專利名稱：：RecQL4基因高表達作為新型的靶點在制備抗腫瘤藥物中的應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種RecQL4(DNA雙鏈解旋酶)基因高表達作為新型的靶點在制備抗腫瘤藥物中的應用，屬于基因新用途
技術領域：
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背景技術：
：RecQL4是RecQ解旋酶家族中的一員。它是由Kitao等人在1998年克隆并以大腸桿菌(E.Coli)RecQ蛋白來命名的(見Genomics,1998，CloningoftwonewhumanhelicasegenesoftheRecQfamily:Biologicalsignificanceofmultiplespeciesinhighereukaryotes，54，443-452)。其主要功能是打開DNA雙螺旋結構用于脂A轉錄、復制以及損傷修復(見GeneticsinMedicine,2006，TheversatileRecQL4，8(4):213-216)，因此，RecQL4對于維持基因組的穩定性是非常重要的。而基因的不穩定性在腫瘤發生及發展中起重要作用。RecQL4功能缺失可弓I起人類基因組不穩定性疾病Rothmund-Thomson綜合癥(RTS)，表現為皮膚紅斑、骨骼異常、早衰和腫瘤特別是骨肉瘤高發(見J.Natl.CancerInst"2003,AssociationbetweenosteosarcomaanddeleteriousmutationsintheRecQL4geneinRothmund-Thomsonsyndrom,95:669-674)。除了RTS，RecQL4功能缺失也與RAPADILIN0和BALLER-GER0LD綜合癥相關(見HumMol.Genet.，2003,MoleculardefectofRAPADILINOsyndromeexpandsthephenotypespectrumofRecQLdiseases,12:2837-2844禾口J.Med.Genet.,2006,Revisitingthecraniosynostosis-radialrayhypoplasiaassociation:Baller-GeroldsymdromcausedbymutationsintheRecQL4gene,43:148-152)。這三種臨床疾病癥候群的共同特征是個矮和骨髂異常，然而腫瘤高發只存在于RTS及RAPADILINO疾病癥候群(見HumGenet.,2008,SensitivityofRecQL4-deficientfibroblastsfromRothmund-Thomsonsyndromepatientstogenotoxicagents,123:643-653)。使用RecQL4基因敲除小鼠模型進一步證實了在人類中的發現。小鼠在RecQL4基因功能缺失之后，表現為生長遲緩、早死、以及其它的類似于人類Rothmund-Thomson綜合癥的缺陷(見HumMolGenet.,2003，GrowthretardationandskinabnomalitiesoftheRECQL4-deficientmouse,12:2293-2299和HumMolGenet，2005，Defectivesister-chromatidcohesion,aneuploidyandcancerpredispositioninamousemodeloftypeIIRothmund-Thomsonsyndrome,14:813-825)。所有這些石開究都是關于RecQL4基因表達缺失與疾病發生發展的關系，而關于RecQL4高表達(over-expression)與人類腫瘤的關系目前在國內外還沒有任何報道。關于RecQL4的堿基序列、制備方法及鑒定方法如下1、RecQL4的堿基序列堿基序列美國國立衛生院癌癥研究所基因序列號麗—004260;網址http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez"db二nuccore。