轉錄因子誘餌的制作方法

專利名稱：轉錄因子誘餌的制作方法
專利說明本發明涉及利用轉錄因子誘餌(decoy)序列來調整原核生物，特別是病原細菌表現型的方法和組合物。本申請與2008年10月3日提交的美國臨時申請、2008年10月3日提交的國際專利申請PCT/GB2008/003353、2009年4月4日提交的美國臨時申請61/167，592以及2009年 4月4日提交的英國專利申請09069130相關，以上申請的內容均通過引用全文并入本文。控制細菌的生長和毒性在尤其是醫學和獸醫學應用中構成日益嚴重的問題，并且可能成為對公共健康的重大挑戰。用于對抗病原菌的抗生素是本領域公知的。但這些抗生素的廣泛使用導致出現對至少一種，某些情況中甚至是多種抗生素(所謂多重耐藥菌株) 有抗性的細菌。新發現和開發的傳統抗生素數量下降進一步惡化了這一情況。抗生素抗性的確是抗菌研究面臨的主要挑戰，威脅到已經上市和那些還處于開發期的抗生素的藥效。 因此存在對能夠用于解決細菌傳播和感染的新抗菌劑的需求。作為一個例子，金黃色葡萄球菌是對全球健康的重要挑戰，它能夠引起多種人和動物疾病，嚴重程度涵蓋從皮膚感染到由中毒性休克引起的致死膿毒癥的廣泛范圍(Lowy， New Engl. J. Med. (1998)339:520-532)。據估計人類人口中20 %在軟組織感染中攜帶該菌，通常有不易察覺的臨床特征，細菌由此進入體內感染血液，然后感染骨骼和心臟組織(Gordon and Lowy, Clin. Infect. Dis. (2008) 40 (S5) :S350_9)。雖然主要被認為是胞外病原菌，涌現大量證據表明金黃色葡萄球菌可以通過躲在胞內而避開抗菌作用或胞吞 (Garzoni and Kelley, Trends Microbiol. (2009) 17 :59-65)，因此可能使它的治療復雜化。自首次接觸抗生素獲得或者發展出抗性機制的程度使得目前臨床上的多重耐藥菌株非常普遍(Hawkey, J. Antimicrob. Chemother. (2008) 62 (Si) :il_9)，而這進一步限制了治療選擇。金黃色葡萄球菌之所以是一個非常靈活的病原菌的幾個原因在于其擁有規避宿主免疫反應的機制(Foster, Nat. Rev. Microbiol. (2005)3:948-958)；可以產生各種毒力因子(Novick,Mol. Micro. (2003)48 =1429-1449)；有分解代謝宿主組織的能力(Vojtov et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA99 :10102-10107)以及能夠容易地適應宿主體內的營養物缺乏和缺氧的環境(Haselbeck et al, Curr. Pharm. Des. 0002)8:1155-1172)。這些過程中很多是在轉錄水平調控，因此目前不是傳統抗生素的針對目標(抗生素主要作用于細胞壁、蛋白或DNA合成)。通常化膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes (Α型鏈球菌GAQ)感染可以用許多不同抗生素進行治療。早期治療可能減少由侵襲性A型鏈球菌疾病造成的死亡的風險。但即使最好的醫療護理也不能杜絕所有病例不發生死亡。對于病情非常嚴重的患者，可能需要重癥護理病房的支持性護理。對于有壞死性筋膜炎的人，經常需要手術來移除受損組織。 已出現了抗大環內酯類抗生素的化膿鏈球菌菌株，但所有菌株仍統一地對青霉素敏感。世界范圍內肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)對青霉素和其他β -內酰胺的抗性都在增強。主要的抗性機制涉及在編碼青霉素結合蛋白的基因中引入了突變。選擇壓被認為在這其中發揮了重要的作用，而內酰胺類抗生素的使用也顯示是感染和增殖的危險因素。肺炎鏈球菌能夠引起肺炎、菌血癥、中耳炎、腦膜炎、鼻竇炎、腹膜炎和關節炎。與青霉素抗性淋病一樣，由肺炎鏈球菌(肺炎球菌)導致的青霉素抗性肺炎也是在1967年首次被發現。在金黃色葡萄球菌之外的青霉素替代品抗性也是已知的。至1993 年，大腸桿菌已對5種氟喹諾酮類變體有抗性。結核分枝桿菌普遍抗異煙胼和利福平，有時對常規療法都有抗性。表現出某些抗性的其他病原菌包括沙門氏菌、彎曲菌和鏈球菌。糞腸球菌(Enterococcus faecium)是醫院中可見的另一種超級細菌。青霉素抗性的腸球菌發現于1983年，萬古霉素抗性的腸球菌(VRE)發現于1987年，而利奈唑胺 (Linezolid)抗性腸球菌(LRE)發現于90年代晚期。銅綠假單胞菌(I^eudomonas aeruginosa)是一種及其普遍的機會病原菌。銅綠假單胞菌最令人擔憂的特性之一是它的低抗生素敏感性。這種低敏感性得益于多重藥物外排泵和染色體編碼的抗生素抗性基因(例如mexAB-oprM、mexXY等)的聯合作用以及細菌細胞被膜的低滲透率。除了內在的抗性，銅綠假單胞菌可以通過染色體上編碼的基因的突變，或者抗生素抗性因子的水平基因傳遞而容易地發展出獲得性抗性。銅綠假單胞菌分離株發展多重藥物抗性需要幾個不同的遺傳事件，包括獲得不同突變和/或生物素抗性基因的水平傳遞。高突變有利于選擇產生慢性感染的銅綠假單胞菌菌株中的突變推動的抗生素抗性，而整合子中聚集多個不同抗生素抗性基因有利于抗生素抗性因子的共同獲得。近年的一些研究顯示與生物膜形成或者出現小菌落變體相關聯的表型耐藥可能對于銅綠假單胞菌群體對抗生素治療的反應來說很重要(Cornelis P.(編輯)Pseudomonas =Genomics and Molecular Biology(1st ed. ) (2008) Caister Academic Press)。艱難梭狀芽孢桿菌(Clostridium difficile)是在世界范圍內醫院中引起腹瀉病的醫院源性病原菌。據報道氯潔霉素(Clindamycin)抗性艱難梭狀芽孢桿菌正是1989 至1992年間造成紐約、亞利桑那、佛羅里達和麻省醫院中腹瀉病大爆發的致病菌(Johnson S. et al，New England Journal of Medicine (1999) 341 :1645-1651)。2005 年北美也報道過地理上分散的抗氟喹諾酮類抗生素(比如環丙沙星(ciprofloxacin)和左氧氟沙星 (Ievofloxacin))的艱難梭狀芽孢桿菌爆發(Loo V. et al N. Engl. J. Med. (2005)353(23) 2442-9)。大腸桿菌和沙門氏菌直接來自被污染的食物。感染了大腸桿菌的肉中百分之八十的細菌耐一或多種藥物，導致耐抗生素的膀胱感染(“HSUS Fact Sheet”)。沙門氏菌在 1970年代首次在人中發現，某些病例中耐多達九種不同抗生素(“HSUS Fact Sheet”)。當這兩種細菌傳播時，會出現嚴重的健康狀況。每年有許多人被感染后住院，有些甚至因此死亡。2004年11月5日，疾病預防與控制中心(⑶C)報告為在伊拉克/科威特地區和阿富汗受傷的服役人員提供治療的軍事醫療設施中，鮑氏不動桿菌(AcinetcAacter baumannii)血流感染病例增加。這些菌株多數表現出多重耐藥性，其中幾個分離株對檢測的所有藥物有抗性。基于DNA的療法構成新型抗菌劑，這類抗菌劑被設計成作用于細菌活性或致病性的關鍵基因目標。這種療法有潛力應用于多種病原菌，并且可以預計通過靶位點突變產生對這些療法的抗性是可能性很小的事件。此外，這類制劑具備的優點有開發時間可能更快和同時作用于多個新的無抗性目標。基于DNA的療法有潛力克服現有療法的局限性，因為可以設計這些療法使它們通過防止抗生素抗性機制的表達或者通過下調必要或適應性基因來抑制生長，從而可能治療任何病原菌。此外，細菌不可能發展出對這些制劑的抗性，因為這種抗性將需要影響轉錄因子及其相應結合位點的同時突變。對于調控多個必要基因的制劑尤其是這樣。轉錄因子誘餌CTranscription Factor Decoys，TFD)是一種這樣的基于DNA的療法。誘餌寡核苷酸被設計為模擬轉錄因子的結合位點并能防止轉錄因子與其相應基因組靴點結合，因此使基因表達得以改變(Mann and Dzau, J. Clin. Investigation(2000) 106 1071-1075)。轉錄因子誘餌的用途主要已在真核系統中進行了展示，它們作為新型治療劑的潛力刺激了其在真核系統中的發展(Marm & DzaiK2000))。為了這一目的，誘餌寡核苷酸被用來展示了轉錄因子EF2抑制大鼠中平滑肌的增殖(Morishita et al,Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1995)95 :5855-5859)；阻斷 STAT3 介導的癌變增殖(Leong et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA(2003) 100 :4138-4143)；以及靶向cAMP應答元件可以控制體內癌癥增殖(Park et al, J. Biol. Chem. (1999)274 :1573-1580)。TFD比其他基于DNA的療法有明顯的優勢。它們的作用機制非常簡單_通過用大量拷貝的特異結合序列(因此名詞稱為“誘餌”)淹沒細胞來捕獲轉錄因子，防止轉錄因子與啟動子結合，TFD由此可以控制基因表達。這與反義策略不同，在反義策略中由于mRNA二級結構復雜，很難界定靶分子。與反義方法相比，TFD還有作用迅速、防止基因表達的優點， 而反義方法著手于表達的結果。因此，TFD在低得多的濃度即有效，因為單個TFD-轉錄因子相互作用可以阻斷單個基因的轉錄，否則該基因就可以產生幾千拷貝的mRNA，后者構成反義方法的靶分子。據發明人所知，已有兩份關于誘餌在真核細胞中使用的報道。第一份中，富含AT 的誘餌寡核苷酸(被設計用于模擬核糖1，5，_ 二磷酸羧化酶/加氧酶(rbc)基因啟動子中富含AT的元件)被用于改變藍細菌中(X)2對rbc基因表達的調控(Onizuka et al, FEBS Lett. (2003)542 :42-46)。第二份報道中，誘餌寡核苷酸被用于鑒定天藍色鏈霉菌(S.C0eliC0l0r)A3的 actII-orf4啟動子中的新順式調控序列O)，所述基因編碼產生抗生素放線菌紫素的途徑特異激活子(McArthur and Bibb，PNAS (2008) 105 1020-1025)。本發明就是在這一背景下進行了改進。為了改變細胞活性，發明人使用了 TFD技術來打斷原核細胞的細胞途徑、應答和抗性機制的調控。例如方法可以用于改變一或多種抗生素抗性表現型、細胞對環境條件的適應反應、細胞毒性和細胞基本代謝。因此，發明人提供了治療細菌感染和限制細菌生長的手段。根據一方面，本發明在于利用轉錄因子誘餌(TFDs)減弱原核細胞的活力。具體來說，本發明包括減弱原核細胞活力的方法，所述方法包括(a)提供包含靶轉錄因子的結合位點的誘餌多核苷酸(誘餌序列)；(b)將誘餌多核苷酸引入原核細胞，所述原核細胞包含與基因可操縱地連接的轉錄因子識別位點；
其中誘餌多核苷酸的引入減少了細胞中靶轉錄因子與結合位點的結合，導致可操縱地連接的基因的表達被改變；其中所述靶轉錄因子包含基因的表達調控因子，所述基因編碼下述中的一或多個(i)細胞適應性反應；(ii)細胞內在抗生素抗性機制；(iii)細胞毒力因子；(iv)細胞應激反應；或者(ν)細胞關鍵基因。另一方面，本發明提供了 -提高原核細胞抗生素敏感性的方法，所述方法包括(a)提供包含靶轉錄因子的結合位點的誘餌多核苷酸(誘餌序列)；(b)將誘餌多核苷酸引入原核細胞，所述原核細胞包含與基因可操縱地連接的轉錄因子識別位點；其中誘餌多核苷酸的引入減少了細胞中靶轉錄因子與結合位點的結合，導致可操縱地連接的基因的表達被改變，從而提高細胞的抗生素敏感性；其中所述靶轉錄因子包含基因的表達調控因子，所述基因編碼下述中的一或多個(i)細胞適應性反應；(ii)細胞內在抗生素抗性機制；(iii)細胞毒力因子；(iv)細胞應激反應；(ν)細胞關鍵基因。發明還提供了 -包含靶轉錄因子的結合位點的誘餌多核苷酸，其中所述結合位點沒有可操縱地連接基因，并且其中所述轉錄因子包含基因的表達調控因子，所述基因編碼下述中的一或多個(i)細胞適應性反應；(ii)細胞內在抗生素抗性機制；(iii)細胞毒力因子；(iv)細胞應激反應；(ν)細胞關鍵基因。靴轉錄因子可以選自:WhiB7(SEQ ID NOs 5 & 9) ,FabB (SEQ ID NO 6)、LytM (SEQ ID NO 7)、Ssa(SEQ ID NO 8)、FadR(SEQ ID NO 10)、YycG/YycF(SEQ ID NOs :11 & 12)、 σ 54(或 SigA) (SEQ ID NOs :13 & 14)、Fur (SEQ ID NOs : 15、16 & 17)、TcdR (SEQ ID NO: 18), Vfr (SEQ ID NOs :19,20 & 21)、NtrC(SEQ ID NO :22)、ArsR(SEQ ID NOs :23 & 24)、 TcaA (SEQ ID NO :25)、AgrA(SEQ ID NOs :26 & 27),WalR(SEQ ID NOs :44、45、48、49 & 57)、 sigB(SEQ ID NO :58)或Ksig(SEQ ID NOs :59 & 60)；或者任何一種的功能變體或同源物。發明還提供了如上所述的誘餌多核苷酸，其包含一個以上的靶轉錄因子的一個以上的結合位點。-包含外源誘餌多核苷酸的細胞，所述多核苷酸包含沒有可操縱地連接基因的靶轉錄因子的結合位點；其中所述細胞包含可操縱地連接基因的轉錄因子的結合位點；并且其中所述靶轉錄因子包含基因的表達調控因子，所述基因編碼下述中的一或多個(i)細胞適應性反應；(ii)細胞內在抗生素抗性機制；(iii)細胞毒力因子；(iv)細胞應激反應；(ν)細胞關鍵基因。-治療受試對象中細菌感染的方法，所述方法包括將本發明的誘餌多核苷酸，任選與一或多種抗生素和/或抗細菌劑組合進行給藥。-殺死細菌、抑制細菌生長或者減輕細菌毒力的離體(exvivo)方法，所述方法包括將本發明的誘餌多核苷酸，任選與一或多種抗生素和/或抗細菌劑組合施用。-藥物組合物，所述組合物包含本發明的誘餌多核苷酸和藥物可接受賦形劑或載體，任選組合一或多種抗生素和/或抗細菌劑。-包含本發明的誘餌多核苷酸的消毒組合物，任選組合一或多種抗生素和/或抗細菌劑。-包含本發明的誘餌多核苷酸的清潔組合物，任選組合一或多種抗生素和/或抗細菌劑。-試劑盒，所述試劑盒包含本發明的誘餌多核苷酸以及一或多種抗生素和/或抗細菌劑，其中所述誘餌以及一或多種抗生素和/或抗細菌劑聯用于殺死細菌、抑制細菌生長或者減弱細菌毒力。-減弱原核細胞毒力的方法，所述方法包括(a)提供包含靶轉錄因子的識別位點的誘餌多核苷酸；(b)將誘餌多核苷酸引入原核細胞，所述原核細胞包含與基因可操縱地連接的轉錄因子識別位點；其中誘餌多核苷酸的引入減少了細胞中靶轉錄因子與結合位點的結合，導致可操縱地連接的基因的表達被改變，從而減弱細胞毒力；并且其中所述靶轉錄因子包含基因的表達調控因子，所述基因編碼下述中的一或多個(i)細胞適應性反應；
(ii)細胞內在抗生素抗性機制；(iii)細胞毒力因子；(ν)細胞關鍵基因。-包含靶轉錄因子的結合位點的誘餌多核苷酸，其中所述結合位點具有SEQID NO :57、SEQ ID NO 58 或 SEQ ID NO 60 所示的序列。-包含SEQID NO :57、SEQ ID NO 58或SEQ ID NO 60序列的誘餌多核苷酸在治
療細菌感染中的用途。一般來說，轉錄因子誘餌(TFD)序列(或誘餌序列)包含轉錄因子結合位點，所述結合位點包含細胞中的天然或內源順式調控序列或者與之競爭結合細胞中的相應轉錄因子。(通過本文描述的方法或者其他方法)被引入包含所述順式調控序列的合適宿主細胞時，誘餌序列與細胞內的順式調控序列競爭結合相應的轉錄因子。這種競爭減少了轉錄因
