專利名稱：構建血紅鉚釘菇子實體周圍土壤真菌群落its文庫的方法
技術領域：
本發明涉及一種構建血紅鉚釘菇子實體周圍土壤真菌群落ITS文庫的方法。
背景技術：
血紅鉚釘菇(Chroogomphis rutillus)，擔子菌亞門，層菌綱，傘菌目，鉚釘菇科，紅鉚釘菇屬，俗稱紅蘑、松樹傘、松蘑、肉蘑，形狀似鉚釘，顏色為暗紅色，名貴野生菌根食用菌，是針葉樹木重要的外生大型菌根真菌，夏、秋季群生或散生。該菇肉厚、品質滑潤、細膩，味道鮮美，營養價值高，富含蛋白質，含有人體所需的8種必需氨基酸、鈣、鐵等礦物質和大量碳水化合物，也是膳食纖維和天然抗氧化物的重要來源，深受人們喜愛。血紅鉚釘菇為外生菌根菌，至今難以人工馴化。近年來隨著旅游業的發展和高強度的采收，血紅鉚釘菇與衛生資源與生存環境正在受到威脅和破壞。為了更好地保護血紅鉚釘菇資源，許多研究者致力于血紅鉚釘菇的人工馴化研究，如利用生長環境中的土壤或者松樹的組織培養物作為血紅鉚釘菇菌絲體分離的培養基。到目前為止，雖然純培養的菌絲已經獲得，但是血紅鉚釘菇的人工馴化仍未成功。一些研究者開始從生態角度研究血紅鉚釘菇生長環境中的影響因子，如植被種類、光照、水分等條件。但其生長環境中的微生物種群的研究未見報道。迄今為止，仍然有99%的微生物是未知的，并且絕大多數的微生物種類是不可培養的，基于分子生物學技術的對不可培養微生物種類的鑒定加速了對環境樣品的研究。
發明內容
本發明的目的是提供一種構建血紅鉚釘菇子實體周圍土壤真菌群落ITS文庫的方法。本發明提供了一種構建血紅鉚釘菇子實體周圍土壤真菌群落的分子圖譜的方法，包括如下步驟(1)取血紅鉚釘菇子實體周圍土壤，作為土壤樣本提取宏基因組DNA ；(2)以所述宏基因組DNA為模板，用上游引物ITSl和下游引物ITS4組成的引物對進行PCR擴增，回收PCR擴增產物，即為DNA片段庫(690_710bp)；所述上游引物ITSl為序列表的序列1所示的DNA片段；所述下游引物ITS4為序列表的序列2所示的DNA片段；(3)將所述DNA片段庫與pMD19-T載體連接，得到重組質粒庫；(4)分別以所述重組質粒庫中的每個重組質粒為模板，用上游引物RV-M和下游引物M13-47組成的引物對進行PCR擴增，回收PCR擴增產物；將各個PCR擴增產物分別用限制性內切酶Hinf I.Hae III.Msp I.Taq I和Mbo I進行酶切并電泳，得到分子圖譜；所述上游引物RV-M為序列表的序列3所示的DNA片段；所述下游引物M13-47為序列表的序列4所示的DNA片段。所述步驟(2)中，所述PCR擴增的反應體系由溶劑和溶質組成；所述溶劑為IXExTaq Buffer ；每50 μ 1所述反應體系中含有如下溶質20ng所述模板、80pmol所述上游引物、80pmol 所述下游引物、0. 2mmol/l dNTP 和 1. 5U Ex Taq DNA 聚合酶。所述步驟(2)中，所述PCR擴增的反應程序為95°C 5min ；95°C 30s,58°C lmin、72°C 30s, 30 個循環；72°C IOmin0所述步驟(4)中，所述PCR擴增的反應體系由溶劑和溶質組成；所述溶劑為IXExTaq Buffer ；每50 μ 1所述反應體系中含有如下溶質20ng所述模板、80pmol所述上游引物、80pmol 所述下游引物、0. 2mmol/l dNTP 和 1. 5U Ex Taq DNA 聚合酶；所述步驟中，所述PCR擴增的反應程序為95°C 5min ；95°C 30s、58°C lmin、72°C 30s, 30 個循環；72°C IOmin0所述步驟中，所述電泳可為2%瓊脂糖凝膠電泳。所述電泳的參數優選為100V電壓、40mA電流、3-4小時(如3. 