2、RecQL4的制備方法全長RecQL4基因序列合成利用胍類裂解試劑提取人類組織或細胞的核酸RNA，然后利用反轉錄酶將RNA反轉錄成模板cDNA。同時根據RecQL4基因的兩端序列合成一對引物[引物1:gcaagcgcggaggccgggcgggcgcgcgcgccatggagcggctg(位置1-44);弓I物2為反義序歹U:tattctgcattttggagcctcctcgttc(位置3753-3780)]。然后使用這對引物和前面合成的模板cDNA在PCR儀器上進行聚合酶鏈式反應。反應產物可以通過瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。3、RecQL4的鑒定方法(1)RecQL4全長基因序列鑒定可以使用聚合酶鏈式反應產物在測序儀上直接進行測序。其結果可與美國國立衛生院癌癥研究所網址所公布的序列進行比較。即可確知所制備的RecQL4基因產物是否正確。(2)腫瘤細胞RecQL4信息RNA(mRNA)水平鑒定(用定量的Real-TimeRT-PCR方法)利用胍類裂解試劑提取腫瘤細胞的核酸RNA，然后利用反轉錄酶將RNA反轉錄成模板cDNA。然后利用Real-TimeRT-PCR方法對RecQL4mRNA水平進行定量分析。(3)腫瘤細胞RecQL4蛋白水平鑒定(WesternBlot):將獲取的人類組織或細胞在裂解緩沖液中進行勻槳，離心，獲取蛋白上清。然后通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進行蛋白分離。分離之后再轉移到硝酸纖維素膜，并與RecQL4抗體(已經商業銷售)進行孵育。然后再與RecQL4抗體相匹配的第二類抗體進行孵育，并用化學發光方法檢測RecQL4在人類組織或細胞中的蛋白表達水平。
發明內容本發明所要解決的技術問題是提供一種RecQL4基因高表達作為新型的靶點在制備抗腫瘤藥物中的應用。本發明解決其技術問題所采用的技術方案本發明涉及RecQL4基因高表達作為新型的靶點在制備抗腫瘤藥物中的應用，其特征在于將RecQL4基因高表達作為一種新的耙點來篩選新型的抗腫瘤藥物，即特異的RecQL4基因高表達抑制劑。所述的特異的RecQL4基因高表達抑制劑的第一種篩選方法如下根據RecQL4蛋白ATP結合區三維結構圖，通過計算機分析軟件高通量地篩選小分子化合物文庫以確定哪些化合物能全部或部分地結合到ATP活性位點，即找到ATP結合位點的拮抗劑；在篩選過程中，化合物和ATP結合位點相配合的質量通過形狀匹配或相互作用來判斷；一旦篩選到合適的小分子化合物，將通過化學的方法來合成它們，同時利用生物學的方法來檢測它們對RecQL4酶活性的特異抑制。所述特異的RecQL4基因高表達抑制劑的第二種篩選方法如下因為RecQL4蛋白N-末端的磷酸化對于DNA復制的起始是必須的；因此將根據RecQL4蛋白N-末端磷酸化位點的三維結構圖來篩選這一磷酸化過程的特異阻斷劑，這樣通過阻斷RecQL4蛋白磷酸化修飾而達到抑制DNA復制和腫瘤細胞生長的目的；這一抑制劑的篩選將利用RecQL4蛋白三維結構圖和計算機分析軟件高通量地篩選化合物文庫而最終找到RecQL4蛋白N-末端磷酸化修飾的特異拮抗劑。所述特異的RecQL4基因高表達抑制劑的第三種篩選方法如下以蛋白結構類似集群結合自然化合物引導的化合物文庫建立的方法，此法是利用不同類型蛋白盡管其基因序列沒有明顯同源性，但其功能保守區蛋白三維結構都是類似的；這樣只要發現一種自然化合物對集群蛋白中的一個成員具有明顯抑制作用，那么就依據這一化合物作為引導結構，通過化學合成的方法來組建化合物文庫，經篩選后最終找到特異的化合物抑制劑；通過計算機軟件分析，解旋酶RecQL4和真核細胞DNA轉錄起始因子elF4A以及切除核酸酶亞單位B被歸類6為蛋白結構類似集群，由于從珊瑚中提取的自然化合物Hi卯uristanol已經被證實為elF4A的小分子抑制劑，因此將Hippuristanol作為導引結構來合成一系列的衍生化合物，從而形成自己的化合物文庫，然后使用生物化學的方法逐一檢測它們對RecQL4酶活性的抑制，只要化合物的IG。