專利名稱：一種有機物雌激素受體激動和拮抗作用的識別方法
技術領域：
本發明涉及環境可疑內分泌干擾物生物活性的判別預測方法，具體說是基于
雌激素受體(estrogen rec印tor， ER) H12螺旋構象的變化來識別有機物雌激 素受體激動和拮抗作用的方法。
背景技術：
近年來，多種天然的和人工合成的化學物質因為能夠模擬或抑制體內激素的 作用對人類及其他物種產生嚴重危害而受到廣泛關注。1960s，雷切爾.卡遜在《寂
靜的春天》 一書中提到一些環境化學物質能夠干擾內分泌系統；三十年后，有研
究發現，歐美國家成年男子的精子數和精液量大約減少了一半，生殖系統發育異 常和生殖力降低等現象相應增加，經過分析得出造成這主要是由環境內分泌干擾 物特別是環境雌激素等外源性物質影響并損害生物體內分泌系統的結果
(Carlsen E， Giwercman A， Keiding N, et al. Evidence for decreasing quality of semen during past 50 years. Br Med J， 1992, 305: 609-613.)。目前，環境污染 物質對生物內分泌系統的影響和損害己經成為科學家們新的研究熱點。環境雌激 素(environmental estrogens,或environmental hormones)是內分泌干f尤物 中較為重要的一種，它們是通過與雌激素受體結合或影響細胞信號途徑等其它方 式模擬或部分模仿雌激素，發揮類似雌激素效應的化合物。其中，環境污染物以 與內源性雌激素類似的形式與雌激素受體結合，使受體的構象發生改變，形成配 體-受體復合物，復合物再結合到細胞核內DNA結合域的雌激素響應元素(ERE) 上，誘導或抑制有關調節細胞生長和發育的靶基因的轉錄，從而對一系列雌激素 依賴性生理生化過程造成影響，產生各種環境擬/抗激素效應的受體介導模式尤 其受到關注。
ER受體與配體結合后，自身構型會受配體的影響發生變化而產生改變。配 體與ER結合，可以表現為雌激素激動劑和(或)拮抗劑的作用。通過受體介導 途徑產生效應的環境雌激素雖均能與雌激素受體結合，但是在不同生物體組織和 器官內表現出不同的激動或拮抗的作用，不同污染物所表現的ER激動劑效應或 (和)拮抗劑作用都與ER高親和力的相互作用有關，但其表現出的生物效應卻 完全不同。環境中具有擬/抗雌激素效應的有機污染物種類繁多，數目龐大，許 多在結構上與體內天然雌激素沒有相似性，而且每年都有大量新化學物產生。因 此，首先面對的挑戰是如何快速有效地判斷環境污染物是ER激動劑還是拮抗
劑，亦或是選擇性的激動劑(拮抗劑)，以識別其內分泌干擾作用的類型，以便 進一步闡明其作用機制，為風險管理工作提供科學依據。由于環境中污染物結構
各異且數目與日俱增，因財力、人力和時間所限，單純依賴實驗室工作來進行
ER激動劑/拮抗劑篩選顯然是不現實的，目前迫切需要發展非實驗性的環境雌激 素篩選評價方法，對于環境污染物的擬/抗雌激素效應首先進行快速甄別，在此 基礎上再進行精細測試和研究。基于分子模擬方法的結構活性相關(Structure Activity Relationship, SAR)技術可在環境雌激素結構與其ER激動/拮抗性之間 架起橋梁，使得解決這一難題成為可能(王連生，韓朔睽.有機污染物的定量結 構-活性相關.1993，北京中國環境科學出版社)。這一方法不受實驗條件和測 試儀器的限制，采用各種分子力學和數據挖掘技術來研究和預測化合物的生物活 性，因而在面對大批量化合物時具有尤為明顯的優勢。