5小時)。所述步驟(1)中，所述提取宏基因組DNA的方法包括如下步驟(1)將所述土壤樣本懸浮于緩沖液，12000rpm離心lOmin，取沉淀；(2)洗滌步驟(1)的沉淀；(3)將步驟⑵的沉淀進行宏基因組的提取。所述提取宏基因組DNA的方法具體可為(1)將5g所述土壤樣本懸浮于:3ml TENP緩沖液后渦旋震蕩lOmin，12000rpm離心lOmin，取沉淀；(2)將步驟(1)的沉淀用TENP緩沖液洗滌三次，然后用PBS緩沖液洗滌1次；(3)將步驟 O)的沉淀采用 Mega Preps PowerMax Soil DNA Isolation Kit 進行宏基因組的提取。TENP緩沖液由溶質和水組成，pHIO ；溶質及其在TENP緩沖液中的濃度如下50mMTris-HCl、20mM EDTA-Na2 (乙二胺四乙酸鈉)、IOOmM NaCl 和 0. 01g/ml PVPP(交聯聚乙烯吡咯烷酮)。PBS緩沖液由溶質和水組成，pH7. 4 ；溶質及其在PBS緩沖液中的濃度如下8g/LNaCl.O. 2g/L KCl、1. 44g/L Na2HPO4 和 0. 24g/L KH2PO4。以上任一所述方法得到的血紅鉚釘菇子實體周圍土壤真菌群落的分子圖譜也屬于本發明的保護范圍。本發明還保護以上任一所述方法在構建血紅鉚釘菇子實體周圍土壤真菌群落ITS文庫中的應用。所述應用的方法具體可為根據所述分子圖譜，選擇酶切產物帶型不同(即5種所述限制性內切酶的酶切產物中至少有一種酶切產物帶型不同)的所述重組質粒分別進行測序，得到血紅鉚釘菇子實體周圍土壤真菌群落ITS文庫。所述應用可用于構建血紅鉚釘菇子實體周圍土壤真菌群落的系統發育樹。所述應用的具體方法為將所述測序獲得的各個結果通過BLAST程序與GenBank中的ITS基因序列進行同源性比較，用MEGA 4. 1軟件包中的Kimurd-parameter法計算遺傳距離，用Neighbor-Joining法構建系統發育樹。以上任一所述方法或所述應用可用于研究血紅鉚釘菇子實體周圍土壤真菌群落。以上任一所述方法或所述應用可用于人工馴化血紅鉚釘菇。本發明還保護一種引物組合物，所述引物組合物由引物ITS1、引物ITS4、引物RV-M和引物M13-47組成；所述引物ITSl為序列表的序列1所示的DNA片段；所述引物ITS4為序列表的序列2所示的DNA片段；所述引物RV-M為序列表的序列3所示的DNA片段；所述引物M13-47為序列表的序列4所示的DNA片段。所述引物組合物可用于如下(a)或(b)或(C)或(d)(a)構建血紅鉚釘菇子實體周圍土壤真菌群落的分子圖譜；(b)構建血紅鉚釘菇子實體周圍土壤真菌群落ITS文庫；(c)研究血紅鉚釘菇子實體周圍土壤真菌群落；(d)人工馴化血紅鉚釘菇。所述土壤具體可為血紅鉚釘菇子實體周圍5-15厘米范圍內的土壤，優選為血紅鉚釘菇子實體下方IOcm處的土壤。因此，本發明提供了構建血紅鉚釘菇子實體周圍土壤真菌群落ITS文庫的方法。應用本發明的方法可以構建得到血紅鉚釘菇子實體周圍土壤真菌群落ITS文庫，對于明確血紅鉚釘菇子實體生長環境微生物真菌群落結構、遺傳、功能多樣性具有重要的意義，并為深入探討其在血紅鉚釘菇的人工馴化培養提供重要的信息，具有重要的應用價值。
