專利名稱：利用人類白血球抗原(hla)篩檢預測藥物不良反應的方法
利用人類白血球抗原(HLA)篩檢預測藥物不良反應的方法相關申請的交叉引用本申請主張于2010年4月12日遞交的美國臨時申請No. 61/323，067的優先權。在此通過整體引用該在先申請將其內容結合到本申請中。
背景技術：
不良藥物反應(ADR)仍為臨床上及制藥工業的主要問題。在許多ADR類型中，以史蒂生-瓊森癥候群(Stevens-Johnson syndrome, SJS)、中毒性表皮壞死溶解(TEN)及過敏癥候群(HSS)最嚴重且危及生命，其中，SJS及TEN有10-50%的死亡率。參看Roujeau等人，New Engl. J. Med. 333:1600-1607(1995)。盡管 SJS/TEN/HSS 的發病率低，但這些病狀可能會造成個死亡或導致嚴重殘疾。對于制藥工業而言，發生嚴重藥物過敏是非常不利的；目前有部分的新藥因為會造成嚴重藥物不良反應，而招致藥品退市的命運。參看畫· fda.gov/safety/recalls/default, htm。已發現某些I型人類白血球抗原(HLA)對偶基因(例如HLA-A及HLA-B對偶基因)及某些II型HLA對偶基因(例如HLA-DR對偶基因)與ADR有關。參看Hung等人，Proc.Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102:4134-4139(2005) ;Daly 等人，Nat. Genet. 41:816-819 (2009)；Hautekeete, Gastroenterology 117 (5) : 1181-6 (1999) ^Dettling M, PharmacogenomicsJ. 7 (5) : 325-32 (2007)。所有這些ADR-HLA對偶基因的關聯性，是在測定罹患核準上市藥物誘發ADR的患者后被發現。目前，尚沒有可用于預測開發中的候選藥物是否會在人類中產生這些危及生命的病狀(諸如SJS/TEN/HSS)的方法。因為新藥物開發可能平均耗費10億元及10年時間，所以開發適用于在藥物開發早期階段預測候選藥物的安全性概況的篩選方法將具有重大價值。
發明內容
本發明涉及自HLA庫中鑒別出會與化合物結合的HLA復合物(若存在)的方法。此方法可依用于預測化合物是否將誘發不良藥物反應，且若誘發不良藥物反應，在哪一人類群體中誘發。本發明方法包括至少4個步驟⑴提供HLA庫(例如I型或II型HLA庫)，其包括位于支撐構件上的多個地址處的多種HLA復合物(例如可溶性HLA復合物)，各HLA復合物指定于一獨特地址，( )使化合物與HLA復合物接觸，(iii)判定該化合物是否會與庫中的HLA復合物結合，且，若結合，(iv)則基于HLA復合物的地址鑒別與化合物結合的HLA復合物。本文所用的術語“獨特地址〃是指支撐構件上一種且僅一種類型的HLA復合物所位于的點。在一個實例中，HLA庫為以微芯片為基礎的庫，其包括連接于支撐構件的多種HLA復合物。在此情形中，判定步驟可通過表面等離子共振(SPR)來執行。在另一實例中，HLA庫為以細胞為基礎的庫，其包括各自表達特定HLA復合物的多個細胞株。各細胞株可通過表達HLA復合物的親本細胞來制備，該親本細胞優選地缺乏至少一種類型的HLA (例如I型HLA)。在此情形下，判定步驟可通過收集自各地址的HLA復合物，且通過質譜法判定HLA復
4合物是否與化合物結合來執行。或者，化合物可經同位素標記且通過檢驗各地址處的放射性來執行判定步驟。以下說明書中闡述本發明一個或多個實施例的細節。本發明的其它特征或優點將自以下附圖及實施方式、以及隨附權利要求書中顯而易知。
