用于產生、確認和使用單克隆抗體的方法和系統的制作方法

            文檔序號:3254322閱讀:314來源:國知局
            專利名稱:用于產生、確認和使用單克隆抗體的方法和系統的制作方法
            用于產生、確認和使用單克隆抗體的方法和系統
            交叉引用本申請要求提交于2010年6月16日的美國臨時申請號61/355,329的權益,通過弓I用將該申請整體并入本文。
            關于聯邦資助研究的聲明本發明是在美國政府的支持下基于由國立衛生研究院資助的RR020839和GM076102進行的。政府可享有本發明的某些權利。
            背景技術
            在生物醫學界對于能夠產生具有可能的最高質量、可再現的抗體試劑的可靠技術具有重大需求。該技術路線的持續改進將直接有益于健康研究團體和更大的生物醫學團體。表位、抗原或蛋白質的檢測或結合是服務于學術界和制藥工業的研究產品行業以及診斷和治療行業的一大部分。可利用抗體在檢測表位、抗原或蛋白質中的用途來鑒定新的生物標記并進行許多試驗。例 如,抗體還廣泛用于診斷應用,諸如臨床醫學(例如,ELISA和放射免疫測定系統)。在病理學實驗室中對細胞和組織的分析包括在組織切片上和流式細胞術分析中使用抗體。抗體也可用作治療劑。抗體的生產可能是昂貴且費時的,因此期望更具有成本效益以及耗時較少的高通量抗體(尤其是高度特異性抗體)生產方法。本公開內容滿足了這些需求,并且提供了相關的優點。

            發明內容
            本發明總體上涉及抗體文庫,包括用于生產、產生、表征和利用抗體的方法和系統。抗體可以是高度特異性的。在一些實施方式中,抗體是單克隆抗體。該文庫可以包含多種不同的抗體,其中所述抗體由相同的平臺產生。該文庫可以包含多種不同的抗體,其中在所述多種抗體或多種抗體的子集中,每種抗體都是單特異性抗體;結合其靶蛋白的天然形式;是單克隆抗體;是免疫沉淀抗體;是IgG抗體或IgG同種型抗體;對其靶標具有的結合親和力與所述多種抗體中的另一抗體的結合親和力相似(例如,在至少1%、2%、3%、4%、5%,6%,7%,8%,9%,10%,11%>12%,13%,14%,15%,16%,17%,18%,19%^; 20% 以內);對其靶標具有至少10_7M(Kd)的結合親和力(例如,諸如至少10_8M、10_9M、10_1QM、10_nM、10_12M、10_13M、10_14M、10_15M 或 I(T16M);或其任意組合。可以高重現性地產生該抗體文庫。例如,在第一抗體文庫和第二抗體文庫中,第一和第二文庫包含同一組不同的抗體,且第一文庫的每種抗體具有的結合親和力在第二文庫的相同抗體的結合親和力的至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%或 20% 以內。本發明的一個方面是包含多種不同抗體的抗體文庫,其中所述多種抗體中的至少10%由相同的平臺產生。在一個實施方式中,文庫包含多種不同的抗體,其中所述多種抗體中的至少 20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,95%,99%^; 100%是由相同的平
            臺產生的抗體。由相同的平臺產生的多種抗體中的每種抗體可以是單特異性抗體;結合其靶蛋白的天然形式;是單克隆抗體;是免疫沉淀抗體;是IgG抗體或IgG同種型抗體;對其靶標具有的結合親和力在由相同平臺產生的多種抗體中的另一抗體的結合親和力的至少20%以內,諸如至少 I % >2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9% ,10% ,11% >12% ,13% ,14% ,15%,16%、17%、18%或19%以內;對其靶標具有至少10_7M(KD),諸如至少I(T8M、1(Γ9Μ、I(T10M、10_nM、10_12M、10_13M、10_14M、10_15M 或 10_16M 的結合親和力;或其任意組合。由相同的平臺產生的抗體可包含至少50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900或1000種不同的抗體,其中抗體或抗體的子集可以是單特異性抗體;結合其靶蛋白的天然形式;是單克隆抗體;是免疫沉淀抗體;是IgG抗體或IgG同種型抗體;對其靶標具有的結合親和力在由相同平臺產生的多種抗體中的另一抗體的結合親和力的至少20%以內,諸如至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%或 19% 以內;對其靶標具有至少 KT7M(KD),諸如至少 1(Γ8Μ、1(Γ9Μ、1(Γ10Μ、1(ΓηΜ、1(Γ12Μ、1(Γ13Μ、1(Γ14Μ、I(T15M 或 I(T16M 的結合親和力;或其任意組合。在又一實施方式中,由相同平臺產生的抗體結合人類蛋白質組中的至少0.5%、I 2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9%,10%,11%>12%,13%,14%,15%,16%,17%,18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90%或 100%,其中抗體或抗體的子集可以是單特異性抗體;結合其靶蛋白的天然形式;是單克隆抗體;是免疫沉淀抗體;是IgG抗體或IgG同種型抗體;對其靶標具有的結合親和力在由相同平臺產生的多種抗體中的另一抗體的結合親和力的至少20%以內,諸如至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%或19%以內;對其靶標具有至少 I(T7M,諸如至少 1(Γ8Μ、1(Γ9Μ、1(Γ10Μ、1(ΓηΜ、1(Γ12Μ、1(Γ13Μ、1(Γ14Μ、KT15M 或IO-16M的結合親和力;或其任意組合。由相同平臺產生的抗體可以結合在表5中列出的人類蛋白質中的至少0.5%、I 2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9%,10%,11%>12%,13%,14%,15%,16%,17%,18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90%或 100%,其中抗體或抗體的子集可以是單特異性抗體;結合其靶蛋白的天然形式;是單克隆抗體;是免疫沉淀抗體;是IgG抗體或IgG同種型抗體;對其靶標具有的結合親和力在由相同平臺產生的多種抗體中的另一抗體的結合親和力的至少20%以內,諸如至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%或19%以內;對其靶標具有至少 KT7M (Kd),諸如至少 1(Γ8Μ、1(Γ9Μ、1(Γ10Μ、1(ΓηΜ、1(Γ12Μ、1(Γ13Μ、I(T14M、KT15M或KT16M的結合親和力;或其任意組合。本發明的另一方面是包含多種不同抗體的抗體文庫,其中所述多種抗體的至少10%,諸如至少 20%,30%,40%,50% ,60%,70%,80%,90%,95%,99100%是單特異性抗體。所述多種抗體中的每種單特異性抗體可結合其靶蛋白的天然形式;是單克隆抗體;是免疫沉淀抗體; 是IgG抗體或IgG同種型抗體;對其靶標具有的結合親和力在所述多種抗體中的另一抗體的結合親和力的至少20%以內,諸如至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11 %、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%或 19% 以內;對其革巴標具有至少 KT7M(Kd),諸如至少 1(Γ8Μ、1(Γ9Μ、I(T10M、1(ΓηΜ、I(T12M、I(T13M、I(T14M、KT15M 或IO-16M的結合親和力;或其任意組合。包含該文庫的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或 100% 的單特異性抗體可以包含至少 50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900或1000種不同的抗體,其中抗體或抗體的子集可結合其靶蛋白的天然形式;是單克隆抗體;是免疫沉淀抗體;是IgG抗體或IgG同種型抗體;對其靶標具有的結合親和力在所述多種單特異性抗體的至少10%中的另一抗體的結合親和力的至少 20% 以內,諸如至少 I 2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9%,10%,11%>12%,13%,14%、15%、16%、17%、18%或19%以內;對其靶標具有至少10_7M(KD),諸如至少10_8M、1(Γ9Μ、1(Γ10Μ、1(ΓηΜ、ΙΟΙ、ΙΟΙ、ΙΟΙ、IO-15M 或 IO-16M 的結合親和力;或其任意組合。包含所述多種不同抗體中的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%的單特異性抗體可結合人類蛋白質組的至少0.5%、1%、2%、3 %,4 %,5 %,6 %,7 %,8 %,9 %U0 %U1 %>12 %U3 %U4 %U5 %,16 %,17 %,1819%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90%或 100%,其中抗體或抗體的子集可結合其靶蛋白的天然形式;是單克隆抗體;是免疫沉淀抗體;是IgG抗體或IgG同種型抗體;對其靶標具有的結合親和力在所述多種單特異性抗體的至少10%中的另一抗體的結合親和力的至少20%以內,諸如至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9 %、10 %、11 %、12 %、13 %、14 %、15 %、16 %、17 %、18 % 或 19 % 以內;對其靶標具有至少10_7M(KD),諸如至少 101、10-9]\1、10,]\1、10-11]\1、10-12]\1、10-13]\1、10-14]\1、KT15M 或 1(Γ16Μ 的結合親和力;或其任意組合。包含所述多種不同抗體中的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%的單特異性抗體可結合在表5中列出的人類蛋白質中的至少0.5%U%>2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9%,10%,11%>12%,13%,14%,15%,16%,17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90% 或 100%,其中抗體或抗體的子集可結合其靶蛋白的天然形式;是單克隆抗體;是免疫沉淀抗體;是IgG抗體或IgG同種型抗體;對其靶標具有的結合親和力在所述多種抗體中的另一抗體的結合親和力的至少20%以內,諸如至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%或 19% 以內;對其靶標具有至少 10_7M(KD),諸如至少 1(Γ8Μ、1(Γ9Μ、1(Γ10Μ、1(ΓηΜ、1(Γ12Μ、1(Γ13Μ、1(Γ14Μ、I(T15M 或 I(T16M 的結合親和力;或其任意組合。本文還提供了包含多種不同抗體的抗體文庫,其中所述多種抗體中的至少10%對其靶標、對其靶蛋白具有至少 KT7M(Kd),諸如至少 1(Γ8Μ、1(Γ9Μ、1(Γ10Μ、1(ΓηΜ、1(Γ12Μ、1(Γ13Μ、10_14Μ、10_15Μ或10_16Μ的結合親和力。對其靶標具有至少10_7M(KD),諸如至少10_8M、10_9M、IO^10M, IO^11M, IO^12M, IO^13M, IO^14M, IO^15M ^ 10_16M的結合親和力的所述多種抗體中的每種抗體可以是單特異性抗體;結合其靶蛋白的天然形式;是單克隆抗體;是免疫沉淀抗體;是IgG抗體或IgG同種型抗體;對其靶標具有的結合親和力在所述多種抗體中的另一抗體的結合親和力的至少20%以內,諸如至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%或 19% 以內;或其任意組合。對其靶標具有至少KT7M(Kd),諸如至少lOlUOlUOllOmiOl1(T14M、KT15M 或 1(Γ16Μ 的結合親和力的抗體可包含至少 50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900或1000種不同的抗體,其中抗體或抗體的子集可以是單特異性抗體;結合其靶蛋白的天然形式;是單克隆抗體;是免疫沉淀抗體;是IgG抗體或IgG同種型抗體;對其靶標具有的結合親和力在所述多種抗體中的另一抗體的結合親和力的至少 20% 以內,諸如至少 I 2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9%,10%,11%>12%,13%、14%、15%、16%、17%、18%或 19% 以內;或其任意組合。對其靶標具有至少KT7M(Kd),諸如至少lOlUOlUOllOmiOl10_14M、10_15M或10_16M的結合親和力的抗體可結合人類蛋白質組中的至少0.5%、1%、2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9% ,10% ,11% >12% ,13% ,14% ,15% ,16% ,17% ,18%,19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90%或 100%,其中抗體或抗體的子集可以是單特異性抗體;結合其靶蛋白的天然形式;是單克隆抗體;是免疫沉淀抗體;是IgG抗體或IgG同種型抗體;對其靶標具有的結合親和力在所述多種抗體中的另一抗體的結合親和力的至少20%以內,諸如至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11 %、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%或 19% 以內;或其任意組合。對其靶標具有至少KT7M(Kd),諸如至少lOlUOlUOllOmiOl10_14M、10_15M或10_16M的結合親和力的抗體可結合在表5中列出的人類蛋白質中的至少0.5%U %>2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9%,10%,11%>12%,13%,14%,15%,16%,17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90% 或 100%,其中抗體或抗體的子集可以是單特異性抗體;結合其靶蛋白的天然形式;是單克隆抗體;是免疫沉淀抗體;是IgG抗體或IgG同種型抗體;對其靶標具有的結合親和力在所述多種抗體中的另一抗體的結合親和力的至少20%以內,諸如至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、1 2%、13%、14%、15%、16%、17%、18%或 19% 以內;或其任意組合。本發明的另一方面是包含多種不同抗體的抗體文庫,其中所述多種抗體中的至少10%結合其靶蛋白的天然形式。在一個實施方式中,該文庫包含多種不同抗體,其中所述多種抗體中的至少 20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,95%,99%^; 100%結合其靶蛋白的天然形式。結合其靶蛋白的天然形式的所述多種抗體中的每種抗體可以是單特異性抗體;是單克隆抗體;是免疫沉淀抗體;是IgG抗體或IgG同種型抗體;對其靶標具有的結合親和力在所述多種抗體中的另一抗體的結合親和力的至少20%以內,諸如至少
            I2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9%,10%,11%>12%,13%,14%,15%,16%,17%,18%或 19% 以內;對其靶標具有至少 KT7M(Kd),諸如至少 1(Γ8Μ、1(Γ9Μ、ΙΟ,Μ、1(ΓηΜ、1(Γ12Μ、10_13Μ、10_14Μ、10_15Μ或10_16Μ的結合親和力;或其任意組合。結合其靶蛋白的天然形式的抗體可包含至少50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900或1000種不同的抗體,其中抗體或抗體的子集可以是單特異性抗體;是單克隆抗體;是免疫沉淀抗體;是IgG抗體或IgG同種型抗體;對其靶標具有的結合親和力在所述多種抗體中的另一抗體的結合親和力的至少20%以內,諸如至少
            I2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9%,10%,11%>12%,13%,14%,15%,16%,17%,18%或 19% 以內;對其靶標具有至少 KT7M(Kd),諸如至少 1(Γ8Μ、1(Γ9Μ、ΙΟ,Μ、1(ΓηΜ、1(Γ12Μ、10_13Μ、10_14Μ、10_15Μ或10_16Μ的結合親和力;或其任意組合。在又一實施方式中,結合其靶蛋白的天然形式的抗體可結合人類蛋白質組的至少0.5%U %>2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9%,10%,11%>12%,13%,14%,15%,16%,17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90% 或 100%,其中抗體或抗體的子集可以是單特異性抗體;是單克隆抗體;是免疫沉淀抗體;是IgG抗體或IgG同種型抗體;對其靶標具有的結合親和力在所述多種抗體中的另一抗體的結合親和力的至少 20% 以內,諸如至少 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%或19%以內;對其靶標具有至少KT7M(Kd),諸如至少 1(Γ8Μ、1(Γ9Μ、1(Γ10Μ、1(ΓηΜ、1(Γ12Μ、1(Γ13Μ、1(Γ14Μ、I(T15M 或 I(T16M 的結合親和力;或其任意組合。結合其靶蛋白的天然形式的抗體可結合在表5中列出的人類蛋白質中的至少0.5%U %>2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9%,10%,11%>12%,13%,14%,15%,16%,17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90% 或 100%,其中抗體或抗體的子集可以是單特異性抗體;是單克隆抗體;是免疫沉淀抗體;是IgG抗體或IgG同種型抗體;對其靶標具有的結合親和力在所述多種抗體中的另一抗體的結合親和力的至少 20% 以內,諸如至少 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%或19%以內;對其靶標具有至少KT7M(Kd),諸如至少 1(Γ8Μ、1(Γ9Μ、1(Γ10Μ、1(ΓηΜ、1(Γ12Μ、1(Γ13Μ、1(Γ14Μ、I(T15M 或 I(T16M 的結合親和力;或其任意組合。本發明的另一方面是包含至少50種不同的單克隆抗體,諸如至少75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900 或 1000 種不同單克隆抗體的抗體文庫。該文庫的每種單克隆抗體可以是單特異性的;結合其靶蛋白的天然形式;是免疫沉淀抗體;是IgG抗體或IgG同種型抗體;對其靶標具有的結合親和力在所述多種抗體中的另一抗體的結合親和力的至少20%以內,諸如至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、
            9%、10 %、11 %、12 %、13 %、14 %、15 %、16 %、17 %、18 % 或 19 % 以內;對其靶標具有至少10_7M(KD),諸如至少 101、10-9]\1、10,]\1、10-11]\1、10-12]\1、10-13]\1、10-14]\1、KT15M 或 1(Γ16Μ 的結合親和力;或其任意組合。在又一實施方式中,包含至少50種不同的單克隆抗體,諸如至少75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900 或 1000 種不同單克隆抗體的抗體文庫,結合人類蛋白質組的至少0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、