隨著計算機科學和分子生物學的進步，在利用計算機輔助設計中，目前SAR 方法也從傳統的二維模型預測發展為可以根據化合物三維空間構象信息參數和 活性指標建立合適的三維SAR模型(3D-SAR)， P. SCHMIEDER等人(P. SCHMIEDER et al., A reactivity pattern for discrimination of ER agonism and antagonism based on 3-D molecular attributes, SAR and QSAR in Environmental Research, 2002 Vol. 13 (2)， pp. 353-364)通過構建化合物的三 維模型，考慮了化合物柔性的影響，用于區分ER可能的激動劑與拮抗劑，研究 表明與分子體積相關的參數，包括可接近表面和范德華表面的大小對區分ER激 動劑和拮抗劑具有明顯的效用。Minutolo等人(F. Minutolo， R. Bellini, et al.， Monoaryl-Substituted Salicylaldoximes as Ligands for Estrogen Receptor |3.丄 Med. Chem., 2008. 51(5): p. 1344-1351.)使用分子對接方法研究了單芳香基取 代的水楊醛肟類化合物與ERP的結合模式。表明中間苯環上的取代物會影響此 類化合物與ER(3的結合能力，其中含氯取代物同ERP具有較好的結合，并在體 內以激動相態存在。但是，這些方法均存在如下先驗的理論假設，即化合物的激 動/拮抗性僅取決于其與受體配體結合區(Ligand Binding Domain, LBD)活性 口袋的結合模式，若一批化合物激動/拮抗選擇性不僅受控于其與靶標點作用方
式，而且還取決于受體LBD構象改變，則所得SAR模型的穩健性和預測能力都 會受到較大影響。最初的研究(Katzenellenbogen, B.S.， Montano, M.M.， etal.， Antiestrogens: mechanisms and actions in target cells,丄Steroid Biochem. Mol. Biol. 1995,53,387-393.)表明，具有抗雌激素效應的化合物一般都具有較長的 尾鏈，這一尾鏈的存在會改變這些分子與雌激素受體活性口袋的結合方式。但是 Nettles等人(Nettles KW， Sun丄et al. ， Allosteric control of ligand selectivity between estrogen receptors a and p: implications for other nuclear receptors. Molecular Cell, 2004 13:317-327)的研究表明較小的分子也可能使得結構LBD 區域的構象發生改變，從而使其變為拮抗形態。可見，單純從活性口袋出發難以 區分有機物的激動/拮抗效應。
雌激素配體結合區中由12個a螺旋和一個連接的環狀結構構成的三層螺旋 形成了結合配體小分子的疏水口袋。化合物進入疏水口袋與受體結合后可誘導受 體構象變化，使受體C端的a螺旋(Helix12螺旋，H12) /AF2像一個蓋子折疊 在口袋的上方，關閉配體進出口袋的通道，穩定受體與配體的結合，同時在受體 中形成了一個新的能與蛋白質(如共激活因子或共抑制因子)相互作用的表面。以 前認為激動劑可以充滿活性口袋并誘導了單一的活性構象，但近來晶體結構研究 發現受體活性口袋存在多種活性構象，能夠以不同方式適應各種配體。核受體的 活性口袋結構會根據結合配體性質的不同而發生重排，引起口袋不同區域的尺寸 變化，配體結合區晶體結構顯示活性口袋可以擴張和縮小，如Skafar等的研究 表明雌激素受體F功能區能夠調節hERa配體轉錄激活活性，F區與H12連接， 具有高度的延展性，容易環繞在LBD表面，不同激動劑或拮抗劑結合會導致F 區及整個LBD區的構象變化(Skafar D.F.， Koide S,. Understanding the human estrogen receptor-alpha using targeted mutagenesis. Molecular 3nd Cellular Endocrinology, 2006, 246: 83-90.)。 H12決定著內部所結合配體的疏水表面尺