圖I為說明獲得能夠與HLA-Β-β 2微球蛋白復合物結合的肽的方法的流程圖，其中該復合物是由穩定表達可溶性HLA-B分子的ClR細胞中產生。圖2為說明表面等離子共振檢定的流程圖。圖3為顯示在37°C過夜下未脈沖自體性B-LCL細胞(敞開條)或以25 μ g/ml CBZ,0XC、GAB或媒劑對照脈沖的自體性B-LCL細胞(封閉框)的特異性溶解圖表。分析三名患者的資料以獲得平均值土SD。* p<0. 05 (未脈沖B-LCL細胞相對于經脈沖B-LCL細胞)。** p<0. 001 (藥物處理組相對于媒劑處理組)。圖4顯示在固定(封閉條)及未固定(敞開條)B-LCL存在下自體性T細胞增殖的圖表。通過習知[3H]胸苷摻入檢定測定T細胞增殖。* :p〈0.05(藥物處理組相對于媒劑處理組)。圖5為顯示各種濃度下的CBZ及其類似物(62. 5至1000 μ Μ)與涂布于CM5芯片上的可溶性HLA-B*1502結合的圖表。通過標準DMSO溶劑校正曲線使用TlOO評估軟件自4至7個獨立實驗計算相對反應(R. U.)。圖6為顯示CBZ及其類似物與各種HLA-B分子結合的圖表。圖表中顯示的數據表示4至11個獨立實驗的平均值土平均值的標準誤差(SEM)。
具體實施例方式本文描述使用HLA庫篩選會與化合物(例如小分子藥物或藥物候選物)特異性相互作用的HLA復合物(若存在)的方法。此方法可用于評估化合物誘發不良藥物反應的機率，并可用于鑒別會對測試化合物產生藥物過敏的高風險人類群體(亦即，帶有此方法中鑒別出的HLA復合物的人類群體)。因此，此在新藥物開發中尤其重要，因為其幫助預測藥物候選物是否可能引起不良藥物反應，且若引起不良藥物反應，會在哪一患者群體中引起。本發明方法中使用的HLA庫可為I型庫，其包括一個或多個HLA復合物子群(例如HLA B庫)。HLA-B對偶基因為最具多形性的基因之一，其具有超過800個變異體。參看Marsh, Marsh, Hum. Immunol. 71(4) :432_6;2010。必要時，HLA-B 庫可包括所有已知的 800種以上不同HLA-B復合物。HLA庫亦可為II型庫，其包括一個或多個II型HLA復合物子群(例如HLA-DR庫)。或者，HLA庫可含有I型及II型HLA復合物兩者。必要時，任何上述庫均可擴展以包括新HLA復合物。I型及II型HLA對偶基因是本領域公知的。舉例而言，這些對偶基因可自GenBank 或由 HUGO 基因命名委員會(HUGO Gene Nomenclature Committee)、EMBL 茵格斯頓分部(EMBL Outstation-Hinxton)、歐洲生物信息研究所(European BioinformaticsInstitute)、英國茵格斯頓劍橋 Wellcome Trust 基因體科學園 CBlO ISD (Wellcome TrustGenome Campus Hinxton Cambridge CBlO 1SD, UK)(參看http://www. genenames. org/)提供的數據庫擷取。本發明方法可使用以細胞為基礎或以微芯片為基礎的HLA庫執行。以細胞為基礎的HLA庫以細胞為基礎的HLA庫含有多個細胞株，其各自產生獨特的HLA復合物。各細胞株可經由已知的重組技術，將親本細胞(優選為哺乳動物細胞)進行遺傳修飾以表達(a)I型HLAa鏈及視情況選用的β 2-微球蛋白(若親本細胞不表達內源性β 2-微球蛋白)，或(b)II型HLAa鏈及II型HLAii鏈來制備。用于構建庫的親本細胞優選缺乏至少一種類型的HLA對偶基因，例如I型HLA、II型HLA或其子群。此種細胞株包括(但不限于)ATCCCRL-1933 (ClR)、ATCC CRL-2309 (KerTr)、ATCC CRL-1992 (T2)、ATCC CRL-2134 (LS513)、ATCC CRL-2158(LS1034)、ATCC CRL-2159 (LS411N)、ATCC CRL-2547 (Pane 10. 05)、ATCCCRL-255l(Panc 08. 13)、ATCC CRL-2553(Pane 02. 03)、ATCC CRL-2549(Pane 03. 27)、ATCCCRL-2554(Pane 02.13)、ATCC CRL-2555(Panc04. 03)及 ATCC CRL-2557(Pane 05.04)。在此清單中，前兩個細胞株缺乏I型HLA而其余細胞株缺乏II型HLA。可經由例行程序來選擇可穩定表達所欲HLA分子的經轉染細胞。