            II%> 12% ,13% ,14% ,15% ,16% ,17% ,18% ,19%,20%,25%,30%,35%,40%,45%,50%、60%、70%、80%、90%或100%,其中單克隆抗體或單克隆抗體的子集可以是單特異性抗體;結合其靶蛋白的天然形式;是免疫沉淀抗體;是IgG抗體或IgG同種型抗體;對其靶標具有的結合親和力在所述多種抗體中的另一抗體的結合親和力的至少20 %以內,諸如至少 I 2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9%,10%,11%>12%,13%,14%,15%,16%,17%、18%或 19% 以內;對其靶標具有至少 10_7M(KD),諸如至少 10_8M、10_9M、10_lclM、10_nM、10-12M、10_13M、IO-14MUO-15M或KT16M的結合親和力;或其任意組合。包含至少50種不同的單克隆抗體,諸如至少75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900或1000種不同單克隆抗體的抗體文庫,可結合在表5中列出的人類蛋白質中的至少 0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12% ,13% ,14% ,15% ,16% ,17% ,18% ,19%,20%,25%,30%,35%,40%,45%,50%,60%、70%、80%、90%或100%,其中單克隆抗體或單克隆抗體的子集可以是單特異性的;結合其靶蛋白的天然形式;是免疫沉淀抗體;是IgG抗體或IgG同種型抗體;對其靶標具有的結合親和力在所述多種抗體中的另一抗體的結合親和力的至少20%以內,諸如至少I 2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%, 9%,10%,11%>12%,13%,14%,15%,16%,17%,18%或 19% 以內;對其靶標具有至少 KT7M(Kd),諸如至少 1(Γ8Μ、1(Γ9Μ、ΙΟ,Μ、1(ΓηΜ、1(Γ12Μ、10_13Μ、10_14Μ、10_15Μ或10_16Μ的結合親和力;或其任意組合。本發明的另一方面是包含結合人類蛋白質組的至少0.5%,諸如人類蛋白質組的至少 I 2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9%,10%,11%>12%,13%,14%,15%,16%,17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90% 或 100%的多種不同抗體的抗體文庫。所述多種抗體中的每種抗體可以是單特異性抗體;結合其靶蛋白的天然形式;是單克隆抗體;是免疫沉淀抗體;是IgG抗體或IgG同種型抗體;對其靶標具有的結合親和力在所述多種抗體中的另一抗體的結合親和力的至少20%以內,諸如至少 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%或 19% 以內;對其靶標具有至少 10_7M(KD),諸如至少 10_8M、10_9M、10_lclM、10_nM、10-12M、10_13M、IO-14MUO-15M或KT16M的結合親和力;或其任意組合。包含結合人類蛋白質組的至少0.5%,諸如人類蛋白質組的至少1%、2%、3%、4%,5%,6%,7%,8%,9% ,10% ,11% >12% ,13% ,14% ,15% ,16% ,17% ,18% ,19%,20%,25%,30%,35%,40%,45%,50%,60%,70%,80%,90%^; 100% 的多種不同抗體的抗體文庫可包含至少 50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900或1000種不同的抗體,其中抗體或抗體的子集可以是單特異性抗體;結合其靶蛋白的天然形式;是單克隆抗體;是免疫沉淀抗體;是IgG抗體或IgG同種型抗體;對其靶標具有的結合親和力在所述多種抗體中的另一抗體的結合親和力的至少20%以內,諸如至少I 2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9%,10%,11%>12%,13%,14%,15%,16%,17%,18%或 19% 以內;對其靶標具有至少 KT7M(Kd),諸如至少 1(Γ8Μ、1(Γ9Μ、ΙΟ,Μ、1(ΓηΜ、1(Γ12Μ、10_13Μ、10_14Μ、10_15Μ或10_16Μ的結合親和力;或其任意組合。包含結合人類蛋白質組的至少0.5%,諸如人類蛋白質組的至少1%、2%、3%、4%,5%,6%,7%,8%,9% ,10% ,11% >12% ,13% ,14% ,15% ,16% ,17% ,18% ,19%,20%,25%,30%,35%,40%,45%,50%,60%,70%,80%,90%^; 100% 的多種不同抗體的抗體文庫,可結合在表5中列出的人類蛋白質中的至少0.5%U%>2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9% ,10% ,11% >12% ,13% ,14% ,15% ,16% ,17% ,18% ,19%,20%,25%,30%,35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90%或100%,其中抗體或抗體的子集可以是單特異性抗體;結合其靶蛋白的天然形式;是單克隆抗體;是免疫沉淀抗體;是IgG抗體或IgG同種型抗體;對其靶標具有的結合親和力在所述多種抗體中的另一抗體的結合親和力的至少 20% 以內,諸如至少 I 2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9%,10%,11%>12%,13%,14%、15%、16%、17 %、18%或19%以內;對其靶標具有至少10_7M(KD),諸如至少10_8M、1(Γ9Μ、1(Γ10Μ、1(ΓηΜ、ΙΟΙ、ΙΟΙ、ΙΟΙ、IO-15M 或 IO-16M 的結合親和力;或其任意組合。本發明的另一方面是包含多種不同抗體的抗體文庫,其中所述多種抗體中的至少
            10%,諸如至少 20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、95 %、99 % 或 100 %對其靶標具有的結合親和力在所述多種抗體中的另一抗體的結合親和力的至少20%以內,諸如至少 I 2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9%,10%,11%>12%,13%,14%,15%,16%,17%、18%或19%以內。所述多種抗體中的每種抗體可以是單特異性抗體;結合其靶蛋白的天然形式;是單克隆抗體;是免疫沉淀抗體;是IgG抗體或IgG同種型抗體;對其靶標具有至少 KT7M (Kd),諸如至少 1(Γ8Μ、1(Γ9Μ、1(Γ10Μ、1(ΓηΜ、1(Γ12Μ、1(Γ13Μ、1(Γ14Μ、KT15M 或 1(Γ16Μ 的結合親和力;或他們的任意組合。包含多種不同抗體(其中所述多種抗體中的至少10%,諸如至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%對其靶標具有的結合親和力在所述多種抗體中的另一抗體的結合親和力的至少20%以內,諸如至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%或 19% 以內)的抗體文庫可包含至少 50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475 、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900或1000種不同的抗體,其中抗體或抗體的子集可以是單特異性抗體;結合其靶蛋白的天然形式;是單克隆抗體;是免疫沉淀抗體;是IgG抗體或IgG同種型抗體;對其靶標具有至少 KT7M(Kd),諸如至少 1(Γ8Μ、1(Γ9Μ、1(Γ10Μ、1(ΓηΜ、1(Γ12Μ、1(Γ13Μ、1(Γ14Μ、KT15M 或 1(Γ16Μ 的結合親和力;或其任意組合。在又一實施方式中,包含多種不同抗體(其中所述多種抗體中的至少10%,諸如至少 20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或 100%對其靶標具有的結合親和力在所述多種抗體中的另一抗體的結合親和力的至少20%以內,諸如至少I %、2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9% ,10% ,11% >12% ,13% ,14% ,15% ,16% ,17% ,18%或19%以內)的抗體文庫結合人類蛋白質組的至少0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%,8%,9% ,10% ,11% >12% ,13% ,14% ,15% ,16% ,17% ,18% ,19%,20%,25%,30%,35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90%或100%,其中抗體或抗體的子集可以是單特異性抗體;結合其靶蛋白的天然形式;是單克隆抗體;是免疫沉淀抗體;是IgG抗體或IgG同種型抗體;對其靶標具有至少10_7M(KD),諸如至少ΙΟΙ、ΙΟΙ、1(Γ10Μ、1(ΓηΜ、ΙΟΙ、10_13M、10_14M、10_15M或10_16M的結合親和力;或其任意組合。包含多種不同抗體(其中所述多種抗體中的至少10%,諸如至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%對其靶標具有的結合親和力在所述多種抗體中的另一抗體的結合親和力的至少20%以內,諸如至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%或 19% 以內)的抗體文庫可以結合在表5中列出的人類蛋白質中的至少0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%,8%,9% ,10% ,11% >12% ,13% ,14% ,15% ,16% ,17% ,18% ,19%,20%,25%,30%,35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90%或100 %,其中抗體或抗體的子集可以是單特異性抗體;結合其靶蛋白的天然形式;是單克隆抗體;是免疫沉淀抗體;是IgG抗體或IgG同種型抗體;對其靶標具有至少10_7M(KD),諸如至少ΙΟΙ、ΙΟΙ、1(Γ10Μ、1(ΓηΜ、ΙΟΙ、10_13M、10_14M、10_15M或10_16M的結合親和力;或其任意組合。本文還提供了包含多種不同抗體的抗體文庫,其中所述多種抗體中的至少10%是IgG抗體或IgG同種型抗體。在一個實施方式中,該文庫包含多種不同的抗體,其中所述多種抗體中的至少 20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或 100%是由相同的平臺產生的IgG抗體(例如,IgG同種型抗體)。每種IgG抗體(例如,IgG同種型抗體)均可以是單特異性抗體;結合其靶蛋白的天然形式;是單克隆抗體;是免疫沉淀抗體;對其靶標具有的結合親和力在由相同平臺產生的多種抗體中的另一抗體的結合親和力的至少 20% 以內,諸如至少 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%或19%以內;對其靶標具有至少KT7M(Kd),諸如至少 1(Γ8Μ、1(Γ9Μ、1(Γ10Μ、1(ΓηΜ、1(Γ12Μ、1(Γ13Μ、1(Γ14Μ、I(T15M 或 I(T16M 的結合親和力;或其任意組

            口 οIgG抗體(例如,IgG同種型抗體)可以包含至少50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900或1000種不同的抗體,其中抗體或抗體的子集可以是單特異性抗體;結合其靶蛋白的天然形式;是單克隆抗體;是免疫沉淀抗體;對其靶標具有的結合親和力在由相同平臺產生的多種抗體中的另一抗體的結合親和力的至少20%以內,諸如至少 I %>2%,3%,4 %,5%,6%,7%,8%,9%,10%,11%>12%,13%,14%,15 %、16 %、17%、18%或19%以內;對其靶標具有至少10_7M(KD),諸如至少1(Γ8Μ、1(Γ9Μ、10-lclM、10-nM、10-12M、10-13M、IO-14MUO-15M 或 KT16M 的結合親和力;或其任意組合。在又一實施方式中,IgG抗體(例如,IgG同種型抗體)結合人類蛋白質組的至少0.5%U %>2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9%,10%,11%>12%,13%,14%,15%,16%,17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90% 或 100%,其中抗體或抗體的子集可以是單特異性抗體;結合其靶蛋白的天然形式;是單克隆抗體;是免疫沉淀抗體;對其靶標具有的結合親和力在由相同平臺產生的多種抗體中的另一抗體的結合親和力的至少20%以內,諸如至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%或 19% 以內;對其靶標具有至少 10_7M(KD),諸如至少 1(Γ8Μ、1(Γ9Μ、1(Γ10Μ、1(ΓηΜ、1(Γ12Μ、1(Γ13Μ、1(Γ14Μ、I(T15M 或 I(T16M 的結合親和力;或其任意組合。IgG抗體(例如,IgG同種型抗體)可結合在表5中列出的人類蛋白質中的至少0.5%U %>2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9% ,10%,11%>12%,13%,14%,15%,16%,17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90% 或 100%,其中抗體或抗體的子集可以是單特異性抗體;結合其靶蛋白的天然形式;是單克隆抗體;是免疫沉淀抗體;對其靶標具有的結合親和力在由相同平臺產生的多種抗體中的另一抗體的結合親和力的至少20%以內,諸如至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%或 19% 以內;對其靶標具有至少 10_7M(KD),諸如至少 1(Γ8Μ、1(Γ9Μ、1(Γ10Μ、1(ΓηΜ、1(Γ12Μ、1(Γ13Μ、1(Γ14Μ、I(T15M 或 I(T16M 的結合親和力;或其
            任意組合。本發明的另一方面是包含抗體文庫和基底的陣列,其中抗體或子集,諸如抗體中的 10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,95%,99%^; 100%,被固定在基底上。基底可以是平面的或是顆粒,包含實心或多孔材料。固定化可以是可逆的或不可逆的。陣列可包含含有多種不同的抗體的抗體文庫,其中所述多種抗體中的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99% 或 100%可由相同的平臺產生,是單特異性抗體;結合其靶蛋白的天然形式;是單克隆抗體;是免疫沉淀抗體;IgG抗體或IgG同種型抗體;對其靶標具有的結合親和力在由相同平臺產生的多種抗體中的另一抗體的結合親和力的至少20%以內,諸如至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%或 19% 以內;對其靶標具有至少 10_7M(KD),諸如至少 1(Γ8Μ、1(Γ9Μ、1(Γ10Μ、1(ΓηΜ、1(Γ12Μ、1(Γ13Μ、1(Γ14Μ、I(T15M 或 I(T16M 的結合親和力;或其任意組合。陣列可包含抗體文庫,該抗體文庫包含至少50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900或1000種不同的抗體,其中抗體或抗體的子集可由相同的平臺產生,是單特異性抗體;結合其靶蛋白的天然形式;是單克隆抗體;是免疫沉淀抗體;是IgG抗體或IgG同種型抗體;對其靶標具有的結合親和力在由相同平臺產生的多種抗體中的另一抗體的結合親和力的至少20%以內,諸如至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%或 19% 以內;對其靶標具有至少 KT7M (Kd),諸如至少 1(Γ8Μ、1(Γ9Μ、1(Γ10Μ、1(ΓηΜ、1(Γ12Μ、1(Γ13Μ、1(Γ14Μ、KT15M 或 1(Γ16Μ的結合親和力;或其任 意組合。陣列可以包含結合人類蛋白質組的至少0.5%U %>2%,3%,4%,5%,6%,7%,
            8%,9 %U0 %U1 %>12 %U3 %U4 %U5 %U6 %,17 %,18 %,19 %,20 %,25 %,30
            35 %、40 %、45 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 %或100 %的抗體文庫,其中抗體或抗體的子集可由相同的平臺產生,是單特異性抗體;結合其靶蛋白的天然形式;是單克隆抗體;是免疫沉淀抗體;是IgG抗體或IgG同種型抗體;對其靶標具有的結合親和力在由相同平臺產生的多種抗體中的另一抗體的結合親和力的至少20%以內,諸如至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%或19%以內;對其靶標具有至少 KT7M (Kd),諸如至少 1(Γ8Μ、1(Γ9Μ、1(Γ10Μ、1(ΓηΜ、1(Γ12Μ、1(Γ13Μ、I(T14M、KT15M或KT16M的結合親和力;或其任意組合。陣列可以包含可結合在表5中列出的人類蛋白質中的至少0.5%、1%、2%、3%、4%,5%,6%,7%,8%,9%,10%,11% >12%,13%,14%,15%,16%,17%,18%,19%,20%,25%,30%,35%,40%,45%,50%,60%,70%,80%,90%^; 100% 的抗體文庫,其中抗體或抗體的子集可由相同的平臺產生,是單特異性抗體;結合其靶蛋白的天然形式;是單克隆抗體;是免疫沉淀抗體;是IgG抗體或IgG同種型抗體;對其靶標具有的結合親和力在由相同平臺產生的多種抗體中的另一抗體的結合親和力的至少20%以內,諸如至少I 2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9%,10%,11%>12%,13%,14%,15%,16%,17%,18%或 19% 以內;對其靶標具有至少 KT7M(Kd),諸如至少 1(Γ8Μ、1(Γ9Μ、ΙΟ,Μ、1(ΓηΜ、1(Γ12Μ、10_13Μ、10_14Μ、10_15Μ或10_16Μ的結合親和力;或其任意組合。本文還提供了產生抗體文庫的方法,該方法包括:(a)利用多種抗原免疫動物;(b)從所述動物中分離產生抗體的細胞;(C)從所述產生抗體的細胞中分離多種抗體;(d)利用人類蛋白質組陣列篩選步驟c)中的所述多種抗體,其中人類蛋白質組陣列可以包含人類蛋白質組的至少 0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13% ,14% ,15% ,16% ,17% ,18% ,19%,20%,25%,30%,35%,40%,45%,50%,60%,70%、80%、90%或100%,或表5中列出的人類蛋白質中的至少0.5%U%>2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9%,10%,11 %>12%,13%,14%,15%,16%,17%,18%,19%,20%,25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90%或 100% ;以及(e)選擇對于蛋白質組陣列為單特異性的抗體。在一些實施方式中,將在步驟(e)中選定的抗體加入文庫中,其中該文庫可包含多種不同的抗體,其中所述多種不同抗體中的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%可由相同的平臺產生,是單特異性抗體;結合其靶蛋白的天然形式;是單克隆抗體;是免疫沉淀抗體;是IgG抗體或IgG同種型抗體;對其靶標具有的結合親和力在由相同平臺產生的多種抗體中的另一抗體的結合親和力的至少 20% 以內,諸如至少 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%或19%以內;對其靶標具有至少KT7M(Kd),諸如至少 1(Γ8Μ、1(Γ9Μ、1(Γ10Μ、1(ΓηΜ、1(Γ12Μ、1(Γ13Μ 、1(Γ14Μ、I(T15M 或 I(T16M 的結合親和力;或其任意組合該方法可以產生可包含至少50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900或1000種不同抗體的抗體文庫,其中抗體或抗體的子集可由相同
