專利名稱：檢測侵襲性真菌致病菌的基因芯片和試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測九種常見侵襲性致病真菌的基因芯片和檢測用試劑盒。
技術背景
近年來，由于抗生素、激素、免疫抑制劑和腫瘤放療化療的廣泛應用，各種體內留 置管、人工瓣膜等的大量使用，以及艾滋病(AIDS)的增多，侵襲性真菌感染發病率有明顯 上升的趨勢，并且已成為危重病人死亡的重要原因之一。在美國，1990年住院患者深部真菌 感染率是1980年的1. 9倍，居各種病原體感染率上升之首位，2004年報道住院患者侵襲性 真菌感染率是20世紀90年代的2. 4倍，病死率為29%;在歐洲，1983 1997年間，侵襲性 真菌感染死亡患者占所有死亡患者的5. 1 %，而1998 2002年間由侵襲性真菌感染導致死 亡的患者占到了 7.8% ；在中國，北京協和醫院1998年6月 1999年6月調查I⑶282例 患者中有53例發生深部真菌感染，感染率為18.8%，比1993年的5. 6%上升了 3. 4倍。侵襲性真菌感染多發生在醫院內，主要由念珠菌、隱球菌等所致。其中，念珠菌是 血液系統感染的主要致病菌，由其導致的敗血癥病死率最高。在醫學上常見的念珠菌除了 最常見的白色念珠菌外，近年來隨著新一代抗真菌藥物的應用，光滑假絲酵母，克柔假絲酵 母和熱帶假絲酵母等真菌造成的感染也日益增多。經研究發現，這些不同種類的假絲酵母 對抗生素敏感性存在差異。念珠菌感染是一種人類的機會感染，它可以急性或慢性感染的 形式發生。對口部粘膜的慢性增生性念珠菌疾病的研究是相當重要的，因為它與鱗狀細胞 癌的發生有關。除了表面器官損傷以外，像心臟內膜炎和食道炎，深部念珠菌感染疾病，很 可能發生在免疫缺陷的個體中。對念珠菌的研究，很少將其鑒定到種的水平。在慢性增生性念珠菌病例中，研究僅 限于通過觀察病變組織中念珠菌的菌絲來辨別菌種。人們已經認識到念珠菌菌種和亞種在 致病能力上存在很大差異。對念珠菌臨床菌株進行鑒定和分類的傳統方法包括形態學、生 物化學分析、菌落形態學分析、抗性分析以及血清學分類，這些方法很費時，而且依賴表型 特征，所以他們的可靠性不是很高。依靠基因的不同進行菌種檢測是另一種可行的方法，基 因型分析方法已被用在念珠菌菌株的分類和檢測中，但是并不常用在種的分類中。隱球菌的主要致病類型是新型隱球菌，隱球菌感染是艾滋病常見的并發癥，發生 隱球菌腦膜炎后治愈率極低。隱球菌屬包括許多種，其中新生隱球菌被認為是唯一的一種 人類病原體。新生隱球菌首先侵入肺中，然后通過血流擴散到達大腦和腦膜。在未被HIV感 染的隱球菌病患者中，特別是隱球菌引起的腦膜炎患者，經常有像紅斑狼瘡、肉狀瘤病、白 血病、淋巴瘤、庫欣綜合癥等一系列并發癥出現。新生隱球菌病是一種經常與AIDS相伴的 疾病。新生隱球菌病和血清性感染跡象可以作為感染AIDS的一個判斷依據。在將近45% 的AIDS患者中，新生隱球菌病經常被用于診斷AIDS。肺部新生隱球菌病的患者通常是很難 被診斷。診斷通常只能依靠檢測肺部組織切片來完成，為了實現真菌的快速和簡單的檢測 需要更加靈敏和特異的方法。其中一種方法是檢測血清中的抗原，然而，檢測新生隱球菌抗 原的血清方法具有假陽性的缺點。在實驗室中，診斷真菌感染經常很困難。培養從病人的尿液，血液以及唾液獲得的樣品經常很困難。在評價實驗結果時，還要考慮到可能的污染問 題。近年來，越來越多的分子技術用于病原菌的鑒定、檢測及病害診斷中，包括間區基 因序列分析、隨機擴增長度多態性(RAPD)分析、核糖體DNA限制性片段長度多態性(RFLP) 分析等。和傳統檢測技術相比，這些基于多聚酶鏈式反應(PCR)的分子檢測技術，不需要經 過病原菌的分離、純培養等過程，而且具有快速、靈敏、特異性強等優點。生物芯片作為一種病原體分子檢測技術具有高通量、快速、準確、可靠的特點，能 夠實現對組群樣品、多目標的同時檢測，極大的提高檢測效率。