9子與細胞內的順式調控序列的結合，使得那些由轉錄因子與順式調控序列的結合來調控表達的基因的表達被改變。用于本文的誘餌功能是指序列與順式調控序列以這種方式競爭結合相應轉錄因子的能力。順式調控序列或元件通常是指存在于基因的轉錄起始位點上游(5’ )或下游 (3’)，并行使調節基因表達之功能的核苷酸序列。一般來說，順式調控序列包含蛋白質(轉錄因子)的結合位點，并且所述蛋白的結合能夠調控給定基因的轉錄。蛋白質與序列的結合直接或間接導致基因表達的調整。例如，結合了的蛋白質可能與結合在附近區域的轉錄所需的另一個蛋白質相互作用，將后者錨定在正確位置；或者可能抑制轉錄所需的另一個蛋白質的結合。一般順式調控序列或元件出現在基因的啟動子區，但原核細胞中順式調控序列位于受它們影響的基因的上游或下游幾百堿基對處也并不罕見。順式調控序列可能是抑制性的(結合了轉錄因子后抑制或減少基因的轉錄)或者活化性的(結合了轉錄因子后激活或增加基因的轉錄)。因此與順式調控序列結合的轉錄因子可能是陰性效應物(阻遏蛋白)或者陽性效應物(激活蛋白)。誘餌多核苷酸或誘餌序列的靶序列是指與其競爭結合轉錄因子的細胞轉錄因子結合位點。類似地，靶調控蛋白是指誘餌序列要結合的轉錄因子。誘餌序列的靶基因是指與細胞轉錄因子結合位點可操縱地連接的基因。因此誘餌系統打斷靶基因表達所受到的調控。發明人利用誘餌改變了原核細胞表現型，特別是與細菌致病性相關的表現型，并用于解決細菌感染。具體來說，為了使細胞對被殺死或生長抑制更易感，和/或不利條件下存活能力下降，和/或毒力更弱，發明人利用誘餌打斷細胞途徑、應答和抗性機制的表達。—方面，為了使例如常見條件下細胞活性較低，所述方法打斷基因的表達。例如， 可能因為對抗生素的易感性增加、應激反應受損、毒性反應受損和/或必要基因表達被打斷，細胞變得活性較低。本方法可以利用誘餌來減弱細胞防御或存活系統和/或毒性系統。 所述方法可能使細胞對細胞死亡和/或抑制生長或致病性更易感。因此，一個方面中，所述誘餌可能產生殺菌或抑菌效果。例如，一個方面中，發明人利用誘餌改變了原核細胞，特別是細菌，尤其是病原細菌的抗生素易感性表現型。一個方面中，易感性的增加不是一種抗生素或一類抗生素特異的。一個方面中，易感性的增加不是任何一種抗生素或一類抗生素結構和/或機制特異的。 一個方面中，對廣泛的抗生素或抗生素類型的敏感性獲得了提高。一個方面中，易感性的增加不是選自以下的任何一種或一類抗生素特異的氨基糖苷類(比如卡那霉素)、碳青霉烯類(比如美羅培南(meropenem))、頭孢菌素類(比如頭孢吡肟(cef印ime))、糖肽(比如萬古霉素和達托霉素(daptomycin))、青霉素類(比如氨芐西林、羧芐西林和盤尼西林)、多肽抗生素(比如多粘菌素B)、喹啉(比如levaquin)、 磺胺類(比如復方新諾明(Bactrim))、四環素類(比如四環素)、以及各種氯霉素、利福平 (rifampicin)、斯沃(Zyvox)0本文描述的誘餌方法還可以用于改變諸如細胞適應性反應或細胞毒力的表現型。 方法還可能用于改變必要基因的細胞表達，以及改變例如指定培養基或生理條件下(例如營養有限)的細胞存活。總的來說，所述方法提供了針對細菌感染和相關疾病的新手段。這可以通過強化抗生素的效果，或者通過對細菌的直接抑制效果(例如抑制生長或存活、抑制毒力因子的表達、抑制必要基因的表達)。因此，TFD可以自身作為抗生素或抗細菌劑。一個方面中，方法利用誘餌打斷決定細胞活力的基因的表達。如上所述，本方法利用誘餌打斷細胞途徑、反應和抗性機制的調控。某些情況中， 這涉及全局性調節分子的靶向結合。靶基因可以是應答抗生素調節的那些基因。靶分子可以包括內在抗生素抗性機制的調節因子，所述抗性機制包括內在多重藥物耐藥性機制。內在機制可能提供對藥物(比如抗生素)的物理屏障，例如通過提高抗生素從細胞清理出去的速率或者通過降低細胞壁的穿透性或滲透性。內在機制可以提供對已進入細胞質的抗生素的抗性。內在抗性機制可能在應答環境條件時被誘導，例如文中列出的脅迫或其他條件。某些情況中，編碼內在抗性機制的基因的表達受到抗生素反應的調節。 例如，這些可以是編碼具有生理作用的蛋白質的基因，所述基因的表達應答抗生素時差別調節。編碼參與內在抗性的蛋白質的基因可能編碼例如外排泵、或者決定細胞壁組成或密度或細胞壁代謝的蛋白質。一個方面中，靶基因編碼的抗性機制就例如抗生素結構或機制來說，不是一種或一類抗生素特異的。靶分子可以包括細胞適應性反應的調控因子。通常這些是對環境條件，例如不利環境條件的適應性反應。例如，這些包括應激反應，比如氧化應激反應或者過氧化物應激反應、對營養缺乏(例如氮限制)的反應、對毒素，例如金屬毒素(比如高鐵條件)的反應、對高酸度HSpH)條件的反應。因此靶分子可能包括應激反應基因的調控因子、金屬調控蛋白以及固氮基因的調控因子。細胞適應性基因是這樣一些基因，這些基因的表達由環境因素決定，并且影響細菌在該環境下存活和引起疾病的能力。例如，細菌可能需要通過誘導基因來適應宿主體內的低鐵濃度，所述基因表達能夠攝取鐵并將鐵帶入細胞的蛋白質。還包括生物膜的形成、細胞壁生理特性和初級代謝的變化。應激反應基因構成細胞適應性基因的一個類型。它們是數量有限的幾組基因，它們中的全部或某些在應答多種脅迫時被誘導。所述脅迫可以包括物理因素(溫度變化、酸度、低氧)、生物因素(應答宿主或其他細菌)以及化學因素(比如用抗生素進行的治療)。還包括的有對生理條件的反應。因此靶分子可能包括致病基因或毒力因子(比如毒素)表達的調控因子。靶分子還包括決定生物膜形成和營養(例如鐵)清除的蛋白質的調控因子。毒力因子基因是這樣一些基因，這些基因控制細菌產生特定分子，比如毒素；或者引發宿主的反應，影響細菌存活和導致疾病的能力。靶分子還包括必要基因的調控因子。所述必要基因是那些它們的表達為細胞在常見環境條件下存活所必需的基因。例如，靶分子可以是編碼DNA復制、初級代謝途徑、脂肪酸合成或細胞分裂所需蛋白質的基因的調控因子。必要基因是細菌在任何環境下存活所必需的基因。以上描述的系統經常在細胞內有重疊。因此一個調控蛋白可能調控編碼毒力因子的基因的表達以及應對環境脅迫反應的細胞壁代謝。另一個例子中，調控蛋白可能控制特定環境條件(例如營養缺乏)下對細胞關鍵的基因的表達。一個方面中，本方法可以靶向這樣的基因，所述基因的表達調控決定細胞在有抗生素存在的情況(例如有一種以上或者一類以上抗生素)下存活的能力。抗生素抗性基因的實例在同時待審的申請PCT/GB2008/003353中有公開。為了改變，例如增強抗生素抗性，可以將如本文描述的誘餌用于靶向PCT/GB2008/003353所述任意一種或多種基因，所述基因編碼β-內酰胺、外排泵(例如

圖1所示的那些)、氨基糖苷修飾酶或ermB基因。的確，誘餌可以含有兩個或兩個以上序列要作用于一個以上的基因或轉錄因子和/或一種以上的細菌菌株。例如，誘餌可以包含來自革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌的Sig結合位點。TFDs可以用于治療發生在人體內任何部位的多種細菌感染。可以描述的有五種普通的細菌感染區域。呼吸道感染是最常見的一種，上呼吸道感染包括可以用局部施藥或氣溶膠制品治療的耳、喉和鼻竇。下呼吸道感染包括肺炎，后者是由多種細菌病原菌、支氣管炎和囊性纖維化的感染性并發癥導致的。社區和醫院診所的一個常見問題是尿道感染，該病中尿液被感染，抗細菌劑需要進入膀胱、前列腺、輸尿管和腎。腸易被感染(例如胃腸道感染)，其中細菌通過侵入粘膜或者產生毒素引起疾病，實例包括霍亂流行，以及當口服或靜脈內施用抗生素時。皮膚和軟組織感染通常可以通過局部施藥治療，在創傷性損傷或燒傷后很常見，這使得微生物能夠定居和內移，造成局部化的或者快速通過組織擴散的感染。 造成皮膚感染的微生物經常來自正常的皮膚菌群，比如化膿鏈球菌導致淺表皮膚感染(膿皰病)、蜂窩組織炎(更深層的感染，可能擴散到血液)和壞死性筋膜炎(進展迅速的感染， 經常會危及生命)。最后中樞神經系統的感染，比如細菌性腦膜炎，可能是最不容易治療的， 因為治療劑必需象病原細菌一樣透過血腦屏障。可以按照同時待審的申請PCT/GB2008/003353所述制備和測試誘餌。考慮到本方法時，以上方面中的一個或多個可以進行組合。本方法利用誘餌多核苷酸打斷原核細胞中的基因表達。誘餌多核苷酸包含轉錄因子結合位點(誘餌序列)。通常在本方法中，誘餌多核苷酸被引入靶細胞，所述細胞包含與順式調控序列可操縱地連接的基因，所述順式調控序列中含有轉錄因子的結合位點。多核苷酸將轉錄因子從細胞結合位點搶奪下來(titrates)，打斷對細胞中所述可操縱地連接基因的表達的調控。基因表達的改變導致細胞表現型的變化。利用本方法(包括本文和同時待審的申請PCT/GB2008/003353所述)可以尋靶轉錄因子和基因。具體實例包括圖2中也列出的以下調控因子和調控序列。提到每個特定調控因子包括所列舉的物種中的該調控因子及其任何物種的同源物。每個目標有天然結合位點和/或共有結合序列。靶向調控因子的誘餌序列可以包含存在的天然序列或共有序列或者它們的具有文所述誘餌功能的變體或片段，例如另一物種中的天然結合位點。檢測變體序列的誘餌功能的方法在同時待審的申請PCT/GB2008/003353 中有描述。正如下文列舉的，靶向特定調控因子的誘餌尤其適合在有該調控因子的原核細胞中使用。以下還給每個調控因子列舉了靶向該調控因子的誘餌的用途實例，例如在用誘餌處理后，細胞通常變得對其更易感的抗生素。本文提供的序列顯示了結合位點的單條鏈。但是，應當明白自然界中和本發明的 TFDs中的序列是雙鏈的。文中列出的序列的互補鏈可以根據例如Molecular ClOning =A Laboratory Manual (3rd Edition), 2001 by Joseph Sambrook and David Russell
易地推斷。
ffhiB7WhiB7是包括分枝桿菌(例如恥垢分枝桿菌(M. smegmatis)和結核分枝桿菌)和鏈霉菌的放線菌中抗生素抗性基因的轉錄調控因子(Nguyen et al, Trends in Microbiology(2006) 14 :304-312)。恥垢分枝桿菌菌株MC2155中的天然WhiB7結合位點包含5' -CACCAGCCGA AAAGGCCACG GACCCGCAGT CACCCGGATC CGTGGCCATT TTTGTCGGAC CCCCCGAGAA ATCTGGTCGC AGGATCCATC AGCTCAGACA GATCAC-3，(SEQ ID NO 9)基因座CP000480 6988209bp DNA 環形 BCT 12-DEC-2006定義恥垢分枝桿菌菌株MC2 155，完整基因組。登錄號CP000480版本CP000480. 1 GI :118168627坐標20313637-2031742用途提高多種親水/疏水抗生素的效力，所述抗生素包括大環內酯類、林可酰胺類、氯霉素、亞胺培南、普那霉素(pristinamycin)、利福平、鏈霉素、壯觀霉素、四環素、異煙胼、乙胺丁醇。
WhiB7 TFD序列的一個實例包含
WhiB7 TFD 5' TGG CCA CGG ATC CGG GTG ACT GCG GGT CCG TGG CCT 3'
(SEQ ID NO 5 ；實施例 2)
FadR
i^adR是大腸桿菌中脂肪酸合成關鍵途徑的基因(包括fabA和fabB) (Campbell & Cronan, J.Bacteriology(2001) 183 :5982-5990)大腸桿菌K12中的天然!^adR結合位點包含序列5’ AGTAAGTTTC GAATGCACAA TAGCGTACAC TTGTACGCCG AACAAGTCCG ATCAGCCATT TAA-3，(SEQ ID NO 10)基因座CP000948 4686137bp DNA 環形 BCT 05-JUN-2008定義大腸桿菌菌株K12亞菌株DH10B，完整基因座登錄號CP000948版本CP000948. 1 GI :169887498坐標2531419-2531481用途提高任何針對脂肪酸合成的抗生素的效力，所述抗生素比如平板霉素 (platensimycin)、平板素(platnecin)衍生物、莖點霉聯烯酸(phomallenic acid)、紫堇塊莖堿(corytuberine)、環砜、鄰氨基苯甲酸衍生物、cerulenic acid。FadR TFD序列的一個實例包含FabB TFD 5，TTT ATT CCG AAC TGA TCG GAC TTG TTC AGC GTA CAC GTG TTA GCT ATC CTG CGT GCT TCA 3'.(SEQ ID NO 6 ；實施例 3)YycG/YycFYycG/YycF是低G+C革蘭氏陽性細菌中的雙組分調節因子，所述細菌包括金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、肺炎鏈球菌、化膿鏈球菌、單核細胞增多性李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)。YycG/YycF已知是至少12種基因的關鍵調控因子，所述基因包括 LytM和kaA，以及參與毒性決定和細胞壁合成的基因(Dubrac & Msadek，Journal of Bacteriology(2004) 186 :1175-1181)。 金黃色葡萄球菌中YycF和YycG的天然結合位點(位于LytM和Ssa啟動子)包
含
YycF_LytM
5’-GCTATTTTGTAATGACAATGTAATGAGTTTAGTAAAAA-3’ (SEQ ID NO :11)
基因座CP000730 2872915bp DNA 環形 BCT 16-N0V-2007
定義金黃色葡萄球菌金黃亞種USA300_TCH1516，完整基因座。
登錄號CP000730
版本CP000730.1 GI :160367075
坐標322073-322109
YycF SsaA
5’-ATTACAAATTTGTAACAGACTTATTTTA-3’ (SEQ ID NO 12)
基因座CP000730 2872915bp DNA 環形 BCT 16-N0V-2007
定義金黃色葡萄球菌金黃亞種USA300_TCH1516，完整基因座。
登錄號CP000730
版本CP000730.1 GI :160367075
坐標2415067-2415093
用途提高大環內酯類-林可酰胺類-鏈陽性菌素B類(macrolide-lincosamide
-Streptogramin B) (MLSB)抗生素的效力。YycG/YycF TFD序列的實例包括LytM TFD 5’ GCT ATT TTG TAA TGA CAA TGT AAT GAG TTT AGT AAAAA3’SsaA TFD 5，ATT ACAAAT TTG TAA CAG ACT TAT TTT A 3，·(SEQ ID NOs 7 & 8 ；實施例 4)σ 54 或 SiRaσ 54或SigB是適應性反應的主要調控因子，發生在大約60%細菌中，所述細菌包括恥垢分枝桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae) (ffigneshweraraj, Molecular Microbiology(2008) 68 :538-546)。金黃色葡萄球菌和肺炎克雷伯氏菌中的天然結合位點包含SA_sig5，-TTATTATATA CCCATCGAAA TAATTTCTAA TCTTC—3，(SEQ ID NO :13)基因座CP000730 2872915bp DNA 環形 BCT 16-N0V-2007定義金黃色葡萄球菌金黃亞種USA300_TCH1516，完整基因座登錄號CP000730版本CP000730. 1 GI :160367075坐標2187051-2187017KP_sig5，-CCGATAAGGG CGCACGGTTT GCATGGTTAT-3，(SEQ ID NO 14)
