個帶有插入片段的DNA 克隆載體；S102.以DNA克隆載體為原料，利用生物素標記數量和位置確定的擴增引物或接頭元件制備捕獲探針。需要說明的是步驟SlOl中，根據待捕獲核酸片段，從標準序列庫中找到與之對應匹配的核酸序列信息，并根據找到的核酸序列信息，將其分成連續且相鄰之間有重疊部分的片段，長度為 10 300kb，其長度可視選用的DNA克隆載體而定，得到至少一個帶有插入片段的DNA克隆載體。所述DNA克隆載體，是指能容納外源DNA作為插入片段的克隆載體，較為常見的， 包括但不限于細菌人工染色體(Bacterial Artificial Chromosome, BAC)、酵母人工染色體(Yeast Artificial Chromosome, YAC)、Pl 派生人工染色體(PlDerived Artificial
6Chromosome,PAC)和哺乳動物人工染色體(Mammal Artificial Chromosome,MAC)。作為插入片段的外源DNA，優選20kb 300kb的DNA片段。本發明中，若待捕獲核酸片段大小在單個DNA克隆載體能夠克隆的范圍之內，則只需I個DNA克隆載體即可；若待捕獲核酸片段大小超出單個DNA克隆載體的克隆能力范圍，則需要多個DNA克隆載體。DNA克隆載體的插入片段與待捕獲核酸片段之間是互補結合關系，存在多個DNA克隆載體時，其內的插入片段是連續且相鄰之間有重置部分，置加后能形成完整的待捕獲核酸片段。DNA克隆載體的獲取，可以通過相應的載體構建公司購買，也可以自行構建。構建載體的技術，是現有技術中常見而且十分成熟的，主要利用如下步驟進行DNA克隆載體的構建(I)將已知的與待捕獲核酸片段相匹配的標準序列裂解成10 300kb的DNA片段， 并將其插入到克隆空載體中，得到DNA克隆載體；(2)利用末端測序或Southern blot方法對DNA克隆載體進行篩選，得到含有目的片段的DNA克隆載體。步驟S102開始之前，若DNA克隆載體量少，不足以支持后續的操作時，可對其進行增殖以獲取足夠的載體量。步驟S102利用生物素標記數量和位置確定的擴增引物或接頭元件，通過一系列操作將DNA克隆載體中的插入片段制備成特定位置帶特定數量的生物素標記的捕獲探針。 其中，生物素標記數量和位置確定，主要是指在設計與合成擴增引物和接頭元件的時候，根據不同的需要，在擴增引物和接頭元件的不同位置標記上不同的生物素數量，然后這些擴增引物會在后續的擴增反應中完成對捕獲探針生物素數量和位置的控制，而接頭元件則可以通過與DNA克隆載體片段連接的過程中實現對捕獲探針生物素數量和位置的控制。對于圖I所示的本發明的技術方案，下面將給出具體實施例加以詳細闡述。在步驟SlOl的一個實施例中，步驟SlOl具體實施如下在本步驟的一個實施方式中，利用BAC DNA克隆載體，以人類白細胞抗原(human leukocyte antigen, HLA)作為待捕獲核酸片段。從標準序列庫中找到HLA基因的核酸序列并進行片段劃分，根據其序列選擇并得到BAC DNA克隆載體。HLA是人類的主要組織相容性復合體，位于人類第6號染色體短臂上6p21. 3，全長為4000Kb。以每個BAC DNA克隆載體容納150Kb的插入片段進行計算，因此可選擇采用數量> 27的BAC DNA克隆載體，本實施例中采用28個BAC DNA克隆載體用于制備捕獲探針，進行HLA核酸片段的捕獲。對于確定的BAC DNA克隆載體，通過載體構建公司訂購獲取。在本步驟的另一個實施方式中，利用YAC DNA克隆載體，以DMD基因(X連鎖隱性遺傳病基因)作為待捕獲核酸片段。從標準序列庫中找到DMD基因的核酸序列并進行片段劃分，根據其序列選擇并確定BAC DNA克隆載體。DMD基因位于人類X染色體短臂Xp21上， 全長為2500kb。以每個YAC DNA克隆載體容納250Kb的插入片段進行計算，采用11個YAC DNA克隆載體用于制備捕獲探針，進行DMD基因的捕獲。對于確定之后的YAC DNA克隆載體，為了節省時間，可直接由載體構建公司訂購獲得。在本步驟的另一個實施方式中，利用PAC DNA克隆載體，對乳腺癌易感基因中的 BRCAl基因進行捕獲。