發明內容
本發明的一個目的是將基因芯片技術應用于侵襲性真菌的檢測，利用生物芯片高 通量、快速、靈敏、特異性好的特點，提高侵襲性真菌的檢測速度、通量和靈敏度，大大降低 成本，縮短檢測時間。 本發明所述的檢測侵襲性真菌致病菌的基因芯片，包括固相載體和固定在該固相 載體上的寡聚核苷酸探針，其中所述的該寡聚核苷酸探針包含從以下序列中選取的一種或 多種序列a.從白色念珠菌、近平滑假絲酵母、熱帶假絲酵母、乳酒假絲酵母、克魯斯假絲酵 母、葡萄牙假絲酵母、光滑假絲酵母、季也蒙假絲酵母、新生隱球菌的rDNA的18S-5. 8S或 5. 8S-28S內轉錄間區(ITS)、5· 8S rDNA選取的一種或多種DNA序列； b.所述a中選取的DNA序列的互補DNA序列；c. a或b中所述的DNA序列的互補RNA序列。本發明的一優選實施例中，上述a中從白色念珠菌、近平滑假絲酵母、熱帶假絲酵 母、乳酒假絲酵母、克魯斯假絲酵母、葡萄牙假絲酵母、光滑假絲酵母、季也蒙假絲酵母、新 生隱球菌的rDNA的18S-5. 8S或5. 8S-28S內轉錄間區(ITS)、5. 8S rDNA選取的DNA片段 具有SEQ ID NO 3-38、除去其中的5、16的核苷酸序列中的一種或多種。本發明所述的基因芯片，還包括陽性對照探針、陰性探針和熒光探針。本發明的優選實施例中，上述陽性對照探針選自上述白色念珠菌、近平滑假絲酵 母、熱帶假絲酵母、乳酒假絲酵母、克魯斯假絲酵母、葡萄牙假絲酵母、光滑假絲酵母、季也 蒙假絲酵母、新生隱球菌的5. 8S rDNA序列。本發明的優選實施例中，上述陽性對照探針具有SEQ ID NO :16所示的核苷酸序 列。本發明所述的基因芯片可用于檢測白色念珠菌、近平滑假絲酵母、熱帶假絲酵母、 乳酒假絲酵母、克魯斯假絲酵母、葡萄牙假絲酵母、光滑假絲酵母、季也蒙假絲酵母或新生 隱球菌。本發明還提供一種檢測侵襲性真菌的試劑盒，其包含上述的基因芯片，具體地，該 基因芯片可以包含具有SEQ ID N0:3-38、除去其中的5、16的核苷酸序列中的一種或多種 的寡核苷酸探針。本發明所述的試劑盒可應用于檢測白色念珠菌、近平滑假絲酵母、熱帶假絲酵母、 乳酒假絲酵母、克魯斯假絲酵母、葡萄牙假絲酵母、光滑假絲酵母、季也蒙假絲酵母或新生隱球菌。由上述的技術方案可見，本發明將特異rDNA間區序列與基因芯片技術相結合，建 立了一種快速、靈敏、準確性高、重復性強的白色念珠菌、近平滑假絲酵母、熱帶假絲酵母、 乳酒假絲酵母、克魯斯假絲酵母、葡萄牙假絲酵母、光滑假絲酵母、季也蒙假絲酵母、新生隱 球菌檢測基因芯片及其檢測方法，利用本發明的基因芯片可以達到檢測九種侵襲性真菌致 病菌目的。本發明提供的檢測侵襲性致病真菌的基因芯片，檢測范圍內的九種致病菌為白色 念珠菌、近平滑假絲酵母、熱帶假絲酵母、乳酒假絲酵母、克魯斯假絲酵母、葡萄牙假絲酵 母、光滑假絲酵母、季也蒙假絲酵母、新生隱球菌，以彌補針對真菌檢測技術存在的費時耗 力的缺陷，擴展病原菌檢測范圍，提高檢測靈敏度和特異性，降低勞動強度，縮短檢測周期。為讓本發明的上述和其它目的、特征和優點 能更明顯易懂，下面特舉較佳實施例， 并配合說明書附圖，作詳細說明如下。
圖1為本發明基因芯片的一個實施例的外形示意圖；圖2為本發明基因芯片的一個實施例上單一點陣探針排布規律示意圖；圖3A為利用本發明的基因芯片檢測白色念珠菌時的雜交結果；圖3B為利用本發明的基因芯片檢測乳酒假絲酵母時的雜交結果；圖3C為利用本發明的基因芯片檢測熱帶假絲酵母時的雜交結果；圖3D為利用本發明的基因芯片檢測近平滑假絲酵母時的雜交結果；圖3E為利用本發明的基因芯片檢測克魯斯假絲酵母時的雜交結果；圖3F為利用本發明的基因芯片檢測葡萄牙假絲酵母時的雜交結果；圖3G為利用本發明的基因芯片檢測季也蒙假絲酵母時的雜交結果；圖3H為利用本發明的基因芯片檢測新生隱球菌時的雜交結果；圖31為利用本發明的基因芯片檢測光滑假絲酵母時的雜交結果；圖3J為利用本發明的基因芯片檢測異常畢赤酵母時的雜交結果。