寸，對配體結合區的轉錄激活功能發揮具有非常重要的作用。大量的晶體結構數 據表明，碳端的H12構象的變化與配體-雌激素受體復合物可能產生的激動或拮 抗效應相關。H12螺旋的位置對污染物的激動劑/拮抗劑活性具有重要的識別作 用，污染物結合后引發H12構象變化的不同會導致不同的輔因子結合區暴露在 受體表面，從而與不同的輔因子結合，發揮其激動劑/拮抗劑活性，共激活因子 和共抑制因子在受體表面的結合區域有顯著交迭，這可能是部分選擇性激動劑/
拮抗劑既能與共激活因子結合又可以與共抑制因子結合的根本原因。已有的
SAR研究方法多是基于分子力學的分子對接，只能模擬EDs與激素受體口袋的 結合，因此無法判斷LBD 口袋以外H12螺旋位置對于污染物激動劑/拮抗劑活性 的識別作用。
另外，有機污染物與雌激素受體的結合是一個動態平衡過程，結合中伴隨著 污染物和受體大分子體系構象的改變(van Lipzig MMH, Ter Laak AM， et al., Prediction of ligand binding affinity and orientation of xenoestrogens to the estrogen receptor by molecular dynamics simulations and the linear interaction energy method. J Med Chem， 2004， 47:1018—1030)。同源模建和晶體衍射得到
的受體結構是靜態的，只能顯示某一瞬時的分子構象。而激素受體分子又有一定 的柔性，其構象會隨結合污染物的不同發生一定程度的變化，因此對相關結構的 分子動力學模擬在闡明伴隨配體結合的構象和動力學性質變化，區分污染物是具 有擬雌激素效應(即激動劑)、抗雌激素效應(即拮抗劑)將非常重要。通過比 較經分子動力學計算得到可能的環境內分泌干擾物與ER結合后H12螺旋位置 與典型的ER激動/拮抗劑H12螺旋位置，可以定性判別該污染物的激動/拮抗作 用。
文獻檢索結果表明，在本發明完成之前，還未發現基于分子動力學方法分析 ER的LBD結構中H12螺旋位置的變化對污染物擬/抗雌激素效應影響進行識別 的報道。
發明內容
1. 發明要解決的技術問題。
針對環境有機污染物擬/抗雌激素效應的快速確定對每一種化合物進行生物 化學和毒理實驗需要巨大的人力、物力、財力，目前已有的雌激素激動/拮抗劑 篩選和預測方法受限于對于雌激素受體本身構象動態信息的獲取和描述，對污染 物激動/拮抗效應的識別預測能力有限。本發明的目的是提供一種有機物雌激素 受體激動和拮抗作用的識別方法，基于分子動力學方法分析ER的LBD結構中 H12螺旋位置的變化，快速、簡便、經濟地識別污染物擬/抗雌激素效應。
2. 技術方案
本發明的原理是利用分子動力學手段，計算與分析有機物與雌激素受體結合
過程，基于配體結合方式和雌激素配體結合區構象的變化，特別是ER的LBD 結構中H12螺旋位置的變化，識別有機物是ER激動劑還是拮抗劑的一種方法。
采用的技術方案如下 一種有機物雌激素受體激動和拮抗作用的識別方法，其步驟包括-
(1) 根據已有雌激素受體與配體結合方式和其在體內發揮作用區別，從