            的平臺產生,是單特異性抗體;結合其靶蛋白的天然形式;不結合其靶蛋白的變性形式;是單克隆抗體;是免疫沉淀抗體;是IgG抗體或IgG同種型抗體;對其靶標具有的結合親和力在由相同平臺產生的多種抗體中的另一抗體的結合親和力的至少20%以內,諸如至少I 2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9%,10%,11%>12%,13%,14%,15%,16%,17%,18%或 19% 以內;對其靶標具有至少 KT7M(Kd),諸如至少 1(Γ8Μ、1(Γ9Μ、ΙΟ,Μ、1(ΓηΜ、1(Γ12Μ、10_13Μ、10_14Μ、10_15Μ或10_16Μ的結合親和力;或其任意組合。該方法可以產生可結合人類蛋白質組的至少0.5%U %>2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9% ,10% ,11% >12% ,13% ,14% ,15% ,16% ,17% ,18% ,19%,20%,25%,30%,35 %、40 %、45 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 %或100 %的抗體文庫,其中抗體或抗體的子集可由相同的平臺產生,是單特異性抗體;結合其靶蛋白的天然形式;是單克隆抗體;是免疫沉淀抗體;是IgG抗體或IgG同種型抗體;對其靶標具有的結合親和力在由相同平臺產生的多種抗體中的另一抗體的結合親和力的至少20 %以內,諸如至少I %、2 %、3 %、4 %、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%或19%以內;對其靶標具有至少 KT7M (Kd),諸如至少 1(Γ8Μ、1(Γ9Μ、1(Γ10Μ、1(ΓηΜ、1(Γ12Μ、1(Γ13Μ、I(T14M、KT15M或KT16M的結合親和力;或其任意組合。該方法可以產生可結合在表5中列出的人類蛋白質中的至少0.5%、1%、2%、3 %,4 %,5 %,6 %,7 %,8 %,9 %U0 %U1 %>12 %U3 %U4 %U5 %,16 %,17 %,1819%,20%,25%,30%,35%,40%,45%,50%,60%,70%,80%,90%^; 100% 的抗體文庫,其中抗體或抗體的子集可由相同的平臺產生,是單特異性抗體;結合其靶蛋白的天然形式;是單克隆抗體;是免疫沉淀抗體;是IgG抗體或IgG同種型抗體;對其靶標具有的結合親和力在由相同平臺產生的多種抗體中的另一抗體的結合親和力的至少20%以內,諸如至少I 2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9%,10%,11%>12%,13%,14%,15%,16%,17%,18%或 19% 以內;對其靶標具有至少 KT7M(Kd),諸如至少 1(Γ8Μ、1(Γ9Μ、ΙΟ,Μ、1(ΓηΜ、1(Γ12Μ、10_13Μ、10_14Μ、10_15Μ或10_16Μ的結合親和力;或其任意組合。產生抗體文庫的方法可進一步包括在步驟c)之前預篩選來自產生抗體的細胞的多種抗體,諸如通過進行免疫細胞化學或確定來自所述產生抗體的細胞的抗體與包含一種或多種靶抗原如天然蛋白質的混合物的結合。該混合物可以包含粗裂解物、一種或多種細胞、一種或多種蛋白質、一種或多種肽、或一種或多種核酸或生物樣品,其中該生物樣品可以是但不限于,細胞混合 物、組織、血液、血清、血漿、尿液、腦脊液(CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊膜液、耵聹、母乳、支氣管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、Cowper液、射精前液體、女性噴射液(female ejaculate)、汗水、淚水、囊腫液、胸膜液、腹膜液、心包液、淋巴、食糜、乳糜、膽汁、間隙液、月經、膿汁、皮脂、陰道分泌物、黏膜分泌物、糞便水(stool water)、胰液、來自竇腔的灌洗液、支氣管肺抽出物、囊胚腔液(blastocyl cavity fluid)或臍帶血。產生抗體文庫的方法可包括用多種抗原免疫動物,其中所述多種抗原可包含粗裂解物、一種或多種細胞、一種或多種蛋白質、一種或多種肽、或一種或多種核酸。所述多種抗原還可包含生物樣品,其中該生物樣品可以是但不限于,細胞的混合物、組織、血液、血清、血漿、尿液、腦脊液(CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊膜液、耵聹、母乳、支氣管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、Cowper液、射精前液體、女性射出液、汗水、淚水、囊腫液、胸膜液、腹膜液、心包液、淋巴、食糜、乳糜、膽汁、間隙液、月經、膿汁、皮脂、陰道分泌物、黏膜分泌物、糞便水、胰液、來自竇腔的灌洗液、支氣管肺抽出物、囊胚腔液或臍帶血。在一些實施方式中,所述多種抗原包含至少11,000種不同的抗原,諸如至少12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000或20,000種不同的抗原。在一些實施方式中,所述多種抗原包含人類蛋白質組的至少0.5 %,諸如人類蛋白質組的至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%,8%,9% ,10% ,11% >12% ,13% ,14% ,15% ,16% ,17% ,18% ,19%,20%,25%,30%,35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90% 或 100%。在產生抗體文庫中,產生抗體的細胞可以是B細胞。產生抗體文庫的方法可進一步包括將抗體固定于基底上,其中基底可以是平面的或是顆粒,包含實心或多孔材料,或其任意組合。抗體可以可逆地或不可逆地固定于基底上。本文還提供了鑒定對于人類蛋白質為單特異性的抗體的方法,該方法包括:(a)使多種抗體與人類蛋白質組陣列接觸;(b)確定所述多種抗體與存在于人類蛋白質組陣列上的靶標之間的結合;以及(c)當抗體對于蛋白質組陣列上的單一靶標為單特異性時,將所述抗體鑒定為單特異性的,其中人類蛋白質組陣列可以包含人類蛋白質組的至少0.5%、
            I2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9%,10%,11%>12%,13%,14%,15%,16%,17%,18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90% 或 100%,或在表5中列出的人類蛋白質中的至少0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、
            II%> 12% ,13% ,14% ,15% ,16% ,17% ,18% ,19%,20%,25%,30%,35%,40%,45%,50%、60%、70%、80%、90% 或 100%。本文還提供了鑒定針對靶標的抗體的方法,該方法包括:(a)使靶標與抗體文庫或包含抗體文庫的陣列接觸,(b)確定所述靶標與所述多種抗體之間的結合;以及(C)當靶標與文庫的抗體結合時,鑒定針對靶標的抗體。該文庫可以包含多種不同的抗體,其中所述多種抗體中的至少 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99% 或100%可由相同的平臺產生,是單特異性抗體;結合其靶蛋白的天然形式;是單克隆抗體;是免疫沉淀抗體;是IgG抗體或IgG同種型抗體;對其靶標具有的結合親和力在由相同平臺產生的多種抗體中的另一抗體的結合親和力的至少20%以內,諸如至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%或19%以內;對其靶標具有至少 KT7M(Kd),諸如至少 IO^8M, IO^9M, IO^10M, IO^11M, IO^12M, IO^13M, IO^14M,10_15M或10_16M的結合親和力;或其任意組合。鑒定針對靶標的抗體的方法可包括使靶標與抗體文庫或包含抗體文庫的陣列接觸,該抗體文庫包含至少 50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900或1000 種不同的抗體,其中抗體或抗體的子集可由相同的平臺產生,是單特異性抗體;結合其靶蛋白的天然形式;是單克隆抗體;是免疫沉淀抗體;是IgG抗體或IgG同種型抗體;對其靶標具有的結合親和力在由相同平臺產生的多種抗體中的另一抗體的結合親和力的至少 20% 以內,諸如至少 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%或19%以內;對其靶標具有至少KT7M(Kd),諸如至少 1(Γ8Μ、1(Γ9Μ、1(Γ10Μ、1(ΓηΜ、1(Γ12Μ、1(Γ13Μ、1(Γ14Μ、I(T15M 或 I(T16M 的結合親和力;或其任意組

            口 ο鑒定針對靶標的抗體的方法可包括使靶標與抗體文庫或包含抗體文庫的陣列接觸,該抗體文庫可以結合人類蛋白質組的至少0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9 %,10 %,11 %>12%,13 %,14%U5 %,16 %,17 %,18%,19 %,20 %,25 %,30 %,3540%、45%、50%、60%、70%、80%、90%或100 %,其中抗體或抗體的子集可由相同的平臺產生,是單特異性抗體;結合其靶蛋白的天然形式;是單克隆抗體;是免疫沉淀抗體;是IgG抗體或IgG同種型抗體;對其靶標具有的結合親和力在由相同平臺產生的多種抗體中的另一抗體的結合親和力的至少20%以內,諸如至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9 %、10 %、11 %、12 %、13 %、14 %、15 %、16 %、17 %、18 % 或 19 % 以內;對其靶標具有至少10_7M(KD),諸如至少 101、10-9]\1、10,]\1、10-11]\1、10-12]\1、10-13]\1、10-14]\1、KT15M 或 1(Γ16Μ 的結合親和力;或其任意組合。鑒定針對靶標的抗體的方法可包括使靶標與抗體文庫或包含抗體文庫的陣列接觸,該抗體文庫可以結合在表5中列出的人類蛋白質中的至少0.5%、1%、2%、3%、4%、5%,6%,7%,8%,9%,10%,11 %>12%,13%,14%,15%,16%,17%,18%,19%,20%,25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90%或 100%,其中抗體或抗體的子集可由相同的平臺產生,是單特異性抗體;結合其靶蛋白的天然形式;是單克隆抗體;是免疫沉淀抗體;是IgG抗體或IgG同種型抗體;對其靶標具有的結合親和力在由相同平臺產生的多種抗體中的另一抗體的結合親和力的至少20 %以內,諸如至少I %、2 %、3 %、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%或19%以內;對其靶標具有至少 KT7M(Kd),諸如至少 IO-8M, IO^9M, IO^10M, IO^11M, IO^12M, IO^13M, IO^14M,10_15M或10_16M的結合親和力;或其任意組合。本文還提供了檢測靶標的方法,該方法包括:(a)使靶標與抗體文庫或包含抗體文庫的陣列接觸,(b)確定所述靶標與所述多種抗體之間存在或不存在結合;以及(c)當靶標與文庫的至少一種抗體結合時,檢測該靶標。該文庫可包含多種不同的抗體,其中所述多種抗體中的至少 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99% 或 100%可由相同的平臺產生,是單特異性抗體;結合其靶蛋白的天然形式;是單克隆抗體;是免疫沉淀抗體;是IgG抗體或IgG同種型抗體;對其靶標具有的結合親和力在由相同平臺產生的多種抗體中的另一抗體的結合親和力的至少20%以內,諸如至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%或19%以內;對其靶標具有至少 KT7M (Kd),諸如至少 1(Γ8Μ、1(Γ9Μ、1(Γ10Μ、1(ΓηΜ、1(Γ12Μ、1(Γ13Μ、I(T14M、KT15M或KT16M的結合親和力;或其任意組合。在一些實施方式中,該方法進一步包括檢測多種靶標。在一些實施方式中,該方法包括檢測50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900或1000種不同的靶標。在一些實施方式中,該方法包括檢測一種或多種靶標的水平。
            援引并入本說明書中提到的所有出版物、專利和專利申請均通過引用而以相同程度并入本文,猶如表明每個單獨的出版物、專利和專利申請特別地和單獨地通過引用而并入。


            本發明的新特征在隨附的權利要求中具體闡述。通過參考以下對在其中利用到本發明原理的說明性實施方式加以闡述的詳細描述和附圖,將會獲得對本發明的特征和優點的更好的理解,在附圖中:圖1描述了:Α.—種通過免疫動物、從動物產生雜交瘤、接種雜交瘤、針對文庫探測產生的抗體以及選擇具有期望的結合譜(profile)的抗體來選擇抗體的方法;以及B.通過活細胞免疫、雜交瘤選擇、MAb鑒定和確認來產生和確認超特異性單克隆抗體(MAb)的方法。圖2描述了 3-D池分析(pooling)策略。圖3描述了利用8,064個克隆的BsrGI消化,向目標載體內的LR重組克隆的流程圖。圖4描述了人類蛋白質組芯片的制備。A.17,000種人類蛋白質以^端651'-把8乂6融合蛋白的形式進行純化,并通過銀染色和免疫印跡分析監測質量。B.將17,000種純化的人類蛋白質和對照物一式兩份點樣在一個載玻片上。利用抗-GST將固定化的蛋白質可視化。C.B的更高倍數視圖表明該陣列具有良好的質量。圖5描述了人類蛋白質芯片上單克隆抗體(mAb)的質量譜分析(profiling)。A.1, 058種蛋白質的人類蛋白質芯片的GST圖像。B.針對芯片上的1,058種蛋白質對測試了針對pirin產生的單克隆抗體(mAb),該mAb只識別pirin。紫色方框指示小鼠IgG位標。C.另外四種mAb也顯示出與抗-pirin mAb相似的特異性。
            圖6描述了有助于mAb特異性的蛋白質微陣列分析的池分析策略。將雜交瘤上清液(A-L)在“垂直”和“水平”池內合并,之后用人類蛋白質微陣列檢測其結合特異性。通過確定微陣列上的哪種蛋白質被垂直和水平池的哪種組合所結合來鑒定單個mAb的特異性。
            在此處示出的實例中,識別特定蛋白質的mAb池用X表示。結果表明,只有含有mAb的“D”池識別該抗原。圖7描述了針對細菌開發的高通量蛋白質純化方案。A.該方案的流程圖。B.來自1.5mL大腸桿菌(E.coli)培養物的純化蛋白質的考馬斯染色。C.大腸桿菌蛋白質組芯片的制備。圖8描述了利用ICC對四種人類蛋白質的亞細胞定位。原來不清楚其亞細胞定位的Cllorf68、CNTDl、DYDC2和TXNDC9現在分別被定位于線粒體、細胞溶膠、質膜和內質網/
            聞爾基體。圖9描述了 mMAb (單特異性單克隆抗體)的確認和表征。利用V5標記的抗原構建體(泳道I)或空載體(泳道2)轉染細胞,或利用抗原構建體與它們相應的shRNA構建體共轉染細胞(泳道3)。在轉染后2天 ,將細胞裂解并利用每種相應的mMAb進行免疫印跡(上圖)。作為對比,取下(strip)相同的印跡并利用抗-V5抗體重新探測(下圖)。圖10顯示了許多mMAb為IP級。用V5標記的抗原構建體轉染的HeLa細胞利用它們相應的mMAb進行免疫沉淀,并利用抗-V5抗體進行免疫印跡。泳道1:輸入;泳道2:利用mMAb進行免疫沉淀的抗原;泳道3 =IgG陰性對照;泳道4:抗-V5陽性對照。圖11描述了抗-HNRPC mMAb的表征。A.使用抗-HNRPC的ICC分析清楚地示出了不同的核定位。B.在轉染的HeLa細胞利用抗-HNRPC進行免疫沉淀并利用抗-V5進行免疫印跡后,將V5標記的HNRPC的單一條帶可視化。抗-小鼠IgG和抗-V5抗體分別用作陰性和陽性對照。C.使用成功進行了染色質免疫沉淀(ChIP)圖12描述了使用斜入射光反射差法(OIRD)對mAb親和力的連續測量。紅色、藍色和黑色曲線分別代表通過用抗-兔、抗-小鼠和抗-人第二抗體探測中試(pilot) IgG微陣列而獲得的平滑化的和平均化的ImlOIRD}值。紅色虛線示出了估計的飽和階段的起點。
            具體實施例方式本發明總體上涉及抗體文庫,包括用于生產、產生、表征和利用抗體的方法和系統。抗體可以是高度特異性的。該文庫可以包含多種不同的抗體,其中所述抗體由相同的平臺產生。該文庫可以包含多種不同的抗體,其中在所述多種抗體或所述多種抗體的子集內,每種抗體均是單特異性抗體;結合其靶蛋白的天然形式;是單克隆抗體;是免疫沉淀抗體;是IgG抗體或IgG同種型抗體;對其靶標具有與所述多種抗體中的另一抗體的結合親和力相似的結合親和力;對其靶標具有至少KT7M(Kd)的結合親和力;或其任意組合。抗體文庫可包含由相同的平臺產生的多種不同的抗體。在一個實施方式中,抗體文庫包含多種不同的抗體,其中所述多種抗體中的至少10%是由相同的平臺產生的。例如,該文庫可包含多種不同的抗體,其中所述多種抗體中的至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%是由相同的平臺產生的抗體。當第一抗體和第二抗體由相同的方案產生時,即認為這些抗體是由相同的平臺產生的。例如,多種抗體可由如圖1A和/或圖B中所示的平臺產生。在一個實施方式中,如在圖1A步驟102中所述,可利用多種抗原免疫動物。該動物可以是非人類動物,諸如牛、禽、犬、馬、貓、羊、豬或靈長類動物。該動物可以是哺乳動物,諸如小鼠、大鼠、兔、貓、狗、猴或山羊。所述多種抗原可包含純化的或非純化的樣品,諸如純化的或非純化的細胞、蛋白質、肽或核酸。在另一實施方式中,所述多種抗原可包含非純化的樣品,諸如粗裂解物或未純化的細胞、蛋白質、肽或核酸樣品。所述多種抗原可包含生物樣品。例如,所述多種抗原可包含來自生物體的單個細胞或多個細胞、蛋白質、代表性肽或組織。該生物體可以是人或非人類。非人類生物體可以是哺乳動物,諸如小鼠、大鼠、兔、貓、狗、猴或山羊。該生物樣品可以是組織、血液、血清、血漿、尿液、腦脊液(CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊膜液、耵聹、母乳、支氣管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、Cowper液、射精前液體、女性射出液、汗水、淚水、囊腫液、胸膜液、腹膜液、心包液、淋巴、食糜、乳糜、膽汁、間隙液、月經、膿汁、皮脂、陰道分泌物、黏膜分泌物、糞便水、胰液、來自竇腔的灌洗液、支氣管肺抽出物、囊胚腔液或臍帶血。在一個實施方式中,該生物樣品可以基本上排除了常見的血清蛋白,例如但不限于白蛋白或IgG。排除可包括過濾、分級分離或親和純化。生物樣品可包含細胞,諸如干細胞、未分化細胞、已分化細胞或來自患病個體或具有特定狀況的個體的細胞。該疾病或狀況可以是癌癥、炎癥性疾病、免疫疾病、自身免疫疾病、心血管疾病、神經疾病、傳染病、代謝疾病或圍產期狀況。例如,癌癥可以是乳腺癌、卵巢癌、肺癌、結腸癌、結直腸癌、前列腺癌、黑素瘤、胰腺癌、腦癌、血液系統惡性腫瘤、肝細胞癌、宮頸癌、子宮內膜癌、頭頸癌、食道癌、胃腸道間質瘤(GIST)、腎細胞癌(RCC)或胃癌。所述多種抗原還可包含在細菌(諸如,但不限于大腸桿菌)、酵母、哺乳動物或昆蟲細胞中產生的樣品,諸如由生物體過量表達的蛋白質。純化的或非純化的抗原,諸如表達感興趣的抗原的過量表達細胞 或細胞混合物的形式,可用于免疫動物。所述多種抗原可包含至少11,000種不同的抗原,諸如至少12,000、13,000、14,000,15, 000,16, 000,17, 000,18, 000,19, 000 或 20,000 種不同的抗原。在步驟104中,然后可分離來自于動物的產生抗體的細胞,諸如淋巴樣細胞,以用于產生多種抗體。產生抗體的細胞可用于產生雜交瘤。產生抗體的細胞可以是B細胞。可將B細胞與骨髓瘤細胞融合以產生雜交瘤。骨髓瘤細胞的實例包括但不限于NS-1、P3U1、SP2/0、AP-1以及類似細胞。在步驟106中,產生抗體的細胞,諸如雜交瘤細胞,之后可用于產生無性系。例如,可將雜交瘤細胞置于半固體培養基上從而迅速地產生無性系。可利用熒光標記的抗原或同種型特異性探針分離感興趣的克隆,以用于表征和增殖。在步驟108中,針對抗原文庫探測感興趣的克隆,以檢測每種抗體識別的抗原,且同時獲得關于它不與哪些抗原反應的信息(消除假陽性)。抗原文庫可以代表生物體蛋白質組的至少 0.5%U%>2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9%,10%,11%>12%,13%,14%,15% ,16% ,17% ,18% ,19%, 20%,25%,30%,35%,40%,45%,50%,60%,70%,80%,90%或100%。抗原文庫可代表大部分或整個生物體蛋白質組,諸如細菌、病毒、真菌的蛋白質組。抗原文庫可代表昆蟲或哺乳動物(諸如小鼠、大鼠、兔、貓、狗、猴、山羊或人類)的大部分或整個蛋白質組。例如,抗原文庫可包含至少11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000或20,000種不同的抗原。抗原文庫可包含在表5中列出的人類蛋白質中的至少 0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13% ,14% ,15% ,16% ,17% ,18% ,19%,20%,25%,30%,35%,40%,45%,50%,60%,70 %、80 %、90 %或100 %。抗原文庫還可包含融合蛋白文庫,其代表未純化形式的生物體蛋白質組,如過量表達細胞的集合(大腸桿菌、酵母、哺乳動物、昆蟲或其他生物體)。可通過排列過量表達諸如融合蛋白的抗原的細胞或不同細胞系(如癌細胞系)的細胞以及針對該排列的細胞檢測雜交瘤上清液來進行探測。可對排列的細胞進行透性化。還可通過熒光流式細胞術進行探測,并通過對細胞內重組DNA的PCR或序列分析來鑒定靶標。在步驟110中,抗體具有期望的結合譜。選定的抗體可以是僅識別一個靶標且不與該生物體的蛋白質組文庫中的其他靶標交叉反應的高度特異性的單克隆抗體。可以擴大分泌這些單克隆抗體的細胞系。由相同的平臺或方案產生的抗體可用于產生或形成抗體文 庫。當抗體是通過在產生文庫的方法中如以下進一步描述的相同的方法或方案所產生時,抗體也可由相同的平臺產生。