《10uM就被認為中標。本發明的理論根據如下本發明是基于發現了RecQL4基因的新功能，這一新功能是RecQL4基因在人類腫瘤中的高表達可促進人類腫瘤的形成，并利用這一新功能而作出的用途發明。RecQL4基因的這一新功能從以下四個方面得到實驗證實(1)RecQL4蛋白水平在人乳腺上皮和前列腺上皮永生化細胞株中是增高的體細胞永生化即細胞獲得無限增殖的能力是細胞癌變的前期階段。經過對4例乳腺永生化細胞株(MCF-IOF、HMEC-hTl、HMEC-hT2和HMEC-hT3)及2例前列腺永生化細胞株(RWEP1和PEHC-hT)的分析，發現所有6例細胞株盡管無致瘤性，但其RecQL4蛋白水平明顯高于相對應的正常乳腺上皮細胞(HMEC)及前列腺上皮細胞(PHEC)，經定量分析，平均增高2.4-9.7倍。因此，在細胞癌變早期階段，RecQL4水平是增高的(見圖1)。(2)RecQL4在大多數(4/6)體外培養的人乳腺癌腫瘤細胞株中也是增高的利用WesternBlot技術，以正常人類乳腺上皮細胞為參照，對RecQL4在體外培養的乳腺癌細胞株中的蛋白表達水平進行了檢測。總共檢測了6例乳腺癌細胞株，其中4例包括MCF-7、MDA-MB-361、MM-MB-436和MDA-MB453，其RecQL4蛋白表達水平比正常乳腺上皮細胞(HMEC)增高3.4-14.2倍(見圖2)，因此，RecQL4在大多數的乳腺癌細胞株中也是高表達的。(3)乳腺腫瘤細胞在其RecQL4表達水平受到抑制后可明顯降低它在裸鼠中的腫瘤生長速度為了確定是否RecQL4高表達參與腫瘤細胞形成過程，申請人選擇一例腫瘤細胞株MDA-MB453，通過反義RNA技術抑制RecQL4在其內的表達水平。實驗流程如下首先根據RecQL4mRNA序列設計一段含有21堿基序列的發夾式結構。通過DNA合成儀進行合成后，連接到表達載體(Vector)中.然后將載有RecQL4寡核苷酸序列的載體導入MDA-MB453腫瘤細胞中。因為載體本身含有抗生素篩選基因，因此，有載體表達的細胞就會在抗生素的篩選下存活下來，并形成細胞克隆，然后使用克隆環將每個細胞克隆分離出來，并擴增形成克隆細胞株。最后，通過Westernblot技術對所有的克隆細胞株進行鑒定，結果有兩株克隆細胞(MB453-ShRNAl和MB453-ShRNA2)其RecQL4蛋白水平受到了明顯的抑制，而MDA-MB453和只導入空白載體(不含RecQL4寡核苷酸序列)的MDA-MB453-Vector細胞仍表達高水平的RecQL4蛋白(見圖3)。然后將這4種細胞株(MDA-MB453、MDA-MB453-vector、MB453-ShRNAl和MB453-ShRNA2)分別注射到裸鼠的皮下，每株細胞共注射5個點即5只裸鼠，每只裸鼠注射一個點，每點注射5X106細胞，然后觀察腫瘤的生長情況。結果證實在第四周時，100%(5/5)的裸鼠在注射了MDA-MB453或是MDA-MB453-vector腫瘤細胞后都形成了持續生長的腫瘤結節，其腫瘤體積平均為240.5-272.8mm3。而與此相對比，盡管80%(4/5)裸鼠在注射了MB453-ShRNAl細胞，以及100%(5/5)的裸鼠在注射了MB453-ShRNA2細胞后也形成了腫瘤結節，但其平均體積只有19.7-37.6mm3，經統計學分析，其體積明顯小于由MDA-MB453和MDA-MB453-vector腫瘤細胞形成的腫瘤體積(P〈0.01)。因此，MDA-MB453腫瘤細胞在其RecQL4蛋白水平受到抑制后可明顯減緩和抑制其在裸鼠中的腫瘤生長速度(見附表1及圖4)。(4)RecQL4mRNA水平在88.4%乳腺癌組織中超過正常組織3倍以上，特別是在轉移癌中，其水平超過正常組織46倍以上為了確定RecQL4在人類乳腺腫瘤中的表達水平，申請人利用定量Real-TimeRT-PCR方法對5例正常乳腺組織以及43例乳腺癌標本中的RecQL4mRNA水平進行了定量檢測。