蛋白質數據庫(PDB)庫中選擇包含與受測化合物結構類似的雌 激素受體晶體結構，作用位點的選擇采用SitelD (SYBYL7.3, Tripos Inc.)等分子模擬方法尋找受體大分子的活性口袋，并結合 晶體結構中配體分子的結合方式確定結合的活性口袋，選擇活性 殘基周圍一定范圍的殘基組成底物的結合口袋。在目前結晶的諸 多ER配體結合區結構中，許多結構由多條肽鏈組成，即部分氨 基酸殘基無法結晶出來，這些氨基酸殘基多處于二級結構銜接的 環區。但在隨后進行的研究中，要求整個受體結構由一條鏈組成， 不能存在斷裂，因而當選擇的受體晶體結構不完整，缺少部分氨
基酸信息時，使用同源模建等方法將這些區域補齊。
(2) 構建有機污染物分子的空間結構并進行構型和能量優化，采用分子
對接計算可疑環境內分泌污染物與雌激素受體活性口袋結合的作 用模式。具體地說構建有機物結構，使用Tripos力場對化合物 進行能量優化，選擇電荷選擇為Gasteiger-H(jckel電荷，能量收 斂標準為0.0"lkcal/mol，最大迭代次數設置為1000次。使用 Surflex分子對接方法將化合物與雌激素受體活性口袋進行分子 對接，參數選擇系統默認參數；
(3) 對構建好的雌激素受體-配體復合物進行分子動力學優化模擬。具體
地說，分子動力學模擬是在常溫常壓(NPT)下由AMBER程序 包完成的。使用AMBER的ff03力場參數描述體系的蛋白質分子， 使用GAFF力場描述配體分子。保留晶體結構中的水分子，并將 整個系統放入充滿TIP3P水分子模型的立方體的周期性盒子中， 蛋白質或復合物距離盒子的最短具體為10A，并根據需要加入必 要的Na+或Cr維持體系的電中性，使得體系中的個別水分子被 Na+或Cr離子所替換。使用Langevin恒溫器維持常溫為300K,
控制碰撞頻率為1.0PS—1，同時維持體系壓力為1個標準大氣壓，
對于所有涉及氫原子的鍵長使用SHAKE算法控制含氫鍵的運 動，截斷半徑設定為10A，動力學模擬時間步長為2.0fs，每1ps 保存一個構象。具體的模擬過程如下1.結構優化，運行500步 的最陡下降法(ste印est descent),然后使用共軛梯度法 (conjugate gradient)使得體系的能量收斂；2.升溫，在50ps 內，對受體蛋白的空間位置進行束縛，使得體系溫度上升到300K;
3. 溶劑體系平衡；同樣對受體蛋白的空間位置進行約束,進行50ps
的分子動力學模擬，使得模擬體系通過釋放過高能量而得到放松；
4. 分子動力學模擬不再進行位置約束，對體系進行2.0ns的分
子動力學模擬。對分子動力學模擬進行分析，根據勢能、動能、
總能量、溫度、壓力、體積、密度、RMSD等隨時間變化的曲線， 判斷整體結構是否達到平衡，平衡的標志是構象差異RMSD隨時 間變化不顯著。
(4)污染物擬/抗雌激素作用識別。分析動力學模擬獲得的蛋白質構象與 初始構象的區別，計算雌激素受體配體結合區H12螺旋附近的氨 基酸在動力學模擬過程中的RMSD值隨時間的變化，來獲得真實 環境中配體與雌激素配體結合區的結合模式。計算分子動力學模 擬前后的ER構象差異的RMSD值，比較經分子動力學計算得到 可能的環境內分泌干擾物與ER結合后H12螺旋位置與典型的 ER激動/拮抗劑H12螺旋位置，可以識別該污染物的激動/拮抗作 用。H12螺旋蓋在口袋上方，則識別為激動作用為主，H12的這 一精確位置在已知結構的LBD結合中高度保守，是轉錄激活的必 備條件。而在拮抗劑與ER的結合中，H12的這一位置被污染物 阻止，迫使H12移動，形成可阻止有轉錄能力的轉錄激活區2 (Activation Function 2， AF隱2)構象所致。 上述受體種類包括能夠介導生物體內雌激素響應的各種物種和亞型的雌激 素受體。根據已有雌激素受體實驗測定所使用受體的物種和亞型，從蛋白質數據 庫(PDB)中選擇與不同類型激動劑和拮抗劑結合的雌激素受體晶體結構建立 ER模型，作用位點的選擇是采用SitelD (SYBYL7.3， Tripos Inc.)等分子模擬
方法尋找受體大分子的活性口袋，選擇活性殘基周圍一定范圍內的殘基組成底物