基因座X133032 4206bp DNA 線性 BCT 18-APR-2005定義肺炎克雷伯氏菌nif基因簇DNA登錄號X13303版本X13303. 1 GI :43820坐標18301-18330
用途提高例如本文描述的殺菌和抑菌性抗生素的效力。 Fur
Fur調控最初被描述為對鐵調節很重要，但逐漸認識到它參與其他適應性途徑，最顯著的是金屬調節(Zn-^ir)還決定對過氧化物酶的抗性(Per)。Fur調控至少發生在金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)、枯草芽孢桿菌(Fur，PerR, Zur, MntR) (Horsburgh 2001、Lavarr 2003 禾口 Delany 2001)中。金黃色葡萄球菌和大腸桿菌中結合Fur的共有序列包含SA_fur5，-ACT ACA AGT ACT ATT AGT AAT AGT TAA CCC TT—3，(SEQ ID NO :15)如 Horsburgh, J. Bacteriology (2001) 183 :468 所述共有序列(iFur BOX，)。EC_fur5，-GATAATGATAATCATTATC-3，(SEQ ID NO :16) 如 de Lorenzo, J. Mol. Biol. (1998) 283 :537 所述共有序列。 幽門螺桿菌中的天然結合序列包含HP_fur5， -GTT GTC CCA TAA TTA TAG CAT AAA TGA TAA TGA AAA AGT AAA-3， (SEQ ID NO 17)基因座CP001072 1608548bp DNA 環形 BCT 12-JUN-2008 幽門螺桿菌Sii470，完整基因座. CP001072
CP001072. 2 GI :189491895 691415-691374
用途總體上提高抗生素(可能誘導脅迫，殺菌)的效力。Fur誘餌可以在沒有抗生素的情況下，用于干擾應激反應機制和環境適應。TcdRTcdR是能夠自身調節并調控決定毒力的兩種主要外毒素的表達的選擇性σ因子。已知TcdR調控發生在艱難梭狀芽孢桿菌、肉毒梭狀芽孢桿菌(C.botulinium)(其中同源物是BotR)、破傷風梭狀芽孢桿菌(C. tetani) (TetR)和產氣莢膜梭狀芽孢桿菌 (C. perfringenns)(UviA)(Matamourous, Molecular Microbiology(2007) 64 :1274-1288)中。艱難梭狀芽孢桿菌中的共有結合位點包含TcdR5，-AAG TTT ACA AAA TTA TAT TAG AAT AAC TTT TTT A TT-3，(SEQ ID NO :18)共有序歹IjCTcdR，其中-35 和-10 盒帶有下劃線)如 Dupuy，Mol. Micro. (2006)55
定義
登錄號
版本坐標
151196中所描述。用途提高許多抗生素，最顯著的是那些具有抑菌性能的抗生素的效力。VfrVfr是銅綠假單胞菌和大腸桿菌中毒力因子的全局調控因子(Kanack， Microbiology (2006) 152 :3485-3496)。大腸桿菌同源物是CRP，其結合位點發生在toxA基因的啟動子和regA基因的啟動子Pl內。銅綠假單胞菌中的共有序列和兩個天然結合位點是PA_Vfr5，-AAA TGT GAT CTA GAT CAC ATT T_3，(SEQ ID NO :19)共有序列如Kanack，Microbiol. (2006)55 :1196 中所描述的.PAJoxA5，-CACTCTGCAA TCCAGTTCAT AAATCC-3，(SEQ ID NO :20)基因座EU595736 26bp DNA 線性 BCT 15-JUN-2008定義銅綠假單胞菌菌株PACS458克隆fal366，完整序列。登錄號EU595736 REGION 10145. . 10170版本EU595736. 1 GI :187939551坐標10145-10170PA_RegA5，-GTAACAGCGGAACCACTGCACAG-3，(SEQ ID NO :21)基因座EU595736 26bp DNA 線性 BCT 15-JUN-2008定義銅綠假單胞菌株PACS458克隆fal366，完整序列登錄號EU595736 REGION 10145. . 10170版本EU595736. 1 GI :187939551坐標312-334抗生素可以在沒有抗生素的情況下，利用誘餌控制決定銅綠假單胞菌和大腸桿菌的毒力的基因的表達。誘餌可以用于提高抗生素，最顯著的是具有抑菌性能的抗生素的效力。NtrCNtrC是必要基因glnA的調控因子，該基因在至少肺炎克雷伯氏菌中是環境適應性所必需的(Minchin et al，The EMBO Journal (1989) 8 :3491-3499)。肺炎克雷伯氏菌的天然結合位點包含KP_NtrC5，-GCTTTGCACTACCGCGGCCCATCCCTGCCCCAAAACGATCGCT-3，(SEQ ID NO :22)基因座X13303 24206bp DNA 線性 BCT 18-APR-2005定義肺炎克雷伯氏菌nif基因簇DNA。登錄號X13303版本X13303. 1 GI :43820坐標18159-18201用途可以在沒有抗生素的情況下，用誘餌干擾必要基因glnA的表達，該基因是環境適應性所必需的；或者誘餌與可能誘發脅迫(殺菌)的抗生素組合。ArsRArsR是在至少幽門螺桿菌、獵豹螺桿菌(H. acinonychis)和貓螺桿菌(H. felis) 中編碼酸適應的基因的調控因子(Pflock et al,J. Bacteriology (2006) 188 :3449-3462)。 如Pflock et al中的描述，結合位點存在于amiE啟動子和rocF啟動子內。天然結合序列的實例包括HP_AmiE5' -ATAATCATAA TGATTAAAGT TTTCATATTC ATTATAAATC CGTTTACACA ATTATT-3，(SEQ ID NO :23)基因座AE000511 56bp DNA 線性 BCT 27-DEC-2005 幽門螺桿菌沈695，完整基因組。 AE000511 REGION :310910. . 310965定義登錄號版本坐標HP RocF
AE000511. 1 GI :6626253 310910-3109655’ -GAAATTGTTC TATTTATTAT CCATTTGCTT ATTAATAATT GGTTGTTAAT TTTGGTTTAG A-3，(SEQ ID NO 24)基因座AE000511 61bp DNA 線性 BCT 27-DEC-2005定義幽門螺桿菌沈695，完整基因組。登錄號AE000511 REGION 1459830. . 1459890版本AE000511. 1 GI :6626253坐標1459830-1459890用途可單獨使用誘餌干擾介導鐵攝取的必要基因的表達，所述基因是環境適應所必需的；或者將誘餌與一般會誘導脅迫(殺菌)的抗生素組合使用。糖肽抗性共有序列(GISA)通過對開放芯片數據進行生物信息學分析確定共有序列。將糖肽抗性菌株與其親代，以及同一抗性株與回復突變體進行比較時，在顯示被上調的基因中發現了基序 (Scherl, BMC Genomics (2006) 7 296)。在 17/22 啟動子發現含有共有序列。在tcaA(已知的毒力陽性調控因子)的啟動子中發現的一例共有序列可以用于誘胃(Maki, Antimicrobial Agents Chemother. (2004) 48 :1953) ()。SAJcaA5，-TGAACACCTTCTTTTTA-3，(SEQ ID NO :25)基因座CP000730 2872915bp DNA 環形 BCT 16-N0V-2007定義金黃色葡萄球菌金黃亞種USA300_TCH1516，完整基因組.登錄號CP000730版本CP000730. 1 GI :160367075坐標2476452-2476436
共有序列至少存在于金黃色葡萄球菌。靶向該序列的誘餌可以用于尋靶與天然啟
動子中該序列結合的任何調控蛋白。一般通過結合天然序列受到調控的基因導致糖肽抗性和/或毒性。用途誘餌可以用于提高糖肽類抗生素的效力。AgrA通過對開放芯片數據進行生物信息學分析確定共有序列。在顯示受到和毒性相關的調控因子Agr陽性調控的基因中發現了基序(Dunman，J. Bacteriol. (2001) 183 :7341)。發現公認基序發生在兩個啟動子中，這兩個啟動子被認為可能參與決定致病性 (SA2093 (AraC樣轉錄調控因子上游)和SA1269 (Bit樣基因))。SA_Agr_20935，-AGAAAG ACAAAC AGG AGT AA—3，(SEQ ID NO :26)基因座CP000730 2872915bp DNA 環形 BCT 16-N0V-2007定義金黃色葡萄球菌金黃亞種USA300_TCH1516，完整基因組。登錄號CP000730版本CP000730. 1 GI :160367075坐標2414790-2414771SA_Agr_1269 5，-GAA GAAACAAAAAGC AGC AT—3，(SEQ ID NO :27) 基因座 AP009324 2880168bp DNA 環形 BCT 09-JAN-2008 定義金黃色葡萄球菌金黃亞種Mu3 DNA,完整基因組. 登錄號 AP0093M 版本 AP009324. 1 GI :156720466坐標1549580-1549561結合基序至少存在于金黃色葡萄球菌，在諸如銅綠假單胞菌和大腸桿菌的許多革蘭氏陰性物種含有同源物。靶向該基序的誘餌可以用于尋靶與天然啟動子中該基序結合的任何調控蛋白。一般通過結合天然序列受到調控的基因決定細胞中的毒性。用途誘餌可以用于控制決定銅綠假單胞菌和大腸桿菌的毒性的一組基因的表達。通常，多核苷酸中的誘餌序列(轉錄因子結合位點)不與基因可操縱地連接。所述轉錄因子結合位點可以分離自相應啟動子的任何其他元件。誘餌多核苷酸可以包含質粒載體。例如，誘餌多核苷酸可能包含如共同待審的申請PCT/GB2008/003353所述n[陷阱(snare)]質粒和/或根據共同待審的申請PCT/ GB2008/003353所述方法來制備。誘餌多核苷酸可能包含一個以上拷貝的誘餌序列。所述多核苷酸可以包含多聚體分子，后者含有多拷貝誘餌序列。例如，從1到1000個拷貝。一般來說，有兩個或以上拷貝， 例如 2-1000 拷貝，例如至少 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、 700、800 或 900 拷貝。例如，可以有 10-200、10-150、20-120、20-100、30-100、30-80、30-50、 30-40拷貝。例如，可以有30個拷貝的誘餌序列。一般有多拷貝誘餌，例如誘餌序列的多個直接重復。替代地，誘餌多核苷酸可以包含一個以上的誘餌序列以及誘餌序列的多個拷貝。誘餌多核苷酸可以包含誘餌序列之外的其他序列。一般所述其他序列使得誘餌序列更抗外切和/或內切核酸酶造成的降解。誘餌多核苷酸可以包含至少一個二級結構元件。一般所述二級結構使得誘餌序列更抗外切和/或內切核酸酶造成的降解。誘餌多核苷酸可以包含修飾的堿基或糖以便賦予更大的核酸酶抗性。誘餌多核苷酸可以在多核苷酸的末端包含2’ OH核苷酸或氨基來減弱或抑制外切核酸酶活性。誘餌多核苷酸可以包含線性多核苷酸。誘餌多核苷酸可以包含環形雙鏈DNA，例如所謂啞鈴構型(Ahn et al, Biochemical Biophysical Res. Comm. Q003) 310 :1048-1053)。啞鈴構型一般含有雙鏈區， 該雙鏈區內含有被小的莖環結構或其它序列夾著的靶序列。誘餌多核苷酸可以在分子的一個或每個5’端含有膽固醇修飾。誘餌多核苷酸可以包含任意合適組合的一個或多個以上特征。誘餌多核苷酸可以包含本文描述的或者按照同時待審的申請PCT/GB2008/003353 所述方法鑒定到的任何誘餌序列，還可以包含本文描述的其他序列。正如上文所述，誘餌多核苷酸可以包含n[陷阱(snare)]質粒。與例如線性寡核苷酸相比，質粒具有容易導入細菌、可以通過正篩選維持以及避免了外切核酸酶降解的問題的優勢。制備質粒骨架版本的誘餌多核苷酸的優勢包括降低制備成本、提高對核酸酶體內降解的抗性、通過(自身復制或者如果需要通過正篩選)維持質粒濃度、廣泛的宿主范圍、 以及利用不同但兼容的11[陷阱]質粒(檢測協同效應)檢測組合或順式調控序列的能力。η[陷阱]質粒適合作為本方法中的誘餌多核苷酸。η[陷阱]質粒和文庫還適合用于測試已知或公認的順式調控序列的可能誘餌功能，或者用于篩選新的順式調控序列(該序列可能作為誘餌序列)。使用η[陷阱]質粒的原理如圖3所示。質粒包含“陷阱”序列(圖中顯示了多個拷貝)。如果所述“陷阱”包含與胞內順式調控序列競爭結合轉錄因子的轉錄因子結合位點 (即具有誘餌功能)，向細胞內導入η[陷阱]質粒將導致轉錄因子被從胞內順式調控序列上除去而結合到陷阱上。其細胞內的表達受到該順式調控序列的調控的那些基因，通過它們表達的變化或者通過細胞表現型的改變可以檢測到這一點。通常η [陷阱]質粒包含質粒載體和插入序列(包含陷阱的插入)。在質粒中并入陷阱序列解決了現有技術中誘餌降解的問題，使得誘餌(以及對基因表達的任何影響)穩定保持在細胞內。插入序列包含一或多個拷貝的單體序列(其包含陷阱)。因此，插入可以包含例如1到200個單體序列。一般有兩個或以上拷貝，例如2-200個拷貝，例如至少10、20、30、 40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180 或 190 個拷貝。例如，可能有 5-200、5-150、5-100、10-150、10-50、5-50、5-40、10-40、5-30 個拷貝。例如可能有 30 個
拷貝的單體序列。質粒一般包含單體的同聚物。一般它們是多重拷貝的單體，例如單體序列的多個直接重復。提供單體(也就是陷阱)的多重拷貝增加了誘餌的搶奪能量。單體序列包含陷阱序列。一般來說，陷阱中的轉錄因子結合位點沒有在例如陷阱或陷阱質粒中可操縱地連接著基因。從這一意義上，結合位點與其相應基因分離。陷阱中的結合位點還可以與其相應啟動子中的其他元件分離。一個例子中，單體序列不含有基因。單體可以包含陷阱之外的其他序列。這類其他序列經常來源于產生陷阱和/或質粒插入片段所使用的方法。例如，單體可以包含銜接子(adaptor)序列，比如根據本文描述的方法由“定制”η[陷阱]文庫產生定制陷阱時經常得到的銜接子序列。所述銜接子序列可以包含例如一或多種限制酶的識別和/或切割位點。單體可以包含構成引物的結合位點的核苷酸序列，其中的引物是制備單體或者包含多重單體的插入片段時使用的引物。例如，當利用如同時待審的申請PCT/GB2008/003353所述滾環擴增法制備質粒插入片段時，單體一般包含一個區段對應滾環復制中使用的引物(例如Τ7引物)的結合位