首先從標準核酸序列庫中找到BRCAl基因的核酸序列信息，然后根據其序列信息確定PAC DNA克隆載體。BRCAl基因位于人類17號染色體長臂17q21上，基因全長約為100Kb。根據PAC DNA克隆載體的容納能力，直接采用I個PAC DNA克隆載體制備成捕獲探針即可對BRCAl基因進行捕獲。以上實施方式的有益效果是通過不同種類以及不同數量的DNA克隆載體對待捕獲核酸片段進行直接覆蓋，制備成捕獲探針，從而可以獲取待捕獲核酸的全長片段；通過 DNA克隆載體的形式引入插入片段作為后續待捕獲核酸片段的捕獲探針的制備原料，而不是直接合成，降低生產成本。應當說明的是，以上實施例僅是步驟SlOl的其中一些實施方式，并不用以限制本發明的保護范圍。步驟S102中以DNA克隆載體為原料，利用生物素標記數量和位置確定的擴增引物或接頭元件制備捕獲探針，實現對捕獲探針數量和位置確定的生物素標記，可以采用多種方法實現，既利于實際應用中的操作，又通過對數量和位置的控制實現成本的降低和標記效率的提高。以下將結合附圖以及具體實施例進行詳細說明。圖2給出了步驟S102以DNA克隆載體為原料，利用生物素標記數量和位置確定的擴增引物或接頭元件制備成捕獲探針的一種方法流程，該方法包括S1021.片段化處理DNA克隆載體，得到DNA克隆載體片段；S1022.在DNA克隆載體片段兩端接上接頭，得到帶接頭的DNA克隆載體片段；S1023.利用生物素標記數量和位置確定的擴增引物對帶接頭的DNA克隆載體片段進行擴增，得到擴增產物；S1024.分離提純擴增產物，得到生物素標記數量和位置確定的捕獲探針。本方法的優點在于利用特定位置帶有特定數量生物素標記的擴增引物實現對捕獲探針進行標記數量及位置的可控生物素標記，實現對生產過程的控制，提高生物素標記效率，降低生產成本；同時還可以對接上接頭之后的DNA克隆載體片段進行擴增，實現捕獲探針數量增加的目的。需要說明的是步驟S1021開始之前，對DNA克隆載體進行培養增殖，以便達到后續擴增反應所需的模板鏈需求。步驟S1021中，對于DNA克隆載體進行片段化處理的方法包括但不限于霧化、超聲破碎、機械剪切破碎、酶切片段化、化學以及熱誘導片段化。在DNA克隆載體片段化之后，根據捕獲的需要進行片段的分離純化，本發明所需的DNA克隆載體片段大小優選為100-1000bp。此外為了便于接頭的連接，需要對分離純化得到的片段進行磷酸化以及末端補平修飾。步驟S1023中，帶生物素標記的擴增引物是指在設計合成的時候，根據不同的需要對帶生物素標記的堿基位置和數量進行控制，且擴增引物的序列與步S1022中的接頭序列互補或部分互補。通過對擴增引物上的生物素標記的數量和位置進行控制，從而在后續的擴增反應中將這種控制傳遞到捕獲探針上，實現對捕獲探針的生物素標記數量和位置的控制。步驟S1024中，利用帶生物素標記擴增引物進行擴增能夠得到帶生物素標記的擴增產物這一特性，采用表面帶有鏈霉親和素或親和素修飾的微珠分離提純產物。進一步的，所述微珠包括但不限于磁珠、玻璃珠或塑料珠。進一步的，分離純化步驟之后需要進行變性解離形成單鏈的操作。
對于圖2所示的本發明的技術方案，下面將給出具體實施例加以詳細闡述。在步驟S1021的一個實施例中，步驟S1021具體實施如下培養28個BAC DNA克隆載體進行增殖，使得載體中所含的插入片段達到能夠進行一般擴增反應所需模板的數量。采用超聲破碎的方法對BAC DNA克隆載體進行片段化處理，操作條件為430-440W 功率，超聲破碎5 10s，重復40次。破碎后得到的片段混合物利用I %瓊脂糖凝膠進行分離純化,切膠回收IOO-IOOObp大小的片段，為保證回收產物的純度，利用純化柱對回收產物再次純化回收得到BAC DNA片段。為了便于后續的接頭連接，對BAC DNA片段進行磷酸化和末端補平修飾，本實施例中具體操作如下BAC DNA片段溶液，20μ L ;10mM dNTP，I. 5 μ L ;T4DNA聚合酶(5U/μ L)， I μ L ；Klenow DNA 聚合酶(lOU/μ L)，0· I μ L ；Τ4 多核苷酸激酶(10U/μ L)，O. 5 μ L ；10mM ATP，I. 5 μ L ；T4DNA連接緩沖液，10 μ L ;加ddH20至100 μ L，25°C孵育45min,反應結束后利用回收試劑盒進行純化回收。