            單特異性抗體文庫可包含多種不同的抗體,每種抗體對于其靶標具有特定的結合特異性。例如,抗體文庫可包含多種不同的抗體,其中抗體是單特異性的。在一個實施方式中,抗體文庫包含多種不同的抗體,其中所述多種抗體中的至少10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70%,80%,90%,95%,99%^; 100%是單特異性的。當在包含表5中所列的抗原的陣列上孵育時,如果抗體對于蛋白質或抗原具有大于6的A值和大于3的S值,則該抗體是單特異性的。對于一種抗體,高于整個陣列的平均信號強度的標準差的個數稱為A值。當對該抗體針對整個陣列的信號強度進行等級排序時,陣列上最高信號與第二高信號之間的差為S值。例如,A值和S值可通過以下步驟計算:將來自產生抗體的細胞或雜交瘤的單獨的上清液組合成12X12的二維池組,且將這些池在陣列(諸如人類蛋白質組微陣列)上孵育,并標記抗體(諸如通過Cy5-偶聯的抗IgG第二抗體或任何其他檢測抗體的方法)。洗滌和掃描之后,每個斑點(代表與陣列上的蛋白質或抗原結合的抗體)的信號強度以前景信號與背景信號的比值表示。高于整個陣列的平均信號強度的標準差的個數稱為A值。標記A>3的重復斑點(對于蛋白質或抗原的每個重復對),并將結果去卷積以鑒定在單個水平池和單個垂直池的交叉點上存在、并因此被單個單克隆抗體識別的蛋白質或抗原。單獨地針對整個陣列測試每種候選的高度特異性單克隆抗體(即A>3),并針對每種點樣蛋白質測量A。之后將信號強度進行等級排序,并計算陣列上的最高信號和第二高信號之間的差,得出S值。將A > 6且S > 3的單克隆抗體認定為單特異性單克隆抗體(mMAb)。雙特異性單克隆抗體(dMAb)強烈地與陣列上兩種不同的蛋白質結合,并具有A > 6且S > 3的值。在一些實施方式中,mMAb可具有大于 6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90 或100 的 A 值,和 / 或大于 3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90 或 100 的 S 值。在一個實施方式中,用于確定抗體的單特異性的陣列包含生物體的蛋白質組文庫,諸如生物體蛋白質組的至少0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、
            11%> 12% ,13% ,14% ,15% ,16% ,17% ,18% ,19%,20%,25%,30%,35%,40%,45%,50%、60%、70%、80%、90%或100%。抗原文庫可代表大部分或整個生物體蛋白質組,諸如細菌、病毒、真菌的蛋白質組。抗原文庫可代表昆蟲或哺乳動物(諸如小鼠、大鼠、兔、貓、狗、猴、山羊或人類)的大部分或整個蛋白質組。例如,生物體的蛋白質組文庫可包含至少11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000 或 20,000 種不同的抗原。生物體的蛋白質組文庫可包含在表5中列出的人類蛋白質中的至少0.5%,1%>2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9%,10%,11%>12%,13%,14%,15%,16%,17% ,18%,19%,20%,25%,30%,35%,40%,45%,50%,60%,70%,80%,90%^; 100%。
            結合栄和力抗體文庫可包含對其靶標具有特定結合親和力的多種不同抗體。例如,該文庫可包含多種不同抗體,其中所述多種抗體中的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%具有特定結合親和力。例如,所述多種抗體對其靶蛋白可具有如通過其解離常數(Kd)確定的至少io_7m,諸如至少ιοΛ^κΤμ'ιο,μ'ιοΑμ'κγΚμ、1(Γ13Μ、1(Γ14Μ、I(T15M 或 I(T16M 的結合親和力。所述多種抗體可具有如通過其結合速率常數(km)測定的結合親和力,其中所述多種抗體具有至少IO4M·W至少5X IO4M-1S'至少IO5M-V1'至少5X IO5IT1S'至少IO6IT1S'至少5X IO6M-1S'至少IO7M-1S'至少5Χ107Μ 或至少IO8ITV1的結合親和力。所述多種抗體可具有如通過其解離速率常數Gwf)測定的結合親和力,其中所述多種抗體具有小于IO3ITV1、小于5 X IO3IT1S'小于IO4IT1S'小于5 X IO4IT1S'小于IO5MW小于 5 X IO5MW 小于 IO6IT1S' 小于 5 X IO6MW 小于 IO7IT1S' 小于 5 X IO7MW 或小于IO8IT1S'小于5 X IO7MW小于IO8MW小于5 X IO8IT1S'小于IO9MW小于5X IO9M-1 S—1、或小于IO10M-1S-1的結合親和力。可通過表面等離子體共振、色譜法或本領域已知的任何其他方法來確定結合親和力。還可通過光學法,諸如通過使用檢測生物分子相互作用的實時方法和/或無標記的方法來確定結合親和力。在一個實施方式中,使用了斜入射光反射差法(OIRD)。抗體文庫可包含結合其靶蛋白的天然形式的多種不同的抗體。例如,該文庫可包含多種不同的抗體,其中所述多種抗體中的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%結合其靶蛋白的天然形式。在一個實施方式中,結合其靶蛋白的天然形式的所述多種抗體在相同的結合條件下不結合其靶蛋白的變性形式。抗體文庫可包含多種不同的抗體,其中該文庫的一種或多種抗體對其靶標具有的結合親和力與所述多種抗體中的另一抗體的結合親和力相似。例如,抗體文庫可包含第一抗體和第二抗體,其中第一抗體對第一蛋白質的結合親和力與第二抗體對第二蛋白質的結合親和力相似。該文庫的一種抗體對其靶標具有的結合親和力可在該文庫的一種或多種其他抗體的結合親和力的至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13 %、14%、15 %、16 %、17 %、18 %、19 %或20 %以內。該文庫的第一抗體對其靶標具有的結合親和力可在該文庫的一種或多種其他抗體的結合親和力的至少20%以內。在一個實施方式中,抗體文庫可包含多種不同的抗體,其中所述不同抗體中的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%對其靶蛋白具有的結合親和力在所述多種不同抗體中的其余抗體對其各自靶蛋白的結合親和力的至少20%以內。
            蛋白質組本文還提供了可包含與生物體蛋白質組的一部分結合的多種不同抗體的抗體文庫。所述多種不同抗體可結合生物體蛋白質組的至少0.5%U %>2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9% ,10% ,11% >12% ,13% ,14% ,15% ,16% ,17% ,18% ,19%,20%,25%,30%,35%,40%,45%,50%,60%,70%,80%,90%^; 100%。例如,所述多種不同的抗體可結合生物體的至少 11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000 或20,000種蛋白質。蛋白質組可以是細菌、病毒、真菌的蛋白質組。蛋白質組可以是昆蟲或哺乳動物如小鼠、大鼠、兔、貓、狗、猴、山羊或人類的蛋白質組。在一些實施方式中,蛋白質組是人類蛋白質組。例如,所述多種不同的抗體可結合人類蛋白質組的至少0.5%。在一個實施方式中,所述多種不同的抗體可結合人類蛋白質組的至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、
            9%U0 %U1 %>12 %U3 %,14%U5 %U6 %,17 %,18 %,19 %,20%,25 %,30 %,3540%、45%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。所述多種不同的抗體可結合在表5中列出的人類蛋白質中的至少 0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12% ,13% ,14% ,15% ,16% ,17% ,18% ,19%,20%,25%,30%,35%,40%,45%,50%,60%,70%,80%,90%^; 100%。
            其他抗體特征抗體文庫 還可包含多種不同的抗體,其中抗體是IgG抗體(例如,IgG同種型抗體)。例如,抗體文庫可包含多種不同的抗體,其中至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%的抗體是IgG抗體或IgG同種型抗體。抗體文庫還可包含多種不同的抗體,其中抗體是免疫沉淀抗體。例如,抗體文庫可包含多種不同的抗體,其中至少 10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,95%,99%或100%的抗體是免疫沉淀抗體。免疫沉淀抗體是與無抗體陰性對照和抗-V5抗體陽性對照相比能夠從細胞勻漿中免疫沉淀靶蛋白的抗體。免疫沉淀的靶標的檢測可通過Western印跡法進行。免疫沉淀可用透明細胞裂解物和大約2 μ g的抗體來進行,隨后在4°C下孵育2小時,然后加入基底以結合任何抗體-蛋白質復合物(諸如蛋白質-G Dynabead),而后在4°C下再孵育2小時。孵育之后,例如用冰冷的TBST洗滌基底兩次,將基底轉移至新的反應容器中,再次用冰冷的TBST洗滌,之后進行SDS-PAGE和Western印跡分析。
            牛物學涂徑一方面,本發明涉及包含對于共同途徑的抗原為特異性的多種抗體的抗體文庫。當抗原在基因本體(將確定的特征分配給一組基因及其產物的集合)中具有一種或多種共同的屬性時,抗原屬于共同的途徑。由基因本體(“G0”)聯合會管理的該本體在這一點上是特別有用的。可通過搜索共享一種或多種屬性的基因的基因本體(諸如G0)來鑒定屬于共同途徑的抗原。共同屬性可以是,例如,共同的結構特征、共同的位置、共同的生物過程或共同的分子功能。出版的、同行評議的文獻中存在的、關于人類基因和蛋白質的功能的大量信息已經使用由基因本體(GO)聯合會(http://www.geneontology.0rg/)管理的受控詞表的協作系統得到組織和管理。在人類基因組中的大約40,000個轉錄的單元中,其中大約20,000個編碼注釋的蛋白質,且這些蛋白質中的大約14,OOO個在GO數據庫中具有功能注釋。包含在GO數據庫中的功能注釋以分層的方式得到組織,且可以從GO數據庫訪問該信息并搜索人類基因組中所有注釋為參與相同的生物過程、存在于相同的細胞成分中或執行相同的分子功能的基因。在一些實施方式中,共同途徑中的抗原是參與如由基因本體注釋的相同生物過程或分子功能的基因的表達產物。其一個實例是參與對DNA損傷的反應的基因。另一實例是諸如特定的組織、細胞類型或器官的轉錄因子的基因產物。一個實例是腦的轉錄因子的基因產物。在一些實施方式中,共同途徑中的抗原是全部由相同的轉錄因子蛋白質、轉錄因子蛋白質的復合物、結合蛋白質的其他核酸或其他分子結合的基因的基因產物。這些相互作用可發生在活細胞中(體內)或純化的分子的溶液中(體外)。例如,由低氧誘導轉錄因子蛋白質結合的基因的所有基因產物。在一些實施方式中,共同途徑中的抗原是當處理或暴露于相同刺激物時其轉錄水平或蛋白質水平發生改變并因此得到協同調控的基因的基因產物。例如,當用UV輻射處理時誘導的或抑制的所有抗原。在一些實施方式中,共同途徑中的抗原是包含相似序列特征的抗原。這些特征可以是DNA序列基序、DNA序列基序的集合或可與隨機基因組序列的背景|旲型區分開的更聞級序列特征的富集。如本文所用的序列基序是一串兩個或更多個核酸堿基(A、T、C或G)。DNA序列基序可通過共有序列或概率矩陣來確定,概率矩陣中每個堿基在基序的每個位置處的身份被定義為概率。在一些實施方式中,共同途徑中的抗原可以是其序列、轉錄物或蛋白質通過代謝轉化和/或物理的蛋白質-蛋白質、蛋白質-DNA和蛋白質-化合物相互作用而連接的基因的基因產物。酶催化這些反應,且常常需要飲食礦物質、維生素和其他輔因子以便正常作用。由于可能涉及到許多化學品,途徑可能相當復雜。在一些實施方式中,途徑的成員共享共同的結構或功能屬性。例如,蛋白質可以共孚相同的序列基序,諸如鋒指或跨I吳區。在一些實施方式中,共同途徑中的抗原屬于相同的信號轉導途徑。通常,在生物學中,信號轉導是指細胞通過其將一種信號或刺激轉變為另一種的任何過程,最常見地涉及細胞內有序的一系列生物化學反應,這些反應通過酶進行,由第二信使激活,導致被視為信號轉導途徑的途徑。通常,信號轉導涉及細胞外信號分子(或配體)與從質膜朝向外并觸發細胞內事件的細胞表面受體的結合。此外,細胞內信號級聯可通過細胞-基底的相互作用而觸發,如對于結合在細胞外基質中發現的配體的整合素的情況。類固醇代表由于其親脂性或疏水性而可以穿過質膜的細胞外信號分子的另一個實例。許多,但不是所有的類固醇,具有細胞質中的受體且通常通過刺激其受體與類固醇響應基因的啟動子區域的結合而發揮作用。在多細胞生物體內,具有多種不同的小分子和多肽,它們作為一個整體用于協調生物體環境中細胞的單獨的生物活性。這些分子的實例包括激素(例如,褪黑素)、生長因子(例如,表皮生長因子)、細胞 外基質成分(例如,纖連蛋白)、細胞因子(例如,Y-干擾素)、趨化因子(例如,RANTES)、神經遞質(例如,乙酰膽堿)和神經營養蛋白(例如,神經生長因子)。
            除了以上所列的許多常規信號轉導刺激之外,在復雜生物體中,還存在引發信號轉導過程的其他的環境刺激的實例。環境刺激還可以是自然界中的分子或更多是物理刺激,諸如照射眼睛的視網膜上的細胞的光、與鼻上皮中的嗅覺受體結合的增味劑、刺激味蕾中的味覺感受器的苦味和甜味、改變細胞中的DNA的紫外線以及激活細胞中的一系列事件的低氧。某些微生物分子,例如病毒核苷酸、細菌脂多糖或蛋白質抗原,能夠引起通過信號轉導過程介導的、免疫系統針對入侵的病原體的應答。基因的激活、新陳代謝的改變、細胞的持續增殖和死亡以及運動的刺激或抑制是需要信號轉導的對細胞外刺激的一些細胞反應。基因激活導致進一步的細胞效應,因為許多響應基因的蛋白質產物包括酶和轉錄因子本身。作為信號轉導級聯的結果而產生的轉錄因子可轉而激活更多的基因。因此初始刺激可觸發整個一組基因的表達,并且其轉而可導致許多復雜生理事件的激活。這些事件包括,例如,由胰島素刺激的從血流中攝取葡萄糖的增加,以及由細菌產物刺激的中性粒細胞向感染部位的遷移。大多數哺乳動物細胞需要刺激來不僅控制細胞分裂,而且控制生存。在缺乏生長因子刺激時,大多數細胞中將隨之發生程序性細胞死亡。對細胞外刺激的這樣的需求對于在單細胞和多細胞生物體中控制細胞行為都是必要的。信號轉導途徑對于生物過程是如此重要,以至于將大量的疾病歸因于其調節異常不足為奇。在一些實施方式中,本發明提供了包括包含抗原特異性的多種抗體的文庫的方法和組合物,該抗原是腫瘤學途徑的一部分。腫瘤學途徑中的抗原是那些參與增生、腫瘤形成和/或癌癥的發展的基因的基因產物。腫瘤學途徑的實例包括但不限于低氧、DNA損傷、細胞凋亡、細胞周期和P53途徑。在一些實施方式中,本發明提供了包括包含抗原特異性的多種抗體的文庫的方法和組合物,該抗原是膜途徑的一部分。膜途徑的實例包括但不限于轉運蛋白、G-偶聯受體、離子通道、細胞粘附蛋白和受體途徑。在一些實施方式中,本發明提供了包括包含抗原特異性的多種抗體的文庫的方法和組合物,該抗原是核受 體途徑的一部分。核受體途徑中抗原的實例包括但不限于,由糖皮質激素受體蛋白、雌激素受體蛋白、過氧化物酶體增生物激活受體蛋白、雄激素受體蛋白以及包括ABC和SLC轉運蛋白在內的轉運蛋白途徑調控的基因產物。在一些實施方式中,本發明提供了包括包含抗原特異性的多種抗體的文庫的方法和組合物,該抗原是神經元途徑的一部分。神經元途徑中抗原的實例包括但不限于在神經兀中表達的基因的基因廣物,如神經遞質和細胞粘附蛋白。在一些實施方式中,本發明提供了包括包含抗原特異性的多種抗體的文庫的方法和組合物,該抗原是血管途徑的一部分。血管途徑中抗原的實例包括但不限于參與血管生成、脂類代謝以及炎癥的抗原。在一些實施方式中,本發明提供了包括包含抗原特異性的多種抗體的文庫的方法和組合物,該抗原是信號途徑的一部分。信號途徑中抗原的實例包括但不限于參與細胞間信號傳導的基因產物、激素、激素受體、cAMP響應以及細胞因子。在一些實施方式中,本發明提供了包括包含抗原特異性的多種抗體的文庫的方法和組合物,該抗原是酶途徑的一部分。酶途徑中抗原的實例包括但不限于參與糖酵解、厭氧呼吸、三羧酸循環/檸檬酸循環、氧化磷酸化、脂肪酸氧化(β -氧化)、糖異生、HMG-CoA還原酶途徑、磷酸戊糖途徑、葉啉合成(或血紅素合成)途徑、尿素循環、光合作用(植物、藻類、藍細菌)以及化學合成(一些細菌)的基因的基因產物。本發明還提供了包含對于多種抗原為特異性的多種抗體的文庫,這些抗原中有至少 5%UO%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,99%100%的抗原是共同途徑的一部分。在一些實施方式中,本發明提供了包含對于多種抗原為特異性的多種抗體的文庫,在這些抗原中有至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、99%或100%的抗原是腫瘤學途徑的一部分。在一些實施方式中,本發明提供了包含對于多種抗原為特異性的多種抗體的文庫,這些抗原中有至少5 %、10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70%、80%、90%、99%或100%的抗原是低氧途徑的一部分。在一些實施方式中,本發明提供了包含對于多種抗原為特異性的多種抗體的文庫,這些抗原中有至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、99% 或 100 % 的抗原是 DNA 損傷途徑的一部分。在一些實施方式中,本發明提供了包含對于多種抗原為特異性的多種抗體的文庫,這些抗原中有至少 5%,10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,99%^; 100%的抗原是細胞凋亡途徑的一部分。在一些實施方式中,本發明提供了包含對于多種抗原為特異性的多種抗體的文庫,這些抗原中有至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、99%或100%的抗原是細胞周期途徑的一部分。在一些實施方式中,本發明提供了包含對于多種抗原為特異性的多種抗體的文庫,這些抗原中有至少5 %、10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、99 %或100 %的抗原是p53途徑的一部分。在一些實施方式中,本發明提供了包含對于多種抗原為特異性的多種抗體的文庫,這些抗原中有至少5 % UO % ,20 % ,30 % ,40 % ,50 % ,60 % ,70 % ,80 % ,90 % ,99 % 100% 的抗原不同地選自低氧途徑、DNA損傷途徑、細胞凋亡途徑、細胞周期循環途徑以及p53途徑。在一些實施方式中,本發明提供了包含對于多種抗原為特異性的多種抗體的文庫,這些抗原中有至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、99%或100%的抗原是膜結合途徑的一部分。在一些實施方式中,本發明提供了包含對于多種抗原為特異性的多種抗體的文庫,這些抗原中有至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、99%或100%的抗原是核受體途徑的一部分。在一些實施方式中,本發明提供了包含對于多種抗原為特異性的多種抗體的文庫,這些抗原中有至少5 %、10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70%、80%、90%、99%或100%的抗原是糖皮質激素受體途徑的一部分。在一些實施方式中,本發明提供了包含對于多種抗原為特異性的多種抗體的文庫,這些抗原中有至少5%、