點ο包含隨機化陷阱序列的單體一般也包含恒定序列區。例如，η個核苷酸的隨機化陷阱序列可能側接著恒定序列區。替代地，恒定序列核心可能旁邊連接著隨機化核苷酸序列區域。單體的長度可以是例如至多1000個核苷酸，例如至多900、800、700、600、500、 400、300、200、100、90、80、70、60、50、40、30、20、15 或 10 個核苷酸。一般單體的長度在例如 10-100、10-50、20-75、30-60、30-50、35-55個核苷酸的范圍內，比如35巧4個核苷酸。例如， 單體長度可以是30、40或50個核苷酸。單體的陷阱部分一般大小在10-30個核苷酸范圍內，例如10-25、10-20、15-20，比如15、16、17、18、19或20，例如19個核苷酸。銜接子序列可以包含例如5-30個核苷酸，例如5-25、5-20、5_15或5_10個核苷酸，比如10、11、12、13、14或15個核苷酸。—般來說，η[陷阱]質粒中的插入片段包含一或多個本文描述的單體。插入片段包含單體的多重重復的情況中，這些重復可以是串聯重復。質粒載體中的插入片段可以包含例如大約1. 51Λ，例如1-21Λ，例如1. 1,1. 2,1. 3、 1. 4,1. 5,1. 6、1. 7或1. 81Λ。但是，可以使用任何合適的插入片段大小，只要保證質粒能夠在合適的宿主細胞中穩定地保持并有效地用于本方法。一般單個質粒中所有單體的序列是相同的。用于η[陷阱]質粒的質粒載體可能適合用于原核或真核宿主。例如載體可能適合用于原核細胞，比如細菌，例如放線菌宿主。例如，質粒載體可能適合用于鏈霉菌或大腸桿菌菌株，例如天藍色鏈霉菌的一或多個菌株(例如A3 (2)，或菌株Μ145或Μ600)、大腸桿菌、 淺青紫鏈霉菌(Streptomyces lividans)或肉桂鏈霉菌(Streptomyces cinnamoneous)。 文中進一步描述了合適的宿主。一般來說，載體是廣宿主范圍的和/或穿梭載體，因此可以在一個以上宿主中維持和增殖。質粒可以是接合型質粒。這使得很容易通過接合從一個細胞轉移到另一個細胞。優選質粒是自身復制型。一般來說質粒是高拷貝數質粒。例如，質粒可以保持在每個細胞例如20-100拷貝，例如每個細胞20、30、40、50、60、70、80、90和95或100個拷貝。 高拷貝數提高陷阱中誘餌序列的搶奪能量。通常n[陷阱]質粒包含復制起點。合適的復制起點是本領域已知的。一般質粒還包含一或多個可檢測的標記基因，例如一或多個編碼抗生素抗性的基因，例如編碼阿普拉霉素(apramycin)抗性的aac基因。標記基因的表達使得能夠對質粒保持在宿主細胞中進行篩選。
合適的質粒載體的實例包括例如pIJ86。合適的載體是本領域已知的。陷阱可以包含來源于或者分離自基因組或基因組片段的序列。基因組片段可以包含編碼特定目的功能或表現型的基因。陷阱可以包含例如來源于或者分離自這類基因的啟動子區域的序列或者周圍的序列，例如比啟動子距離基因更遠的序列。陷阱可以包含如文中所述與這一類序列競爭結合轉錄因子的序列。制備所述陷阱的方法在本文和同時待審的申請 PCT/GB2008/003;353 中有描述。誘餌多核苷酸可以通過任何合適的方法制備。例如，啞鈴可以制備為線性寡核苷酸，然后用T4連接酶連接。替代地，可以如實施例1的描述，使用合適的引物通過PCR制備 鈴誘餌。每個引物通常含有將形成 鈴結構中的莖環的部分。實施例1中給出了這類引物的實例。利用引物進行PCR擴增后一般將擴增產物經限制消化，連接形成閉合的環形啞鈴。替代地，可以如實施例的描述，通過限制消化質粒來制備啞鈴結構。消化后連接形成閉合的環形啞鈴結構。制備η[陷阱]質粒和η[陷阱]質粒文庫的方法在本文和同時待審的申請PCT/ GB2008/003353 中有描述。本方法可以包括向細胞內引入一種以上的誘餌序列。例如，可以使用誘餌序列混合液，所述混合液包含用于結合不同菌株(例如不同臨床菌株)中的調控因子的變體序列。 混合液中的誘餌序列可以處于與臨床上不同菌株的出現比例相同的比例。另一個實施例中，可以靶向一個以上的調控因子。 一個方面中，本文描述的方法包括體外方法。本文提到的宿主細胞可以是希望利用誘餌發展改變其基因表達(和表現型)的細胞，例如病原細菌。一般地，方法被用于改變細胞表現型的情況中，宿主細胞在沒有誘餌時顯示該表現型。用于改變醫學或醫療相關表現型(例如增強的抗生素敏感性)的誘餌可以在一系列細胞中進行篩選。例如，可以首先在該表現型的細菌模型(例如抗生素抗性模型)中測試誘餌，然后在例如病原菌或臨床分離株中進一步驗證。誘餌可以進一步在動物模型，例如小鼠模型中進行驗證。誘餌是質粒的情況中，通常宿主細胞與質粒載體相容和/或是質粒可以在其中穩定維持和復制的宿主細胞。宿主細胞通常也和質粒中的任何可檢測標記基因相容。一般來說，宿主細胞包含目的順式調控序列，即要篩選的順式調控序列，或者被導入細胞的誘餌序列意圖競爭的順式調控序列，可操縱地連接著基因。對基因表達的調整可以(例如通過表現型的改變)直接或間接地檢測.通常細胞包含啟動子，所述啟動子含有可操縱地連接著基因的順式調控序列。可操縱地連接意味著順式調控序列和/或啟動子與基因的連接方式使得所述序列和/或啟動子能夠(在合適的條件下，例如有必需轉錄因子存在的情況下)發揮作用從而調控基因的表達。因此，結合了相應轉錄因子時，順式調控序列發揮作用來調控(抑制或激活)基因的表達。順式調控序列在細胞內的功能可以通過監測相連基因的表達來確定。這可以通過直接監測基因的表達，或者通過監測與基因表達相關的特定表現型來實現。例如，功能篩選
21可以包括篩選對一或多種抗生素的抗性、應激反應、毒力因子的表達或必要基因的表達。篩選方法在同時待審的申請PCT/GB2008/003353中有描述。宿主細胞可以包含與其天然(相應)基因可操縱地連接的順式調控序列(例如含有該序列的啟動子)，即連接著的基因的表達是所述序列(或啟動子)在天然環境中調控的。順式調控序列和被調控的基因可以是細胞內源的，例如抗生素抗性病原細菌中編碼內在抗性機制的基因。合適的宿主細胞是本領域已知的，在本文實施例中有描述。本方法通常適用于原核細胞。具體來說，方法可以用于病原菌，特別是病原細菌， 例如影響人類的病原細菌。它們包括以下屬的細菌(按照革蘭氏染色結果列出)革蘭氏陰性不動桿菌、博德特氏菌(Bordetella)、疏螺旋體(Borrelia)、布魯氏菌(Bruce 11 a)、彎曲桿菌、埃希氏菌、弗朗西斯氏菌(Franc i se 11 a)、嗜血菌、螺桿菌、克雷伯氏菌、軍團菌、鉤端螺旋體(L印tospira)、耐瑟氏球菌、變形菌(Proteobacteria)、假單胞菌、立克次氏體、沙門氏菌、志賀氏菌、密螺旋體(Ti^ponema)、弧菌、耶爾森氏菌。革蘭氏陽性芽孢桿菌、梭菌、棒桿菌、腸球菌、李斯特氏菌、分枝桿菌、葡萄球菌、 鏈球菌。不染色的衣原體、支原體。革蘭氏陰性病原菌種實例以及它們引起的疾病包括鮑氏不動桿菌 (A. barumannii)(肺炎、菌血癥)、百日咳博德特氏菌(百日咳)、博氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi)(萊姆病 Lyme，s disease)、流產布魯氏菌(Brucella abortus)(布魯氏菌病)、空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)(急性腸炎)、大腸埃希氏菌(敗血癥和肺炎)、兔熱弗朗西斯氏菌(Francisella tularensis)(兔熱病)、流感嗜血菌(流感)、幽門螺桿菌(消化性潰瘍病)、肺炎克雷伯氏菌(肺炎)、嗜肺軍團菌(軍團病)、淋病奈瑟球菌 (淋病)、不動桿菌(醫院內感染)、銅綠假單胞菌(膿毒癥)、立克氏立克次氏體(立克次氏病)、鼠傷寒沙門氏菌(傷寒)、痢疾志賀氏菌(痢疾)、霍亂弧菌(霍亂)、鼠疫耶爾森氏菌(鼠疫)。革蘭氏陽性病原菌種實例以及它們引起的疾病包括炭疽芽孢桿菌(炭疽病)、艱難梭菌(假膜性結腸炎)、白喉棒桿菌(白喉)、糞腸球菌(醫院內感染)、單核細胞增多性李斯特氏菌(李斯特氏菌病)、結核分枝桿菌(結核)、金黃色葡萄球菌(敗血癥)、肺炎鏈球菌(肺炎)。以下屬(包括上文提及的種)的細菌尤其適合本方法使用埃希氏菌、螺桿菌、克雷伯氏菌、奈瑟氏菌、變形菌、假單胞菌、沙門氏菌、芽孢桿菌、梭菌、腸球菌、葡萄球菌、志賀氏菌。—個方面中，發明涉及包含本文描述的(例如，通過本文的任何方法導入細胞的) 誘餌多核苷酸(誘餌分子)的宿主細胞。具體來說，發明涉及這樣的宿主細胞，所述細胞由于誘餌多核苷酸的存在，與沒有質粒/誘餌分子的細胞相比，展示出改變的基因表達和/或表現型，例如對抗生素易感性增加、毒性下降、適應性反應受損。例如，發明涉及用本文描述的誘餌多核苷酸使其活力降低的病原菌或臨床分離株。誘餌多核苷酸可以通過合適的手段導入宿主細胞。例如，轉化、轉染、接合。例如， 多核苷酸包含接合型質粒的情況中，可以通過接合導入宿主細胞。例如環形啞鈴結構的誘餌多核苷酸可以通過轉染導入細胞。細胞可以處于液體培養基中，誘餌被加入液體。替代地，細胞可以培養在固體培養基上，將浸透誘餌的吸水圓紙片覆蓋在培養基上來轉染誘餌。 一般來說，將誘餌多核苷酸加入培養基中被細胞攝取。細胞培養在固體培養基的情況中，誘餌多核苷酸可以加到濾紙盤上，然后被細胞從紙盤上吸收。可以利用滲透緩沖液來協助轉染。一個方面中，誘餌多核苷酸的轉染可以包括利用膽固醇。具體來說，方法可以利用一個或兩個5’端帶有膽固醇修飾的線性誘餌多核苷酸。該修飾被認為能夠促進細胞的攝取。可以另外在誘餌的例如5’端標記上可檢測標記，比如熒光染料，例如Cy5。這將協助監測誘餌被攝取和在細胞中的維持。如實施例1的描述，可以利用膽固醇和/或可檢測標記引物來制備膽固醇修飾和 /或可檢測標記的誘餌。誘餌多核苷酸轉染到細胞內可以包括利用R9-膽固醇，該物質由附著膽固醇分子的 9 個 D-精氨酸線性鏈構成(Kim W. J. et al, Mol. Ther. (2006) 14 =343-350)。總的來說，細胞對誘餌多核苷酸或質粒文庫的攝取和/或維持受到監測。例如質粒誘餌可以包含可檢測標記物(例如編碼抗生素抗性的)，使得可以對質粒的存在進行正選擇，并監測質粒繁殖。誘餌多核苷酸的存在還可以通過qrt-PCR監測。一般來說，誘餌序列包含轉錄因子的結合位點，該結合位點與胞內轉錄因子結合位點競爭結合轉錄因子。通過從胞內位點搶奪轉錄因子，誘餌打斷與胞內結合位點可操縱地連接的基因的表達。誘餌序列可以包含轉錄因子的天然胞內結合位點。天然序列是本領域已知的，本文提供了特定調控因子的內源結合位點的實例。誘餌序列可以包含給定調控因子的共有結合位點。同樣，這種共有位點是本領域已知的，文中給出了某些特定調控因子的例子。替代地，誘餌序列可包含保留了誘餌功能的天然或共有結合序列的變體。可以通過改變親本序列中的例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個核苷酸來制備變體。例如，足跡法實驗可能表明某具體核苷酸對轉錄因子的結合不是太重要，因此可以被改變。通過將包含誘餌序列的誘餌多核苷酸引入合適的宿主細胞可以測試公認的誘餌序列與給定轉錄因子結合位點競爭的能力。宿主細胞包含與基因可操縱地連接的靶轉錄因子結合位點，所述基因的表達可以通過例如篩選表現型的變化來直接或間接地確定。測試序列的誘餌功能可以通過篩選基因表達的變化或者表現型的改變來確定。可以使用本文描述的任何誘餌多核苷酸。可以使用本文描述的任何宿主細胞。例如，可以首先將測試序列引入合適的報告細胞，監測報告基因的表達來評估誘餌功能。可以使用PCT/GB2008/003353所述用“死亡或活的”報告細胞進行的基于報告基因的通用檢驗系統。這一方法解決了需要可打分的表現型的問題，因為正常情況下每個報告基因都會導致細胞死亡，只有當誘餌通過搶奪轉錄因子解除了這種情況，細胞才能夠生長。 因此要依賴于細胞的存活來選擇兩個報告基因，這極大地加速了篩選過程。該系統的另一個特性是這種死亡-或-活的篩選可以容易地自動化作為快速、廣泛或高通量篩選的基礎。還可能用于鑒定控制啟動子的調控序列，這種調控序列在天然情況下沒有容易打分的表現型。替代地或者另外地，可以在包含靶結合位點的宿主細胞中檢測誘餌序列，所述結合位點可操縱地連接著其對應基因，因此可以確定誘餌序列打斷基因表達的能力。意圖用誘餌引起表現型改變的情況中，篩選中使用的宿主細胞顯示該特定表現型。例如，文所述用于靶向調控因子的誘餌序列可以通過篩選宿主細胞對抗生素敏感性的提高來檢測。抗生素可以按照本文描述來選擇。某些情況中，可以通過篩選對靶調控因子適合的另一種表現型來測試誘餌序列。 例如，可以通過檢測被削弱的應激反應來對靶向應激反應調控因子的誘餌進行評估(通過測量對生理脅迫的耐受性)。靶向毒力因子調控蛋白的誘餌可以通過確定毒性機制被破壞來評估。后種情況的一個例子可以是由冷凍管重懸浮后活力低或者甚至是特定基因表達下調(通過qRT-PCR測量的)。例如，可以在有作用于脂肪酸合成過程的抗生素(例如淺藍菌素)的情況下，相對合適的菌株(例如生長在例如Luria-Bertani LB培養基(1% [w/v]Bacto-蛋白胨、0. 5% [w/v]酵母提取物、[w/v]NaCl)上的大腸桿菌)，檢驗靶向脂肪酸合成關鍵基因調控的 FabB誘餌。例如，在淺藍菌素濃度為10 μ g/ml，未處理的細菌生長正常，并作為用誘餌處理過的細菌的參照物，其中處理過的細菌生長明顯緩慢且最終濃度較低。例如，可以通過在脅迫條件(例如堿性條件)下在例如LB培養基中生長來誘導合適菌株(例如金黃色葡萄球菌)中的應激反應。例如，可以使用含有例如30mM KOH的LB 培養基。未處理過的細菌因為堿性條件誘導的應激反應在該培養基中生長良好，而那些用 SA_sigB誘餌(靶向sigB的調控，而sigB是對脅迫的調節性反應的主要部分)處理過的細菌生長很差。某些情況中，篩選相關基因的表達包括確定合適培養條件下宿主細胞的生命力。 例如，當待評估的表現型是抗生素抗性時，篩選可以包括在有抗生素的情況下培養細胞并確定細胞是否有活力。在包含“死的或活的”報告宿主細胞的篩選中，篩選細胞包括在這樣的條件下培養細胞并分離活細胞，所述條件下報告基因(目的順式調控序列可操縱地連接的基因)的表達決定著宿主細胞的活力。本方法可以包括如本文所述，在液體培養基中培養宿主細胞，如果例如要確定的細胞表現型是細胞活力。這樣的優勢是只剩下少量細胞進行分析。本文描述的n[陷阱]質粒可以通過這樣的方法進行制備，所述方法包括-提供包含一或多個拷貝的單體序列的多核苷酸，和-將所述多核苷酸克隆到合適的質粒載體中。單體的組成如本文對n[陷阱]質粒的描述。合適的質粒載體也已描述過。可以通過以下方法提供包含一或多個拷貝的單體序列的多核苷酸，所述方法包括(1)提供環形寡核苷酸，所述寡核苷酸包含⑴目的序列；和(ii)適用于滾環擴增的引物的結合位點；其中單體序列包含⑴和(ii)；以及
(2)利用環形寡核苷酸作為模板進行滾環擴增，從而提供包含單體序列重復的多核苷酸。所述方法的步驟(1)還可以包括通過PCR擴增滾環擴增產物，并分離所需大小的多核苷酸片段，例如包含30-50個單體序列重復的片段。這可以通過例如PAGE分析實現。環形寡核苷酸可以通過以下方法制備，所述方法包括-提供線性單鏈寡核苷酸，其包含待測試的目的序列(i)和適用于滾環擴增的引物的結合位點(ii)；-通常在有通用連接寡核苷酸的情況下，利用例如Taq連接酶將寡核苷酸環化；-任選地用核酸外切酶消化剩下的線性DNA；以及-利用例如PAGE回收單體環形寡核苷酸。適用于滾環擴增的引物是本領域已知的。例如可以使用T7引物。實施滾環擴增的方法是本領域已知的。例如可以使用BstI聚合酶。在一個實施例中，利用滾環擴增中使用的相同引物(例如T7引物)將滾環擴增產物選行PCR擴增。一般來說，單體中的序列(i)包含本文描述的陷阱序列。如文中所述，陷阱序列可以分離自基因組DNA，例如分離自完整基因組，或者基因組片段。陷阱序列一經分離好可以用于通過同時待審的申請PCT/GB2008/003353所述方法形成η[陷阱]質粒。PCT/GB2008/003353中描述了由基因組或基因組片段制備陷阱序列的實驗方案。如文中所述，陷阱序列可以包含隨機化的核苷酸序列。一般陷阱包含η個核苷酸的隨機化(或可變的)核苷酸序列。通常，η可以在5-50個核苷酸的范圍，例如10-50，例如 20-40，例如 25-35，例如 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20 個核苷酸。包含隨機化序列(和任選所述恒定序列)的寡核苷酸可以利用本領域已知方法合成。可以給寡核苷酸的隨機化(或者可變)區引入核苷酸偏性。例如如果適宜，可以引入GC偏性。上述方法中的單體可以包含這樣制備的寡核苷酸。然后可以制備η[陷阱]質粒。如上所述，本發明的一個方面是提高原核細胞對抗生素的易感性。例如這可能涉及靶向細胞中的內在抗性機制或者胞內適應性反應，這就意味著細胞在抗生素誘導的脅迫條件下的存活能力下降。一個方面中，本方法適用于普通地提高抗生素藥效(Alekshun and Levy, CelK2007) 128:1037-1050)。這包括抑菌和殺菌性抗生素。實例包括以下類型的抗生素 氨基糖苷類(比如卡那霉素)、碳青霉烯類(比如美羅培南)、頭孢菌素類(比如頭孢吡肟)、 糖肽(比如萬古霉素和達托霉素)、青霉素類(比如氨芐西林、羧芐西林和盤尼西林)、多肽抗生素(比如多粘菌素B)、喹啉(比如levaquin)、磺胺類(比如復方新諾明)、四環素類 (比如四環素)、以及各種氯霉素、利福平和斯沃。一個方面中，導致細胞中應激反應被抑制的方法，或者導致細胞受到脅迫的方法特別適用于增強殺菌性抗生素的效果(Kohanski et al，Cell (2007) 130 :797-810)。殺菌抗生素可以包括