結合口袋。在目前結晶的諸多ER配體結合區結構中，許多結構由多條肽鏈組成，
即部分氨基酸殘基無法結晶出來，這些氨基酸殘基多處于二級結構銜接的環區。 但在隨后進行的研究中，要求整個受體結構由一條鏈組成，不能存在斷裂，因而 當選擇的受體晶體結構不完整，缺少部分氨基酸信息時，使用同源模建等方法將 這些區域補齊。
上述有機物的能量優化使用Tripos力場，電荷選擇為Gasteiger-HGckel電 荷，能量收斂標準為0.05kcal/mol，最大迭代次數設置為1000次。使用Surflex
分子對接方法將化合物與雌激素受體活性口袋進行分子對接，參數選擇系統默認 參數。
上述分子動力學模擬是在常溫常壓(NPT)下由AMBER程序包完成的。使 用AMBER的ff03力場參數描述體系的蛋白質分子，使用GAFF力場描述配體 分子。保留晶體結構中的水分子，并將整個系統放入充滿TIP3P水分子模型的 立方體的周期性盒子中，蛋白質或復合物距離盒子的最短具體為10A，并根據需 要加入必要的Na+或Cr維持體系的電中性，使得體系中的個別水分子被Na+或 Cr離子所替換。使用Langevin恒溫器維持常溫為300K,控制碰撞頻率為1.0ps人 同時維持體系壓力為1個標準大氣壓，對于所有涉及氫原子的鍵長使用SHAKE 算法控制含氫鍵的運動，截斷半徑設定為10A，動力學模擬時間步長為2.0fs， 每1ps保存一個構象。具體的模擬過程如下1.結構優化，運行500步的最陡下 降法(steepest descent),然后使用共軛梯度法(conjugate gradient)使得體 系的能量收斂；2.升溫，在50ps內，對受體蛋白的空間位置進行約束，使得體 系溫度上升到300K; 3.溶劑體系平衡；同樣對受體蛋白的空間位置進行約束，
進行50PS的分子動力學模擬，使得模擬體系放松；4.分子動力學模擬不再進
行位置束縛，對體系進行2.0ns的分子動力學模擬。對分子動力學模擬進行分析， 根據勢能、動能、總能量、溫度、壓力、體積、密度、RMSD等隨時間變化的 曲線，判斷整體結構是否達到平衡，平衡的標志是構象差異RMSD隨時間變化 不顯著。
上述污染物擬/抗雌激素作用識別方法特征是分析動力學模擬獲得的蛋白 質構象與初始構象的區別，計算雌激素受體配體結合區H12螺旋附近的氨基酸 在動力學模擬過程中的RMSD值隨時間的變化，來獲得真實環境中配體與雌激
素配體結合區的結合模式。計算分子動力學模擬前后的ER構象差異的RMSD 值，比較經分子動力學計算得到可能的環境內分泌干擾物與ER結合后H12螺 旋位置與典型的ER激動/拮抗劑H12螺旋位置。H12螺旋蓋在口袋上方，則識 別為激動作用為主，H12的這一精確位置在己知結構的LBD結合中高度保守， 是轉錄激活的必備條件。而在拮抗劑與ER的結合中，H12的這一位置被污染物 阻止，迫使H12移動，形成可阻止有轉錄能力的轉錄激活區2構象所致。 3.有益成果
采用本發明方法可以真實的再現環境污染物與雌激素受體結合過程，基于分 子動力學模擬H12螺旋位置變化，從而有效識別有機物的擬/抗雌激素作用，方 法成本低廉簡便，能夠節省大量的人力物力財力，為大規模開展毒害化學品環境 安全性評價(REACH)進行提供相應的基礎工具與快捷途徑。
圖1為1ERE中具有晶體結構的序列同完整序列的比對；
圖2為來自與PDB庫的1ERE (左)與補齊后的1ERE結構(右)； 圖3為化合物17卩雌二醇(17p-Estradiol)分子動力學模擬過程的勢能圖4為己烯雌酚(Diethystilbestrol)，4-羥基他莫昔芬(4-OH-Tamoxifene，4-OHT)
經動力學優化后與ER的結合方式作用圖5為雌二醇，己烯雌酚，4-羥基他莫昔芬與染料木素間RMSD值在分子動力 學模擬過程中的變化示意具體實施例方式
以下通過實施例結合附圖進一步說明本發明