            10%、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、99 % 或 100 % 的抗原是過氧化物酶體增生物激活受體途徑的一部分。在一些實施方式中,本發明提供了包含對于多種抗原為特異性的多種抗體的文庫,這些抗原中有至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、99%或100%的抗原是雌激素受體途徑的一部分。在一些實施方式中,本發明提供了包含對于多種抗原為特異性的多種 抗體的文庫,這些抗原中有至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、99%或100%的抗原是雄激素受體途徑的一部分。在一些實施方式中,本發明提供了包含對于多種抗原為特異性的多種抗體的文庫,這些抗原中有至少 5%,10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,99%^; 100%的抗原是細胞色素P450受體途徑的一部分。在一些實施方式中,本發明提供了包含對于多種抗原為特異性的多種抗體的文庫,這些抗原中有至少5 %、10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70%、80%、90%、99%或100%的抗原是轉運蛋白受體途徑的一部分。在一些實施方式中,本發明提供了包含對于多種抗原為特異性的多種抗體的文庫,這些抗原中有至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、99% 或 100% 的抗原不同地選自糖皮質激素受體途徑、過氧化物酶體增生物激活受體途徑、雌激素受體途徑、雄激素受體途徑、細胞色素P450途徑以及轉運蛋白途徑。在一些實施方式中,本發明提供了包含對于多種抗原為特異性的多種抗體的文庫,這些抗原中有至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、99%或100%的抗原是血管途徑的一部分。在一些實施方式中,本發明提供了包含對于多種抗原為特異性的多種抗體的文庫,這些抗原中有至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、99%或100%的抗原是神經元途徑的一部分。在一些實施方式中,本發明提供了包含對于多種抗原為特異性的多種抗體的文庫,這些抗原中有至少5 %、10 %、20 %、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、99%或100%的抗原是轉錄因子途徑的一部分。在一些實施方式中,本發明提供了包含對于多種抗原為特異性的多種抗體的文庫,這些抗原中有至少 5 %、10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、99 % 或 100 % 的抗原是信號傳導途徑的一部分。本發明還提供了包含對于多種抗原為特異性的多種抗體的文庫,其中該文庫代表基因組中為共同途徑的一部分的所有抗原的至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、99%或100%。在一些實施方式中,本發明提供了包含對于多種抗原為特異性的多種抗體的文庫,其中該文庫代表基因組中為腫瘤學途徑的一部分的所有抗原的至少 5%,10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,99%^; 100%。在一些實施方式中,本發明提供了包含對于多種抗原為特異性的多種抗體的文庫,其中該文庫代表基因組中為低氧途徑的一部分的所有抗原的至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、99%或100%。在一些實施方式中,本發明提供了包含對于多種抗原為特異性的多種抗體的文庫,其中該文庫代表基因組中為DNA損傷途徑的一部分的所有抗原的至少 5%UO%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,99%100%。在一些實施方式中,本發明提供了包含對于多種抗原為特異性的多種抗體的文庫,其中該文庫代表基因組中為細胞凋亡途徑的一部分的所有抗原的至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、99%或100%。在一些實施方式中,本發明提供了包含對于多種抗原為特異性的多種抗體的文庫,其中該文庫代表基因組中為細胞周期途徑的一部分的所有抗原的至少 5%UO%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,99%100%。在一些實施方式中,本發明提供了包含對于多種抗原為特異性的多種抗體的文庫,其中該文庫代表基因組中為P53途徑的一部分的所有抗原的至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、99% 或 100%。在一些實施方式中,本發明提供了包含對于多種抗原為特異性的多種抗體的文庫,其中該文庫代表基因組中為膜結合途徑的一部分的所有抗原的至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、99% 或 100%。在一些實施方式中, 本發明提供了包含對于多種抗原為特異性的多種抗體的文庫,其中該文庫代表基因組中為核受體途徑的一部分的所有抗原的至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、99%或100%。在一些實施方式中,本發明提供了包含對于多種抗原為特異性的多種抗體的文庫,其中該文庫代表基因組中為糖皮質激素受體途徑的一部分的所有抗原的至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、99%或100%。在一些實施方式中,本發明提供了包含對于多種抗原為特異性的多種抗體的文庫,其中該文庫代表基因組中為過氧化物酶體增生物激活受體途徑的一部分的所有抗原的至少 5%UO%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,99%100%。在一些實施方式中,本發明提供了包含對于多種抗原為特異性的多種抗體的文庫,其中該文庫代表基因組中為雌激素受體途徑的一部分的所有抗原的至少40%、50%、60%、70%、80%、90%、99%或100%。在一些實施方式中,本發明提供了包含對于多種抗原為特異性的多種抗體的文庫,其中該文庫代表基因組中為雄激素受體途徑的一部分的所有抗原的至少 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、99%或100%。在一些實施方式中,本發明提供了包含對于多種抗原為特異性的多種抗體的文庫,其中該文庫代表基因組中為細胞色素P450受體途徑的一部分的所有抗原的至少5%、10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,99%^; 100%。在一些實施方式中,本發明提供了包含對于多種抗原為特異性的多種抗體的文庫,其中該文庫代表基因組中為轉運蛋白受體途徑的一部分的所有抗原的至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、99% 或 100%。本發明還提供了包含對于多種抗原為特異性的多種抗體的文庫,其中該文庫代表基因組中為神經元途徑的一部分的所有抗原的至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、99%或100%。本發明還提供了包含對于多種抗原為特異性的多種抗體的文庫,其中該文庫代表基因組中為信號傳導途徑的一部分的所有抗原的至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、99% 或 100%。本發明還提供了包含對于多種抗原為特異性的多種抗體的文庫,其中該文庫代表基因組中為血管途徑的一部分的所有抗原的至少 5%UO%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,99%100%。本發明還提供了包含對于多種抗原為特異性的多種抗體的文庫,其中該文庫代表基因組中為轉錄因子途徑的一部分的所有抗原的至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、99% 或 100%。
            產生抗體文庫的方法
            本文還提供了產生抗體文庫的方法。在一個實施方式中,該方法包括(a)利用多種抗原免疫動物;(b)從該動物分離產生抗體的細胞;(c)從該產生抗體的細胞分離多種抗體;(d)利用蛋白質陣列(諸如人類蛋白質陣列)篩選步驟c)的多種抗體;以及(d)選擇對于蛋白質組陣列上的單一靶標為單特異性的抗體。在一個實施方式中,該方法可進一步包括在步驟c)之前預篩選來自產生抗體的細胞的多種抗體。動物可以是非人類動物,諸如牛、禽、犬、馬、貓、羊、豬或靈長類動物。動物可以是哺乳動物,諸如小鼠、大鼠、兔、貓、狗、猴或山羊。可以利用可包含純化的或非純化的樣品(諸如純化的或非純化的細胞、蛋白質、肽或核酸)的多種抗原來免疫動物。在另一實施方式中,所述多種抗原可包含非純化的樣品,諸如粗裂解物或未純化的細胞樣品、蛋白質樣品、肽樣品或核酸樣品。所述多種抗原可包含生物樣品。例如,所述多種抗原可包含來自諸如牛、禽、犬、馬、貓、羊、豬或靈長類動物的生物體的單種細胞或多種細胞、蛋白質、代表性肽或組織。生物體可以是人類或非人類。非人類生物體可以是哺乳動物,諸如小鼠、大鼠、兔、貓、狗、猴或山羊。生物樣品可以是組織、血液、血清、血漿、尿液、腦脊液(CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊膜液、耵聹、母乳、支氣管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、Cowper液、射精前液體、女性射出液、汗水、淚水、囊腫液、胸膜液、腹膜液、心包液、淋巴、食糜、乳糜、膽汁、間隙液、月經、膿汁、皮脂、陰道分泌物、黏膜分泌物、糞便水、胰液、來自竇腔的灌洗液、支氣管肺抽出物、囊胚腔液或臍帶血。在一個實施方式中,生物樣品可以基本上排除了常見血清蛋白,諸如但不限于白蛋白或IgG。排除可包括過濾、分級分離或親和純化。生物樣品可包含細胞,諸如干細胞、未分化細胞、已分化細胞或來自患病個體或具有特定狀況的個體的細胞。疾病或狀況可以是癌癥、炎癥性疾病、免疫疾病、自身免疫疾病、心血管疾病、神經疾病、傳染病、代謝疾病或圍產期狀況。例如,癌癥可以是乳腺癌、卵巢癌、肺癌、結腸癌、結直腸癌、前列腺癌、黑素瘤、胰腺癌、腦癌、血液系統惡性腫瘤、肝細胞癌、宮頸癌、子宮內膜癌、頭頸癌、食道癌、胃腸道間質瘤(GIST)、腎細胞癌(RCC)或胃癌。所述多種抗原還可包含產生于細菌(諸如,但不限于大腸桿菌)、酵母、哺乳動物或昆蟲細胞中的樣品,諸如由生物體過量表達的蛋白質。純化的或非純化的抗原,諸如表達感興趣的抗原的過量表達細胞或細胞混合物的形式,可用于免疫動物。所述多種抗原可包含至少11,000種不同的抗原,諸如至少12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000 或 20,000 種不同的抗原。在一些實施方式中,所述多種抗原包含人類蛋白質組的至少0.5%。所述多種抗原可包含生物體的蛋白質組的至少 0.5%U%>2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9%,10%,11%>12%,13%,14%,15% ,16% ,17% ,18% ,19%,20%,25%,30%,35%,40%,45%,50%,60%,70%,80%,90%或100%。所述多種抗原可包含人類蛋白質組的至少0.5%U%>2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9% ,10% ,11% >12% ,13% ,14% ,15% ,16% ,17% ,18% ,19%,20%,25%,30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90%或 100%。所述多種抗原可包含在表5 中列出的蛋白質中的至少 0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12% ,13% ,14% ,15% ,16% ,17% ,18% ,19%,20%,25%, 30%,35%,40%,45%,50%,60 %、70 %、80 %、90 %或100 %。抗原文庫還可包含融合蛋白文庫,其代表未純化形式的生物體蛋白質組,諸如過量表達細胞的集合(大腸桿菌、酵母、哺乳動物、昆蟲或其他生物體)。來自動物的產生抗體的細胞可以是淋巴樣細胞,諸如B細胞。產生抗體的細胞可用于產生雜交瘤,例如,與諸如骨髓瘤細胞的無限增殖細胞融合以產生雜交瘤。
            在一個實施方式中,進行預篩選步驟,其中在從產生抗體的細胞分離多種抗體之前,篩選來自產生抗體的細胞的多種抗體。可通過使用產生抗體的細胞的血清或上清液來進行預篩選,以確定來自所述產生抗體的細胞的抗體與包含一種或多種靶抗原(諸如天然抗原或蛋白質)的混合物的結合。可使用免疫組織化學、免疫細胞化學、ELISA、色譜法或本領域已知用來測定結合的任何其他合適的方法進行預篩選。預篩選可用于選擇產生抗體的細胞(其可包括已經與無限增殖細胞融合的抗體分泌細胞,諸如雜交瘤)用于進一步篩選,諸如通過本文所述的蛋白質陣列。
            混合物可包含粗裂解物、細胞、蛋白質、肽或核酸。混合物可包含生物樣品,諸如組織、血液、血清、血漿、尿液、腦脊液(CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊膜液、耵聹、母乳、支氣管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、Cowper液、射精前液體、女性射出液、汗水、淚水、囊腫液、胸膜液、腹膜液、心包液、淋巴、食糜、乳糜、膽汁、間隙液、月經、膿汁、皮脂、陰道分泌物、黏膜分泌物、糞便水、胰液、來自竇腔的灌洗液、支氣管肺抽出物、囊胚腔液或臍帶血。在一個實施方式中,生物樣品可以基本上排除了常見血清蛋白,諸如但不限于白蛋白或IgG。排除可包括過濾、分級分離或親和純化。生物樣品可包含細胞,諸如干細胞、未分化細胞、已分化細胞或來自患病個體或具有特定狀況的個體的細胞。可以在具有或沒有先前的預篩選步驟的情況下,分離來自產生抗體的細胞的多種抗體,之后利用生物體蛋白質組的整體或一部分進行篩選。例如,可利用生物體蛋白質組的至少 0.5%U %>2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9%,10%,11%>12%,13%,14%,15%,16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90% 或100%篩選分離的抗體。例如,可利用至少 11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000或20,000種生物體蛋白質篩選分離的抗體。蛋白質組可以是細菌、病毒、真菌的蛋白質組。蛋白質組可以是昆蟲或哺乳動物如小鼠、大鼠、兔、貓、狗、猴、山羊或人類的蛋白質組。在一些實施方式中,蛋白質組是人類的蛋白質組。例如,可利用人類蛋白質組的至少0.5%來篩選分離的抗體。在一個實施方式中,利用人類蛋白質組的至少 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13% ,14% ,15% ,16% ,17% ,18% ,19%,20%,25%,30%,35%,40%,45%,50%,60%,70%、80%、90%或100%篩選分離的抗體。可利用在表5中列出的人類蛋白質中的至少0.5%U %>2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9%,10%,11%>12%,13%,14%,15%,16%,17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90% 或 100%篩選分離的抗體。用于篩選抗體的蛋白質組或其部分可存在于陣列上。在篩選之后,可基于其結合譜選擇抗體。例如,如果抗體與蛋白質組的單個靶標結合,例如與人類蛋白質組陣列的單個靶標結合,則可以為本文所述的文庫選擇該抗體。該方法可用于進行抗體的高通量生產。例如,免疫小鼠的抗原可以高通量的方式生產。這可以如下進行:1)從基因表達文庫針對性地產生重組蛋白,其中可根據需要或通過使用全部異源細胞、組織或來自靶物種的粗細胞提取物或富集的細胞提取物(非定向方法)或設計用于表達異源蛋白的全部哺乳動物細胞(定向方法)來表達感興趣的蛋白質。用于注射的提取物可以包括亞細胞成分,諸如細胞膜和細胞內膜、細胞器、顆粒或蛋白質復合物,且可使用差速離心或其他眾所周知的方法來制備。這些用蛋白質復雜混合物進行的免疫最終可產生針對最高免疫原性的蛋白質的抗體;在該事件中,可使用先前分離的抗體免疫消耗抗原來源,以去除任何特別的抗原性蛋白質。此外,可溶性蛋白質和膜蛋白可在其天然或變性狀態下通過尺寸排阻、離子交換、疏水色譜法或親和色譜法或通過使用單獨收集的小級分以利用數十種到數百種而非數千種蛋白質進行免疫而層析。同樣,對提取物的簡單硫酸銨分級分離將提供多種抗原子集。可使用靶向特定類別的蛋白質的特定技術。例如,參與SNO信號傳導的蛋白質可通過固定化金屬親和色譜法(IMAC)來純化,之后可將洗脫的無金屬的蛋白質用作免疫的抗原,或可將磷蛋白結合到TiO2親和基質上從而得到極大地濃縮。從活細胞或固定細胞直接分離或獲得的天然蛋白質可以是優選的免疫原來源。