圖1為宏基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖；M 1 kb plus DNA ladder ；1 宏基因組 DNA。圖2為以各個重組質粒為模板，用RV-M和M13-47組成的引物對進行PCR擴增得到的各個PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖；M :100 bp DNA ladder ;1至93依次對應93個重組質粒的PCR擴增產物。圖3為各個PCR擴增產物用限制性內切酶Hinf I酶切后的瓊脂糖凝膠電泳圖；M 100 bp DNA ladder ;1至93依次對應93個重組質粒為模板的PCR擴增產物的酶切產物。圖4為各個PCR擴增產物用限制性內切酶Hae III酶切后的瓊脂糖凝膠電泳圖；M=IOO bp DNA ladder ;1至93依次對應93個重組質粒為模板的PCR擴增產物的酶切產物。圖5為各個PCR擴增產物用限制性內切酶Msp I酶切后的瓊脂糖凝膠電泳圖；M 100 bp DNA ladder ;1至93依次對應93個重組質粒為模板的PCR擴增產物的酶切產物。圖6為各個PCR擴增產物用限制性內切酶Taq I酶切后的瓊脂糖凝膠電泳圖；M 100 bp DNA ladder ;1至93依次對應93個重組質粒為模板的PCR擴增產物的酶切產物。圖7為各個PCR擴增產物用限制性內切酶Mbo I酶切后的瓊脂糖凝膠電泳圖；M 100 bp DNA ladder ;1至93依次對應93個重組質粒為模板的PCR擴增產物的酶切產物。圖8為木霉屬的系統發育樹。圖9為交鏈孢霉屬和附球菌屬的系統發育樹。圖10為枝孢霉屬、深黃被孢霉屬、脈胞菌屬、青霉屬、畢赤酵母屬、擲孢酵母屬、側耳屬的系統發育樹。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。大腸桿菌DHlOB 購自北京百泰克生物技術有限公司；產品
5目錄號DP7501。TENP緩沖液由溶質和水組成，pHIO ；溶質及其在TENP緩沖液中的濃度如下50mMTris-HCl、20mM EDTA-Na2 (乙二胺四乙酸鈉)、IOOmM NaCl 和 0. 01g/ml PVPP(交聯聚乙烯吡咯烷酮)。PBS緩沖液由溶質和水組成，pH7. 4 ；溶質及其在PBS緩沖液中的濃度如下8g/LNaCl.O. 2g/L KCl、1. 44g/L Na2HPO4 和 0. 24g/L KH2PO4。實施例1、構建血紅鉚釘菇子實體周圍土壤真菌群落ITS文庫1、樣品的采集在北京地區海拔790米處(GPS坐標為N4057. 186 El 1629. 923)的血紅鉚釘菇子實體下方IOcm處采集土壤樣本，置于無菌的牛皮紙袋中。2、土壤樣品宏基因組DNA的提取(1)稱取5g步驟1采集的土壤樣品懸浮于:3ml TENP緩沖液后渦旋震蕩lOmin，12000rpm離心lOmin，取沉淀。(2)將步驟(1)的沉淀用TENP緩沖液洗滌三次，然后加入:3ml PBS緩沖液洗滌1次。(3)將步驟O)的沉淀進行宏基因組的提取，宏基因組的提取采用Mega PrepsPowerMax Soil DNA Isolation Kit (Mo Bio, Carlsbad, CA, USA)按說明書操作進行，最后將宏基因組DNA溶解于2. 5ml無菌水中。獲得大約10 μ g的宏基因組DNA。宏基因組DNA的0. 8 %瓊脂糖凝膠電泳圖見圖1。3、PCR 擴增 ITS 區域以步驟2提取的宏基因組DNA為模板，用ITSl和ITS4組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。ITSl (上游引物)5，-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3，(序列表的序列 1)；ITS4(下游引物)5，-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3‘(序列表的序列 2、。