實施例1:
采用本發明方法處理雌激素受體缺失結構補齊問題。在分子動力學過程中，
需要保持整個蛋白質為一條單鏈，不能由多個肽段組成。但是實際中在PDB庫
中所能得到的蛋白質結構，常常會出現部分氨基酸殘缺，導致蛋白質鏈的斷裂， 采用同源模建差的方法補齊缺失結構。
采用人雌激素受體a亞型晶體結構(PDBID: 1ERE)作為初始結構。1ERE 的結構在H1-H2螺旋間的Loop區以及H9-H10螺旋間的Loop區均存在缺失，使得整個1ERE結構由三條不相連肽段組成。從PDB庫中獲得1ERE的晶體結 構及完整的一級序列，將具有晶體結構的序列同完整序列進行比對(圖1)，缺 失部分按loop區處理，利用同源模建法構建了 1ERE的完整序列(圖2)。
實施例2:
采用本發明方法處理復合物的分子動力學模擬。AMBER無法自動識別非標 準的氨基酸/核酸及配體分子，在對復合物進行分子動力學模擬前，需要設定復 合物中配體分子的力場。采用AMBER的Antechamber模塊給配體分子加力場 參數，力場采用標準AMBER力場(general AMBER force field, GAFF)，電荷 采用半經驗的AM1-BCC算法得到。通過Antechamber,可以使得系統識別配 體的原子鍵和原子類型的信息，并加入系統缺失的力場參數。
在tLeap中使用ff03力場和GAFF力場，并將小分子力場信息載入tLeap， 這時tLeap可以讀入并正確識別復合物。在體系中增加必要的用于平衡電荷的 Na+原子或Cr原子，加入TIP3P類型的水分子，保存整個體系(包括復合物和 水分子)的拓撲文件和坐標文件。
利用sander模塊進行分子動力學模擬。包括結構優化，升溫，體系平衡和 分子動力學模擬等過程。結構優化過程共1000步，前500步采用最陡下降法， 后500步采用共軛梯度法使得體系能量收斂；升溫過程為50ps，使得體系溫度 升至300k，期間對蛋白質空間位置進行約束；體系平衡過程同樣對蛋白質空間 位置進行約束，共50ps,使得整個體系放松；分子動力學模擬中不再對蛋白質 進行約束，共計進行2.0ns的分子動力學模擬。在全部過程中，使用Langevin 恒溫器維持溫度，控制碰撞頻率為1.0ps"，維持體系1atm,對于涉及氫原子的 運動使用SHAKE算法控制氫鍵的運動，截斷半徑設為10A，動力學模擬步長為 2.0fs，每1ps保存一個構象。
實施例3:
采用本發明方法識別典型雌激素激動型配體17p雌二醇(17p-Estradiol) H12
螺旋的位置。
雌二醇與雌激素受體配體結合區的結合模式已經通過實驗手段得到測定。選 擇雌激素與人類雌激素受體a亞型晶體結構(PDB編碼為1ERE)，使用同源模
建的手法補齊缺失的氨基酸殘基。
利用這一結構作為初始模型進行分子動力學模擬。通過圖3可以看出，在
2ns的分子動力學模擬過程中，復合物分子構型在較短時間內已經處于平衡狀 態，在全部分子動力學模擬過程中，復合物的構象變化不大，RMSD值一直穩 定在3.4A。同時可以看到，經動力學優化后，氨基酸殘基與配體形成氫鍵網絡 并未消失，說明這一氫鍵網絡有助于整個體系的穩定(圖3)。
本例中雌激素H12螺旋的RMSD值在整個動力學模擬過程中變化較小，在 最初短時間震蕩后，系統穩定在3.2A左右振動，這說明在本例模擬的天然環境 中，雌二醇在同雌激素結合后，復合物，尤其是雌激素配體結合區的H12螺旋 處的構象基本沒有變化，說明這此化合物在與雌激素結合時均起到激動劑的作 用，復合物以激活型態存在，能夠激活雌激素效應。
實施例4:
采用本發明方法識別3種有機物的擬/抗雌激素效應。有機物包括己烯雌酚 (Diethystilbestrol)， 4-羥基他莫昔芬(4-OH-Tamoxifene， 4-OHT)和染料木 素Genistein(GEN)。