具體實施例方式實施例1探針的設計和制備核糖體DNA序列存在于所有的生物體內，在進化過程中具有相同的起源與功能， 可以反映物種間具有可比性的進化史。rDNA的內轉錄間隔區(Internal Transcribed Spacer, ITS)是真核細胞rDNA中18S和28S rDNA基因拷貝區之間的一段區域，其中5. 8S rDNA位于ITS1、ITS2之間。5. 8SrDNA的核苷酸序列保守性很強，而ITSl和ITS2進化較 快，但種間同源性非常小，而種內同源性很高，可用于種間的鑒定。1.序列獲得(1)18S-28S間區基因序列的獲得從GenBank公共數據庫分別下載得到白色念珠 菌、近平滑假絲酵母、熱帶假絲酵母、乳酒假絲酵母、克魯斯假絲酵母、葡萄牙假絲酵母、光 滑假絲酵母、季也蒙假絲酵母、新生隱球菌的18S-28S間區基因序列。(2)5. 8S rDNA基因序列的獲得從GenBank公共數據庫分別下載得到白色念珠菌、近平滑假絲酵母、熱帶假絲酵母、乳酒假絲酵母、克魯斯假絲酵母、葡萄牙假絲酵母、光 滑假絲酵母、季也蒙假絲酵母、新生隱球菌的5. 8S rDNA基因序列。2.探針設計(1)特異基因探針將上述從GenBank公共數據庫下載得到的特異基因序列用序 列比對軟件Clustal X比對，找到該基因的保守區段，將該保守區段導入Primer premier 5. 0軟件中，選取長度在20bp到30bp的DNA序列作為候選探針，分別將從GenBank上下載 的真菌的間區與自己選取的DNA序列進行比對，選取發卡結構、二聚體結構及錯誤引發結 構的 AG > -10kcl/mol 并且 Tm = 65V 士5°C的序列。
(2)陽性對照探針將上述從GenBank公共數據庫下載得到的待檢測的九種菌的 5.8S rDNA基因序列用序列比對軟件Clustal X比對，找到該基因的保守區段，將該保守區 段導入Primer premier 5. 0軟件中，選取長度在20bp到30bp的DNA序列作為候選探針， 分別將從GenBank上下載的真菌的間區與自己選取的DNA序列進行比對。選取發卡結構、 二聚體結構及錯誤引發結構的AG > -10kcl/mol并且Tm = 65°C 士5°C的序列。3.探針合成將下表1中的探針序列的5’端延長10個T(表1所示的熒光探針 序列中沒有包含延長的10個T)并氨基化后委托探針合成公司(北京奧科公司)合成，備 用。4.探針篩選將合成好的探針溶解并適量稀釋后用基因芯片點樣儀點在玻璃片 基上制成基因芯片，通過雜交實驗進行探針篩選，最終得到用于制備本發明基因芯片所需 的特異、靈敏的探針。在本發明的一優選實施例中，選擇了 35條長度在25bp士5bp、Tm = 65°C 士5°C 的探針，并通過120次雜交實驗進行探針篩選，最終得到如表1所示的探針。其中，編號 為NO. 16 (SEQ ID NO 16)的探針序列選自的九種菌的5. 8S rDNA，作為陽性對照用，編號 為W). 2的探針為空白對照探針，編號為W). 5的探針為多聚T片段，用作陰性對照，編號為 NO. 1的探針為熒光探針，編號NO. 3-N0. 4的2條探針序列(SEQ ID NO :3_SEQID NO 4)選 自乳酒假絲酵母的18S-28S間區基因序列，編號NO. 6-N0. 10的5條探針序列(SEQ ID NO 6-SEQ ID NO 10)選自熱帶假絲酵母的18S-28S間區基因序列，編號NO. 11-NO. 15的5條 探針序列(SEQ IDNO =Il-SEQ ID NO :15)選自近平滑假絲酵母的18S-28S間區基因序列， 編號NO. 17-N0. 20的4條探針序列(SEQ ID NO :17_SEQ ID NO 20)選自克魯斯假絲酵母 的18S-28S間區基因序列，編號N0. 