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β_內酰胺類(a)青霉素類(b)碳青霉烯類(c)單內酰環類(d)頭孢菌素類第一代頭孢乙腈(Cefacetrile)(氰乙酰頭孢菌素c印hacetrile)、頭孢羥氨節(Cefadroxil) (cefadroxyl ；Duricef)、頭抱氨節(Cefalexin) (cephalexin ；Keflex)、 頭孢甘氨酸(Cefaloglycin)(頭孢來星(^phaloglycin)、頭孢洛寧(Cefalonium) (cephalonium)、頭抱噻唆(Cefaloridine) (cephaloradine)、頭抱噻盼(Cefalotin) (cephalothin ；開弗林(Keflin))、頭孢吡硫(Cefapirin)(cephapirin ；Cefadryl), 頭孢三嗪(Cefatrizine)、頭孢氮氟(Cefazaflur)、頭孢西酮(Cefazedone)、頭孢唑啉(Cefazolin) (cephazolin ；Ancef, Kefzol)、頭抱環己烯(Cefradine) (cephradine ； Velosef)、頭孢甲氧環烯氨(Cefroxadine)、頭孢替唑(Ceftezole)；第二代氯頭孢菌素(Cefaclor)(希克勞(Ceclor)，Distaclor,Keflor, Raniclor)、頭孢尼西(Cefonicid) (Monocid)、頭孢丙烯(Cefprozil)(頭孢羅奇 cefproxil ；Cefzil)、頭抱卩夫月虧(Cefuroxime) (Zinnat, Zinacef, Ceftin, Biofuroksym) > 頭孢唑南(Cefuzonam)、頭孢美唑(Cefmetazole)、頭孢替坦(Cefotetan)、頭孢噻吩 (Cefoxitin)、碳青霉烯類氯碳頭孢(Ioracarbef) (Lorabid)、頭霉素類(Cephamycins) 頭孢拉宗(cefbuperazone)、頭孢美唑(Zefazone)、頭孢米諾(cefminox)、頭孢替坦 (Cefotan)、頭孢噻吩(cefoxitin)(美福仙 Mefoxin)第三代頭孢卡品(Cefcapene)、頭孢達肟(Cefdaloxime)、頭孢地尼(Cefdinir) (Omnicef)、頭孢托侖(Cefditoren)、頭孢他美(Cefetamet)、頭孢克肟(Cefixime) (Suprax)、頭孢甲 B虧(Cefmenoxime)、頭孢地嗪(Cefodizime)、頭孢噻B虧(Cefotaxime) (Claforan)、頭孢米唑(Cefpimizole)、Cefpodoxime (Vantin，PECEF)、頭孢特倉 (Cefteram)、頭孢布烯(Ceftibuten) (Cedax)、頭孢噻呋(Ceftiofur)、頭孢噻林 (Ceftiolene)、頭孢唑廂(Ceftizoxime) (Cefizox)、頭孢曲松(Ceftriaxone)(羅氏芬 Roc印hin)、頭孢哌酮(Cefoperazone)(先鋒必 Cefobid)、頭孢他啶(Ceftazidime)(復達欣 (Fortum)，Fortaz)、氧頭抱烯類(Oxacephems)拉氧頭抱(Iatamoxef) (moxalactam)第四代Cefclidine、頭孢吡肟(Cef印ime)(Maxipime)、頭孢瑞南 (Cefluprenam)、頭孢噻利(Cefoselis)、頭孢唑蘭(Cefozopran)、頭孢匹羅(Cefpirome)、 頭孢喹肟(Cefquinome)、氧頭孢烯類氟氧頭孢(flomoxef)待分類的Ceftobiprole、頭孢氯嗪(Cefaclomezine)、頭孢洛倉(Cefaloram)、 頭孢帕羅(Cefaparole)、頭孢卡奈(Cefcanel)、頭孢屈洛(Cefedrolor)、頭孢吡酮(Cefempidone)、頭孢三唑(Cefetrizole)、頭孢維曲(Cefivitril)、頭孢替林 (Cefmatilen)、Cefm印idium、頭孢維星(Cefovecin)、頭孢唑(Cefoxazole)、頭孢羅替 (Cefeotil)、頭孢舒米(Cefsumide)、頭孢洛林(Ceftaroline)、頭孢噻氧(Ceftoxide)、頭孢呋汀(Cefuracetime)氨基糖苷類(a) 丁胺卡那霉素(amikacin)、慶大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星(netilmicin)、巴龍霉素(paromomycin)、rhodostr印tomycin、鏈霉素、妥布拉霉素、阿普拉
霄素；(b)惠環類(Anthracyclines)，例如多柔比星(doxorubicin)喹諾酮類(Ouinolones)(a)氟喹諾酮；第一代第二代第三代第四代。糖肽抗牛素(a)萬古霉素、替考拉寧(teicoplanin)、telavancin、博萊霉素、雷莫拉寧 (ramoplanin)、decaplanin 禾口 dalbavancin。肽抗牛素類(a)羊毛硫抗生素(Lantibiotics)；1^ (Duramycin)、ILI連菌月太(nisin)、表皮素(epidermin) > actagardine> microbisporicin 禾口 mersacidin ；(b)脂肽類；Cubicin0鏈陽菌素類(Streptogramins)奎奴普丁 ^juinupristin)+達福普汀(dalfopristin) (Synercid ).但所述誘餌和方法也可以用于提高抑菌抗生素，比如大環內酯類、酮內酯類、 四環素類、林可酰胺類(例如氯潔霉素)、噁唑烷酮類(Oxazolidinones)(利奈唑胺 (Linezolid))的效力。所述方法用于治療的情況中，誘餌多核苷酸可以與一或多種抗生素，通常是誘餌使細胞更易感的抗生素組合使用。可以從以上描述的抗生素中選擇。某些情況中，適合根據細菌的種類和要針對的細菌感染來選擇抗生素。例如，結核分枝桿菌是結核病的致病菌，結核病目前使用異煙胼、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺(pyrazinimide)治療。因此，在靶向結核分枝桿菌的方法中，可以選擇這些藥物中的一或多種與誘餌多核苷酸一起使用。類似的，金黃色葡萄球菌感染一般用青霉素治療，產生廣譜內酰胺酶的細菌(例如大腸桿菌或反應克雷伯氏菌)的革蘭氏陰性感染經常用內酰胺質粒。某些情況中，誘餌多核苷酸的類型和表達被它打斷的基因決定了細胞變得更敏感的抗生素的類型，因此該抗生素可以與誘餌聯用。例如，文所述FabB TFD，靶向脂肪酸合成所需要的關鍵酶調控因子(FadR)的結合位點。因此，用誘餌處理過的細胞會變得對能夠抑制脂肪酸合成的抗生素尤其易感。文中還提供了關于特定目標的其他信息。所述誘餌可以用于改變細胞適應性或生理反應，例如本文描述的任何反應。誘餌還可以用于改變關鍵基因的表達，從而改變所述基因關鍵的條件下細胞的活力。誘餌還可以用于改變細胞的毒力。誘餌還可以用于例如通過弓丨起細胞壁或膜組成的變化來提高對抗生素的攝取。
誘餌還可以靶向未知遺傳系統的調控，特別是PCT/GB2008/003353所述n[陷阱] 過程所發現的誘餌。這些例子中，用誘餌處理細菌的后果可以通過例如抗生素易感性來測量，而易感性變化的遺傳機制仍是未知的。某些情況中，用靶向已知基因的調控(比如WhiB7及其在分枝桿菌中的同源物) 的誘餌處理使得細胞對抗生素的易感性增加，而該變化的表現型機制仍是未知的。某些情況中，靶向基因的調控的誘餌能夠提高細胞對抗生素的易感性，而該變化的表現型機制仍是未知的，其中所述基因被生物信息學方法認為決定著抗生素敏感性(比如經轉錄譜鑒定到的那些參與金黃色葡萄球菌糖肽抗性的基因)，并且發現其中部分在其啟動子內有共有順式調控基序。所述誘餌多核苷酸有許多應用，包括醫療用途(例如醫學或獸醫學)和其他離體的例如非治療應用，例如應用在消毒和清潔產品中。所述誘餌可以應用于需要降低原核細胞活力、殺死細胞、抑制其生長或減弱毒性的方法中。如上所述，所述誘餌多核苷酸和方法可以用于提高原核細胞對抗生素的易感性。 因此，誘餌可以用于強化一或多種諸如文所述抗生素的效果。這可以是用于醫學或獸醫學用途，例如治療或預防人或動物中的細菌感染；或者體外使用，例如用在清潔組合物中。因此，誘餌可以用在殺菌或抑菌組合物中。替代地，誘餌多核苷酸和方法可以用于給原核細胞提供或提高對致死環境因子或抗菌劑的易感性。因此，一個方面中，發明提供了治療受試對象中細菌感染的方法，所述方法包括給予文所述誘餌多核苷酸。受試對象可以是人或動物。發明還提供了本文描述的用于醫學上的誘餌多核苷酸，例如用于治療或預防受試對象中的細菌感染；以及誘餌在制備治療細菌感染的藥物中的用途。誘餌可以與抗生素和/或另一種抗菌劑組合使用，所述抗生素是誘餌使細胞對其更敏感的抗生素。合適的抗生素如文中所述。抗生素可以與誘餌同時給予，或者在誘餌之前或之后給予。抗生素和誘餌可以在相同或分開的組合物中給予。因此發明包括聯合治療，其中將鑒定到的和/或如文所述誘餌多核苷酸與一或多種抗生素或其它抗菌治療劑聯合給予受試對象。一個方面中，發明涉及包含誘餌多核苷酸和生理可接受的載體或賦形劑的藥物組合物或藥物。所述組合物還可以如文中所述包含一或多種抗生素或其它抗菌劑。治療用途可接受的載體或稀釋劑是醫藥領域已知的，在例如 Remington’ Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985) 中有描述。藥物載體、賦形劑或稀釋劑的選擇可以根據預期給藥途徑和常規藥學實踐進行。 藥物組合物可以包含任何合適的粘著劑、潤滑劑、懸浮劑、包衣、助溶劑，作為載體、賦形劑或稀釋劑，或者附加于載體、賦形劑或稀釋劑之外。許多方法可以用于將本發明的誘餌遞送至細菌感染位點。體內和/或體外遞送的方法包括，但不限于臉頰或口腔遞送、靜脈內遞送、直接注射到感染內或者間接注射(例如，皮下、腹膜內、肌內或其他注射方法)、局部施用、直接在液體或培養液中接觸、轉染(例如，磷酸鈣、電穿孔、基于DEAE-葡聚糖的以及液體介導的)、轉基因表達(例如，通過顯微注射、胚胎干細胞產生、或者逆轉錄病毒轉移遞送的誘餌表達系統)，或者任何其他本領域已知的常用核酸遞送系統。給藥可以與合適劑量的抗生素組合，其中抗生素與誘餌同時或分開給予。正如以下實施例所述，要顯示對靶基因表達有可預期效果和有抑菌效果所需的 TFD數量可以只有每細胞大約5000個分子。實施例討論的標準體外檢測方法中顯示僅用 InM TFD即可有效殺死多達1，000, 000個細菌細胞，這表明低于0. 001 %的轉染效率即足以實現殺滅細菌細胞。利用熒光顯微鏡測量熒光標記的TFD的攝取對轉染進行定量顯示視野內的全部金黃色葡萄球菌均被轉染。與解決細菌感染的其他基于核酸的策略(比如反義策略)相比，殺死細胞所需的這個分子數量少100到1000倍。這部分反映了盡管反義方法和 TFD都是對基因進行抑制，TFDs作用于早期步驟從而防止轉錄，而反義方法在最常見的循環中立體阻礙轉錄產物幾千mRNAs分子。第二，TFDs被設計成靶向可被正誘導的關鍵基因，因此存活需要它們的啟動和正調控(轉錄因子驅動自身的產生)。在體外，后一個特點意味著當基因不被誘導時，可能存在的轉錄因子相對較少，因此少量TFD就能阻斷誘導。可能在治療情景中，由于細菌群體或者已經被誘導的基因的天然多樣性，每個細胞有更多轉錄因子。這種情況中，預期需要更多TFDs以便看到治療效果，估計將劑量提高100倍(達到IOOnM)或者提高轉染效率(兩個數量級)足夠看到有益效果。某些誘餌可以不與抗生素一起使用來治療或預防細菌感染。例如本文描述的某些誘餌會降低細胞在脅迫條件下存活、或表達必要基因或獲取關鍵營養的能力。某些誘餌會中和細胞毒力，例如通過阻止毒力因子的表達。因此用于靶向必要基因的誘餌可以單獨使用來防止特定病原細菌的生長，即本身作為一種療法或者作為預防性藥物的形式在細菌成為感染之前解決。類似的，靶向毒性決定基因的那些誘餌可以單獨使用來防止感染的擴散。另一個實施例中，本文列舉的對抗幽門螺桿菌的誘餌可以提供抗胃潰瘍/消化性癌癥 (peptic cancer)發展的獨立療法。類似的，能夠防止變異鏈球菌生長的誘餌可以用于治療或預防牙齒變色。誘餌被用來治療的具體感染或相關狀況通常取決于誘餌所靶向的病原細胞。文中和圖2聯系具體細菌，列出了可以利用本方法靶向的細菌感染和相關疾病。本文所述誘餌多核苷酸還可以體外使用，例如用在抗細菌產品中，比如用于清潔產品(例如消毒劑)來殺死細菌或預防細菌的生長或傳染性。誘餌提高了對抗生素的易感性的情況中，一般抗細菌組合物還包含一或多種抗生素和/或一或多種抗菌劑。本發明一個方面涉及這類清潔組合物。本發明的誘餌多核苷酸還可以用在產品中，所述產品在能夠減少或防止微生物生長和/或殺死微生物的條件下，施加到表面(比如試驗臺或手)一段時間，從而減少或防止微生物的生長或者殺死微生物。例如，可以將一或多種誘餌噴在表面。這種噴灑可以用于例如準備進行食品加工的表面或者給要插入患者體內的物品消毒。由于噴灑誘餌制劑減少了接觸表面或物品，因此進一步減少了污染的風險。洗手液和漱口液應用也在發明范圍的考慮內。以上情形中，誘餌可以配置成合適的水性形式。這種情況中，所述制劑可以包含產泡泡的水(water to forma)和水組合物。水組合物還可以進一步包含水和有機溶劑以及它們的組合。本發明還涉及抗細菌用途的試劑盒，所述試劑盒包含如文所述誘餌多核苷酸以及一或多種抗生素或者其他抗菌劑，聯用于殺死細菌或者抑制細菌的生長或毒性。試劑盒一般包含使用說明。同樣試劑盒可以用于治療用途，例如抗細菌感染；或者非治療用途，例如用于清潔或消毒。文中提及的所有文件均通過弓I用并入本文。參照以下附圖，通過非限制性實施例更詳細地描述本發明圖 1.來自 Poole J. (Antimicrobial Chemother. (2005) 56，22-24)的表 1 的復印件，表中分別列出了外排泵介導的對非氟喹諾酮類抗生素和氟喹諾酮類抗生素的抗性。右手一欄中的代號對應論文中給的代號。圖2.來自Poole J.(同上)的表2的復印件，表中列出了根據本方法可以靶向的調控因子和調控序列的例子。該表還提供了所述調控因子或序列出現的細菌菌株的例子和與這些細菌相關聯的疾病指征的例子。圖3.提供了如何使用n[陷阱]質粒來影響基因表達的示意圖。由于阻遏性轉錄因子(B)結合到基因(A)的啟動子內的順式調控序列(C)上，基因(A)沒有轉錄活性。當被引入細胞時，n[陷阱]質粒通過將轉錄因子B從基因組啟動子上搶奪下來，解除對下游基因(D)的轉錄抑制，從而影響靶基因的表達。圖4.顯示了利用SEQ ID NOS 3 & 4中的引物和合適的載體物質獲得的擴增產物 (實施例1.2)。圖5.顯示了在有亞抑制濃度的異煙胼(IZ)或利福平(RF)的情況下培養的恥垢分枝桿菌的生長曲線，其中如實施例2所述，細菌用WhiB7誘餌序列(+)或者陰性對照序列 ㈠處理過。圖6.顯示了在有淺藍菌素的情況下培養的大腸桿菌的生長曲線，其中如實施例3 所述，細菌用FabB誘餌(靶向!^adR結合位點)或者陰性對照序列處理過。圖7.顯示了在有由電穿孔引起的脅迫的情況下金黃色葡萄球菌的生長曲線，其中如實施例4所述，細菌未處理(第一條曲線)，或者用WaA誘餌(第二條曲線)或者LytM 誘餌(第三條曲線)處理過。圖8.顯示了金黃色葡萄球菌的生長曲線，分別是沒有接種的培養基(BHI陰性對照)；轉染了帶有亂序的TFD序列的對照TFD并生長在BHI培養基中；轉染了 kaA TFD (含有WalR位點)并生長在BHI培養基中；轉染了 fhu TFD (設計用于阻斷鐵的攝取)并生長在BHI培養基中；轉染了 sig TFD并生長在BHI培養基中；轉染了無關TFD并生長在NRPMI 培養基(與BHI相比，鐵限制培養基)中；以及轉染了 fhu TFD并生長在NRPMI培養基中。圖9.顯示了在非鐵限制培養基中，Fur_TFDs不干擾金黃色葡萄球菌的生長。金黃色葡萄球菌生長在BHI培養基中，轉染劑中含有Fur_TFD但不含短桿菌肽(單獨TFD ；空心圓)；或者60nM短桿菌肽組合InM對照TFD (對照TFD ；空心三角)或者Fur_TFD (Fur_TFD ； 實心方形)，其中Fur_TFD是設計用于操控fhu操縱子的表達。結果是三次重復的平均值， 誤差條顯示標準誤差。圖10.顯示了 Fur_TFD解除了 fhu基因受到的抑制。㈧.短桿菌肽介導的金黃色葡萄球菌轉染。用單獨TFD，或者短桿菌肽和對照或Fur_TFD處理過的細胞進行收集、洗滌和裂解。利用qPCR確定TFD相對基因組數的平均數。(B).Fur_TFD的轉染抑制了金黃色葡萄球菌中的fur基因。使用平行樣品經qPCR確定fhu的相對表達水平。