可選擇產生高含量I型HLA復合物(由I型HLA α鏈及β 2_微球蛋白構成)或II型復合物(由II型HLAa鏈及II型HLAii鏈構成)的穩定細胞株作為以細胞為基礎的HLA庫的成員。在一個實例中，所選細胞株表達全長HLA分子。在另一實例中，其表達HLA分子的片段，包括其胞外域。該種細胞株產生可溶性HLA復合物。根據上文所述的程序，可構建表達多種HLA復合物的細胞株，亦即每種細胞株可產生一種類型HLA復合物。多種HLA復合物可包括I型HLA(例如HLA-A、HLA-B, HLA-C,HLA-E, HLA-F, HLA-G, HLA-K, HLA-L 或其組合)、II 型 HLA(例如 HLA-DP、HLA-DQ, HLA-DR、HLA-DM、HLA-DO或其組合)。這些穩定細胞株形成以細胞為基礎的HLA庫。各穩定細胞株可安置于支撐構件的孔(亦即獨特地址)中。為了執行本文所述的篩選法，將各細胞株與測試化合物一起培養一適合時段。接著洗滌細胞以移除該化合物的游離分子，接著檢驗并判定細胞所表達的HLA復合物是否與化合物結合。參看圖I。在一個實例中，化合物經放射性同位素標記，且基于各孔相對于空白對照的放射性程度判定化合物與HLA復合物間的結合。若孔中的放射性程度大于空白對照，則表示彼孔中細胞產生的HLA復合物能夠與化合物結合。當使用產生可溶性HLA復合物的細胞株時，可以下示方式判定其與測試化合物的結合。在細胞以測試化合物處理之后，收集各孔中的上清液且使用含有HLA特異性試劑(例如能夠結合于所有類型的I型或II型HLA的抗體)的親和力管柱純化可溶性HLA復合物。含有經純化HLA復合物的樣品在適合溫度(例如70°C )下加熱10分鐘，以解離化合物(可連接于肽)與HLA復合物之間的結合。例如使用離心過濾器(3-1^^截斷,4111；[(3011Ultra-4, Millipore)收集含有低分子量組分(例如<3_kDa)的部分,且進行液相層析聯合質譜分析法以判定其是否含有測試化合物。已知抗原呈遞細胞(APC)對某些藥物(例如阿巴卡韋(abacavir)及青霉素(penicillin))的呈遞為加工依賴性(processing-dependent)的。亦即，在進入細胞之后，這些化合物共價結合于載體蛋白質，所述蛋白質接著經加工且由APC細胞呈遞。參看Schnyder 等人，J. Clin. Invest. 100:136—141 (1997)及 Naisbitt 等人，J. Allergy Clin.
6Immunol. 111:1393-1403(2003)。以細胞為基礎的I型HLA庫尤其適用于篩選對HLA復合物具特異性的經由加工依賴性路徑而由APC呈遞的化合物。以芯片為某礎的HLA庫以芯片為基礎的HLA庫可經由常規的方法將各種HLA復合物(較佳含有HLA分子的胞外域)各自固定于微芯片的獨特點上來制備。參看例如Nature Reviews DrugDiscovery. 1:515-528(2002)。各種HLA復合物可自上文所述的穩定細胞株獲得。為了篩選能夠與測試化合物結合的HLA復合物，可在允許化合物與其同源(cognate)HLA復合物結合的條件下，將連接于微芯片的各種HLA復合物與化合物一起培育適合時段。接著洗滌芯片以移除未結合的化合物分子，接著進行SPR量測以鑒別與化合物結合的HLA復合物。在發現HLA復合物與測試化合物結合之后，可基于其在芯片上的地址確定其身分。SPR為高產量、無標記相互作用分析系統，且用于諸如藥物研發、抗體表征、蛋白質組研究、免疫原性、生物治療劑開發及制造、及許多生命科學研究應用的領域。表面等離子共振(SPR)檢測緊鄰傳感器芯片的表面層的折射率的變化。共振角的此變化可以共振信號(與質量變化成比例)相對于時間的曲線圖形式非侵入性實時監測。參見圖2。使用以芯片為基礎的HLA庫可鑒別對經由加工獨立性路徑由APC呈遞(亦即直接結合于HLA復合物)的化合物具特異性的HLA復合物(參看Wu等人，J. Allergy Clin.Tmmunol.118:233-241;2006 及 Marsh, Hum. Tmmunol. 