應當說明的是，本實施例僅是步驟S1021中的其中一種實施方式，并不用以限制本發明的保護范圍。在步驟S1022的一個實施例中，步驟S1022具體實施如下經補平修飾后的BAC DNA片段進行接頭連接反應，連接體系為補平后的BAC DNA片段溶液，50 μ L ;接頭溶液，5 μ L ；T4DNA連接酶(5U/μ L) ,IOyL ；10XT4DNA連接酶 buffer, 20 μ L ；4XPEG6000 (m/V, 30% )，50 μ L ；10mM ATP, 25 μ L ;加 ddH20 至 200 μ L，16°C 連接過夜，連接產物以回收試劑盒純化回收，得到帶接頭的BAC DNA片段。應當說明的是，本實施例僅是步驟S1022中的其中一種實施方式，并不用以限制本發明的保護范圍。在步驟S1023的一個實施例中，步驟S1023具體實施如下在本步驟的一個實施方式中，為了便于標記和分離提純，設計并合成5’末端帶雙生物素標記的擴增引物，利用該擴增弓I物對帶接頭的BAC DNA片段進行擴增，該擴增引物與接頭序列完全互補。該實施方式的優點在于直接在5’末端進行雙生物素標記，標記數量和位置容易控制，簡單易得，也便于后續應用中分離提純時減少空間位阻效應。在本步驟的另一個實施方式中，為了實現結合的牢固穩定，設計并合成序列中間位置堿基帶雙生物素標記的擴增引物，利用該擴增引物對帶接頭的BAC DNA片段進行擴增， 該擴增引物與接頭序列完全互補。該實施方式的優點在于生物素化標記位置在擴增引物序列中間，能夠使得后續分離提純操作時結合更加穩定牢固。在本步驟的一個實施方式中，為了兼顧成本和結合的穩定程度，設計并合成距5’ 末端差3的位置處堿基帶單生物素標記的擴增引物，利用該擴增引物對帶接頭的BAC DNA 片段進行擴增，該擴增引物與接頭序列部分互補。該實施方式的優點在于可以減少擴增引物的堿基個數，又不影響與接頭的結合穩定程度。擴增引物結合到接頭上之后，可以應用現有技術中一般的液相擴增如聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)或固液兩相擴增方法對其進行擴增。為保證擴增產物的單一性和純度，優選使用可以實現單分子擴增的固液兩相擴增方法，如微乳液 PCR(emulsion PCR，ePCR)以及橋式PCR等。在本步驟的一個實施方式中，采用典型的ePCR擴增方法，先將一端的擴增引物固定于磁珠上，另一端引物位于水相溶液中，然后水相與油相混合制備成乳濁液體系，實現擴增反應在相互隔離的封閉小液滴中進行單分子擴增。 上述 ePCR 具體步驟可參考文獻BEAMing :single_molecule PCR on microparticles in water-in-oil emulsions, Frank Diehl, Meng Li, Yiping He, nature methods, Vol.3, No. 7，July 2006。在本步驟的另一個實施方式中，采用一般的PCR擴增反應，準備過程簡單，擴增體系為4 μ L帶接頭的BAC DNA片段；上、下游兩端所述擴增引物各lyL;10mM dNTPs,2yL ； Taq酶(5U/ μ L)，I μ L ； 10 X buffer, 10 μ L ;加ddH20至100 μ L。擴增反應按照如下程序進95 °C 5min ；95°C 30s, 55°C 30s, 72°C 30s, 15cycles ；72 °C 5min。擴增產物利用試劑盒純化回收，TE重懸。應當說明的是，以上所述僅是步驟S1023中的一些具體實施方式