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圖11.顯示了 Fur_TFDs阻止金黃色葡萄球菌在鐵限制培養基中的生長。金黃色葡萄球菌生長在鐵選擇培養基NRPMI中，轉染劑中含有Fur_TFD但沒有淺藍菌素(單獨TFD ； 空心圓)；或者60nM淺藍菌素組合InM對照TFD (對照TFD ；空心三角)或者Fur_TFD (Fur_ TFD ；實心方形)。結果是三次重復的平均值，誤差條顯示標準誤差。圖12.顯示了基因分析結果，該項分析用于確定金黃色葡萄球菌靶向Fur的 TFD(SAfhu)的可能有效宿主范圍。圖中上面的部分顯示的MEME來源的共有序列是由下面給出的序列產生的金黃色葡萄球菌Fur結合位點基序。圖13.顯示了三個MRSA菌株在有對照TFD或者這樣的TFD (SA3TFD)的情況下的生長曲線，SA3TFD含有金黃色葡萄球菌選擇性ο因子SigB的-10/-35識別序列。圖14.顯示了啞鈴構型中的Sig TFDs抑制臨床分離的MRSA菌株MRSA-5的生長。圖15.顯示了啞鈴構型中的WalR TFD阻止EMRSA15的生長。fhu TFD被用作對照。圖16.顯示的金黃色葡萄球菌生長在BHI培養基中，轉染劑含有InM WalR_ TFD/D0TAP混合物但沒有溶葡萄球菌素(單獨TFD;空心圓)；或者62 μ g/ml淺藍菌素 (gramicidin)組合InM對照TFD(Scr_TFD ；空心三角)或者WalR_TFD (實心方形)，其中 WalR_TFD涉及來操控WalKR操縱子的表達。圖17.沒有檢測到抗性機制。(A). EMRSA-16在完成圖1描述的體外生長實驗后， 總的活菌計數。(B).沒有被WalRjFD處理殺死的細胞做次級培養，在體外生長實驗中進行測試。WalRjFD有效地殺死了次級培養的細胞。依次進行了 5輪次級培養，通過測量總活菌數沒有看到用WalR_TFD處理過的那些細胞有再生長。(C)細菌的簡單生長曲線。類似的，先前接觸了四輪TFD選擇的細菌的生長曲線沒有顯示抗性跡象，因為它們都被有效地殺死。細胞生長通過記錄30個小時內培養物的A420來測量，細胞是未處理的(單獨培養基；空心圓)；用對照TFD加上轉染混合物處理過(空心三角)或者WalR_TFD加上轉染混合物處理過(實心方形)。圖18.微量稀釋實驗顯示只需有限接觸WalR_TFD即可殺死EMRSA-16。細胞是未處理的(單獨培養基；空心圓)；用對照TFD加上轉染混合物處理過(空心三角)或者WalR_ TFD加上轉染混合物處理過(實心方形)，溫育30分鐘后100倍稀釋至不含轉染劑或TFD 復合體的培養基中。只有先前用WalR_TFD處理過的細胞不能生長。圖19.在小鼠膿毒癥模型中，WalR_TFD殺死EMRSA-16與萬古霉素一樣有效。小鼠系統感染和用對照TFD(Scr_TFD、lnM WalR_TFD、萬古霉素和單獨媒介)處理后，測量 EMRSA-16的腎載菌量。圖20.顯示大腸桿菌轉染FabB TFD使得細菌對抑制脂肪酸合成的抗生素(淺藍菌素)敏感化。WhiB7 TFD用作陰性對照，因為它是帶有大腸桿菌基因組中不存在的序列的 FD。圖21.顯示轉染TFD延緩了細菌生長，所述TFD含有肺炎克雷伯氏菌的σ M因子的識別序列。WhiB7 TFD用作陰性對照。圖22.顯示用于發現金黃色葡萄球菌和其他生物中相近的被鑒定為WalR結合位點的序列。圖中顯示了一部分命中序列，由這些序列得到一個共有序列。圖23.部分A顯示金黃色葡萄球菌SigB結合位點的來源于MEME的共有序列。部分B列出了芽孢桿菌目中共有序列的相近序列的發生率伍值< 100)(革蘭氏陽性感染，其中的代表性屬包括芽孢桿菌、李斯特氏菌和葡萄球菌)。圖24.部分A顯示KP_Sig TFD體外殺死肺炎克雷伯氏菌。含有KP_Sig序列的 TFD阻止細胞體外生長(KP_Sig，實心方形)。使用了兩種對照未處理的細胞(肺炎克雷伯氏菌，空心圓)和含有亂序序列的對照TFD (KP-對照TFD，空心三角)。部分B顯示來源于MEME的肺炎克雷伯氏菌Sig結合位點的共有序列。序列簡述
SEQ ID NOS 1 & 2-如實施例1. 1中，用于由pGEMT-Easy載體擴增靶序列的寡核
吲物
SEQ ID NOS 3 & 4-如實施例1. 2中，在制備啞鈴誘餌時，用于由pGEMT-Easy載增靶序列的寡核苷酸引物SEQIDNO5-用于實施例2的WhiB7誘餌
SEQIDNO6-用于實施例3的FabB誘餌
SEQIDNO7-用于實施例4的LytM誘餌
SEQIDNO8-用于實施例4的WaA誘餌
SEQIDNO9-恥垢分支桿菌菌株MC2 155中的天然WhiB7結合位點
SEQIDNO10-大腸桿菌K12中的天然!^adR結合位點
SEQIDNO11-金黃色葡萄球菌中YycF/YycG的天然結合位點
SEQIDNO12-金黃色葡萄球菌中YycF/YycG的天然結合位點
SEQIDNO13-金黃色葡萄球菌中SigB的天然結合位點
SEQIDNO14-肺炎克雷伯氏菌中SigB的天然結合位點
SEQIDNO15-金黃色葡萄球菌中Fur結合的共有序列
SEQIDNO16-大腸桿菌中Fur結合的共有序列
SEQIDNO17-幽門螺桿菌中Fur的天然結合序列
SEQIDNO18-艱難梭菌中TcdR的共有結合位點
SEQIDNO19-銅綠假單胞菌中Vfr的共有結合位點
SEQIDNO20-銅綠假單胞菌中Vfr的天然結合位點
SEQIDNO21-銅綠假單胞菌中Vfr的天然結合位點
SEQIDNO22-肺炎克雷伯氏菌中NtrC的天然結合位點
SEQIDNO23-幽門螺桿菌中ArsR的天然結合序列
SEQIDNO24-幽門螺桿菌中ArsR的天然結合序列
SEQIDNO25-金黃色葡萄球菌中的糖肽抗性共有序列
SEQIDNO26-金黃色葡萄球菌中的Agr結合基序
SEQIDNO27-金黃色葡萄球菌中的Agr結合基序
SEQIDNO28-PCR制備SasigB TFD的正向引物序列
SEQIDNO29-PCR制備SasigB TFD的反向引物序列
SEQIDNO30-PCR制備SAfhu TFD的正向引物序列
SEQIDNO31-PCR制備SAfhu TFD的反向引物序列
SEQIDNO32-PCR制備SsaA TFD的正向引物序列
SEQIDNO:33-PCR制備kaA TFD的反向引物序列
SEQIDNO=34-對照序列
SEQIDNO:35-對照序列
SEQIDNO:36-PCR擴增16s rRNA的正向引物序列
SEQIDNO:37-PCR擴增16s rRNA的反向引物序列
SEQIDNO:38-PCR定量fhu基因的正向引物序列
SEQIDNO:39-PCR定量fhu基因的反向引物序列
SEQIDNO40-磷酸化Sig啞鈴TFD寡核苷酸序列
SEQIDNO41-磷酸化Sig啞鈴TFD寡核苷酸序列
SEQIDNO:42-啞鈴TFD的磷酸化引物，所述TFD含有亂序的Sig結合位點
SEQIDNO:43-啞鈴TFD的磷酸化引物，所述TFD含有亂序的Sig結合位點
SEQIDNO:44-整合了 WalR的結合序列的磷酸化 鈴寡核苷酸
SEQIDNO:45-整合了 WalR的結合序列的磷酸化 鈴寡核苷酸
SEQIDNO:46-整合了亂序的WalR結合位點的磷酸化 鈴寡核苷酸
SEQIDNO:47-整合了亂序的WalR結合位點的磷酸化 鈴寡核苷酸
SEQIDNO:48-整合了 WalR結合位點的磷酸化寡核苷酸
SEQIDNO:49-整合了 WalR結合位點的磷酸化寡核苷酸
SEQIDNO:50-FabB啟動子的正向引物
SEQIDNO:51-FabB啟動子的反向引物
SEQIDNO:52-ffhiB7TFD的正向引物
SEQIDNO:53-ffhiB7TFD的反向引物
SEQIDNO:54-TFD的正向引物，該TFD含有肺炎克雷伯氏菌的σ M因子的識別序列
SEQIDNO:55-TFD的反向引物，該TFD含有肺炎克雷伯氏菌的σ M因子的識別序列
SEQIDNO:56-細胞穿透肽的序列
SEQIDNO:57-ffalR TFD共有序列
SEQIDNO:58-SigB TFD共有序列
SEQIDNO:59-KP_Sig TFD 序列
SEQIDNO:60-KP_Sig TFD 共有序列。實施例雖然總的來說本文提及的許多技術是本領域熟知的，可以參考特別是Sambrook and Russell, 3rd Edition 2001, Molecular Cloning -.a laboratory manual。實施例11. 1在有鏈球菌溶血素0的情況下，膽固醇標記TFD利用寡核苷酸引物，經PCR制備TFD，引物中一個帶有5’膽固醇修飾，另一個在其 5’末端有類似修飾或其他修飾(比如熒光染料，比如Cy5，這樣可以容易地測量轉錄因子誘餌(TFD)的攝取)。如果TFD已被克隆到載體中，引物設計成能夠退火到緊臨插入片段的載體序列上，例如SEQ ID NO 1 Chol_TEf :5，膽固醇-TEG-GGC CGC CAT GGC GGC CGC GGGAAT TCSEQ ID NO 2 Cy5_TEr :5，Cy5_AGG CGG CCG CGA ATT CAC TAG TG如果用于制備TFD的序列還沒有考慮，可以直接合成(如果夠短)并退火形成 TFD，或者用與TFD內部退火的引物由基因組DNA直接擴增。將PCR產物乙醇沉淀，以500-1000ng/ μ 1的濃度重懸于TE緩沖液(IOmM Tris. HCiamM EDTA ρΗ8. 0)中。通常利用96孔板進行抗生素敏感性檢測，每個孔中含有200ml 培養液。例如，對于糞腸球菌，該培養液是補充了 0. 2U/ml鏈球菌溶血素O(Sigma)和5 μ g/ ml萬古霉素抗生素的BHI (腦心浸液Brain Heart hfusion)培養基(Becton Dickinson), 并接種萬古霉素抗性糞腸球菌菌株。1. 2經PCR制備啞鈴現鈴誘餌是共價閉合的單鏈DNA，其特征在于含有目標因子的結合位點的雙鏈中心，旁側連接莖環結構。莖環通過阻止否則會降解誘餌多核苷酸的外切核酸酶的作用使誘餌穩定。因此，由于它們的特征性形狀被稱為啞鈴TFDs (DB)。如1. 1節所述，用含有目標結合位點的pGEMTCasy來源質粒作為模板，經PCR制備 DBs0擴增使用的引物是SEQ ID NO :3DBTEf :5，P_CTTGG TTTTT CCAAG AGAAGAGC CCG CCATGG CGG CCG CGG GAATTCSEQ ID NO :4DBTEr :P_CCG TCT TTT TGA CGG CGA AGA GCA GGC GGC CGC GAATTCACTAGT GA引物中將形成莖環的部分加有下劃線。用合適載體進行的擴增產生如圖4所示的 DNA產物，DB中將與轉錄因子結合的部分顯示為‘NNN NNN’。粗體顯示的序列代表切口限制性內切酶Nt. BspQl的結合位點。在圖4的第二部分顯示了 Nt. BspQl消化PCR產物的結果，該部分顯示莖環結構為單鏈區域，這些區域將形成莖環并能隨后通過用T4 DNA連接酶處理而連接形成共價閉合的環和DB。1. 3通過質粒的限制性消化制備啞鈴寡核苷酸替代地，啞鈴的制備還可以通過將圖4中顯示的鈍末端PCR產物克隆到合適的 PCR克隆載體中，證實其身份和制備質粒。然后可以消化質粒釋放插入片段，后者進一步用 Nt. BspQl消化以釋放圖4中第二部分顯示的片段。該片段可以類似地用T4 DNA連接酶處理從而使DNA分子共價閉合并形成DB。這種方法的優勢是從實踐和經濟角度更易于擴大規模，如果需要大量的 鈴。1. 4用R9-膽固醇試劑進行轉染R9-膽固醇曾被描述能夠協助真核細胞內SiRNA分子的轉染(或其他基于核酸的療法)等(美國專利申請2007-0207966)。這里我們要描述它在給各種細菌轉染TFD中的用途。如前所述(KimW. J. et al, Mol. Ther. (2006) 14 :343-350)合成 R9-膽固醇，該物質由附著在9個D-精氨酸線性鏈上的膽固醇分子構成。TFD與含量逐漸升高的R9-膽固醇在補充有5%葡萄糖的基于TE的緩沖液中混合。混合物在室溫溫育1小時，然后直接用于轉染或者通過瓊脂糖凝膠電泳分析。一般使用能夠導致與DNA的復合體不在凝膠中跑的最小用量，即核酸骨架的電荷被所結合的多精氨酸所中和。膽固醇分子幫助TFD與細菌膜關聯，并進入細胞。TFD/R9-膽固醇偶聯以多種濃度混合在96孔板的200 μ 1培養液中。例如，對于糞腸球菌，培養液是補充了 0. 2U/ml鏈球菌溶血素0 (Sigma)和5 μ g/ml萬古霉素抗生素的 BHI培養基，并接種萬古霉素抗性糞腸球菌菌株。實施例2ffhiBT i細娜后碰木干無化WhiB7是恥垢分枝桿菌中被顯示參與決定該細菌對抗生素敏感性的一個基因。將該基因功能性刪除導致細菌對抗生素高度敏感(PNAS (2005) 102 :12200)。WhiB7被認為是一種轉錄調控因子，文獻中已描述過多個這類基因。病原菌結核分枝桿菌(結核病的致病原)中存在WhiB7的一個相近同源物。如實施例1. 1所述制備含有WhiB7誘餌序列的誘餌多核苷酸，使用多種濃度在 (含有鋼絲的200ml搖瓶中的)20ml培養液中轉染恥垢分枝桿菌。所用培養基是補充了 10% ODAC (Becton Dickinson)和亞抑制濃度的抗生素異煙胼(IZ)或利福平(RF)的 9H1 KBecton Dickinson)。搖瓶在37°C震蕩溫育，不同間隔取樣品并測量吸光度(來監測細胞生長)。搖瓶用IOOnM的WhiB7 TFD (+)或陰性對照TFD(-)處理。明顯在用WhiB7 TFD 而不是對照TFD處理過的搖瓶中，細胞變得對測試過的兩種抗生素都敏感(參見圖5)。SEQ ID NO :5-ffhiB7 TFD 5，TGG CCA CGG ATC CGG GTG ACT GCG GGT CCG TGG CCT 3，實施例3FabB誘餌下調大腸埃希氏菌必要基因FabB誘餌含有!