從臨床病理分級來分，43例乳腺癌中包括11例I級，14例IIA-IIB，14例IIIA-IIIB和4例轉移癌(IV級)。結果證實(a)有88.4%(38/43)的乳腺癌組織其RecQL4mRNA水平超過正常組織3倍以上；(b)從病理分級上來分，72.7%(8/11)1級、92,9%(13/14)工IA-IIB級、92.9%(13/14)IIIA-niB級和100%(4/4)IV級其RecQL4mRNA水平增高3倍以上，因此，隨著腫瘤惡性程度的升高，有更高比例的腫瘤組織發生RecQL4的高表達；(c)從增高程度上，I級平均增高7.5倍，IIA-IIB級平均增高16.65倍，IIIA-IIIB級平均增高13.14倍，轉移癌(IV級)平均增高62.5倍。因此在轉移性乳腺癌中，RecQL4mRNA水平是超乎異常地增高的(見圖5)。本發明的有益效果是RecQL基因高表達提供了一個非常有價值而且在藥理上非常有前途的抗腫瘤靶位點，為研制新的抗腫瘤藥物開拓了新思路，并且開創了抗腫瘤藥物的新領域。圖1-1為RecQL4在人乳腺和前列腺上皮永生化細胞株中蛋白表達水平的實驗結果。圖1-2為圖1-1中RecQL4蛋白表達水平的定量結果。圖2-1為RecQL4在人類乳腺癌細胞株中蛋白表達水平的實驗結果。.圖2-2為圖2-1中RecQL4蛋白表達水平的定量結果。圖3為反義寡核苷酸(ShRNA)介導的RecQL4在人乳腺腫瘤細胞中受到抑制的實驗結果。圖4為MDA-MB453腫瘤細胞在其RecQL4水平受到抑制后其腫瘤生長速度明顯降低的實驗結果。圖5為88.4%(38/45)的人乳腺癌標本其RecQL4m廳水平超過正常組織3倍以上的實驗結果。在圖1中，Y1為增加的倍數;HMEC為正常乳腺上皮細胞；MCF-10F為自發永生化的人乳腺上皮細胞；HMEC-hTl、HMEOhT2和HMEC-hT3為端粒酶高表達介導的永生化人乳腺上皮細胞；PHEC為正常人前列腺上皮細胞；RWEP1為病毒SV40-largeT抗原介導的人前列腺永生化上皮細胞株；PHEC-hT為端粒酶高表達介導的人前列腺永生化上皮細胞。圖1是利用Westernblot的方法，分別提取每株細胞的蛋白上清，經變性聚丙烯酰胺電泳分離之后，轉移到硝酸纖維素膜，然后與抗RecQL4—抗孵育，再與相匹配的二抗孵育后，用化學發光的方法來觀察RecQL4蛋白條帶的強弱。卩-actin水平被用來標定每株細胞的蛋白加樣量。在圖2中，Y2為增加的倍數；麗EC為正常人乳腺上皮細胞；MCF-10F為自發轉化而且無致瘤性的人乳腺永生化上皮細胞；MCF-7、MDA-MB231、MDA-MB361、MDA_MB436、MDA-MB453和MDA-MB468為體外培養的人乳腺癌上皮細胞株。圖2是分別提取每株細胞的蛋白上清，然后利用Westernblot的方法對RecQL4的水平進行檢測和定在圖3中，MDA-MB453為乳腺癌上皮細胞株；MB453-vector為只轉染空載體的MDA-MB453乳腺癌上皮細胞；MB453-ShRNAl和MB453-sh-RNA2為MDA-MB453乳腺癌細胞在轉染反義寡核苷酸后分離到的兩個克隆細胞株，它們的RecQL4表達水平都受到了明顯的抑制。圖4是將MDA-MB453、MB453-vector、MB453-ShRNAl和MB453-ShRNA2分別注射到裸鼠的皮下。裸鼠是具有免疫缺陷的種系，專門用于檢測人類腫瘤細胞的致瘤性。在注射上述細胞之后，分別觀察它們的腫瘤生長速度，并用電子刻度尺來測量腫瘤的直徑。腫瘤的體積用下列公式來計算腫瘤體積=(最長直徑_最短直徑2)X0.5。圖5是利用定量的Real-TimeRT-PCR方法來測定RecQL4在人類乳腺癌標本中的mRNA表達水平，結果證實與正常人乳腺組織相比，43例腫瘤標本中有38例顯示RecQL4mRNA水平超過正常組織三倍以上。如果按臨床病理分級來區分，72.7%(8/11)I級、92.9%(13/14)工工A-IIB級、92.9%(13/14)IIIA-IIIB級和100%(4/4)IV級(轉移癌)其RecQL4mRNA水平增高3倍以上，因此，隨著腫瘤惡性程度的升高，有更高比例的腫瘤會發生RecQL4的高表達。