，并不用以限制本發明的保護范圍。在步驟S1024的一個實施例中，步驟S1024具體實施如下在本步驟的一個實施方式中，根據之前擴增反應中帶有生物素標記的擴增引物， 得到帶生物素標記的擴增產物，因此利用表面帶有鏈霉親和素修飾的磁珠對擴增產物進行分離純化。以磁鐵吸附磁珠，然后用TE緩沖液輕微沖洗數遍，得到純化的擴增產物。擴增產物分離純化后，利用0. IM的NaOH清洗3次，使其解旋形成單鏈,洗脫緩沖液清洗3次，然后TE重懸保存。在本步驟的另一實施方式中，擴增產物以1%瓊脂糖凝膠進行電泳，然后切割所需范圍內的目的條帶純化回收，再利用純化柱對回收產物再次純化回收得到BAC DNA片段，也可實現擴增產物的分離純化。應當說明的是，以上實施方式僅是步驟S1024中的一些具體實施方式
，并不用以限制本發明的保護范圍。圖3示出了圖I步驟S102以DNA克隆載體為原料，利用生物素標記數量和位置確定的擴增引物或接頭元件制備捕獲探針的另一種方法流程，該方法包括S1021’ .通過DNA克隆載體培養增殖，得到足量的DNA克隆載體群；S1022’ .片段化處理DNA克隆載體群，得到DNA克隆載體片段；S1023’ .在DNA克隆載體片段兩端接上生物素標記數量和位置確定的接頭元件， 得到帶生物素標記接頭的DNA克隆載體片段；S1024’ .分離提純帶生物素標記接頭的DNA克隆載體片段，得到生物素標記數量和位置確定的捕獲探針。本方法的優點在于利用特定位置帶有特定數量生物素標記的接頭元件，直接得到生物素標記數量和位置確定的捕獲探針，提高生物素化標記效率，簡化標記步驟，降低生產成本；直接通過培養DNA克隆載體增殖得到足量的插入片段，制備足量的捕獲探針，不需要再經過擴增步驟，更不需要通過在芯片上合成的方式制備捕獲探針，進一步降低生產成本。
對此方法需要說明的是步驟S1021’中，直接利用DNA克隆載體進行培養增殖，是指利用人工染色體的特性，直接進行克隆載體的培養篩選，得到足量的克隆載體群，從而可以不用進行擴增就可以得到足量的捕獲探針制備材料。步驟S1022’中，對于DNA克隆載體群的片段化處理方法包括但不限于霧化、超聲破碎、機械剪切破碎、酶切片段化、化學以及熱誘導片段化。在DNA克隆載體片段化之后，根據捕獲的需要進行片段的分離純化，本發明所需的DNA克隆載體片段大小優選為100-1000bp。此外為了便于接頭的連接，需要對分離純化得到的片段進行磷酸化以及末端補平修飾。步驟S1023’中，根據不同的目的，在設計合成接頭元件時對生物素化標記的位置以及數量進行控制，然后通過在DNA克隆片段兩端接上接頭元件時將這種控制傳遞到捕獲探針，從而在制備過程中實現對捕獲探針的可控生物素標記。所述接頭元件包括但不限于常見的平末端接頭、突出末端接頭、帶莖環結構的接頭、分叉接頭。其中，所述平末端接頭是雙鏈完全互補的核酸分子。其中，所述突出末端接頭是雙鏈核酸分子，雙鏈核酸分子的一個末端為平末端，另一末端為突出末端。突出末端的堿基數無具體限制，優選為I到10個堿基之間。所述帶莖環結構的接頭是單鏈核酸分子，包括莖環區域和互補配對區域。所述分叉接頭是雙鏈核酸分子，包括互補區和分叉區。步驟S1024’中，針對帶有生物素標記的接頭元件，通過表面帶有鏈霉親和素或親和素修飾的微珠直接對接頭連接產物進行分離純化。進一步的，所述的微珠包括但不限于磁珠、玻璃珠或塑料珠。更進一步的，純化的產物進行變性解離形成單鏈捕獲探針。對于圖3所示本發明的技術方案，下面將給出具體實施例加以詳細闡述。在步驟S1021’的一個實施例中，步驟S1021’具體實施如下利用LB液體培養基對訂購回來的BAC DNA克隆載體進行分別培養，得到足量的 BAC DNA克隆載體群，回收提純BAC DNA。應當說明的是，本實施方案僅是步驟S1021’中的一個具體實施方式
，并不用以限制本發明的保護范圍。在步驟S1022’的一個實施例中，步驟S1022’具體實施如下采用超聲破碎的方法對BAC DNA進行片段化處理，操作條件為430-440W功率，超聲破碎5 10s，重復50次。破碎后得到的片段混合物利用I %瓊脂糖凝膠進行分離純化， 切膠回收100-1OOObp大小的片段，為保證回收產物的純度，利用純化柱對回收產物再次純化回收得到BAC DNA片段。為了便于后續的接頭連接，對BAC DNA片段進行磷酸化和末端補平修飾，本實施例中具體操作如下BAC DNA片段溶液，20μ L ;10mM dNTP，I. 5 μ L ;T4DNA聚合酶(5U/μ L)， I μ L ；Klenow DNA 聚合酶(10U/ μ L)，O. I μ L ;Τ4 多核苷酸激酶(10U/ μ L) O. 5 μ L ; IOmM ATP，I. 5 μ L ；Τ4 DNA連接緩沖液，IOyL ;加ddH20至100 μ L，25°C孵育lh，反應結束后利用回收試劑盒進行純化回收。