PCR體系(50 μ 1)中含20ng模板、80pmol上游引物、80pmol下游引物、IXEx TaqBuffer (Mg2+Plus)、0· 2mmol/l dNTP 和 1. 5U Ex Taq DNA 聚合酶(Takara, Japan)。PCR 擴增程序95°C 5min(預變性)；30 個循環(95°C 30s, 58°C lmin,72°C 30s)；72°C IOmin ；降至 4°C結束。4、獲得重組質粒(1)將步驟3的PCR擴增產物進行1. 2%瓊脂糖凝膠電泳，用購自中科瑞泰生物技術有限公司的瓊脂糖DNA回收試劑盒回收純化PCR擴增產物(均為690-710bp)。(2)分別將步驟(1)回收的PCR擴增產物與PMD19-T載體(Takara公司產品，日本)連接，得到重組質粒庫，通過轉化大腸桿菌DH10B并挑取單克隆獲得各個重組質粒。獲得93個重組質粒，即獲得了 93個插入pMD19-T載體的DNA片段(依次命名為Ml至M93)。5、ITS-RFLP(1)分別以步驟4的各個重組質粒為模板，用RV-M和M13-47組成的引物對(對應pMD19-T載體)進行PCR擴增(PCR體系和PCR擴增程序同步驟幻，回收各個PCR擴增產物。各個PCR擴增產物的1. 2%瓊脂糖凝膠電泳圖見圖2。
RV-M :5，-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3，(序列表的序列 3)；M13-47 :5，-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3，(序列表的序列 4)。(2)將步驟(1)的各個PCR擴增產物分別用限制性內切酶Hinf I, Hae III、MspI>Taq I和Mbo I進行酶切，并將酶切產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳(電壓為100V，電流為40mA，電泳時間約3. )，見圖3至圖7。圖3對應限制性內切酶Hinf I，顯示獲得了 147條帶。圖4對應限制性內切酶Hae III，顯示獲得了 112條帶。圖5對應限制性內切酶Msp I，顯示獲得了 133條帶。圖6對應限制性內切酶Taq I，顯示獲得了 194條帶。圖7對應限制性內切酶Mbo I，顯示獲得了 94條帶。6、系統發育分析根據酶切產物的帶型，選擇不同的重組質粒(即上述5種限制性內切酶的酶切產物中至少有一種酶切產物帶型不同)。根據圖3至圖7，從93個重組質粒中篩選出48個不同的重組質粒，分別對其插入片段進行測序(委托北京諾賽基因組研究中心有限公司進行)。將各個測序結果提交到GENBANK核酸序列數據庫中與已知序列進行比對，并用MEGA4. 1構建系統發育樹。所得序列通過BLAST程序與GenBank中的ITS基因序列進行同源性比較，用MEGA 4. 1軟件包中的Kimura2-parameter法計算遺傳距離，用Neighbor-Joining法構建系統發育樹，重復抽樣1000次分析系統樹各分枝的置信度。測序結果表明，48個重組質粒的48個插入片段中，34個屬于木霉屬，3個屬于枝孢霉屬，2個屬于青霉屬、2個屬于畢赤酵母屬、2個屬于交鏈孢霉屬、1個屬于附球菌屬、1個深黃被孢霉屬、1個屬于脈孢菌屬、1個屬于側耳屬、1個屬于擲孢酵母屬，見表1。表1各個插入片段的測序結果
權利要求