如果從增高程度上來區分，轉移瘤其RecQL4mRNA水平比正常組織超出至少46倍以上，因此，在轉移瘤當中，RecQL4mRNA水平是異常增高的。在圖5中，病理分級"0"代表正常人乳腺上皮組織。具體實施例方式下述實施例的理論根據如下人類腫瘤發生發展是一個多歩驟過程，大致分為起始、促進和進展三個階段，在此過程中，上皮細胞要經過一系列的惡前表型的改變直到形成有浸潤能力的腫瘤細胞。正常體細胞的分裂增殖是有限的，即經過一定次數的分裂增殖以后會老化死亡。因此，潛在的腫瘤細胞必須首先克服細胞老化控制機制而獲得無限增殖能力，也可以說細胞永生化即細胞獲得無限增殖的能力是腫瘤細胞形成的先決條件。同時，腫瘤轉移和復發是造成腫瘤病人死亡的主要原因之一，然而臨床上還缺少更為有效或新的治療戰略來預防或降低腫瘤轉移所引起的癌癥病人的高死亡率。盡管以前的研究結果證實了RecQL4功能缺失與人類早衰和骨肉瘤高發相關，但是，RecQL4高表達與人類腫瘤發生的關系目前還沒有任何報道，因此，RecQL4高表達提供了一個非常有價值而且在藥理上非常有前途的抗腫瘤靶位點，依據如下(1)RecQL4蛋白水平在所有檢測的永生化細胞株中都是高表達的，而細胞永生化是癌癥發展過程中的早期階段；(2)多數體外培養的乳腺癌腫瘤細胞株其RecQL4蛋白水平與正常相比也是異常增高的；(3)在乳腺癌腫瘤細胞中，通過RecQL4表達的下調將能抑制其腫瘤生長的速度；(4)在43例臨床乳腺癌標本中，88.4%(38/43)的乳腺癌標本其RecQL4mRNA水平超過正常組織3倍以上，特別是在4例轉移癌中，RecQL4mRNA水平增高至少46倍以上。因此，異常增高的RecQL4水平與腫瘤轉移相關。因此，RecQL4高表達可作為一種新的耙位點來篩選新型的抗腫瘤藥物，即特異的RecQL4高表達抑制劑。實施例1:DNA代謝過程中的一個共同特征是通過DNA解旋酶(Helicase)來打開互補的DNA雙螺旋結構。所有的解旋酶家族成員都擁有一個非常保守的ATP結合功能區，解旋酶就利用水解ATP而獲得的能量在基因重組、轉錄、DNA復制及修復中起重要作用，因此，有效且特異的針對RecQL4蛋白ATP結合位點的抑制劑就會成為潛在的有臨床抗腫瘤作用的候選者。隨著靶蛋白三維晶體結構的完成以及計算機新技術手段的發展，基于蛋白結構以及計算機分析軟件輔助的新藥設計已經成為當今尋找新的導引結構藥的重要手段。RecQL4蛋白保守的ATP結合功能區的三維晶體結構已經完成，其結構圖可在如下網站獲取ProteinDataBank(PDBID:IOYW)，http://www.rcsb.org(見EMBOJ,2003,StructureoftheRecQCatalyticcore,22:4910-4921)。然后，根據RecQL4的三維結構圖，通過計算機分析軟件高通量地篩選化合物小分子文庫以確定哪些化合物能全部或部分地結合到ATP活性位點，即找到ATP結合位點的拮抗劑；在篩選過程中，化合物和ATP結合位點相配合的質量通過形狀匹配或相互作用能量來判斷(見Proteins,2004,Adetailedcomparisonofcurrentdockingandscoringmethodsonsystemsofpharmaceuticalrelevance,56(2):235-49禾口liProtein:Structure,Function,andGenetics,1990,Automateddockingofsubstratestoproteinsbysimulatedannealing,8:195-202);—旦f帝選至廿合適的小分子化合物，即可通過化學的方法來合成它們，同時利用生物學的方法來檢測它們對RecQL4ATP酶活性的特異抑制；只要化合物的IC5。《10uM就可以被認為中標(hits)。IC5。(InhibitoryConcentration)是指當50%的RecQL4酶活性受到抑制時所需的化合物濃度。