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應當說明的是，本實施方案僅是步驟S1022’中的一個具體實施方式
，并不用以限制本發明的保護范圍。在步驟S1023’的一個實施例中，步驟S1023’具體實施如下在本步驟的一個實施方式中，為了簡便易行，減少空間位阻效應，設計并合成了 5’ 末端帶雙生物素標記的平末端接頭，然后利用該平末端接頭與經過補平修飾的BAC DNA片段進行連接，從而實現制備過程中控制捕獲探針的生物素標記。本實施方式的優點在于直接在平末端接頭5’末端帶上雙生物素標記，簡便易行，還能減少后續操作中的空間位阻效應。在本步驟的另一個實施方式中，為了使生物素標記與相應物質的結合穩定，且避免接頭自連現象的發生，設計并合成了互補區中間位置堿基帶雙生物素標記的分叉接頭， 利用該接頭與經過補平修飾的BAC DNA片段兩端連接，實現制備過程中捕獲探針生物素標記的控制。該實施方式的優點在于接頭元件中間位置進行雙生物素化標記，可以使后續的分離純化中與微珠的結合更加穩定；同時分叉接頭還能防止在連接反應中出現接頭自連的現象。上述接頭元件與BAC DNA片段兩端的連接體系為補平后的BAC DNA片段溶液，50 μ L ;所述生物素標記數量和位置確定的接頭溶液，5 μ L ;T4 DNA連接酶(5U/μ L)， 10μ L ；10XT4 DNA 連接酶 buffer，20 μ L ;4XPEG6000 (m/V，30 % ), 50 μ L ；10mM ATP, 25 μ L ;加ddH20至200 μ L，16°C連接24h，連接產物以回收試劑盒純化回收，得到帶生物素標記接頭的BAC DNA片段。應當說明的是，上述實施方案僅是步驟S1023’中的其中一些具體實施方式
，并不用以限制本發明的保護范圍。在步驟S1024’的一個實施例中，步驟S1024’具體實現如下利用表面帶有鏈霉親和修飾的磁珠對帶有生物素標記接頭的BAC DNA克隆片段進行分離純化，利用磁鐵吸附磁珠，然后TE緩沖液進行輕微沖洗數遍，最后TE重懸。分離純化的產物再利用O. IM的NaOH過洗數次，使得連在磁珠上的雙鏈BAC DNA 片段變性解離成單鏈，洗脫緩沖液清洗2次，TE重懸，形成最終的特定位置帶有特定數量生物素標記的捕獲探針。應當說明的是，本實施方案僅是步驟S1024’中的其中一個具體實施方式
，并不用以限制本發明的保護范圍。圖4示出了本發明一個實施例中基于圖I所示方法制備的捕獲探針進行核酸片段捕獲的方法流程，該方法包括S201.根據待捕獲核酸片段的核酸序列信息，得到至少一個帶有插入片段的DNA 克隆載體；S202.以DNA克隆載體為原料，利用生物素標記數量和位置確定的擴增引物或接頭元件制備捕獲探針。S203.片段化處理源核酸得到源核酸片段庫；S204.將已制備好的捕獲探針與源核酸片段庫混合雜交，捕獲待捕獲核酸片段。本發明的優點在于利用基于圖I所示方法制備的捕獲探針進行核酸片段的捕獲，既在捕獲探針的制備過程中進行特定位置帶特定數量的生物素標記控制，提高生物素標記的效率，又可以通過DNA克隆載體引入捕獲探針的制備降低生產成本，還可以實現對任意目標區域而不僅僅是外顯子區域的核酸片段的捕獲。需要說明的是步驟S201與步驟S202按照之前圖示所述步驟進行，在此不再贅述。步驟S203中，所述源核酸可以是任意來源的核酸，包括但不限于基因組DNA、RNA、 核酸大片段、線粒體DNA或質粒DNA。片段化的方法根據所需要的片段大小選取常用方法中的任意一種，包括但不限于霧化、超聲破碎、機械剪切破碎、酶切片段化、化學以及熱誘導片段化。在所述源核酸片段化處理之后，還包括對源核酸片段進行分離純化。根據測序的片段長度需要，對于片段化得到的DNA片段，需要進行目的DNA片段的分離純化，本發明所需要的片段大小優選在IOO-IOOObp之間。