            高通量方法還可包括短時間免疫以產生分泌抗體的淋巴樣細胞。例如,可利用多種抗原和佐劑制劑以后足墊的方式免疫動物。從免疫后的7天到21天收集胭淋巴結。通過在足墊處注射伊文思藍而直接顯示在免疫動物中的淋巴結。高通量方法還可包括在GST-耐受的小鼠中產生抗體。因為許多抗原表達為GST融合體,所以表達GST的小鼠品系(主動表達來自日本血吸蟲(S.japonicum)的GST的小鼠)可用于增加針對融合蛋白的非-GST成分的特異性抗體的產率,并消除抗-GST抗體的產生。用于產生抗體的高通量方法還可包括用于抗體生產的細胞融合體/雜交瘤的構建。將接觸過抗原的淋巴樣細胞和骨髓瘤細胞融合,并將融合產物接種在含有熒光標記的識別期望的免疫球蛋白分子子類的抗體的半固體培養基(甲基纖維素)上,或含有熒光標記的、將標記分泌期望的抗體的菌落的抗原的半固體培養基上。還可使用上述方法的組合。利用倒置突光顯微鏡與使用Drummond微細管和DrummondWireTrol裝置的手動挑取相結合,將熒光標記的菌落從半固體培養基中轉移到液體培養基中,然后長出個體克隆。對于使用重組或天然蛋白質在高通量方法中產生的單克隆抗體,可通過蛋白質微陣列去卷積來鑒定相應的抗原。可以進行單步去卷積。例如,當利用完整的細胞或細胞裂解物產生雜交瘤時,應用二維池分析策略來揭示每種單克隆抗體將識別的抗原的身份。將雜交瘤的上清液排列在二維網格中并以3X3至100X100的池大小水平和垂直地進行池分析。還可進行三維池分析策略,其中雜交瘤排列在平板組中以產生3X3X3到IOOX IOOX 100格式的平板池以及水平和垂直池。得到的池分別與蛋白質微陣列雜交并用微陣列分析軟件進行評分。分別在二維和三維設計中,每個水平和垂直對共享的陽性(命中)或在平板、水平和垂直池(稱作三重組)的每個3向交叉點處共享的陽性(命中),被鑒定為位于相同對或三重組交叉點處的單克隆抗體所識別的抗原。必要時,通過用相應的抗體探測微陣列來確認鑒定的抗原。因為陣列的成本很高,所以池分析策略可以降低表征或生產抗體的成本,并且例如IOX 10池的使用將分析100個克隆所需的陣列數從100個減少到20個;對于20 X 20的池,其可將所需的陣列數從400個減少到40個。例如,三維池可以篩選一批4096個雜交瘤,而16X16X16的3D策略只需要48個陣列。使用IOX 10策略,將可以使用820個陣列。圖2中描述了基于96孔板的3D池分析策略(12X8X12)。在高通量方法中產生的單克隆抗體的表征可使用完整蛋白質組微陣列來進行。該微陣列可用于確定給定的單克隆抗體所結合的特異性抗原。關于單克隆抗體親和力、與其他抗原的潛在交叉反應性或缺少交叉反應性的關鍵質量信息都通過陣列分析來提供。高通量方法中單克隆抗體的生產可來自融合克隆。單克隆抗體在體外或體內以所需的量產生。可利用各種已確立的方法純化這些抗體。基于使用蛋白質微陣列對單克隆抗體的表征,可選定聞質量(例如,聞未和力和低交叉反應性)的單克隆抗體并用于產生抗體陣列。選定抗體并將其濃度標準化為相似效價。可將它們與合適的陽性(例如,稀釋的人IgG)和陰性(例如,人IgM和BSA)對照以多孔格式(例如,96孔、384孔或1562孔)排列,以使用微陣列機械手(例如,Nanoprint,Arraylt, Inc.)制備抗體微陣列。可定制不同微陣列配置的單克隆抗體的排列以促進一系列全蛋白質組研究。使用抗體文庫的方法本文還提供了鑒定針對靶標的抗體的方法,該方法包括使靶標與抗體文庫接觸,確定該靶標與多種抗體之間的結合;以及當靶標與文庫的抗體結合時,鑒定針對該靶標的抗體。本文還提供了鑒定靶標的方法,該方法包括使靶標與抗體文庫接觸,確定該靶標與多種抗體之間的結合;以及當靶標與文庫的抗體結合時,鑒定該靶標的抗體。抗體文庫可以附著于基底上,使得靶標與包含該抗體文庫的陣列相接觸。文庫可包含諸如以上所述的多種不同的抗體。例如,抗體文庫可包含通過相同平臺產生的抗體。文庫可包含多種不同的抗體,其中在所述多種抗體或所述多種抗體的子集(諸如所述多種抗體的至少 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100% )中,抗體由相同的平臺產生,為單特異性的,結合其靶蛋白的天然形式;為單克隆的;為免疫沉淀抗體;為IgG抗體(例如,IgG同種型抗體);對其靶標具有的結合親和力與所述多種抗體中的另一抗體的結合親和力相似(例如,在至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%或 20% 內);每種抗體對其靶標具有至少KT7M(Kd)(例如,諸如至少ΙΟΛ^Κ^Μ'ΙΟ,Μ'ΙΟΑΜ'ΚΓυΜ、10_13M、10_14M、10_15M或I(T16M)的結合親和力;或其任意組合。該文庫可包含至少50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900 或 1000 種不同的單克隆抗體,結合生物體蛋白質組(例如,人類蛋白質組)的至少0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%,8%,9% ,10% ,11% >12% ,13% ,14% ,15% ,16% ,17% ,18% ,19%,20%,25%,30%,35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90%或100%,結合在表5中列出的人類蛋白質中的至少 0.5%,1%>2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9%,10%,11%>12%,13%,14%,15% ,16% ,17% ,18% ,19%,20%,25%,30%,35%,40%,45%,50%,60%,70%,80%,90%或100%,或其任意組合。本文還提供了鑒定對于蛋白質(諸如人類蛋白質)為單特異性的抗體的方法,該方法包括:使多種抗體與蛋白質組陣列(諸如人類蛋白質組陣列)接觸;確定多種抗體與存在于蛋白質組陣列上的靶 標之間的結合;以及將抗體鑒定為單特異性的。陣列可包含多種抗原或蛋白質,該多種抗原或蛋白質包含生物體蛋白質組的至少0.5%、1%、2%、3%、4%,5%,6%,7%,8%,9%,10%,11 %>12%,13%,14%,15%,16%,17%,18%,19%,20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90% 或 100%。例如,蛋白質組陣列可包含生物體的至少 11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,OOO或20,OOO種蛋白質。生物體可以是細菌、病毒或真菌。生物體可以是昆蟲或哺乳動物,諸如小鼠、大鼠、兔、貓、狗、猴、山羊或人類。例如,蛋白質組可包含人類蛋白質組的至少0.5%U %>2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9%,10%,11%>12%,13%,14%,15%,16%,17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90% 或 100%。蛋白質組陣列可包含在表5中列出的人類蛋白質中的至少0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%,7%,8%,9% ,10% ,11% >12% ,13% ,14% ,15% ,16% ,17% ,18% ,19%,20%,25%,30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90% 或 100%。可通過本領域已知的技術(例如,放射免疫測定、ELISA(酶聯免疫吸附測定)、“夾心”免疫測定、免疫放射測定、凝膠擴散沉淀反應、免疫擴散測定、原位免疫測定(例如,使用膠體金、酶或放射同位素標記)'Western印跡法、沉淀反應、凝集測定(例如,凝膠凝集測定、血細胞凝集測定等)、補體固定測定、免疫熒光測定、蛋白A測定以及免疫電泳測定)檢測結合。可通過檢測第一抗體上的標記來檢測抗體的結合。或者,通過檢測第二抗體或試劑與第一抗體的結合來檢測第一抗體。例如,可以標記第二抗體。在一些實施方式中,采用自動檢測測定或高通量系統。例如,在捕獲微酶聯免疫吸附測定(ELISA)中,通過抗體的固定化和隨后對結合的標記抗原的直接或間接比色、熒光、發光或放射性檢測使得抗體/抗原反應成為可測量的。例如,可用生物素或將允許下游檢測的其他標記物標記抗原。固定化抗體通常將與存在的單個抗原決定簇結合。可通過例如包含抗原決定簇的生物標記物的標記來標記抗原決定簇。該反應的特異性將允許ELISA測定中的量化。可使用高通量格式的ELISA反應來經由以下步驟篩選所有雜交瘤上清液。可采用基于非ELISA的其他原理的篩選測定(例如,抗體微陣列、基于MALDI/MS和/或多通道毛細管電泳的高通量篩選)。可通過,例如,已發布的方法來評估ELISA或微陣列數據。數據分析過程的目的是選擇顯示具有重要臨床參數且對于一個分析物組特異的最佳集合的雜交瘤上清液。
            微陣列基底在一些實施方式中,本發明提供了包含抗體文庫和基底的陣列(或微陣列)。在一些實施方式中,每種抗體固定在基底上。可將抗體可逆地或不可逆地固定在基底上。基底可以是平面的或是顆粒,且可包含實心或多孔材料。基底可以是有機的或無機的、生物的或非生物的,或這些材料的任意組合。在一個實施方式中,基底是透明的或半透明的。斑塊(patches)所位于的基底的表面部分優選為平坦且牢固或半牢固的。許多材料適合用作基底。基底可包含硅、二氧化硅、玻璃或聚合物。例如,基底可 以包含選自硅、二氧化硅、石英、玻璃、可控孔度玻璃、碳、氧化鋁、二氧化鈦、鍺、氮化硅、沸石以及砷化鎵的材料。許多金屬,諸如金、鉬、鋁、銅、鈦及其合金,也是可用于陣列基底的選擇。此外,許多陶瓷和聚合物也可用作基底。可用作基底的聚合物包括但不限于以下材料:聚苯乙烯;聚四氟乙烯;聚偏二氟乙烯;聚碳酸酯;聚甲基丙烯酸甲酯;聚乙烯基乙烯;聚乙烯亞胺;聚醚醚酮;聚甲醛(POM);聚乙烯基苯酚;聚乳酸;聚甲基丙烯酰亞胺(PMI);聚烯砜(PAS);聚羥乙基甲基丙烯酸酯;聚二甲基硅氧烷 ’聚丙烯酰胺;聚酰亞胺;嵌段共聚物;以及Eupergit 。光致抗蝕劑、聚合L-B膜以及LiGA結構也可用作本發明中的基底。在一個實施方式中,不同抗體的微陣列結合在涂覆有聚陽離子聚合物的載玻片上。根據本發明的另一方面形成基底,并打算用于檢測靶分子與一種或多種不同抗體的結合。在一個實施方式中,基底包括在其表面上形成有聚陽離子聚合物(優選地,諸如聚賴氨酸或聚精氨酸的陽離子多肽)涂層的玻璃基底。在聚陽離子涂層上形成不同生物聚合體的微陣列,各自定位于已知選定的陣列區域,諸如區域。可通過將聚陽離子聚合物,例如,聚L-賴氨酸的均勻厚度薄膜放置在載玻片表面上并將該薄膜干燥以形成干燥的涂層而涂覆載玻片。添加的聚陽離子聚合物的量足以在玻璃表面上形成至少單層聚合物。聚合物薄膜通過表面上帶負電的甲硅烷基-OH基團與聚合物中帶電荷的胺基團之間的靜電結合而結合到表面上。聚L-賴氨酸涂覆的載玻片可從,例如,Sigma Chemical C0.(St.Louis, M0.)購買到。
            合適的微陣列基底也通過玻璃的化學衍生來制備。將在末端Si上具有合適的離去基團的硅烷化合物共價結合于玻璃表面上。衍生分子可設計用于賦予玻璃基底表面期望的化學性質。這種雙功能試劑的一個實例為氨基-丙基-三(乙氧基)硅烷,其在該分子的三(乙氧基)硅烷部分與玻璃表面反應,同時使得該分子的氨基部分游離。具有末端氨基基團的表面適合于以與聚賴氨酸涂覆的載玻片相同的方式吸附生物聚合物。末端表面基團的身份可通過進一步的化學反應而修飾。例如,在上述實例中末端胺與戊二醛的反應產生末端醛基。在點樣微陣列之前可應用進一步的修飾層以獲得期望的反應性,諸如通過將蛋白A或蛋白G溶液應用于甲硅烷基化的(silynated)玻璃。其他結合多肽的表面為可從Schleicher和Schuell購買到的硝化纖維涂覆的載玻片以及諸如聚苯乙烯的蛋白質結合塑料。點樣的抗體可通過吸附或共價結合而附著。通過點樣多肽和陣列基底之間的靜電相互作用、疏水相互作用、范德華相互作用或氫鍵相互作用而發生吸附。在水環境中將多肽溶液簡單應用于表面足以吸附該多肽。通過多肽上的官能團與化學活化的表面的反應實現共價連接。例如,如果表面已經用高反應性親電子基團如醛或琥珀酰亞胺基團活化,則未修飾的多肽在胺基團處,如在賴氨酸殘基或末端胺處反應以形成共價鍵。

            為了形成微陣列,使用本領域已知的任何合適的方法將確定體積的不同生物聚合物沉積在聚合物涂覆的載玻片上。根據基底的重要特征,當在允許樣品中的標記配體與基底陣列中的同源結合對結合的條件下將含水樣品應用于基底時,沉積的抗體仍然非共價結合于涂覆的載玻片表面。在一些實施方式中,每個微陣列在每個小于約Icm2的表面積上包含至少50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900 或 1000 種不同的抗體。在一個實施方式中,在約16mm2的面積內,微陣列包含50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350或400個區域,或2.5 X IO3個區域/cm2。另外,在一個優選的實施方式中,每個微陣列區域中的抗體以約0.1飛摩爾至100納摩爾之間的確定的量存在。另外,在一個優選的實施方式中,生物聚合物具有至少約50個單元,例如氨基酸、核苷酸等的長度,即,比通過各種原位合成方案以高密度陣列可形成的聚合物明顯更長。
            微陣列的使用本發明的微陣列可用于醫學診斷、藥物發現、分子生物學、免疫學和毒理學。根據本發明制備的固定化抗體的微陣列在許多診斷和篩選應用中可用于大規模結合測定。大量靶標(例如,蛋白質)水平的定量變異的多重測量允許由幾個到許多不同的靶標(例如,蛋白質)確定的模式的識別。可以同時評估許多生理參數和疾病特異性模式。一個實施方式涉及生物樣品中存在的蛋白質的分離、鑒定和表征。例如,通過對比疾病樣品和對照樣品,能夠鑒定“疾病特異性蛋白質”。這些蛋白質可用作藥物開發的靶標或用作疾病的分子標記。抗體陣列可用于監測樣品中蛋白質的表達水平,其中這些樣品可包括感興趣的組織的活檢、培養的細胞、微生物細胞群體、包括血液、血漿、淋巴、滑液、腦脊液、細胞裂解物、培養物上清液、羊膜液等的生物流體及其衍生物。特別感興趣的是生物流體的臨床樣品,包括血液及其衍生物、腦脊液、尿液、唾液、淋巴、滑液等。這樣的測定可以是定量的、半定量的或定性的。在測定為定量的或半定量的時,其優選地包含競爭型格式,例如在標記的和未標記的樣品之間,或在區別標記的樣品之間。用于檢測固定化多肽的靶分子的存在的測定可如下進行,但該方法不必局限于本文所述的那些方法,且包括本領域已知的任何合適的方法。將樣品、其級分或小份加入到包含抗體的微陣列中。樣品可包含許多如上所述的生物流體或提取物。優選地,含有已知濃度的對照配體的一系列標準作為對照與樣品或其小份平行測定。孵育時間應該足夠靶分子結合多肽。一般為約0.l-3h,通常為lh,但可以長達I天或更久。孵育后,通常洗掉 不溶性載體上的非結合成分。通常,將合適pH(通常為7-8)的稀釋的非離子型去污劑介質用作洗滌介質。可采用1-6次洗滌,使用足以徹底地洗掉樣品中存在的非特異性結合的蛋白質的體積。為了檢測結合的靶標的存在,可使用許多方法。這些分成三個普通組。可利用可檢測的標記物來標記祀標本身,并直接測定結合的標記物的量。或者,在競爭測定中標記的樣品可與區別標記的或未標記的樣品混合。在又一實施方式中,樣品本身不進行標記,但加入第二階段標記試劑以便定量存在的配體的量。允許直接測量配體結合的標記物的實例包括放射性同位素標記(諸如咕或125I)、熒光劑、染料、珠子、化學發光劑、膠體顆粒等等。合適的熒光染料是本領域已知的,包括異硫氰酸熒光素(FITC);羅丹明和羅丹明衍生物;德克薩斯紅;藻紅蛋白;別藻藍蛋白;6-羧基熒光素(6-FAM) ;2' ,T -二甲氧基-4',5' -二氯_6_羧基熒光素(JOE);6-羧基-X-羅丹明(ROX) ;6_羧基-2' A' ,T,4,7-六氯熒光素(HEX) ;5_羧基熒光素(5-FAM) ;N,N,N',N' _四甲基_6_羧基羅丹明(TAMRA);磺化羅丹明;Cy3 ;Cy5等。優選地,待標記的化合物與活化染料相結合,該活化染料與配體上存在的基團(例如,氨基、硫醇基、醒基等)進行反應。特別是,在例如通過添加識別靶標的標記抗體進行第二階段檢測時,標記可以是在添加合適的底物之后能夠提供可檢測產物信號的共價結合的酶。用于偶聯物中的合適的酶的實例包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、蘋果酸脫氫酶等等。在不能購買到時,這類抗體-酶偶聯物可容易地通過本領域技術人員已知的技術生產。第二階段結合試劑可以是以足夠的特異性結合靶分子的任何化合物,以便其可與存在的其他成分區分開。在一個優選的實施方式中,第二階段結合試劑為配體特異性的抗體,其為單克隆或多克隆血清,例如,小鼠抗人抗體等。為了信號的放大,可利用諸如生物素、洋地黃毒苷等試劑來標記配體,其中第二階段試劑將包含適合于該標記物的抗生物素蛋白、鏈霉親和素、抗洋地黃毒苷抗體等。可通過例如使用掃描激光顯微鏡、熒光測定、改良的ELISA讀板器等掃描微陣列以檢測配體的結合。例如,掃描激光顯微鏡可針對所用的每個熒光團使用合適的激發光線進行單獨掃描。之后合并由該掃描產生的數字圖像用于隨后的分析。對于任何特定的陣列元素,將用一種標記物的熒光信號的比值與來自另一種標記DNA的熒光信號進行比較,并確定相對豐度。檢測靶分子的微陣列和方法可用于許多篩選、研究和診斷測定。在一種應用中,抗體陣列與來自生物體的總蛋白質結合,從而為了研究或診斷目的監測蛋白質表達。利用一種顏色的熒光團標記來自正常細胞的總蛋白質且利用另一種顏色的熒光團標記來自患病細胞的總蛋白質,并同時將兩種樣品與同一陣列結合,允許以兩種熒光團強度的比值測定不同的蛋白質表達。該雙色實驗可用于監測在不同組織類型中的表達、疾病狀態、對藥物的響應或對環境因素的響應。在篩選測定中,例如為了確定一種蛋白質或多種蛋白質是否與疾病途徑相關或是否與疾病特異性表型相關,可由培養的細胞進行測定。可通過添加作用于感興趣的靶標或途徑的藥理活性劑來實驗操作這些細胞。該應用對于闡明生物學功能或治療靶標的發現至
            關重要。對于許多診斷和研究目的,測定血液或血清中的靶分子例如蛋白質的水平是有用的。該應用對于與特定診斷或預后相關的臨床上有用的標記物的發現和診斷至關重要。例如,通過平行監測一系列抗體或T細胞受體特異性,可以確定自身免疫疾病過程中、感染期間、移植物排斥中等的抗體的水平和動力學。或者,可通過正常的和患病的血液樣品的對比或通過對比疾病不同階段的臨床樣品來開發與感興趣的疾病相關的新型蛋白質標記物。關于生物體基因組中蛋白質表達的信息可具有許多應用,包括但不限于通過結合諸如發病、疾病的發展、抗病性、疾病易感性或藥物反應之類的表型,以個性化方式診斷和治療疾病(也稱作“個性化醫學”)。在細胞或組織特異性方面對與生物體基因組中生物途徑有關的蛋白質的鑒定和表征還可有助于針對具有增強的治療效果和降低的副作用的治療設計轉基因表達構建體。在細胞或組織特異性方面對蛋白質表達的鑒定和表征還可有助于針對疾病的診斷、預防和治療開發功能標記物。“疾病”包括但不限于期望改變的生物體的任何狀況、性狀或特征。例如,狀況可以是物理的、生理的或心理的,且可以是有癥狀的或無癥狀的。在本發明的另一實施方式中,抗體陣列用于檢測蛋白質中的翻譯后修飾,其在研究信號傳導途徑和細胞調控中是重要的。翻譯后修飾可用對于蛋白質特定狀態(諸如磷酸化、糖基化、法呢基化(farnesylated)等)特異性的抗體進行檢測。配體和多肽之間的這些相互作用的檢測可導致醫學診斷。例如,通過將未知病原體的樣品與包含對于已知致病性抗原特異性的許多類型抗體的陣列結合,可以明確地確定病原微生物的身份。
            試齊U盒在一個實施方式中,提供了包含抗體文庫的試劑盒。在一些實施方式中,抗體文庫排列于諸如96或384孔的支持物中。在一個實施方式中,試劑盒包含抗體微陣列。試劑盒可進一步包括:報告測定底物;用于誘導或抑制特定生物途徑的試劑(細胞因子或其他純化的蛋白質、小分子、cDNA、siRNA等),和/或數據分析軟件。此外,提供了試劑盒,其包含用于執行本發明方法或利用本發明的任何組合物、文庫、陣列或物品組合進行測試或測定的試劑和說明。試劑盒可進一步包含緩沖液、酶、銜接子、標記物、第二抗體和使用該試劑盒所必需的說明,任選地包括疑難解答信息。在又一實施方式中,試劑盒可包含諸如本文所述的抗體文庫以及諸如生物體的蛋白質組的抗原文庫。試劑盒可包含生物體蛋白質組的至少0.5%U%>2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9% ,10% ,11% >12% ,13% ,14% ,15% ,16% ,17% ,18% ,19%,20%,25%,30%、35%、40%、45%、5 0%、60%、70%、80%、90%或 100%。抗原文庫可代表大部分或整個生物體蛋白質組,諸如細菌、病毒、真菌的蛋白質組。抗原文庫可代表昆蟲或哺乳動物(諸如小鼠、大鼠、兔、貓、狗、猴、山羊或人類)的大部分或整個蛋白質組。例如,生物體蛋白質組文庫可包含至少 11,000,12, 000,13, 000,14, 000,15, 000,16, 000,17, 000,18, 000、19,000或20,000種不同的抗原。生物體蛋白質組文庫可包含在表5中列出的人類蛋白質中的至少 0.5%,1%>2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9%,10%,11%>12%,13%,14%,15% ,16% ,17% ,18% ,19%,20%,25%,30%,35%,40%,45%,50%,60%,70%,80%,90%或 100%。
            實施例
            實施例1:將約17,000個全長人類ORF亞克隆至表達載體中。獲得了約16,000 個獨特 ORF 的Gateway ORF 集合(Invitrogen, CA),同時亞克隆了額外的1,000個全長人類0RF。構建了用于酵母的Gateway 相容性表達載體(pEGH-A),該載體在半乳糖誘導后在酵母中產生N-末端6xHis6::谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)融合蛋白(圖3)。隨后,以通過限制酶切消化確定的99%的成功率亞克隆了全部約17,000個人類0RF。尤其是,對該集合制備了三個重復,從其中之一中提取出了進入DNA(Entry DNA),并在瓊脂糖凝膠上檢查了質粒DNA的質量。之后將得到的重組體轉化入細菌并在含有Amp的平板上選擇單菌落。對于每個LR重組體,挑取了四個單菌落以產生甘油貯存液,將其中兩個進一步處理以在96孔格式中提取質粒DNA。將提取的質粒DNA用限制性內切酶消化以釋放插入物,并在瓊脂糖凝膠上電泳以檢查作為成功亞克隆的指示的載體和插入物大小(圖3)。基于預期插入物大小對每個限制事件進行評分,且成功率確定為99.3%。 大于200個隨機表達克隆的測序顯示100%的序列是正確的。將確認的表達構建體重新排列以產生用于酵母的表達克隆主集(masterset)。相似的大規模克隆在細菌表達載體內完成。