其中己烯雌酚雖然擁有通過實驗手段測定的結構(PDB編碼為1S9P)，但 是此三維結構中缺少H12螺旋部分的信息，本發明中利用對接手法解決此類三 級結構殘缺的問題。4-羥基他莫昔芬與染料木素均擁有合適的三維結構(PDB 編碼分別為3ERT與1X7R)。但與三種配體結合的雌激素配體結合區構象并不 一致，尤其是H12螺旋區域的構象間存在較大差異。
為了比較這三種化合物進入雌激素配體結合區后H12螺旋的變化，本例中 將三種配體對接入實施例1獲得的受體LBD活性口袋內，并利用分子動力學模 擬復合物構象的變化趨勢。選用雌激素受體與實施例3相同。
構建了這幾種化合物的結構，并使用Tripos力場對化合物進行能量優化， 電荷選擇為Gasteiger-H(ickel電荷，能量收斂標準為0.05kcal/mol，最大迭代次 數設置為1000次。使用Surflex將化合物與受體活性口袋對接，選擇其中結合 模式與實驗得到的晶體結構最為相似的作為初始構象。
利用分子對接得到的結構作為初始模型進行分子動力學模擬。經過2ns的分子動 力學模擬，得到上述幾個分子在ER配體結合區的結合方式及其引起的構象變
化。通過對整個體系的平衡分析可以看出，在整個動力學過程中，己烯雌酚和染 料木素達到平衡所用的時間較短，而4-羥基他莫昔芬所達到平衡所需的時間較
長。并且，通過對LBD的RMSD值統計可以看出，在4-羥基他莫昔芬的動力學 模擬過程時，0.6ns左右RMSD值明顯增大，說明此時間配體結合區發生了構 象變化，從分子動力學過程中蛋白質的構象變化上看，H12螺旋發生了旋轉。并 且，這一變化是在極短的時間內完成，表明H12螺旋構象的變化并非緩慢進行 而是發生了一次突變。在此突變之后，整個蛋白質構象又重新回歸穩定，說明整 個蛋白質重新得到一個新的平衡構象。通過計算得到，H12螺旋在平衡前后的 RMSD差值在0.5A左右。從整個動力學過程中抽樣得到H12螺旋平衡前后的蛋 白質構型，從圖4中可以看出，ER的LBD結構，尤其是H12螺旋的構象發生 了重要的變化。在分子動力學模擬結構穩定后，4-羥基他莫昔芬的RMSD值與 其他三者有較大差異，差值約在0.5A，而四者中，僅4-羥基他莫昔芬由于尾鏈 的存在，使得H12螺旋遠離活性口袋，表現出拮抗作用，其他三者H12螺旋均 位于覆蓋于口袋上方，都是激動劑(圖5)。
權利要求
1. 一種有機物雌激素受體激動和拮抗作用的識別方法，包括以下步驟:(1)根據已有雌激素受體與配體結合方式和其在體內發揮作用，從蛋白質數據庫庫中選擇包含與受測化合物結構類似的雌激素受體晶體結構；(2)構建有機污染物分子的空間結構并進行構型和能量優化，采用分子對接計算可疑環境內分泌污染物與雌激素受體活性口袋結合的作用模式；(3)對構建好的雌激素受體-配體復合物進行分子動力學優化模擬；(4)有機物雌激素受體激動和拮抗作用的識別，分析動力學模擬獲得的蛋白質構象與初始構象的區別，計算雌激素受體配體結合區H12螺旋附近的氨基酸在動力學模擬過程中的RMSD值隨時間的變化，來獲得真實環境中配體與雌激素配體結合區的結合模式；計算分子動力學模擬前后的ER構象差異的RMSD值，比較經分子動力學計算得到可能的環境內分泌干擾物與ER結合后H12螺旋位置與典型的ER激動和拮抗劑H12螺旋位置，可以識別該污染物的激動和拮抗作用。
2. 根據權利要求l中所述的一種有機物雌激素受體激動和拮抗作用的識別方 法，其特征在于利用分子動力學手段，計算與分析有機物與雌激素受體結 合過程，根據配體結合方式和雌激素配體結合區構象的變化，特別是ER 的LBD結構中H12螺旋位置的變化，識別有機物是ER激動劑還是拮抗劑。