片段分離方法可采用凝膠方法、蔗糖梯度或氯化銫梯度沉降、柱層析分離等常用方法。分離提純源核酸片段之后，為了得到更多拷貝數量的源核酸片段，可以對分離提純產物進一步進行擴增。步驟S204中，利用已制備的捕獲探針捕獲目標核酸片段后，為了便于后續的進一步應用，還可以對捕獲的待捕獲核酸片段進行變性解離，形成單鏈核酸片段文庫。對于圖4所示的本發明的技術方案，下面將給出具體實施例加以詳細闡述。以HLA作為待捕獲核酸片段為例，利用BAC DNA克隆載體制備數量和位置確定的生物素化標記捕獲探針。步驟S201和步驟S202可以通過多種方式實現，其中一些具體實施方式
和操作已在前面圖示中進行過詳細描述，在此不再進行贅述。在步驟S203的一個實施例中，步驟S201具體實施如下源核酸選用包含有HLA整體的大片段DNA，通過Sau3AI/HinfI又雙酶切的方法進行片段化處理，酶切體系為大片段DNA5μ g ；Sau3AI/HinfI 各 100U ;10 X enzyme buffer 20 μ L ；加ddH20 至 200μ L，37°C酶切 2h。得到的酶切片段混合物利用I %瓊脂糖凝膠進行分離純化，選擇IOO-IOOObp大小的片段切膠回收，得到所需要的源核酸片段。本實施例使用雙酶切體系，能夠保證隨即酶切得到的片段長度更加均勻。應當說明的是，本實施方案僅是步驟S203中的其中一個具體實施方式
，并不用以限制本發明的保護范圍。在步驟S204中的一個實施例中，步驟S204具體操作如下40 μ L源核酸片段庫溶液95°C加熱Imin,然后置于冰中迅速冷卻，加入到50 μ L 捕獲探針溶液中，再加入2μ L Salmon sperm DNA，加ddH20至100 μ L，65°C雜交36 72h ; 反應結束后，先用含有O. I % SDS的IX檸檬酸鈉緩沖液(salt-sodium citrate, SSC)在 15 25°C條件下清洗雜交產物15min ;然后繼續用含有O. 1% SDS的1乂33(在651條件下，清洗雜交產物15min，重復3次。捕獲目標核酸片段后，還包括對其進行解離釋放的步驟，具體為向雜交產物中加入20 μ L O. IM的NaOH，15 25°C作用lOmin，然后去除連接有捕獲探針的微珠，再向液體中加入1.2yL 20%的乙酸保存所捕獲的源核酸片段庫。應當說明的是，本實施方案僅是步驟S204中的其中一個具體實施方式
，并不用以限制本發明的保護范圍。圖5示出了本發明一種基于圖4所示方法捕獲的核酸片段進行基因測序的方法流程，該方法包括S301.在捕獲核酸片段形成的片段文庫中加入引物進行擴增，得到捕獲片段擴增產物；S302.分離提純捕獲片段擴增產物，形成測序文庫；S303.利用測序文庫進行測序，得到所捕獲核酸片段的基因序列。本發明所述技術方案的優點在于利用DNA克隆載體制備成的帶生物素化標記的捕獲探針捕獲得到的目標核酸片段擴增形成測序文庫，可以實現對特定核酸片段的序列進行分析，實現對其功能的解析。對上述技術方案需要說明的是步驟S301中加入的引物，可以是普通的擴增引物，優選為帶生物素標記的擴增引物。進一步的，所述擴增可以是液相擴增，如普通的PCR;也可以是固液兩相擴增，如 ePCR。步驟S302中，所述分離提純，根據加入的擴增引物為帶生物素標記的擴增引物， 優選利用表面帶有鏈霉親和素修飾的微珠進行分離純化。步驟S303中，所述測序是指利用堿基互補原則，對待測序文庫進行序列檢測，從而得到所捕獲片段的基因序列。所用測序方法包括但不限于常見的Sanger測序法、454焦磷酸測序法、ABI的Solid測序法、Illumina的Solexa測序法或Pstar系列的連接測序法和配對末端測序法。對于圖5所示的本發明的技術方案，下面將給出具體實施例加以詳細闡述。在步驟S301的一個實施例中，步驟S301具體實現如下在捕獲核酸片段形成的BAC DNA片段文庫中加入帶生物素標記的引物，擴增的 PCR反應體系為片段文庫溶液40 μ LUOXbuffer 30 μ LUOmM dNTP3 μ L、上下游兩端引物各3 μ L、Taq酶3 μ L (5U/ μ L)，ddH20加至300 μ L。擴增反應程序為94°C 2min ；94°C 10s，57°C 10s,72°C 20s, 15cycles ；72°C 5min。應當說明的是，本實施方案僅是步驟S301中的其中一個具體實施方式