21-NO. 23的3條探針序列(SEQ ID NO 21-SEQ ID NO 23)選自季也蒙假絲酵母的18S-28S間區基因序列，編號NO. 24-N0. 25的2條探針序列(SEQ ID NO :24-SEQID NO :25)選自葡萄牙假絲酵母的18S-28S間區基因序列，編號NO. 26-N0. 28 的3條探針序列(SEQ ID NO :26-SEQ ID NO :28)選自新生隱球菌的18S-28S間區基因序 列，編號NO. 29-N0. 35的7條探針序列(SEQ IDNO :29_SEQ ID NO :35)選自光滑假絲酵母 的18S-28S間區基因序列，編號NO. 36-N0. 38的3條探針序列(SEQ ID NO :36_SEQ ID NO 38)選自白色念珠菌的18S-28S間區基因序列。表1 本發明基因芯片上選用的寡核苷酸探針序列及可檢測出的致病菌
權利要求
一種檢測侵襲性真菌致病菌的基因芯片，包括固相載體和固定在該固相載體上的寡聚核苷酸探針，其特征在于該寡聚核苷酸探針包含從以下序列中選取的一種或多種序列a.從白色念珠菌、近平滑假絲酵母、熱帶假絲酵母、乳酒假絲酵母、克魯斯假絲酵母、葡萄牙假絲酵母、光滑假絲酵母、季也蒙假絲酵母、新生隱球菌的rDNA的18S 5.8S或5.8S 28S內轉錄間區、5.8S rDNA選取的一種或多種DNA序列；b.所述a中選取的DNA序列的互補DNA序列；c.a或b中所述的DNA序列的互補RNA序列。
2.根據權利要求1所述的基因芯片，其特征在于所述a中從白色念珠菌、近平滑假絲 酵母、熱帶假絲酵母、乳酒假絲酵母、克魯斯假絲酵母、葡萄牙假絲酵母、光滑假絲酵母、季 也蒙假絲酵母、新生隱球菌的rDNA的18S-5. 8S或5. 8S-28S內轉錄間區、5. 8S rDNA選取的 DNA片段具有SEQID NO :3_38、除去其中的5、16的核苷酸序列中的一種或多種。
3.根據權利要求1或2所述的基因芯片，其特征在于還包含陽性對照探針、陰性探針和 熒光探針。
4.根據權利要求3所述的基因芯片，其特征在于所述陽性對照探針選自所述白色念珠 菌、近平滑假絲酵母、熱帶假絲酵母、乳酒假絲酵母、克魯斯假絲酵母、葡萄牙假絲酵母、光 滑假絲酵母、季也蒙假絲酵母、新生隱球菌的5. 8S rDNA序列。
5.根據權利要求4所述的基因芯片，其特征在于所述陽性對照探針具有SEQID NO 16 所示的核苷酸序列。
6.權利要求1所述的基因芯片在檢測白色念珠菌、近平滑假絲酵母、熱帶假絲酵母、乳 酒假絲酵母、克魯斯假絲酵母、葡萄牙假絲酵母、光滑假絲酵母、季也蒙假絲酵母或新生隱 球菌中的應用。
7.—種檢測侵襲性真菌的試劑盒，其特征在于包含權利要求1所述的基因芯片。
8.根據權利要求7所述的試劑盒，其特征在于所述基因芯片為權利要求2所述的基因-H-· I I心片。
9.權利要求7或8所述的試劑盒在檢測白色念珠菌、近平滑假絲酵母、熱帶假絲酵母、 乳酒假絲酵母、克魯斯假絲酵母、葡萄牙假絲酵母、光滑假絲酵母、季也蒙假絲酵母或新生 隱球菌中的應用。
全文摘要
本發明提供一種檢測侵襲性致病真菌的基因芯片和試劑盒，其中基因芯片包括固相載體和固定在該固相載體上的寡聚核苷酸探針，上述探針包含從白色念珠菌、近平滑假絲酵母、熱帶假絲酵母、乳酒假絲酵母、克魯斯假絲酵母、葡萄牙假絲酵母、光滑假絲酵母、季也蒙假絲酵母、新生隱球菌的rDNA的18S-5.8S或5.8S-28S內轉錄間區(ITS)以及從上述九種真菌的5.8S rDNA中選取的DNA序列。利用本發明的基因芯片和試劑盒檢測九種常見致病菌，操作簡便，準確性高，重復性強。
文檔編號C40B40/06GK101967507SQ20091015207
公開日2011年2月9日 申請日期2009年7月28日 優先權日2009年7月28日
發明者馮露, 喻群芳, 曹勃陽, 楊磊, 王磊 申請人:天津生物芯片技術有限責任公司