實施例2:目前實驗結果證實RecQL4蛋白的N-末端與酵母Sld2/Drcl蛋白序列同源，它可以被細胞周期蛋白依賴的激酶磷酸化，而且這一修飾過程對于DNA復制過程的起始是必須的(見MolCellBiol.，2006,TheN-terminalnoncatalyticregionofXenopusRecQL4.isrequiredforchromatinbindingofDNApolymerasealphaintheinitiationofDNAreplication,26:4843-4852禾口CurrentBiol.,2002，CDKphosphorylationofDrclregulatesDNAreplicationinfissionyeast,12:599-605禾口Nature,2007,2007，PhosphorylationofSld2andSld3bycyclin-dependentkinasespromotesDNAreplicationinbuddingyeast,445:281-285)。因此，只要篩選到這一磷酸化過程的特異阻斷劑，那么就將通過阻斷RecQL4蛋白N-末端的磷酸化修飾而達到抑制DNA復制的目的，DNA復制受到抑制后，相應的腫瘤細胞的生長也會受到抑制。同樣的，此種特異抑制劑的尋找也可以通過RecQL4蛋白三維結構結合計算機分析軟件的戰略來完成。盡管RecQL4全長蛋白的三維結構圖還未完成，但基于同一家族蛋白一RecQLl的三維晶體結構(PDBID:2vlx)和蛋白結構分析軟件(見Bioinformatics,2002,ESyPred3D:Predictionofproteins3Dstructures,18(9):1250-1256),將通過計算機分析軟件來模擬RecQL4蛋白的三維結構，根據這一結構和實施例1中描述的方法來高通量地篩選化合物小分子文庫以確定哪些化學物能全部或部分地結合到RecQL4的磷酸化位點，即找到RecQL4磷酸化位點的拮抗劑。因此，RecQL4ATP結合位點以及N-末端磷酸化位點的特異抑制劑都可以通過蛋白結構結合計算機分析軟件輔助的高通量篩選戰略來實現。實施例3:第三種尋找特異的化合物抑制劑的戰略是以蛋白結構類似集群(Proteinstructuresililarityclustering,PSSC)結合自然化合物引導的化合物文庫建立的方法(見DrugDiscovToday,2005，Proteinstructuresimilarityclusteringandnaturalproductstructureasguidingpronciplesindrugdiscovery,10(7):471-83)，此法是利用不同類型蛋白盡管其基因序列沒有明顯的同源性，但其功能保守區蛋白三維結構卻是非常的類似；這樣只要發現一種自然化合物對集群蛋白中的一個成員具有明顯抑制作用，那么就能依據這一化合物作為導引結構，通過化學合成的方法來組建化合物文庫，經篩選后最終找到特異的化合物抑制劑；應用這一戰略，RecQL4蛋白結構類似集群可通過Dali資料庫來搜尋分析(網站http:〃www.ebi.ac.uk/dali，見NucleicAcidsRes.，1997,Dali/FSSPclassificationofthree-dimensionalproteinfolds,25:231-234)，結果發現，解旋酶RecQL4、真核細胞DNA轉錄起始因子elF4A以及切除核酸酶亞單位B(EXCINUCLEASEABCSUBUNITB)盡管它們的基因序列同源性非常低，但它們保守的催化功能區的空間結構卻非常類似；如果并列比較它們的三維結構，其RMSD(RootMeanSquareDeviation)值在大約3-4A之間。RMSD是指兩種蛋白結構在并列放置時的Ca位置，通常被用來比較兩種不同蛋白的結構類似性。因此，解旋酶RecQL4、真核細胞DNA轉錄起始因子elF4A以及切除核酸酶亞單位B可以被歸為蛋白結構類似集群(PSSC)。