，并不用以限制本發明的保護范圍。 在步驟S302的一個實施例中，步驟S302具體實施如下利用表面帶有鏈霉親和修飾的磁珠對帶生物素標記擴增產物進行分離純化，利用磁鐵吸附磁珠，然后TE緩沖液進行輕微沖洗數遍，最后TE重懸。分離純化的帶生物素標記擴增產物再經過O. IM的NaOH數次過洗，使得連在磁珠上的雙鏈帶生物素標記擴增產物變性解離成單鏈，洗脫緩沖液清洗2次，TE重懸形成測序文庫。應當說明的是，本實施方案僅是步驟S302中的其中一個具體實施方式
，并不用以限制本發明的保護范圍。在步驟S303的一個實施例中，步驟S303具體實施如下利用Pstar測序系統，對測序文庫進行測序，具體操作包括點樣將測序文庫中的待測樣品與測序buffer混合，在制備好并放置于容器內的固相載體上進行點樣。固定樣品利用錫箔紙將放有已經點好樣的固相載體的容器包住避光，室溫下固定 16h。上樣測序固定結束之后的固相載體，用TE溶液洗滌，并用ddH20進行過洗。將洗滌過的固相載體裝入測序小室中，進行基因測序，收集熒光信號。應當說明的是，本實施方案僅是步驟S303中的其中一個具體實施方式
，并不用以限制本發明的保護范圍。圖6示出了本發明利用BAC DNA克隆載體制備捕獲探針用以捕獲核酸片段并制備成測序文庫進行基因測序的方法示意圖。該圖直觀的展示了利用BAC DNA克隆載體制備捕獲探針用以捕獲核酸片段并制備成測序文庫進行基因測序的過程步驟I.根據待捕獲核酸片段的核酸序列信息，得到至少一個帶有插入片段的BAC DNA克隆載體。根據待捕獲的目標核酸HLA片段，采用28個BAC DNA克隆載體，該28個BAC DNA克隆載體的插入片段彼此之間有重疊區域，疊加之后能形成完整的待捕獲核酸HLA片段。通過載體構建公司直接獲取該28個BAC DNA克隆載體。步驟2.以BAC DNA克隆載體為原料，利用生物素標記數量和位置確定的擴增引物或接頭元件制備捕獲探針。利用超聲破碎的方式對BAC DNA克隆載體進行片段化處理，I % 凝膠分離純化大小在IOO-IOOObp之間的BAC DNA片段，然后進行磷酸化和末端補平修飾。 修飾后的BAC DNA片段兩端接上接頭一，并加入生物素標記數量和位置確定的擴增引物進行擴增，利用磁珠對擴增產物進行分離提純。純化產物以NaOH進行變性解離形成單鏈，得到帶生物素標記的捕獲探針。步驟3.片段化處理包含有HLA在內的大片段DNA，得到的片段接上接頭二進行擴增形成待捕獲的DNA片段文庫。利用Sau3AI和HinfI對大片段DNA進行雙酶切處理，凝膠分離純化大小在IOO-IOOObp之間的DNA片段。提取的DNA片段經過磷酸化和末端補平修飾后，接上接頭，并加入擴增引物進行擴增得到待捕獲的DNA片段文庫。步驟4.將制備好的帶生物素標記的捕獲探針與待捕獲的DNA片段文庫混合雜交， 捕獲HLA片段。首先將待捕獲的DNA片段文庫95°C加熱lmin，然后迅速冷卻，將其加入至捕獲探針溶液中，加入其它雜交輔助試劑，65°C孵育雜交48h，捕獲DNA片段文庫中屬于HLA 的片段。利用磁鐵對捕獲產物進行分離，然后變性解離捕獲得到的HLA片段。步驟5.利用捕獲得到的HLA片段制備測序文庫。利用與原擴增引物序列互補的擴增引物對捕獲得到的HLA片段進行再次擴增，對擴增產物進行提純，然后接上接頭三，形成測序文庫。步驟6.將測序文庫中的樣品進行點樣固定，上樣至測序儀，獲取測序樣品的基因序列。
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應當說明的是，本發明對捕獲探針制備的方法典型的應用但不限于捕獲探針制備，任何其他類似的應用均應包含在本發明的保護范圍之內。以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
權利要求