^adR調控因子的結合位點，所述調控因子控制參與脂肪酸合成關鍵途徑的基因(包括fabA和fabB)的表達。已有報道功能性敲除fadR基因產生的大腸埃希氏菌菌株在脂肪酸合成方面有缺陷，不能在有抗生素淺藍菌素(靶向脂肪酸合成)的情況下生長(J. Bacteriol. (2005) 183 :5292)) FabB誘餌含有以下序列SEQ ID NO 6 FabB TFD 5，TTT ATT CCG MC TGA TCG GAC TTG TTC AGC GTA CAC GTG TTA GCT ATC CTG CGT GCT TCA3'如實施例1. 1所述制備誘餌，以各種濃度用于轉染96孔板的每個孔，孔中含有 200 μ 1補充了 1 μ g/ml淺藍菌素(Sigma)的Rich培養基(每升含有IOg蛋白胨、5g NaCl, Ig酵母提取物，補充有終濃度0. 2%葡萄糖和0. 4%醋酸鹽)。培養板在37°C震蕩溫育，用讀板儀取(595nM處)吸光度讀數。所有數據點進行三次。細菌是未用TFDs處理的(未處理)、轉染FabB TFD(FabB)或者轉染陰性對照的(Van)，所述陰性對照由其序列在大腸桿菌中沒有的TFD構成。很顯然在圖6中，未處理樣品和陰性對照樣品在培養液中生長速度相當，而用 FabB TFD處理使得細胞基本不生長。實施例4使金黃餼葡萄球菌對應激反應敏感化的誘餌誘餌多核苷酸經電穿孔轉染到金黃色葡萄球菌中。通過標準方法制備細菌細胞。簡單地說，細胞在LB培養基中于37°C生長至對數早期，即420nM處的吸光度達到0. 3。通過低速離心收集將細胞冷卻到4°C并收集，在類似體積的無菌冰冷10% (ν/ν)甘油中洗三次。最后，細胞重懸于最初體積十分之一的10%甘油中。電穿孔的進行是將50 μ 1細胞與 1 μ 1 TFD (通常IOOng到1 μ g的DNA)在電穿孔小池中混合，然后在Biofcid Genepulser中穿孔，儀器設置為2. 5kEV、100 Ω和25 μ F，得到時間常數在3. 8到4. 8ms的范圍內。一般使用50 μ 1電穿孔細胞接種含有30mM KOH(誘導應激反應)的IOml BHI或LB培養基。將 200 μ 1細胞分到96孔板的小孔內，培養板在37°C中等震蕩溫育，通過測量吸光度監測生長。生長曲線圖顯示了特定TFD與對照(經過模擬電穿孔，沒有轉染DNA;或者轉染了無關序列)相比，降低生長速度的效果(圖7)。以下誘餌序列能夠降低金黃色葡萄球菌在脅迫條件下的生長速度SEQ ID NO 7 =LytM TFD 5’ GCT ATT TTG TAA TGA CAA TGT AAT GAG TTT AGT AAAAA3，SEQ ID NO 8 SsaA TFD 5，ATT ACA AAT TTG TAA CAG ACT TAT TTT A3，.實施例5Sir TFD抑制金黃餼葡萄球菌的牛長Sig_TFD含有金黃色葡萄球菌SigB蛋白的結合位點。該蛋白是控制大量脅迫相關基因的選擇性 σ 因子(Wigneshawerajaj，Molecular Microbiology(2008)68 538) 通過用該TFD轉染金黃色葡萄球菌細胞并在96孔板中規定培養基中培養細胞，TFD明顯能夠抑制細胞生長。DNA含有Fur轉錄因子的結合位點，Fur在鐵限制情況下調節鐵的攝取(Horsburgh et al，J. Bacteriol. (2001) 183:468)。SsaA 含有雙組分調控因子WalR的結合位點，WalR被證實調控影響生長速度的12個基因(Dubrac & Msadek， J.Bacteriology(2004)186 :1175)。5. 1 通過 PCR 制備 TFDs按照同時待審的申請PCT/GB2008/003353中的描述通過PCR制備TFDs。用于PCR 反應的寡核苷酸引物一般在5’端被修飾，其中一個含有5’膽固醇修飾。其他所用修飾包括生物素、胺、細胞穿透肽、熒光染料(比如Cy5或熒光素)，從而可以容易地測量TFD的攝取。考慮到的其他用于測試的修飾包括病原細菌細胞膜特有的脂類。因此可以給經PCR產生的TFDs的5’端修飾多種分子，作用在于提高TFD的體內穩定性、提高攝取效率、能夠通過熒光進行檢測。如果TFD已被克隆到載體(pGEMT-Easy)中，引物要設計成與緊鄰插入片段的載體序列退火，例如SEQ ID NO :l-Chol_TEf :5，膽固醇-TEG-GGC CGC CAT GGC GGC CGC GGG AAT TC 3，SEQ ID NO :2-Cy5_TEr :5，Cy5_AGG CGG CCG CGA ATT CAC TAG TG 3，.將PCR產物乙醇沉淀，以500-1000ng/ μ 1的濃度重懸于TE緩沖液中。通過將含有帶檢驗的結合位點的合成磷酸化寡核苷酸對退火來克隆TFDs。每對寡核苷酸3’端含有腺嘌呤，以方便克隆到帶有5’胸腺嘧啶突出的pGEM_TeaSy載體中(從而加速PCR產物的克隆)。為Sig TFD使用的引物序列是SEQ ID NO :28_SasigB FOR :GAA GAT TAG AAA TTA TTT CGA T GGG TAT ATA ATAASEQ ID NO :29_SASigB REV :TAT TAT ATA CCC ATC GAA ATA ATT TCT AAT CTT C A為1 !! TFD使用的引物序列是SEQ ID NO :30_SAfhu FOR :ACT ACA AGT ACT ATT AGT AAT AGT TAA CCC TASEQ ID NO 31-SAfhu REV :AGG GTT AAC TAT TAC TAA TAG TAC TTG TAG TA為kaA TFD使用的引物序列是SEQ ID NO :32-SsaA FOR :ATT ACA AAT TTG TAA CAG ACT TAT TTT ASEQ ID NO :33-SsaA REV :AAA ATA AGT CTG TTA CAA ATT TGT A AT A5. 2在96孔板中講行牛長研究.如5.1部分制備膽固醇/Cy5標記的誘餌多核苷酸。然后通常將Iyg TFD與 0. 3 μ 1脂質體轉染劑DOTAP (Roche)混合，室溫下溫育10分鐘。確定誘餌多核苷酸對細菌細胞生長的效果的檢驗用96孔板進行，每個孔含有200 μ 1培養液，培養液由不是鐵限制的 BHI 培養基(購自 Becton Dickinson)補充60nM短桿菌肽(購自 Sigma Corporation. Cat# G5002)構成，或者由類似地補充了短桿菌肽的缺鐵培養基(NRPMI)構成。去除鐵的方法其他地方有詳細描述(Science 0004)305 =1626-1628)。每個孔中加入1 μ 1各種濃度的膽固醇/Cy5標記的誘餌-TFD復合體，在溫育過程中通過測量不同時間培養液的吸光度監測它們對葡萄球菌細菌生長的效果。平板于37°C震蕩溫育，用讀板儀取G50nM處的)吸光度讀數。測試了多個誘餌=SigJhu和kaA。由圖8可見，很明顯用只有IOnM Sig TFD進行的處理阻止了在BHI培養基中的生長，而類似用量的fhu TFD對細菌在該培養基，即不是鐵限制的培養基中的生長沒有影響。 IOnM SsaA TFD造成細菌生長有可測量到的延緩。使用鐵限制培養基時，證明IOnM fhu TFD能夠阻止生長，而類似用量的對照 TFD(SsaA)在這些條件下對細菌生長沒有影響。實施例6Fur TFDs控制fhu的表達，阻止金黃餼葡萄球菌在鐵限制培養基中的生長。設計TFDs與Fur轉錄因子結合，該轉錄因子在控制細菌攝取鐵(Somerville and Proctor (2009) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 73 :233-248)、負調控 fhu 操縱子中發揮核心作用，所述fhu操縱子控制被清出的鐵(scavenged iron)的運輸。鐵對生長很重要-它為電子傳遞所需要并且在許多酶學過程中作為輔助因子。但是在宿主中，鐵以限制量存在，通常通過合并到諸如轉鐵蛋白和乳鐵蛋白的宿主載體蛋白中而不能被細菌獲得。針對這一點，金黃色葡萄球菌合成高親和力的鐵螯合劑-鐵載體來結合鐵并利用(比如fhuCBG編碼的)ABC轉運蛋白將鐵-鐵載體復合體運輸到細胞質中。因為輸入過多的鐵會導致經費頓反應(Fenton reaction)形成自由基，隨后引起細胞損傷(Wandersman and Del印elaire，Ann Rev Microbiol (2004) 58 :611-647)，鐵攝取必須受到嚴格的調控。 Fur敲除菌株在體外鐵限制培養基中生長不良并在動物模型中喪失致病性(Horsburgh，et al. J. Bacteriol (2001) 183 :468-475)，這表明了 Fur有作為治療目標物的潛能。6. 1 方法6. 1. 1細菌菌株和培養條件
金黃色葡萄球菌ATCC 6538NA培養物生長和維持在BHI培養基(Becton Dickenson)中。冷凍菌種的制備是將對數早期(A6tltl的OD為0.幻的培養物和相同體積的 50%甘油混合并冷凍在-80°C。BHI是用于非鐵限制條件的培養基，如前所述(Skaar et al. 2004)制備的NRPMI用于鐵限制的生長條件。6. 1. 2 制備 TFD制備含有TFD序列的質粒是通過將以下序列退火，所述序列分別是含有Fur結合位點的寡核苷酸(SAFur 1,5'P-ACT ACA AGT ACT ATT AGT AAT AGT TAA CCC TA-3，(SEQ ID NO 30)禾口 SAFur2，5’ P-AGG GTT AAC TAT TAC TAA TAG TAC TTG TAG TA—3’ (SEQ ID NO 31))；對照序列(Conl，5，P-TGG CCA CGG ATC CGG GTG ACT GCG GGT CCG TA-3’ (SEQ ID NO 34)和Con2，5，P-ACG GAC CCG CAG TCA CCC GGA TCC GTG GCC AA-3，(SEQ ID NO :35)； 將它們連接至pGEMTCasy載體(ftOmega)并轉化到大腸桿菌DH5 α (Invitrogen)中。然后利用針對PGEMTeasy 的標記引物 chol-Tef (5，-膽固醇-GGC CGC CAT GGC GGC CGC GGG MT TC-3，(SEQ ID NO :1))和 cy5_Ter(5，_Cy5_AGG CGG CCG CGA ATT CAC TAG TGA-3，(SEQ ID NO 2))經PCR擴增TFDs并通過乙醇沉淀純化。6. 1. 3轉染稈序將21mg短桿菌肽溶解在Iml甲醇中新鮮制備短桿菌肽儲液。使用前在水中稀釋并進一步1/100稀釋到生長培養基中得到終濃度60nM。用冷凍的金黃色葡萄球菌菌種 1/100接種補充培養基，室溫下溫育10分鐘。TFD-D0TAP復合體的形成是將lug TFD與2 μ g DOTAP(Roche)混合并在實驗臺上于室溫溫育10分鐘。然后將TFD復合體與接種了的培養基混合，分樣到96孔平底板中，在37°C震蕩培養，用BioTek讀板儀分析生長情況。6. 1.4通過實時aPCR定量TFD的數量從每個孔得到的細胞在PBS (磷酸緩沖鹽水)中洗兩次，重懸于100 μ 1水中。每個qPCR反應中使用1 μ 1各個樣品，將DNA標準或者樣品與引物混合，分別在補充了 0. 5μ 1 ROX 的 12.5ul SYBR Green DNA 混合液(Invitrogen)中擴增 TFD CTef■和 iTer ；SEQ ID NOs 1 & 2)或者 16S rRNA(stypF,5'-ACG GTC TTG CTG TCA CTT ATA-3，(SEQ ID NO :36) ；stypR, 5，-TAC ACA TAT GTT CTT CCC TAA TAA-3，(SEQ ID NO :37))。得到的數據用于計算每個基因組中存在的TFD數量。6. 1. 5RNA 分析培養物用RNA Protect試劑^jiagen)處理，按照描述收集細胞并保存在_80°C。將細胞重懸于含有100 μ g/ml溶葡萄球菌素的100 μ 1 TE緩沖液(IOmM Tris-HCl，ImM EDTA) 中，在37°C溫育30分鐘來裂解細胞。加入700 μ 1 RLT緩沖液^iagen RNA提取試劑盒)， 按照生產商的實驗方案收集1 離。用化“廿呢611 DNase I將任何殘留的DNA消化掉-2. 5 μ g RNA樣品與1. 25U DNAseI混合在25 μ 1中，室溫放置15分鐘。加入2. 5 μ 1 25mM EDTA并在65°C加熱10分鐘來滅活DNAseI酶，處理過的RNA利用隨機引物合成進行cDNA合成(NEB Protoscript)。利用標準實時PCR方法，使用cDNA來定量相對轉錄，為fhu基因使用的引物 qSAfhuF，5，-CGT CAA TCA TTG GTC CTA ACG GCT GC-3，(SEQ ID NO :38) ；qSAfhuR，5，_GCC ATC TGC TAC TTC AGG TGA TTG AGG-3，(SEQ ID NO :39)；歸一化利用 16s rRNA 水平(使用的引物為 stypF 和 stypR ；SEQ ID NOs 36 & 37)。6. 2 結果
6. 2. IFur TFD在非鐵限制件培養基中的轉染。鐵的可得性影響著59個金黃色葡萄球菌基因的調控，其中17個顯示是Fur調控的(Allard et al, Microbiol. Infect. (2006)8 :1679-1690 ；Xiong et al，J. Infect. Dis. (2000) 181 :1020-1026 ；Horsburgh et al, J.Bacteriol. (2001a) 183 :468-475)。Fur 還作為某些Per調控的基因，包括katA(編碼氧化脅迫抗性所需的催化劑)的正調控因子(Horsburgh et al, Infect. Immun. (2001b)69 :3744-3754 ；Morrissey et al, Infect. Immun. (2004)72 :972-979)，因此fur突變體防止毒性羥基形成的能力受到損害。這些多樣化而復雜的調控特性可能是造成金黃色葡萄球菌fur突變體毒性下降的原因。為了評估 TFD方法在調控Fur活性中的可行性，設計整合了 Fur結合位點的TFD，其中所述結合位點是先前在金黃色葡萄球菌fhu啟動子上進行的足跡法實驗鑒定到的(Xiong et al. 2000)。 對照TFD由核苷酸組成類似的金黃色葡萄球菌基因組中沒有的無關序列構成，這是為了確認Fur TFD的作用是否是序列特異的，以及是否轉染程序本身造成了殺菌效果。將每個核苷酸序列連接到大腸埃希氏菌載體PGEMTCasy中，得到的質粒用側接插入位點的引物經PCR 制備TFDs。常規地將引物5’端修飾，這部分地是為了通過使TFD免于核酸外切酶的作用而提高TFD的穩定性，但也是為了使所述分子用膽固醇(正向引物)和cy5染料(反向引物)而功能化。因此，Fur TFD的總長度是60bp，對照TFD的總長度是62bp。為了實現轉染，將TFDs與商品脂質制品DOTAP混合形成穩定的復合體，屏蔽磷酸骨架的陰離子。然后將TFD-D0TAP復合體與金黃色葡萄球菌在非鐵限制性的BHI培養基中混合，所述培養基中補充有60nM短桿菌肽。短桿菌肽是一種抗微生物肽，具有抗革蘭氏陽性細菌的膜的活性(Herrell and HeiIman, J. Clin. Invest. (1941)20:583-591)。發明人以前的實驗已證實亞致死濃度的短桿菌肽能夠使得TFD-D0TAP復合體與細菌膜融合并攝取TFD。加入轉染試劑與對照TFD造成金黃色葡萄球菌生長速度下降。這可能是由于弱化細胞壁而導致的某些殺菌活性。用InM Fur或對照TFD進行的轉染導致在鐵富集培養基中有非常類似的生長曲線(圖9)。