            實施例2 =5000種人類抗原的微陣列的設計與構建。進行預實驗以測試快速純化用于微陣列生產的正確折疊的重組蛋白的能力。這些蛋白質分為5種不同的功能類別:轉錄因子和轉錄輔助調節物、RNA結合蛋白、蛋白激酶、染色質相關蛋白和染色質修飾蛋白以及線粒體蛋白。根據一級序列、文獻和基因本體論注釋將蛋白質置于這些類別中。表達的ORF代表相關功能類別中全部人類蛋白質中的多達85%(就轉錄因子而言)。以足夠用于陣列構建的水平純化90%以上的表達的蛋白質(Ho,S.W.,等,Linking DNA-binding proteins totheir recognition sequences by using proteinmicroarrays.Proc Natl AcadSci U S A,2006.103(26):p.9940-5)。進行幾項功能試驗以確認表達的蛋白質在固定于固體表面后是有功能的。在包含來自酵母的119種獨立純化的蛋白質激酶的激酶芯片上進行自磷酸化測定,觀察到大約85%的激酶表現出可檢測的激酶活性(Zhu, H.,等,Analysis of yeast protein kinasesusing protein chips.NatGenet, 2000.26 (3) p.283-9.)。盡管是共價連接到固體表面,但是這些蛋白質激酶中的大多數明顯保持了其酶活性。使用由大約300種酵母轉錄因子組成的蛋白質芯片鑒定并表征各種DNA基序與轉錄因子之間的特異性相互作用(Ho,S.W.,等,Linking DNA-binding proteins to theirrecognition sequences by using proteinmicroarrays.Proc Natl Acad Sci U SA, 2006.103 (26):p.9940-5.)。還研究了 DNA 基序與人類轉錄因子之間的相互作用,其中由大約1,OOO種人類轉錄因子組成的先導蛋白質芯片用于證明已知的DNA基序與其文獻記錄的轉錄因子特異性結合;相反,在這些基序中的點突變顯著地降低其結合親和力(Hu, S.,等,Profiling the human protein-DNAinteractome reveals ERK2 as atranscriptional repressor of interferonnsignaling.Cell, 2009.139(3):p.610-22.)。
            實施例3:人類抗原蛋白質芯片的制備為了從酵母細胞純化全套17,000種人類蛋白質抗原,將整個人類ORF主集在PEGH-A中克隆至酵母中,挑取單菌落并制備甘油貯存液。誘導酵母細胞用于重組蛋白生產并儲存于_80°C下。為了監測誘導的培養物的質量,針對每批培養制備物一式二份接種24個隨機菌株并使其首先經歷蛋白質純化步驟。使用免疫印跡和銀染色技術,估計培養物誘導的成功率(圖4A)。只有當至少85%的純化蛋白質在免疫印跡和銀染色分析中在預期分子量范圍內顯示出主帶時才表明成功。否則,針對失敗批次重復培養物制備。使用該標準,全部17,000種抗原蛋白質以85%的成功率進行了純化。使用微陣列點樣儀將純化的人類抗原蛋白質點樣至各玻璃表面(例如,FAST、N1-NTA和FullMoon)以產生人類抗原芯片。通過利用抗-GST抗體和Cy3-標記的第二抗體探測載玻片來監測芯片的質量。掃描芯片并使用GenePix軟件獲得和分析信號。結果表明,芯片是高質量的且> 90%的點印的蛋白質產生顯著高于背景的信號(圖4B、圖4C)。
            實施例4:抗原微陣列上的抗體質暈譜分析針對在人肝臟中表達的蛋白質的單克隆抗體用傳統方法產生(Hu,S.,等,A protein chip approach for high-throughput antigen identification andcharacterization.Proteomics, 2007.7 (13):p.2151-61)。從腹水中純化大量單克隆抗體并在含有1%的BSA的PBS中稀釋10,000倍。使用人類肝臟蛋白質芯片評估mAb的質量(例如,親和力和特異 性)。根據文獻/數據庫檢索,將已知在人類肝臟中表達的1058種全長cDNA克隆至將這些蛋白質表達為N-末端GST融合蛋白的表達載體中。為了制備人類肝臟蛋白質芯片,表達這些基因,并利用谷胱甘肽親和色譜法從酵母細胞中純化這些基因,并點樣至載玻片上。同時將小鼠IgG點樣至芯片上以用作位標。用抗-GST抗體將抗原微陣列上固定化的人類肝臟蛋白質的量可視化和量化(圖5A)。結論是98.5% (I, 042/1,058)的蛋白質顯示出顯著高于背景的信號,且蛋白質芯片是高質量的。為了評估針對不同人類肝臟蛋白質產生的幾種單克隆抗體的特異性,于室溫(RT)下在自制的濕室中在輕輕搖動下將芯片用含1%的BSA的PBS緩沖液封閉至少lh。同時,將從腹水中純化的單克隆抗體在磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中稀釋20,000倍。封閉之后,將稀釋的mAb加入不同的芯片中并在室溫和輕輕搖動下孵育30min。之后將芯片于42°C搖動下在PBST (I %的吐溫20)緩沖液中洗滌3次,持續lOmin。將用Cy3標記的抗小鼠IgG抗體(Jackson Laboratories,美國,在PBS中稀釋11,000倍)加入芯片中并在室溫下于黑暗中孵育lh。之后將芯片于42°C在輕輕搖動下用預熱的PBS+0.1% Triton洗滌3次,每次持續lOmin。在過濾器除菌的雙去離子水中沖洗兩次后,將芯片旋轉至干。為了將結合譜可視化,我們用微陣列掃描儀掃描芯片并用GenePix軟件進一步分析了結合信號。如圖5B中所示,針對點樣于載玻片上的1,058種蛋白質檢測了針對pirin產生的mAb的特異性,且該mAb只識別pirin。因為每種點樣蛋白質的量不會顯著地變化,因此該結果表明抗體是高度特異性的。用針對其他四種人類蛋白質產生的mAb也得到了相似的結果(圖5C)。
            實施例5:單特異性抗體的產生和表征。響應于重組人類蛋白質以及活的人類癌癥細胞系的免疫已經產生了超過2,000種強IgG-分泌單克隆抗體。含有17,000種人類蛋白質的蛋白質微陣列已用于分析這些單克隆抗體中的88種的結合特異性。為了減少用于該分析的微陣列的數量,在圖6圖示的交叉分析中使用來自多達7個不同的雜交瘤的上清液的等量混合物,以檢查這些合并的抗體的特異性。88種單克隆抗體中的11種是真正單特異性的,因為微陣列上只有一種蛋白質被這些單克隆抗體所識別。另外7種單克隆抗體僅結合陣列上的3種不同的蛋白質,顯示高度限制性的特異性。對于其中4種單特異性單克隆抗體,不能購買到任何種類(多克隆或單克隆)的抗體,同時也不知道對于其他7種的任何可購買到的抗體是否是單特異性的。這些單特異性單克隆抗體以及可購買到的識別它們的抗體的列表示于表I中。被11種單特異性單克隆抗體識別的抗原按照基因符號ID列出。還列出了針對該蛋白質的所有可購買到的抗體(單克隆的和多克隆的)的數目,并且在括號內列出了針對該抗原的單克隆抗體的數目。
            表1:生成的單特異性mAb所識別的抗原。
            權利要求
            1.一種抗體文庫,其包含:多種不同的抗體,其中所述多種抗體中的至少10%是由相同的平臺產生的。
            2.如權利要求1所述的文庫,其中所述多種抗體中的至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%是由相同的平臺產生的抗體。
            3.如權利要求1-2所述的文庫,其中由相同的平臺產生的所述多種抗體中的每種抗體都是單特異性抗體。
            4.如權利要求1-3所述的文庫,其中由相同的平臺產生的所述多種抗體中的每種抗體對其靶蛋白具有至少10_7M(Kd)的結合親和力。
            5.如權利要求4所述的文庫,其中所述結合親和力至少為1(Γ12Μ、1(Γ13Μ、1(Γ14Μ、I (T15M 或 1(Γ16Μ。
            6.如權利要求1-5所述的文庫,其中由相同的平臺產生的所述多種抗體中的每種抗體結合其靶蛋白的天然形式。
            7.如權利要求1-6所述的文庫,其中所述多種抗體包含至少50種不同的抗體。
            8.如權利要求7所述的文庫,其中所述多種抗體包含至少75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900 或 1000 種不同的抗體。
            9.如權利要求1-8所述的文庫,其中所述多種抗體結合人類蛋白質組的至少0.5%。
            10.如權利要求9所述的文庫,其中所述多種抗體結合人類蛋白質組的至少I%、2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9%,10%,11% >12%,13%,14%,15%,16%,17%,18%,19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90% 或 100%。
            11.如權利要求1-10所述的文庫,其中所述多種抗體結合在表5中列出的人類蛋白質中的至少 0.5%U%>2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9%,10%,11%>12%,13%,14%,15% ,16% ,17% ,18% ,19%,20%,25%,30%,35%,40%,45%,50%,60%,70%,80%,90%或 100%。
            12.如權利要求1-11所述的文庫,其中由相同的平臺產生的所述多種抗體中的每種抗體對其靶標具有的結合親和力在由相同平臺產生的所述多種抗體中的另一抗體的結合親和力的至少20%以內。
            13.如權利要求12所述的文庫,其中由相同的平臺產生的所述多種抗體中的每種抗體對其靶標具有的結合親和力在由相同平臺產生的所述多種抗體中的另一抗體的結合親和力的至少 I %>2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9%,10%,11%>12%,13%,14%,15%,16%、17%、18%或 19% 以內。
            14.如權利要求1-13所述的文庫,其中由相同的平臺產生的所述多種抗體中的每種抗體都是單克隆抗體。
            15.如權利要求1-14所述的文庫,其中由相同的平臺產生的所述多種抗體中的每種抗體都是免疫沉淀抗體。
            16.如權利要求1-15所述的文庫,其中由相同的平臺產生的所述多種抗體中的每種抗體都是IgG抗體。
            17.一種陣列,其包含:如權利要求1-16所述的抗體文庫,其中每種抗體都固定在基底上。
            18.如權利要求17所述的陣列,其中所述基底是平面的。
            19.如權利要求17所述的陣列,其中所述基底是顆粒。
            20.如權利要求17-19所述的陣列,其中所述基底包含實心材料。
            21.如權利要求17-19所述的陣列,其中所述基底包含多孔材料。
            22.如權利要求17-21所述的陣列,其中所述固定是可逆的。
            23.如權利要求17-21所述的陣列,其中所述固定是不可逆的。
            24.一種產生如權利要求1-16所述的文庫的方法,該方法包括: a)用多種抗原免疫動物; b)從所述動物分離產生抗體的 細胞; c)從所述產生抗體的細胞分離多種抗體; d)利用人類蛋白質組陣列篩選步驟c)的所述多種抗體;以及 e)為所述文庫選擇對于所述蛋白質組陣列上的單一靶標為單特異性的抗體。
            25.如權利要求24所述的方法,進一步包括在步驟c)之前預篩選來自所述產生抗體的細胞的所述多種抗體。
            26.如權利要求25所述的方法,其中所述預篩選是通過進行免疫細胞化學而實現的。
            27.如權利要求25所述的方法,其中所述預篩選是通過確定來自所述產生抗體的細胞的抗體與包含一種或多種靶抗原的混合物的結合而實現的。
            28.如權利要求27所述的方法,其中所述混合物包含粗裂解物、細胞、蛋白質、肽或核酸。
            29.如權利要求27所述的方法,其中所述混合物包含生物樣品。
            30.如權利要求24-29所述的方法,其中所述多種抗原包含粗裂解物、細胞、蛋白質、肽或核酸。
            31.如權利要求24-29所述的方法,其中所述多種抗原包含生物樣品。
            32.如權利要求29和31所述的方法,其中所述生物樣品為組織、血液、血清、血漿、尿液、腦脊液(CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊膜液、耵聹、母乳、支氣管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、Cowper液、射精前液體、女性射出液、汗水、淚水、囊腫液、胸膜液、腹膜液、心包液、淋巴、食糜、乳糜、膽汁、間隙液、月經、膿汁、皮脂、陰道分泌物、黏膜分泌物、糞便水、胰液、來自竇腔的灌洗液、支氣管肺抽出物、囊胚腔液或臍帶血。
            33.如權利要求24-32所述的方法,其中所述多種抗原包含至少11,000種不同的抗原。
            34.如權利要求33所述的方法,其中所述多種抗原包含至少12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000 或 20,000 種不同的抗原。
            35.如權利要求24-32所述的方法,其中所述多種抗原包含人類蛋白質組的至少0.5%。
            36.如權利要求35所述的方法,其中所述多種抗原包含人類蛋白質組的至少1%、2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9% ,10% ,11% >12% ,13% ,14% ,15% ,16% ,17% ,18%,19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90% 或 100%。
            37.如權利要求24-36所述的方法,其中所述產生抗體的細胞是B細胞。
            38.如權利要求24-37所述的方法,進一步包括將所述抗體固定于基底上。
            39.如權利要求38所述的方法,其中所述基底是平面的。
            40.如權利要求38所述的方法,其中所述基底是顆粒。
            41.如權利要求38-40所述的方法,其中所述基底包含實心材料。
            42.如權利要求38-40所述的方法,其中所述基底包含多孔材料。
            43.如權利要求38-42所述的方法,其中所述固定是可逆的。
            44.如權利要求38-42所述的方法,其中所述固定是不可逆的。
            45.一種鑒定對于人類蛋白質為單特異性的抗體的方法,該方法包括: a)使多種抗體與人類蛋白質組陣列接觸; b)確定所述多種抗體與所述人類蛋白質組陣列上存在的靶標之間的結合;以及 c)當抗體與所述蛋白質組陣列上的單一靶標結合時,將所述抗體鑒定為單特異性的。
            46.如權利要求24-45所述的方法,其中所述人類蛋白質組陣列包含人類蛋白質組的至少0.5%。
            47.如權利要求46所述的方法,其中所述人類蛋白質組陣列包含人類蛋白質組的至少I 2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9%,10%,11%>12%,13%,14%,15%,16%,17%,18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90% 或 100%。
            48.如權利要求24 -47所述的方法,其中所述人類蛋白質組陣列包含在表5中列出的人類蛋白質中的至少 0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13% ,14% ,15% ,16% ,17% ,18% ,19%,20%,25%,30%,35%,40%,45%,50%,60%,70%、80%、90% 或 100%。
            49.一種鑒定針對靶標的抗體的方法,該方法包括: a)使靶標與權利要求1-16的所述抗體文庫接觸; b)確定所述靶標與所述多種抗體之間的結合;以及 c)當所述靶標與所述文庫的抗體結合時,鑒定針對所述靶標的抗體。
            50.一種鑒定針對靶標的抗體的方法,該方法包括: a)使靶標與權利要求17-23的所述陣列接觸; b)確定所述靶標與所述多種抗體之間的結合;以及 c)當所述祀標與所述陣列的抗體結合時,鑒定針對所述祀標的抗體。
            51.—種鑒定祀標的方法,該方法包括: a)使靶標與權利要求1-16的所述抗體文庫接觸; b)確定所述靶標與所述多種抗體之間的結合;以及 c)當所述靶標與所述文庫的抗體結合時,鑒定所述靶標。
            52.—種鑒定祀標的方法,該方法包括: a)使靶標與權利要求17-23的所述陣列接觸; b)確定所述靶標與所述多種抗體之間的結合;以及 c)當所述靶標與所述陣列的抗體結合時,鑒定所述靶標。
            全文摘要
            本發明提供了一種抗體文庫,其中所述抗體文庫可包含多種單克隆抗體、單特異性抗體或免疫沉淀抗體。本發明還提供了產生和使用該抗體文庫的方法。
            文檔編號C40B40/10GK103168119SQ201180039055
            公開日2013年6月19日 申請日期2011年6月16日 優先權日2010年6月16日
            發明者杰夫·D·伯克, 恒·朱, 塞斯·布萊克肖, 丹尼爾·J·艾興格, 伊格納西奧·皮諾 申請人:Cdi實驗室, 約翰·霍普金斯大學
            網友詢問留言 已有0條留言
            • 還沒有人留言評論。精彩留言會獲得點贊!
            1
            婷婷六月激情在线综合激情,亚洲国产大片,久久中文字幕综合婷婷,精品久久久久久中文字幕,亚洲一区二区三区高清不卡,99国产精品热久久久久久夜夜嗨 ,欧美日韩亚洲综合在线一区二区,99国产精品电影,伊人精品线视天天综合,精品伊人久久久大香线蕉欧美