1.一種捕獲探針的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟A.根據待捕獲核酸片段的核酸序列信息，得到至少一個帶有插入片段的DNA克隆載體；B.以DNA克隆載體為原料，利用生物素標記數量和位置確定的擴增引物或接頭元件制備捕獲探針。
2.根據權利要求I所述的捕獲探針的制備方法，其特征在于，所述步驟B利用生物素標記數量和位置確定的擴增引物制備捕獲探針，包括以下步驟BI.片段化處理DNA克隆載體，得到DNA克隆載體片段；B2.在DNA克隆載體片段兩端接上接頭，得到帶接頭的DNA克隆載體片段；B3.利用生物素標記數量和位置確定的擴增引物對帶接頭的DNA克隆載體片段進行擴增，得到擴增產物；B4.分離提純擴增產物，得到生物素標記數量和位置確定的捕獲探針。
3.根據權利要求I所述的捕獲探針的制備方法，其特征在于，所述步驟B利用生物素化標記數量和位置確定的接頭元件制備捕獲探針，包括以下步驟BI’ .通過DNA克隆載體培養增殖，得到DNA克隆載體群；B2’ .片段化處理DNA克隆載體群，得到DNA克隆載體片段；B3’.在DNA克隆載體片段兩端接上生物素標記數量和位置確定的接頭元件，得到帶生物素標記接頭的DNA克隆載體片段；B4’.分離提純帶生物素標記接頭的DNA克隆載體片段，得到生物素標記數量和位置確定的捕獲探針。
4.根據權利要求2或3所述的捕獲探針的制備方法，其特征在于，所述DNA克隆載體片段的大小在IOO-IOOObp之間。
5.根據權利要求2或3所述的捕獲探針的制備方法，其特征在于，所述分離提純擴增產物或分離提純帶生物素標記接頭的DNA克隆載體片段，是通過表面帶有鏈霉親和素或親和素修飾的微珠實現的。
6.根據權利要求I所述的捕獲探針的制備方法，其特征在于，若所述步驟A中的DNA克隆載體數量大于等于2時，則插入片段相互之間疊加能形成完整的待捕獲核酸片段。
7.一種基于權利要求I所述方法制備的捕獲探針進行核酸片段捕獲的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟Ml.片段化處理源核酸得到源核酸片段庫；M2.利用基于權利要求I所述方法制備的捕獲探針與源核酸片段庫混合雜交，捕獲目標核酸片段。
8.根據權利要求7所述的核酸片段捕獲的方法，其特征在于，所述步驟Ml中源核酸片段大小在IOO-IOOObp之間。
9.根據權利要求7所述的核酸片段捕獲的方法，其特征在于，所述步驟Ml還包括對得到的源核酸片段庫進行擴增的步驟。
10.根據權利要求7所述的核酸片段捕獲的方法，其特征在于，所述步驟M2之后還包括以下步驟M3.變性解離捕獲的目標核酸片段的片段，形成片段文庫。
11.一種基于權利要求7所述的方法捕獲的核酸片段進行基因測序的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟Pl.利用基于權利要求6所述方法所捕獲的核酸片段形成的片段文庫中加入引物進行擴增，得到捕獲片段擴增產物；P2.分離提純捕獲片段擴增產物，形成測序文庫；P3.利用測序文庫進行測序，得到所捕獲核酸片段的基因序列。
12.根據權利要求11所述的基因測序的方法，其特征在于，所述步驟Pl中的引物是帶生物素標記的引物。
全文摘要
本發明涉及生物樣品的制備與處理，提供了一種捕獲探針的制備方法及其應用。所述捕獲探針的制備方法包括以下步驟A.根據待捕獲核酸片段的核酸序列信息，得到至少一個帶有插入片段的DNA克隆載體；B.以DNA克隆載體為原料，利用生物素標記數量和位置確定的擴增引物或接頭元件制備捕獲探針。本發明所述方法利用DNA克隆載體帶入與待捕獲核酸片段互補或部分互補的片段制備捕獲探針，實現數量和位置確定的生物素標記，降低生產成本，適用范圍廣，使得制備的捕獲探針能夠應用于任意目標區域而不僅僅是外顯子區域核酸片段的捕獲。
文檔編號C40B50/06GK102586229SQ20121004786
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月28日 優先權日2012年2月28日
發明者盛司潼 申請人:盛司潼