Hippuristanol已經被證實是elF4A的小分子抑制劑(見PLoSONE，2008,SelectivepharmacologicaltargetingofaDEADboxRNAhelicase，3(2):e1583)，它是從珊瑚中提取的自然化合物，因此，將Hippuristanol用作導引結構來合成一系列的衍生化合物，從而形成自己的化合物文庫；然后使用生物化學的方法逐一檢測它們對RecQL4蛋白N-末端磷酸化修飾的抑制；自然化合物是理想的導引結構，原因是這些自然化學結構是經過自然界長期進化篩選過的而且在生物學上與蛋白質保守功能區有很強親和力的基本化學支架結構。因此，以這些導引結構為基礎來設計和合成一系列針對蛋白功能保守區的衍生化合物可大大提高中標(Hits)的幾率。附表l:乳腺腫瘤細胞MDA-MB453在RecQL4受抑制后的腫瘤生長情況細胞類型裸鼠腫瘤形成率平均腫瘤體積(mm3)13<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>在附表中，*代表？<0.01，t檢驗方法。權利要求1、RecQL4基因高表達作為新型的靶點在制備抗腫瘤藥物中的應用，其特征在于將RecQL4基因高表達作為一種新的靶點來篩選新型的抗腫瘤藥物，即特異的RecQL4基因高表達抑制劑。2、根據權利要求1所述的RecQL4基因高表達作為新型的耙點在制備抗腫瘤藥物中的應用，其特征在于所述特異的RecQL4基因高表達抑制劑的篩選方法如下根據RecQL4蛋白的三維結構圖，通過計算機分析軟件高通量地篩選化合物小分子庫以確定哪些化合物能全部或部分地結合到ATP活性位點，即找到ATP結合位點的拮抗劑；在篩選過程中，化合物和ATP結合位點相配合的質量將通過形狀匹配或相互作用能量來判斷；一旦篩選到合適的小分子化合物，即通過化學的方法來合成它們，同時利用生物學的方法來檢測它們對RecQL4酶活性的特異抑制，只要化合物的ICs。《10uM就被認為中標。3、根據權利要求1所述的RecQL4基因高表達作為新型的耙點在制備抗腫瘤藥物中的應用，其特征在于所述特異的RecQL4基因高表達抑制劑的篩選方法如下因為RecQL4蛋白N-末端的磷酸化對于DNA復制的起始是必須的；因此將根據RecQL4蛋白N-末端磷酸化位點的三維結構圖來篩選這一磷酸化過程的特異阻斷劑，這樣通過阻斷RecQL4蛋白磷酸化修飾而達到抑制DNA復制和腫瘤細胞生長的目的；這一抑制劑的篩選將利用RecQL4蛋白三維結構圖和計算機分析軟件高通量地篩選化合物文庫而最終找到RecQL4蛋白N-末端磷酸化修飾的特異拮抗劑。4、根據權利要求1所述的RecQL4基因高表達作為新型的靶點在制備抗腫瘤藥物中的應用，其特征在于所述特異的RecQL4基因高表達抑制劑的篩選方法如下以蛋白結構類似集群結合自然化合物引導的化合物文庫建立的方法，此法是利用不同類型蛋白盡管其基因序列沒有明顯同源性，但其功能保守區蛋白三維結構都是類似的；這樣只要發現一種自然化合物對集群蛋白中的一個成員具有明顯抑制作用，那么就依據這一化合物作為引導結構，通過化學合成的方法來組建化合物文庫，經篩選后最終找到特異的化合物抑制劑；通過計算機軟件分析，解旋酶RecQL4和真核細胞DNA轉錄起始因子elF4A以及切除核酸酶亞單位B被歸類為同一蛋白結構類似集群，由于從珊瑚中提取的自然化合物Hippuristanol已經被證實是elF4A的小分子抑制劑，因此將Hippuristanol作為導引結構來合成一系列的衍生化合物，從而形成自己的化合物文庫，然后使用生物化學的方法逐一檢測它們對RecQL4酶活性的特異抑制，只要化合物的IC5。《10uM就被認為中標。全文摘要本發明涉及一種RecQL4基因高表達作為新型的靶點在制備抗腫瘤藥物中的應用，其特征在于將RecQL4基因高表達作為一種新的靶點來篩選新型的抗腫瘤藥物，即特異的RecQL4基因高表達抑制劑。本發明的有益效果是RecQL高表達提供了一個非常有價值而且在藥理上非常有前途的抗腫瘤靶位點，為研制新的抗腫瘤藥物開拓了新思路，并且開創了抗腫瘤藥物的新領域。文檔編號C40B30/04GK101476163SQ20091007373公開日2009年7月8日申請日期2009年2月3日優先權日2009年2月3日發明者趙永良申請人:趙永良