            亚洲精品1区 国产成人一级 91精品国产欧美一区二区 亚洲精品乱码久久久久久下载 国产精品久久久久久久伊一 九色国产 国产精品九九视频 伊人久久成人爱综合网 欧美日韩亚洲区久久综合 欧美日本一道免费一区三区 夜夜爽一区二区三区精品 欧美日韩高清一区二区三区 国产成人av在线 国产精品对白交换绿帽视频 国产视频亚洲 国产在线欧美精品 国产精品综合网 国产日韩精品欧美一区色 国产日韩精品欧美一区喷 欧美日韩在线观看区一二 国产区精品 欧美视频日韩视频 中文字幕天天躁日日躁狠狠躁97 视频一二三区 欧美高清在线精品一区二区不卡 国产精品揄拍一区二区久久 99久久综合狠狠综合久久aⅴ 亚洲乱码视频在线观看 日韩在线第二页 亚洲精品无码专区在线播放 成人亚洲网站www在线观看 欧美三级一区二区 99久久精品免费看国产高清 91麻豆国产在线观看 最新日韩欧美不卡一二三区 成人在线观看不卡 日韩国产在线 在线亚洲精品 亚洲午夜久久久久中文字幕 国产精品成人久久久久久久 精品国产一区二区在线观看 欧美精品国产一区二区三区 中文在线播放 亚洲第一页在线视频 国产午夜精品福利久久 九色国产 精品国产九九 国产永久视频 久久精品人人做人人综合试看 国产一区二区三区免费观看 亚洲精品国产电影 9999热视频 国产精品资源在线 麻豆久久婷婷国产综合五月 国产精品免费一级在线观看 亚洲国产一区二区三区青草影视 中文在线播放 国产成人综合在线 国产在线观看色 国产亚洲三级 国产片一区二区三区 久久99精品久久久久久牛牛影视 亚洲欧美日韩国产 四虎永久免费网站 国产一毛片 国产精品视频在 九九热在线精品 99精品福利视频 色婷婷色99国产综合精品 97成人精品视频在线播放 精品久久久久久中文字幕 亚洲欧美一区二区三区孕妇 亚洲欧美成人网 日韩高清在线二区 国产尤物在线观看 在线不卡一区二区 91网站在线看 韩国精品福利一区二区 欧美日韩国产成人精品 99热精品久久 国产精品免费视频一区 高清视频一区 精品九九久久 欧美日韩在线观看免费 91欧美激情一区二区三区成人 99福利视频 亚洲国产精品91 久热国产在线 精品久久久久久中文字幕女 国产精品久久久久久久久99热 成人自拍视频网 国产精品视频久久久久久 久久影院国产 国产玖玖在线观看 99精品在线免费 亚洲欧美一区二区三区导航 久久久久久久综合 国产欧美日韩精品高清二区综合区 国产精品视频自拍 亚洲一级片免费 久久久久久九九 国产欧美自拍视频 视频一区二区在线观看 欧美日韩一区二区三区久久 中文在线亚洲 伊人热人久久中文字幕 日韩欧美亚洲国产一区二区三区 欧美亚洲国产成人高清在线 欧美日韩国产码高清综合人成 国产性大片免费播放网站 亚洲午夜综合网 91精品久久一区二区三区 国产无套在线播放 国产精品视频网站 国产成人亚洲精品老王 91在线网站 国产视频97 欧美黑人欧美精品刺激 国产一区二区三区免费在线视频 久久久国产精品免费看 99re6久精品国产首页 久久精品91 国产成人一级 国产成人精品曰本亚洲 日本福利在线观看 伊人成综合网 久久综合一本 国产综合久久久久久 久久精品成人免费看 久久福利 91精品国产91久久久久久麻豆 亚洲精品成人在线 亚洲伊人久久精品 欧美日本二区 国产永久视频 国产一区二 一区二区福利 国产一毛片 亚洲精品1区 毛片一区二区三区 伊人久久大香线蕉综合影 国产欧美在线观看一区 亚洲国产欧洲综合997久久 国产一区二区免费视频 国产91精品对白露脸全集观看 久久亚洲国产伦理 欧美成人伊人久久综合网 亚洲性久久久影院 久久99国产精一区二区三区! 91精品国产欧美一区二区 欧美日韩亚洲区久久综合 日韩精品一二三区 久久久夜色精品国产噜噜 国产在线精品福利91香蕉 久久久久久久亚洲精品 97se色综合一区二区二区 91国语精品自产拍在线观看性色 91久久国产综合精品女同我 日韩中文字幕a 国产成人亚洲日本精品 久久国产精品-国产精品 久久国产经典视频 久久国产精品伦理 亚洲第一页在线视频 国产精品久久久久三级 日韩毛片网 久久免费高清视频 麻豆国产在线观看一区二区 91麻豆国产福利在线观看 国产成人精品男人的天堂538 一区二区三区中文字幕 免费在线视频一区 欧美日韩国产成人精品 国产综合网站 国产资源免费观看 亚洲精品亚洲人成在线播放 精品久久久久久中文字幕专区 亚洲人成人毛片无遮挡 国产一起色一起爱 国产香蕉精品视频在 九九热免费观看 日韩亚洲欧美一区 九九热精品在线观看 精品久久久久久中文字幕专区 亚洲欧美自拍偷拍 国产精品每日更新 久久久久国产一级毛片高清板 久久天天躁狠狠躁夜夜中文字幕 久久精品片 日韩在线毛片 国产成人精品本亚洲 国产成人精品一区二区三区 九九热在线观看 国产r级在线观看 国产欧美日韩精品高清二区综合区 韩国电影一区二区 国产精品毛片va一区二区三区 五月婷婷伊人网 久久一区二区三区免费 一本色道久久综合狠狠躁篇 亚洲综合色站 国产尤物在线观看 亚洲一区亚洲二区 免费在线视频一区 欧洲精品视频在线观看 日韩中文字幕a 中文字幕日本在线mv视频精品 91精品在线免费视频 精品国产免费人成在线观看 精品a级片 中文字幕日本在线mv视频精品 日韩在线精品视频 婷婷丁香色 91精品国产高清久久久久 国产成人精品日本亚洲直接 五月综合视频 欧美日韩在线亚洲国产人 精液呈暗黄色 亚洲乱码一区 久久精品中文字幕不卡一二区 亚洲天堂精品在线 激情婷婷综合 国产免费久久精品久久久 国产精品亚洲二区在线 久久免费播放视频 五月婷婷丁香综合 在线亚洲欧美日韩 久久免费精品高清麻豆 精品久久久久久中文字幕 亚洲一区网站 国产精品福利社 日韩中文字幕免费 亚洲综合丝袜 91精品在线播放 国产精品18 亚洲日日夜夜 伊人久久大香线蕉综合影 亚洲精品中文字幕乱码影院 亚洲一区二区黄色 亚洲第一页在线视频 一区二区在线观看视频 国产成人福利精品视频 亚洲高清二区 国内成人免费视频 精品亚洲性xxx久久久 国产精品合集一区二区三区 97av免费视频 国产一起色一起爱 国产区久久 国产资源免费观看 99精品视频免费 国产成人一级 国产精品九九免费视频 欧美91精品久久久久网免费 99热国产免费 久久精品色 98精品国产综合久久 久久精品播放 中文字幕视频免费 国产欧美日韩一区二区三区在线 精品久久蜜桃 国产小视频精品 一本色道久久综合狠狠躁篇 91在线免费观看 亚洲精品区 伊人成综合网 伊人热人久久中文字幕 伊人黄色片 99国产精品热久久久久久夜夜嗨 久久免费精品视频 亚洲一区二区三区高清不卡 久久久久国产一级毛片高清板 国产片一区二区三区 久久狠狠干 99久久婷婷国产综合精品电影 国产99区 国产精品成人久久久久 久久狠狠干 青青国产在线观看 亚洲高清国产拍精品影院 国产精品一区二区av 九九热在线免费视频 伊人久久国产 国产精品久久久久久久久久一区 在线观看免费视频一区 国产精品自在在线午夜区app 国产精品综合色区在线观看 国产毛片久久久久久国产毛片 97国产免费全部免费观看 国产精品每日更新 国产尤物视频在线 九九视频这里只有精品99 一本一道久久a久久精品综合 久久综合给会久久狠狠狠 国产成人精品男人的天堂538 欧美一区二区高清 毛片一区二区三区 国产欧美日韩在线观看一区二区三区 在线国产二区 欧美不卡网 91在线精品中文字幕 在线国产福利 国内精品91久久久久 91亚洲福利 日韩欧美国产中文字幕 91久久精品国产性色也91久久 亚洲性久久久影院 欧美精品1区 国产热re99久久6国产精品 九九热免费观看 国产精品欧美日韩 久久久久国产一级毛片高清板 久久国产经典视频 日韩欧美亚洲国产一区二区三区 欧美亚洲综合另类在线观看 国产精品自在在线午夜区app 97中文字幕在线观看 视频一二三区 精品国产一区在线观看 国产欧美日韩在线一区二区不卡 欧美一区二三区 伊人成人在线观看 国内精品91久久久久 97在线亚洲 国产在线不卡一区 久久久全免费全集一级全黄片 国产精品v欧美精品∨日韩 亚洲毛片网站 在线不卡一区二区 99re热在线视频 久久激情网 国产毛片一区二区三区精品 久久亚洲综合色 中文字幕视频免费 国产视频亚洲 婷婷伊人久久 国产一区二区免费播放 久久99国产精品成人欧美 99国产在线视频 国产成人免费视频精品一区二区 国产不卡一区二区三区免费视 国产码欧美日韩高清综合一区 久久精品国产主播一区二区 国产一区电影 久久精品国产夜色 国产精品国产三级国产 日韩一区二区三区在线 久久97久久97精品免视看 久久国产免费一区二区三区 伊人久久大香线蕉综合电影网 99re6久精品国产首页 久久激情网 亚洲成人高清在线 国产精品网址 国产成人精品男人的天堂538 香蕉国产综合久久猫咪 国产专区中文字幕 91麻豆精品国产高清在线 久久国产经典视频 国产精品成人va在线观看 国产精品爱啪在线线免费观看 日本精品久久久久久久久免费 亚洲综合一区二区三区 久久五月网 精品国产网红福利在线观看 久久综合亚洲伊人色 亚洲国产精品久久久久久网站 在线日韩国产 99国产精品热久久久久久夜夜嗨 国产综合精品在线 国产区福利 精品亚洲综合久久中文字幕 国产制服丝袜在线 毛片在线播放网站 在线观看免费视频一区 国产精品久久久精品三级 亚洲国产电影在线观看 最新日韩欧美不卡一二三区 狠狠综合久久综合鬼色 日本精品1在线区 国产日韩一区二区三区在线播放 欧美日韩精品在线播放 亚洲欧美日韩国产一区二区三区精品 久久综合久久网 婷婷六月激情在线综合激情 亚洲乱码一区 国产专区91 97av视频在线观看 精品久久久久久中文字幕 久久五月视频 国产成人福利精品视频 国产精品网址 中文字幕视频在线 精品一区二区三区免费视频 伊人手机在线视频 亚洲精品中文字幕乱码 国产在线视频www色 色噜噜国产精品视频一区二区 精品亚洲成a人在线观看 国产香蕉尹人综合在线 成人免费一区二区三区在线观看 国产不卡一区二区三区免费视 欧美精品久久天天躁 国产专区中文字幕 久久精品国产免费中文 久久精品国产免费一区 久久无码精品一区二区三区 国产欧美另类久久久精品免费 欧美精品久久天天躁 亚洲精品在线视频 国产视频91在线 91精品福利一区二区三区野战 日韩中文字幕免费 国产精品99一区二区三区 欧美成人高清性色生活 国产精品系列在线观看 亚洲国产福利精品一区二区 国产成人在线小视频 国产精品久久久久免费 99re热在线视频 久久久久久久综合 一区二区国产在线播放 成人国产在线视频 亚洲精品乱码久久久久 欧美日韩一区二区综合 精品久久久久免费极品大片 中文字幕视频二区 激情粉嫩精品国产尤物 国产成人精品一区二区视频 久久精品中文字幕首页 亚洲高清在线 国产精品亚洲一区二区三区 伊人久久艹 中文在线亚洲 国产精品一区二区在线播放 国产精品九九免费视频 亚洲二区在线播放 亚洲狠狠婷婷综合久久久久网站 亚洲欧美日韩网站 日韩成人精品 亚洲国产一区二区三区青草影视 91精品国产福利在线观看 国产精品久久久久久久久99热 国产一区二区精品尤物 久碰香蕉精品视频在线观看 亚洲日日夜夜 在线不卡一区二区 国产午夜亚洲精品 九九热在线视频观看这里只有精品 伊人手机在线视频 91免费国产精品 日韩欧美中字 91精品国产91久久久久 国产全黄三级播放 视频一区二区三区免费观看 国产开裆丝袜高跟在线观看 国产成人欧美 激情综合丝袜美女一区二区 国产成人亚洲综合无 欧美精品一区二区三区免费观看 欧美亚洲国产日韩 日韩亚州 国产欧美日韩精品高清二区综合区 亚洲午夜国产片在线观看 精品久久久久久中文字幕 欧美精品1区 久久伊人久久亚洲综合 亚洲欧美日韩精品 国产成人精品久久亚洲高清不卡 久久福利影视 国产精品99精品久久免费 久久久久免费精品视频 国产日产亚洲精品 亚洲国产午夜电影在线入口 精品无码一区在线观看 午夜国产精品视频 亚洲一级片免费 伊人久久大香线蕉综合影 国产精品久久影院 久碰香蕉精品视频在线观看 www.欧美精品 在线小视频国产 亚洲国产天堂久久综合图区 欧美一区二区三区不卡 日韩美女福利视频 九九精品免视频国产成人 不卡国产00高中生在线视频 亚洲第一页在线视频 欧美日韩在线播放成人 99re视频这里只有精品 国产精品91在线 精品乱码一区二区三区在线 国产区久久 91麻豆精品国产自产在线观看一区 日韩精品成人在线 九九热在线观看 国产精品久久不卡日韩美女 欧美一区二区三区综合色视频 欧美精品免费一区欧美久久优播 国产精品网址 国产专区中文字幕 国产精品欧美亚洲韩国日本久久 日韩美香港a一级毛片 久久精品123 欧美一区二区三区免费看 99r在线视频 亚洲精品国产字幕久久vr 国产综合激情在线亚洲第一页 91免费国产精品 日韩免费小视频 亚洲国产精品综合一区在线 国产亚洲第一伦理第一区 在线亚洲精品 国产精品一区二区制服丝袜 国产在线成人精品 九九精品免视频国产成人 亚洲国产网 欧美日韩亚洲一区二区三区在线观看 在线亚洲精品 欧美一区二区三区高清视频 国产成人精品男人的天堂538 欧美日韩在线观看区一二 亚洲欧美一区二区久久 久久精品中文字幕首页 日本高清www午夜视频 久久精品国产免费 久久999精品 亚洲国产精品欧美综合 88国产精品视频一区二区三区 91久久偷偷做嫩草影院免费看 国产精品夜色视频一区二区 欧美日韩导航 国产成人啪精品午夜在线播放 一区二区视频在线免费观看 99久久精品国产自免费 精液呈暗黄色 久久99国产精品 日本精品久久久久久久久免费 精品国产97在线观看 99re视频这里只有精品 国产视频91在线 999av视频 亚洲美女视频一区二区三区 久久97久久97精品免视看 亚洲国产成人久久三区 99久久亚洲国产高清观看 日韩毛片在线视频 综合激情在线 91福利一区二区在线观看 一区二区视频在线免费观看 激情粉嫩精品国产尤物 国产成人精品曰本亚洲78 国产成人精品本亚洲 国产精品成人免费视频 国产成人啪精品视频免费软件 久久精品国产亚洲妲己影院 国产精品成人久久久久久久 久久大香线蕉综合爱 欧美一区二区三区高清视频 99热国产免费 在线观看欧美国产 91精品视频在线播放 国产精品福利社 欧美精品一区二区三区免费观看 国产一区二区免费视频 国产午夜精品一区二区 精品视频在线观看97 91精品福利久久久 国产一区福利 国产综合激情在线亚洲第一页 国产精品久久久久久久久久久不卡 九色国产 在线日韩国产 黄网在线观看 亚洲一区小说区中文字幕 中文字幕丝袜 日本二区在线观看 日本国产一区在线观看 欧美日韩一区二区三区久久 欧美精品亚洲精品日韩专 国产日产亚洲精品 久久综合九色综合欧美播 亚洲国产欧美无圣光一区 欧美视频区 亚洲乱码视频在线观看 久久无码精品一区二区三区 九九热精品免费视频 久久99精品久久久久久牛牛影视 国产精品成久久久久三级 国产一区福利 午夜国产精品视频 日本二区在线观看 99久久网站 国产亚洲天堂 精品国产一区二区三区不卡 亚洲国产日韩在线一区 国产成人综合在线观看网站 久久免费高清视频 欧美在线导航 午夜精品久久久久久99热7777 欧美久久综合网 国产小视频精品 国产尤物在线观看 亚洲国产精品综合一区在线 欧美一区二区三区不卡视频 欧美黑人欧美精品刺激 日本福利在线观看 久久国产偷 国产手机精品一区二区 国产热re99久久6国产精品 国产高清啪啪 欧美亚洲国产成人高清在线 国产在线第三页 亚洲综合一区二区三区 99r在线视频 99精品久久久久久久婷婷 国产精品乱码免费一区二区 国产在线精品福利91香蕉 国产尤物视频在线 五月婷婷亚洲 中文字幕久久综合伊人 亚洲精品一级毛片 99国产精品电影 在线视频第一页 久久99国产精品成人欧美 国产白白视频在线观看2 成人精品一区二区www 亚洲成人网在线观看 麻豆91在线视频 色综合合久久天天综合绕视看 久久精品国产免费高清 国产不卡一区二区三区免费视 欧美国产中文 99精品欧美 九九在线精品 国产中文字幕在线免费观看 国产一区中文字幕在线观看 国产成人一级 国产精品一区二区制服丝袜 国产一起色一起爱 亚洲精品成人在线 亚洲欧美精品在线 国产欧美自拍视频 99精品久久久久久久婷婷 久99视频 国产热re99久久6国产精品 视频一区亚洲 国产精品视频分类 国产精品成在线观看 99re6久精品国产首页 亚洲在成人网在线看 亚洲国产日韩在线一区 久久国产三级 日韩国产欧美 欧美在线一区二区三区 国产精品美女一级在线观看 成人午夜免费福利视频 亚洲天堂精品在线 91精品国产手机 欧美日韩视频在线播放 狠狠综合久久综合鬼色 九一色视频 青青视频国产 亚洲欧美自拍一区 中文字幕天天躁日日躁狠狠躁97 日韩免费大片 996热视频 伊人成综合网 亚洲天堂欧美 日韩精品亚洲人成在线观看 久久综合给会久久狠狠狠 日韩精品亚洲人成在线观看 日韩国产欧美 亚洲成aⅴ人片在线影院八 亚洲精品1区 99久久精品免费 国产精品高清在线观看 国产精品久久久免费视频 在线亚洲欧美日韩 91在线看视频 国产精品96久久久久久久 欧美日韩国产成人精品 91在线亚洲 热久久亚洲 国产精品美女免费视频观看 日韩在线毛片 亚洲永久免费视频 九九免费在线视频 亚洲一区网站 日本高清二区视频久二区 精品国产美女福利在线 伊人久久艹 国产精品久久久久三级 欧美成人精品第一区二区三区 99久久精品国产自免费 在线观看日韩一区 国产中文字幕一区 成人免费午夜视频 欧美日韩另类在线 久久99国产精品成人欧美 色婷婷中文网 久久天天躁夜夜躁狠狠躁2020 欧美成人伊人久久综合网 国产精品福利资源在线 国产伦精品一区二区三区高清 国产精品亚洲综合色区韩国 亚洲一区欧美日韩 色综合视频 国语自产精品视频在线区 国产高清a 成人国内精品久久久久影 国产在线精品香蕉综合网一区 国产不卡在线看 国产成人精品精品欧美 国产欧美日韩综合精品一区二区三区 韩国电影一区二区 国产在线视频www色 91中文字幕在线一区 国产人成午夜免视频网站 亚洲综合一区二区三区 色综合视频一区二区观看 久久五月网 九九热精品在线观看 国产一区二区三区国产精品 99久热re在线精品996热视频 亚洲国产网 在线视频亚洲一区 日韩字幕一中文在线综合 国产高清一级毛片在线不卡 精品国产色在线 国产高清视频一区二区 精品日本久久久久久久久久 亚洲国产午夜精品乱码 成人免费国产gav视频在线 日韩欧美一区二区在线观看 欧美曰批人成在线观看 韩国电影一区二区 99re这里只有精品6 日韩精品一区二区三区视频 99re6久精品国产首页 亚洲欧美一区二区三区导航 欧美色图一区二区三区 午夜精品视频在线观看 欧美激情在线观看一区二区三区 亚洲热在线 成人国产精品一区二区网站 亚洲一级毛片在线播放 亚洲一区小说区中文字幕 亚洲午夜久久久久影院 国产自产v一区二区三区c 国产精品视频免费 久久调教视频 国产成人91激情在线播放 国产精品欧美亚洲韩国日本久久 久久亚洲日本不卡一区二区 91中文字幕网 成人国产在线视频 国产视频91在线 欧美成人精品第一区二区三区 国产精品福利在线 久久综合九色综合精品 欧美一区二区三区精品 久久国产综合尤物免费观看 久久99青青久久99久久 日韩精品免费 久久国产精品999 91亚洲视频在线观看 国产精品igao视频 色综合区 在线亚洲欧国产精品专区 国产一区二区三区在线观看视频 亚洲精品成人在线 一区二区国产在线播放 中文在线亚洲 亚洲精品第一国产综合野 国产一区二区精品久久 一区二区三区四区精品视频 99热精品久久 中文字幕视频二区 国产成人精品男人的天堂538 99精品影视 美女福利视频一区二区 久久午夜夜伦伦鲁鲁片 综合久久久久久久综合网 国产精品国产欧美综合一区 国产99视频在线观看 国产亚洲女在线精品 婷婷影院在线综合免费视频 国产亚洲3p一区二区三区 91成人爽a毛片一区二区 亚洲一区二区高清 国产欧美亚洲精品第二区首页 欧美日韩导航 亚洲高清二区 欧美激情观看一区二区久久 日韩毛片在线播放 亚洲欧美日韩高清中文在线 亚洲日本在线播放 国产精品一区二区制服丝袜 精品国产一区二区三区不卡 国产不卡在线看 国产欧美网站 四虎永久在线观看视频精品 国产黄色片在线观看 夜夜综合 一本色道久久综合狠狠躁篇 欧美亚洲综合另类在线观看 国产91在线看 伊人久久国产 欧美一区二区在线观看免费网站 国产精品久久久久三级 久久福利 日韩中文字幕a 亚洲午夜久久久久影院 91在线高清视频 国产亚洲一区二区三区啪 久久人精品 国产精品亚洲午夜一区二区三区 综合久久久久久 久久伊人一区二区三区四区 国产综合久久久久久 日韩一区精品视频在线看 国产精品日韩欧美制服 日本精品1在线区 99re视频 无码av免费一区二区三区试看 国产视频1区 日韩欧美中文字幕一区 日本高清中文字幕一区二区三区a 亚洲国产欧美无圣光一区 国产在线视频一区二区三区 欧美国产第一页 在线亚洲欧美日韩 日韩中文字幕第一页 在线不卡一区二区 伊人久久青青 国产精品一区二区在线播放 www.五月婷婷 麻豆久久婷婷国产综合五月 亚洲精品区 久久国产欧美另类久久久 99在线视频免费 伊人久久中文字幕久久cm 久久精品成人免费看 久久这里只有精品首页 88国产精品视频一区二区三区 中文字幕日本在线mv视频精品 国产在线精品成人一区二区三区 伊人精品线视天天综合 亚洲一区二区黄色 国产尤物视频在线 亚洲精品99久久久久中文字幕 国产一区二区三区免费观看 伊人久久大香线蕉综合电影网 国产成人精品区在线观看 日本精品一区二区三区视频 日韩高清在线二区 久久免费播放视频 一区二区成人国产精品 国产精品免费精品自在线观看 亚洲精品视频二区 麻豆国产精品有码在线观看 精品日本一区二区 亚洲欧洲久久 久久中文字幕综合婷婷 中文字幕视频在线 国产成人精品综合在线观看 91精品国产91久久久久福利 精液呈暗黄色 香蕉国产综合久久猫咪 国产专区精品 亚洲精品无码不卡 国产永久视频 亚洲成a人片在线播放观看国产 一区二区国产在线播放 亚洲一区二区黄色 欧美日韩在线观看视频 亚洲精品另类 久久国产综合尤物免费观看 国产一区二区三区国产精品 高清视频一区 国产精品igao视频 国产精品资源在线 久久综合精品国产一区二区三区 www.五月婷婷 精品色综合 99热国产免费 麻豆福利影院 亚洲伊人久久大香线蕉苏妲己 久久电影院久久国产 久久精品伊人 在线日韩理论午夜中文电影 亚洲国产欧洲综合997久久 伊人国产精品 久草国产精品 欧美一区精品二区三区 亚洲成人高清在线 91免费国产精品 日韩精品福利在线 国产一线在线观看 国产不卡在线看 久久99青青久久99久久 亚洲精品亚洲人成在线播放 99久久免费看国产精品 国产日本在线观看 青草国产在线视频 麻豆久久婷婷国产综合五月 国产中文字幕一区 91久久精品国产性色也91久久 国产一区a 国产欧美日韩成人 国产亚洲女在线精品 一区二区美女 中文字幕在线2021一区 在线小视频国产 久久这里只有精品首页 国产在线第三页 欧美日韩中文字幕 在线亚洲+欧美+日本专区 精品国产一区二区三区不卡 久久这里精品 欧美在线va在线播放 精液呈暗黄色 91精品国产手机 91在线免费播放 欧美视频亚洲色图 欧美国产日韩精品 日韩高清不卡在线 精品视频免费观看 欧美日韩一区二区三区四区 国产欧美亚洲精品第二区首页 亚洲韩精品欧美一区二区三区 国产精品视频免费 在线精品小视频 久久午夜夜伦伦鲁鲁片 国产无套在线播放 久热这里只精品99re8久 欧美久久久久 久久香蕉国产线看观看精品蕉 国产成人精品男人的天堂538 亚洲人成网站色7799在线观看 日韩在线第二页 一本色道久久综合狠狠躁篇 国产一区二区三区不卡在线观看 亚洲乱码在线 在线观看欧美国产 久久福利青草精品资源站免费 国产玖玖在线观看 在线亚洲精品 亚洲成aⅴ人在线观看 精品91在线 欧美一区二三区 日韩中文字幕视频在线 日本成人一区二区 日韩免费专区 国内精品在线观看视频 久久国产综合尤物免费观看 国产精品系列在线观看 一本一道久久a久久精品综合 亚洲免费播放 久久精品国产免费 久久人精品 亚洲毛片网站 亚洲成a人一区二区三区 韩国福利一区二区三区高清视频 亚洲精品天堂在线 一区二区三区中文字幕 亚洲国产色婷婷精品综合在线观看 亚洲国产成人久久笫一页 999国产视频 国产精品香港三级在线电影 欧美日韩一区二区三区四区 日韩国产欧美 国产精品99一区二区三区 午夜国产精品理论片久久影院 亚洲精品中文字幕麻豆 亚洲国产高清视频 久久免费手机视频 日韩a在线观看 五月婷婷亚洲 亚洲精品中文字幕麻豆 中文字幕丝袜 www国产精品 亚洲天堂精品在线 亚洲乱码一区 国产日韩欧美三级 久久999精品 伊人热人久久中文字幕 久热国产在线视频 国产欧美日韩在线观看一区二区三区 国产一二三区在线 日韩国产欧美 91精品国产91久久久久 亚洲一区小说区中文字幕 精品一区二区免费视频 国产精品视频免费 国产精品亚洲综合色区韩国 亚洲国产精品成人午夜在线观看 欧美国产日韩精品 中文字幕精品一区二区精品