有趣的是，fur敲除表現出在富集培養基中的生長缺陷 (Horsburgh et al,2001)而對照和Fur TFD測試樣品之間沒有可見的差別。這種不同的一個解釋可能是因為生長條件(例如，96孔板上通氣不好)和培養基不同，但更恰當的原因可能是基因敲除和TFD處理效果之間的本質不同。Fur_TFD會阻止任何能夠結合該位點的轉錄因子，不僅是Fur蛋白，還有與同一位點結合的其他蛋白。人們逐漸認識到細菌中的轉錄調控比先前認為的要復雜的多，而且與真核細胞中一樣，影響表達的轉錄因子有一個以上，有來自許多調控網絡的參與，因此是組合式的(Barnard et al，Curr. Opin. Microbiol. (2004)7 :102-108).進行定量PCR來證實細胞是否發生了轉染以及是否每個基因組中有許多TFD進入。在沒有短桿菌肽和DOTAP的情況下，沒有檢測到TFDs在細菌細胞內部或者附著在細胞上，這表明TFDs不會自發進入細胞，清洗程序成功地除去了與細胞表面非特異關聯的任何 TFDs0在有轉染劑存在的情況下，檢測到每個基因組中Fur和對照TFD分別有4500和5340 個TFDs (圖10A)。因此，轉染程序將相當多數量的兩種TFDs遞送到細菌細胞內，對細胞在鐵富集培養基上的生長沒有任何可觀察到的效果差別。6. 2. 2TFD 調控的 fhu 表達如果Fur_TFD結合Fur，則阻止它與fhu啟動子的結合預期會解除對fhu基因的抑制。為了檢驗這一點，將Fur_TFD處理過的樣品中存在的fhu轉錄產物的拷貝數(標準化為核糖體DNA)與對照樣品進行比較(圖10B)。對分離自樣品的RNA進行的定量實時RT-PCR 如圖9所示證明Fur_TFD給fhu轉錄造成了與預期一致的變化比對照樣品高5倍。因此， 特異TFD的轉染可以用于調整金黃色葡萄球菌中已知對致病性關鍵的基因的表達方式。6. 2. 3Fur TFD在鐵限制培養基中對牛長的影響使用相同的轉染方案將Fur和對照TFDs引入培養在鐵限制性培養基中的金黃色葡萄球菌(Skaar et al，Science (2004) 305 :1626-8) 正如預期的，與在BHI中生長情況相比，在該培養基中的生長被延緩。但是，用Fur TFD轉染過的培養物在整個試驗過程中未能顯示任何生長跡象(圖11)，表明干擾鐵限制情況下鐵的調控對生長是有害的，這再現了在Fur敲除突變體中看到的結果(Horsburgh et al, 2001a) Fur轉錄因子通常被認為是一個作用于全局的阻遏物，在鐵過量的情況下它下調鐵攝取基因的轉錄，從而防止費頓反應造成的鐵中毒(Wandersman& Del印elaire，Ann. Rev. Microbiol. (2004)58 :611-647)。金黃色葡萄球菌fur突變對毒性也有不利影響，在鐵限制條件下不能生長，導致在體內的毒性減弱(Horsburgh et al. 2001a)。這種現象的原因還不清楚，但可能反映了 Fur在幫助細菌適應環境變化中的核心作用，和受損的應答氧化脅迫的能力。對毒性的這種影響似乎不是金黃色葡萄球菌所特有的。fur突變也導致霍亂弧菌、空腸彎曲菌、幽門螺桿菌、胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae) 和蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)在體內的毒力減弱(Mey et al, Infect. Immun. (2005)73 :8167-8178 ；Palyada et al, J.Bacteriol. (2004) 186 :4714-4729 ；Bury-Mone et al, Mol. Microbiol. (2004)53 :623-638 Jacobsen et al, Infect. Immun. (2005)73 3740-3744 ；Harvie et al,Microbiol. (2005) 151:569-577)。對金黃色葡萄球菌 Fur 共有序列和以前鑒定到的序列(Horsburgh et al. 2001a)進行生物信息學分析(利用MEME軟件(http //meme. sdsc. edu/meme4 1/intro. html)顯示該序列在蠟樣芽孢桿菌、炭疽芽孢桿菌、單核細胞增多性李斯特氏菌和金黃色葡萄球菌中高度保守(圖12)，預示了抗其他芽孢桿菌目細菌的活性。反義分子已被用于治療病原細菌。最值得注意的使用諸如肽核酸(Good& Nielsen, Nat. Biotech. (1998) 16 :355-358)和嗎啉基寡核苷酸(Shen et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA(2009) 106 :8163-8168)的修飾骨架，并用陽離子肽實現遞送。它們在微摩濃度下調目標mRNA的翻譯從而抑制微生物的體外和體內生長。轉換為修飾骨架具有的優勢是提高了寡核苷酸在生物液體中的穩定性并且減少或去除了磷酸骨架的負電荷。后一種效果的優勢是修飾寡核苷酸更容易穿過帶負電的細菌外膜進行轉染。但是，因為TFD通過干擾DNA-蛋白質相互作用發揮作用，磷酸骨架可能對蛋白識別很重要，不能輕易替換。本實施例顯示TFDs，作為含有天然骨架的較大寡核苷酸，可以有效地利用肽和脂質體組合遞送到細胞內，從而在納摩濃度下殺死細菌。TFDs因為阻斷酶促過程(轉錄)，因此在低的多的濃度即很有效，而反義分子作為轉錄產物(mRNA)的空間障礙發揮作用。使用 TFD的再一優勢是它們阻斷許多關鍵基因的表達，而不是只有一個目的物，這使它們對抗性機制較不易感。實施例7Sir TFD抑制MRSA菌株的生長
如實施例5. 1所述制備膽固醇/Cy5標記的誘餌多核苷酸。然后一般取1 μ g Sig TFD 與 0. 3 μ 1 月旨質體轉染劑 D0TAP(l，2-dioleoyl-3-trimethylammonium propane ；Roche) 復合，室溫下溫育10分鐘。確定它們對細菌細胞生長的影響的檢驗用96孔板進行，培養板中每孔含有由補充了 60nM短桿菌肽(Sigma Corporation. Cat# 6500 的BHI培養基 (Becton Dickinson)構成的200 μ 1培養液。向每個孔加入1 μ 1各種濃度的膽固醇/Cy5 標記誘餌-TFD復合體，監測對已被證實是甲氧西林抗性菌株(MRSA)的金黃色葡萄球菌臨床分離株生長的影響。通過在溫育過程不同時間測量培養液的吸光度來監測生長情況。培養板在37°C震蕩溫育，用讀板儀獲取G50nM處的)吸光度讀數。如圖13所示，很顯然用只有IOnM的Sig阻止了 MRSA菌株在BHI培養基中的生長。 類似用量的對照TFD(含有長度類似的金黃色葡萄球菌基因組中不存在的無關序列)對細菌在該培養基中的生長沒有影響。實施例8Sig TFD強化杭牛素杭EMRSA15(臨床分離的流行株)的作用如實施例9. 1所述制備Sig啞鈴TFD(見下文)。用研究成熟的MRSA菌株-EMRSA15A，如實施例5. 2所述進行生長分析。該菌株表現出對甲氧西林(能夠在2mg/ml 抗生素中生長)、o. 5mg/ml 紅霉素禾口 0. 5mg/ml 環丙沙星(Porter and Damani, J. Hospital Infection(2007)65 88)的抗性。 如下表1所示，通過確定細菌培養物生長過程中的延遲時間，測量到EMRSA15菌株在有IOnM Sig TFD的情況下，重新對甲氧西林、紅霉素和環丙沙星敏感。這種試驗中，用對照TFD (如實施例5. 1所述)和抗生素處理過的培養基的延遲時間為0表明培養物和生長在補充了抗生素的培養基中的未處理細菌在相同的時間點開始生長。對于Sig TFD處理過的培養物，延遲時間是與有抗生素情況下對照TFD中看到的相比在生長上的滯后。因此，延遲時間6. 4小時(在有2mg/ml甲氧西林的情況下)、8· 2小時(在有0. 5mg/ml紅霉素的情況下)和8. 3小時(在有0. 5mg/ml環丙沙星的情況下)表明Sig TFD與這些抗生素協同作用延緩生長。該效果的機制可能是Sig TFD阻止或下調了應激反應調節子的抗生素介導的誘導，使得細胞更敏感。因為多數抗生素能夠引起應激反應，如果組合使用TFD，我們預計能提高所有或大部分這類抗生素的藥效。表 權利要求
1.降低原核細胞活力的方法，所述方法包括(a)提供包含靶轉錄因子的結合位點的誘餌多核苷酸(誘餌序列)；(b)將所述誘餌多核苷酸引入原核細胞，所述原核細胞包含與一或多個基因可操縱地連接的上述轉錄因子的識別位點；其中所述誘餌多核苷酸的引入減少了所述靶轉錄因子與細胞中結合位點的結合，導致可操縱地連接的一或多個基因的表達被改變；并且其中所述靶轉錄因子包含一或多個基因的表達調控因子，所述一或多個基因編碼下述中的一或多個(i)細胞適應性反應；( )細胞內在抗生素抗性機制；(iii)細胞毒力因子；(iv)細胞應激反應；或者 (ν)細胞關鍵基因。
2.提高原核細胞抗生素敏感性的方法，所述方法包括(a)提供包含靶轉錄因子的結合位點的誘餌多核苷酸(誘餌序列)；(b)將所述誘餌多核苷酸引入原核細胞，所述原核細胞包含與一或多個基因可操縱地連接的所述轉錄因子的結合位點；其中所述誘餌多核苷酸的引入減少了所述靶轉錄因子與細胞中結合位點的結合，導致可操縱地連接的一或多個基因的表達被改變，從而提高該細胞的抗生素敏感性；并且其中所述靶轉錄因子包含一或多個基因的表達調控因子，所述一或多個基因編碼下述中的一或多個(i)細胞適應性反應；( )細胞內在抗生素抗性機制；(iii)細胞毒力因子；(iv)細胞關鍵基因。
3.權利要求1或2的方法，其中降低活力包括下述中的一或多個 (i)抑制細胞的適應性反應，比如應激反應；( )提高細胞對抗生素的易感性；(iii)抑制一或多個關鍵基因的表達；(iv)抑制一或多個毒力基因的表達。
4.權利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述靶轉錄因子選自WhiB7、i^dR、YycG/ YycF, σ 54 (或 SigA)、Fur、TcdR、Vfr、NtrC、ArsR、TcaA、AgrA、WalR、sigB、Ksig、fhu 或者它們中任何一種的功能性變體或同源物。
5.權利要求1-4中任一項所述的方法，其中所述原核細胞是細菌。
6.權利要求5所述的方法，其中所述細菌是病原菌。
7.前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述誘餌多核苷酸中的轉錄因子結合位點并未可操縱地連接基因。
8.包含靶轉錄因子結合位點的誘餌多核苷酸，其中所述結合位點并未與基因可操縱地連接，并且其中所述轉錄因子包含一或多個基因的表達調控因子，所述一或多個基因編碼下述中的一或多個(i)細胞適應性反應；( )細胞內在抗生素抗性機制；(iii)細胞毒力因子；(iv)細胞應激反應；或者(ν)細胞關鍵基因。
9.權利要求8所述的誘餌多核苷酸，其中所述靶轉錄因子包含下述基因的表達調控因子(a)一或多個基因，其編碼細胞外排泵蛋白，決定細胞壁組成、細胞壁密度或細胞壁代謝的蛋白；(b)一或多個細胞應激反應基因；(c)一或多個編碼金屬調控蛋白的基因；(d)一或多個編碼固氮蛋白的基因；(e)一或多個編碼致病蛋白或毒力因子的基因；(f)一或多個關鍵基因。
10.權利要求8或9所述的誘餌多核苷酸，其中所述靶轉錄因子選自WhiB7、FadR、 YycG/YycF、 σ 54( ^； SigA)、Fur、TcdR、Vfr> NtrC、ArsR> TcaA> AgrA> WalR> sigB、Ksig fhu或者它們中任何一種的功能性變體或同源物。
11.權利要求8-10中任一項所述的誘餌多核苷酸，其中所述誘餌多核苷酸包含環形雙鏈DNA或線性寡核苷酸；和/或至少一個二級結構元件；和/或一個以上拷貝的轉錄因子結合位點；和/或結合位點的其他序列；和/或用于提高多核苷酸的核酸酶抗性的修飾過的堿基或糖；和/或質粒或質粒文庫。
12.權利要求11所述的誘餌多核苷酸，其中所述誘餌多核苷酸包含轉錄因子結合位點的多個直接重復。
13.權利要求11所述的誘餌多核苷酸，其中所述誘餌多核苷酸包含多個轉錄因子結合位點。
14.權利要求11、12或13所述的誘餌多核苷酸，其中所述誘餌多核苷酸包含含有至少一個5’膽固醇修飾的線性寡核苷酸。
15.權利要求11-14中任一項所述的誘餌多核苷酸，其中所述誘餌多核苷酸包含環形啞鈴。
16.權利要求11所述的誘餌多核苷酸，其中所述誘餌多核苷酸包含質粒，所述質粒含有一或多個拷貝的包含陷阱序列的單體序列，所述陷阱序列包含轉錄因子結合位點，其中所述結合位點沒有可操縱地連接基因。
17.前述權利要求中任一項所述的誘餌多核苷酸，其中所述誘餌多核苷酸中的轉錄因子結合位點包含SEQ ID NOS :25-60中的任一個，或者其保留了誘餌功能的變體或片段。
18.包含外源誘餌多核苷酸的細胞，所述多核苷酸包含沒有可操縱地連接基因的靶轉錄因子結合位點；其中所述細胞包含可操縱地連接一或多個基因的轉錄因子結合位點；并且其中所述靶轉錄因子包含一或多個基因的表達調控因子，所述一或多個基因編碼下述中的一或多個(i)細胞適應性反應； ( )細胞內在抗生素抗性機制； (iii)細胞毒力因子； (ν)細胞關鍵基因。
19.權利要求18所述的細胞，其中所述誘餌多核苷酸為權利要求8-17中任一項所定義。
20.權利要求18或19所述的細胞，其中所述細胞是細菌性病原菌。
21.按照權利要求1-7中任一項所述方法制備的細胞。
22.治療受試對象中細菌感染的方法，所述方法包括將權利要求8-17中任一項所述的誘餌多核苷酸，任選與一或多種抗生素和/或抗細菌劑組合進行給藥。
23.權利要求8-17中任一項定義的誘餌多核苷酸用于治療細菌感染。
24.權利要求8-17中任一項定義的誘餌多核苷酸在制備治療細菌感染的藥物中的用途。
25.誘餌多核苷酸或者權利要求23-Μ所述的用途，其中治療細菌感染包括使用一或多種抗生素和/或其他抗細菌劑。
26.權利要求22-25中任一項所述的方法、誘餌多核苷酸或用途，其中治療細菌感染包括治療選擇以下的狀況肺炎、菌血癥、百日咳、萊姆病、布魯氏菌病、急性腸炎、膿毒病(s印sis)、兔熱病、流感、消化性潰瘍病、軍團病、淋病、醫院內感染、膿毒癥、立克次氏病、傷寒、痢疾、霍亂、鼠疫、炭疽病、假膜性結腸炎、白喉、李斯特氏菌病、結核、敗血癥 (septicemia)。
27.殺死細菌、抑制細菌生長或者減弱細菌毒力的離體(exvivo)方法，所述方法包括將權利要求8-17中任一項所述的誘餌多核苷酸，任選與一或多種抗生素和/或抗細菌劑組合施用。
28.藥物組合物，包含權利要求8-17中任一項所述的誘餌多核苷酸和藥物可接受賦形劑或載體，任選組合一或多種抗生素和/或抗細菌劑。
29.清潔組合物，包含權利要求8-17中任一項所述的誘餌多核苷酸，任選組合一或多種抗生素和/或抗細菌劑。
30.試劑盒，包含權利要求8-17中任一項所述的誘餌多核苷酸以及一或多種抗生素和 /或抗細菌劑，其中所述誘餌以及一或多種抗生素和/或抗細菌劑聯用于殺死細菌、抑制細菌生長或者減弱細菌毒力。
31.轉錄因子誘餌(TFDs)在降低原核細胞活力中的用途。
32.轉錄因子誘餌(TFDs)在降低原核細胞毒力中的用途。
33.包含SEQID NO 57的轉錄因子誘餌(TFD)。
34.包含SEQID NO 58的轉錄因子誘餌(TFD)。
35.包含SEQID NO 60的轉錄因子誘餌(TFD)。
36.權利要求33、34或35中任一項所述的轉錄因子誘餌在治療細菌感染中的用途。
全文摘要
改變原核細胞細胞活力表現型(包括抗生素易感性)的方法和組合物。
文檔編號C40B40/06GK102292453SQ200980148638
公開日2011年12月21日 申請日期2009年10月2日 優先權日2008年10月3日
發明者簡.M.莫爾, 邁克爾.邁克阿瑟 申請人:普羅卡塔生物系統有限公司