1.一種構建血紅鉚釘菇子實體周圍土壤真菌群落的分子圖譜的方法，包括如下步驟(1)取血紅鉚釘菇子實體周圍土壤，作為土壤樣本提取宏基因組DNA；(2)以所述宏基因組DNA為模板，用上游引物ITSl和下游引物ITS4組成的引物對進行PCR擴增，回收PCR擴增產物，即為DNA片段庫；所述上游引物ITSl為序列表的序列1所示的DNA片段；所述下游引物ITS4為序列表的序列2所示的DNA片段；(3)將所述DNA片段庫與pMD19-T載體連接，得到重組質粒庫；(4)分別以所述重組質粒庫中的每個重組質粒為模板，用上游引物RV-M和下游引物M13-47組成的引物對進行PCR擴增，回收PCR擴增產物；將各個PCR擴增產物分別用限制性內切酶Hinf I、Hae III,Msp I,Taq I和Mbo I進行酶切并電泳，得到分子圖譜；所述上游引物RV-M為序列表的序列3所示的DNA片段；所述下游引物M13-47為序列表的序列4所示的DNA片段。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟( 和/或所述步驟中，所述PCR擴增的反應體系由溶劑和溶質組成；所述溶劑為IXEx Taq Buffer ；每50 μ 1所述反應體系中含有如下溶質20ng所述模板、.80pmol所述上游引物、80pmol所述下游引物、0. 2mmol/l dNTP和1. 5U ExTaq DNA聚合酶；所述步驟⑵和/或所述步驟⑷中，所述PCR擴增的反應程序為95°C 5min；.95°C 30s,58°C lmin、72°C 30s, 30 個循環；72°C IOmin0
3.權利要求1或2所述方法得到的血紅鉚釘菇子實體周圍土壤真菌群落的分子圖譜。
4.權利要求1或2所述方法在構建血紅鉚釘菇子實體周圍土壤真菌群落ITS文庫中的應用。
5.如權利要求4所述的應用，其特征在于所述應用的方法為根據所述分子圖譜，選擇酶切產物帶型不同的所述重組質粒分別進行測序，得到血紅鉚釘菇子實體周圍土壤真菌群落ITS文庫。
6.權利要求4或5所述應用在構建血紅鉚釘菇子實體周圍土壤真菌群落的系統發育樹中的應用。
7.權利要求1或2所述的方法，或，權利要求4至6中任一所述的應用在在血紅鉚釘菇子實體周圍土壤真菌群落研究中的應用。
8.權利要求1或2所述的方法，或，權利要求4至6中任一所述的應用在在血紅鉚釘菇人工馴化中的應用。
9.一種弓I物組合物，由引物ITSl、引物ITS4、引物RV-M和引物M13-47組成；所述弓|物ITSl為序列表的序列1所示的DNA片段；所述引物ITS4為序列表的序列2所示的DNA片段；所述引物RV-M為序列表的序列3所示的DNA片段；所述引物M13-47為序列表的序列4所示的DNA片段。
10.權利要求9所述引物組合物在如下(a)或(b)或(c)或(d)中的應用(a)構建血紅鉚釘菇子實體周圍土壤真菌群落的分子圖譜；(b)構建血紅鉚釘菇子實體周圍土壤真菌群落ITS文庫；(c)研究血紅鉚釘菇子實體周圍土壤真菌群落；(d)人工馴化血紅鉚釘菇。
全文摘要
本發明公開了一種構建血紅鉚釘菇子實體周圍土壤真菌群落ITS文庫的方法。本發明方法包括如下步驟提取血紅鉚釘菇子實體周圍土壤的宏基因組；以宏基因組為模板用ITS1和ITS4進行PCR擴增回收700bp的DNA片段；將每個DNA片段與pMD19-T載體連接，用RV-M和M13-47進行PCR擴增，分別用HinfI、Hae III、Msp I、Taq I和Mbo I酶切各PCR產物并電泳，得到分子圖譜。應用本發明的方法可以構建得到血紅鉚釘菇子實體周圍土壤真菌群落ITS文庫，對于明確血紅鉚釘菇子實體生長環境微生物真菌群落結構、遺傳、功能多樣性具有重要的意義，為深入探討其在血紅鉚釘菇的人工馴化培養提供重要信息，具有重要的應用價值。
文檔編號C40B50/06GK102559658SQ20111038676
公開日2012年7月11日 申請日期2011年11月29日 優先權日2011年11月29日
發明者劉宇, 孟莉莉, 尹永剛, 王蘭青, 王守現, 王鵬, 耿小麗, 許峰, 趙爽 申請人:北京市農林科學院