71(4):432-6;2010)。若經本發明方法鑒別，無HLA復合物與測試化合物結合的現象，則表明此化合物誘發ADR的機率較低。另一方面，若此方法中鑒別出測試化合物與HLA復合物的結合，則表明測試化合物誘發ADR的機率較高，且在表達該HLA復合物的人類中尤其如此。此項技術中已知某些HLA對偶基因在特定人類種族中出現的頻率比其它種族高。參看WWW. allelefrequencies. net。基于此知識,本發明方法獲得的結果可用于預測哪一種族將對特定藥物或藥物候選物敏感。這將關于臨床試驗中患者的選擇及銷售決策方面引導藥物開發。下表I列出高加索人(Caucasians)、亞洲人(Asians)及非裔美國人(AfricanAmericans)中的主要HLA-B對偶基因。表I.高加索人、亞洲人及非裔美國人中的主要HLA-B對偶基因
權利要求
1.一種鑒別會與化合物結合的HLA復合物的方法，其包括提供HLA庫，其包括位于支撐構件上的多個地址處的多種HLA復合物，所述HLA復合物各自指定于一獨特地址；使化合物與所述HLA復合物接觸；判定該化合物是否與所述HLA復合物中的之一結合；及當該化合物與一個HLA復合物結合時，基于該一個HLA復合物的地址鑒別與該化合物結合的該一個HLA復合物。
2.根據權利要求I的方法，其中所述HLA復合物為I型HLA復合物。
3.根據權利要求2的方法，其中所述I型HLA復合物為HLA-B復合物。
4.根據權利要求I的方法，其中所述HLA復合物為II型HLA復合物。
5.根據權利要求4的方法，其中所述II型HLA復合物為HLA-DR復合物。
6.根據權利要求I的方法，其中該HLA-B庫為以微芯片為基礎的庫，其中該多種HLA復合物連接于該支撐構件。
7.根據權利要求6的方法，其中所述HLA復合物為其天然存在的對應物的胞外域。
8.根據權利要求7的方法，其中該判定步驟系通過表面等離子共振來執行。
9.根據權利要求I的方法，其中該HLA庫為以細胞為基礎的庫，該庫包括多個表達該多種HLA復合物的細胞。
10.根據權利要求9的方法，其中所述HLA復合物為其天然存在的對應物的胞外域。
11.根據權利要求9的方法，其中該多個細胞各自通過在缺乏I型HLA的親本細胞中表達I型HLA復合物來制備。
12.根據權利要求9的方法，其中該多個細胞各自通過在缺乏II型HLA的親本細胞中表達II型HLA復合物來制備。
13.根據權利要求9的方法，其中該判定步驟通過自各地址收集該HLA復合物且通過質譜法判定該HLA復合物是否結合于該化合物來執行。
14.根據權利要求9的方法，其中該化合物具放射性且該判定步驟通過檢驗各地址處的放射性來執行。
15.—種評估化合物于施用該化合物的個體中誘發不良藥物反應的風險的方法，其包括提供HLA庫，其包括位于支撐構件上的多個地址處的多種HLA復合物，所述HLA復合物各自指定于一獨特地址；使化合物與所述HLA復合物接觸；及判定該化合物是否與所述HLA復合物之一結合；其中當該化合物與所述HLA復合物之一結合時，表示該化合物會于施用該化合物的個體中誘發不良藥物反應的風險。
16.根據權利要求15的方法，當該化合物與該一個HLA復合物結合時，其進一步包括基于該一個HLA復合物的地址鑒別與該化合物結合的該一個HLA復合物。
17.根據權利要求15的方法，其中所述HLA復合物為I型HLA復合物。
18.根據權利要求17的方法，其中所述I型HLA復合物為HLA-B復合物。
19.根據權利要求15的方法，其中所述HLA復合物為II型HLA復合物。
20.根據權利要求19的方法，其中所述II型HLA復合物為HLA-DR復合物。
全文摘要
本發明涉及一種用于自HLA庫鑒別出會與化合物特異性結合的HLA復合物的方法。此方法可用于評估化合物是否可能誘發不良藥物反應，且若誘發不良藥物反應，在哪一人類群體中誘發。
文檔編號C40B40/10GK102918396SQ201180018181
公開日2013年2月6日 申請日期2011年4月11日 優先權日2010年4月12日
發明者陳垣崇, 洪舜郁, 魏淳郁 申請人:中央研究院