3. 根據權利要求1中所述的一種有機物雌激素受體激動和拮抗作用的識別方 法，其特征在于步驟(l)中根據已有雌激素受體與配體結合方式和其在 體內發揮的作用，從蛋白質數據庫庫中選擇包含與受測化合物結構類似的 雌激素受體晶體結構，作用位點的選擇采用SiteID分子模擬方法尋找受 體大分子的活性口袋，并結合晶體結構中配體分子的結合方式確定結合的 活性口袋，選擇活性殘基周圍一定范圍的殘基組成底物的結合口袋。
4. 根據權利要求1~3中任一項所述的一種有機物雌激素受體激動和拮抗作 用的識別方法，其特征在于步驟(2)中化合物結構與能量優化使用Tripos 力場，電荷選擇為Gasteiger-H ii ckel電荷，能量收斂標準為 0. 05kcal/raol,最大迭代次數設置為1000次；使用Surf lex分子對接方法將化合物與雌激素受體活性口袋進行分子對接。
5. 根據權利要求2中任一項所述的一種有機物雌激素受體激動和拮抗作用的 識別方法，其特征在于步驟(3)中所述的雌激素受體-配體復合物的分子 動力學優化模擬，模擬是在常溫常壓下由AMBER程序包完成的，使用AMBER 的ff03力場參數描述體系的蛋白質分子，使用GAFF力場描述配體分子， 保留晶體結構中的水分子，并將整個系統放入充滿TIP3P水分子模型的立 方體的周期性盒子中，蛋白質或復合物距離盒子的最短具體為10A,并根 據需要加入必要的Na'或Cr維持體系的電中性，使得體系中的個別水分子 被Na+或Cr離子所替換，使用Langevin恒溫器維持常溫為300K,控制碰 撞頻率為l.Ops—',同時維持體系壓力為l個標準大氣壓，對于所有涉及氫 原子的鍵長使用SHAKE算法控制含氫鍵的運動，截斷半徑設定為10A，動 力學模擬時間步長為2.0fs,每0.2ps保存一個構象，具體的模擬過程如 下l.結構優化，運行500步的最陡下降法，然后使用共軛梯度法使得體 系的能量收斂；2.升溫，在50ps內，對受體蛋白的空間位置進行束縛， 使得體系溫度上升到300K; 3.溶劑化動力學；同樣對受體蛋白的空間位置 進行東縛，進行50ps的分子動力學模擬，使得模擬體系放松；4.分子動 力學模擬不再進行位置東縛，對體系進行2.0ns的分子動力學模擬。
6. 根據權利要求5中任一項所述的一種有機物雌激素受體激動和拮抗作用的 識別方法，其特征在于步驟(3)中所述的對于復合物構象處于平衡的判 定是建立在對分子動力學模擬結構進行分析的基礎上，根據勢能、動能、 總能量、溫度、壓力、體積、密度和RMSD隨時間變化的曲線，判斷整體 結構是否達到平衡，平衡的標志是構象差異RMSD隨時間變化不顯著。
7. 根據權利要求5中任一項所述的一種有機物雌激素受體激動和拮抗作用的 識別方法，其特征在于步驟(3)中通過控制分子動力學模擬過程中各步 參數的設定，能夠在最終的模擬過程中得到接近自然條件的"真實"環境。
8. 根據權利要求5中任一項所述的一種有機物雌激素受體激動和拮抗作用的 識別方法，其特征在于由于采用的分子動力學模擬軟件Amber與分子對接 軟件SYBYL所支持力場的不同，特征步驟(2)中小分子選用Tripos力場， 而在特征步驟(3)中小分子改用GAFF力場。
9. 根據權利要求1-3中任一項所述的一種有機物雌激素受體激動和拮抗作 用的識別方法，其特征在于步驟U)中通過比較經分子動力學計算得到 可能的環境內分泌干擾物與ER結合后H12螺旋位置與典型的ER激動和拮 抗劑的H12螺旋位置，識別有機物的雌激素激動和拮抗作用。
10. 根據權利要求1-3中任一項所述的一種有機物雌激素受體激動和拮抗 作用的識別方法，其特征在于步驟(3)和(4)中所述的的RMSD值通過 分子動力學計算得到，且RMSD計算的參考構象為分子動力學計算前的初 始構象。
全文摘要
本發明公開了一種有機物雌激素受激動和拮抗體作用的識別方法。利用分子動力學手段，計算與分析有機物與雌激素受體結合過程，基于配體結合方式和雌激素配體結合區構象的變化，特別是ER的LBD結構中H12螺旋位置的變化，識別有機物是ER激動劑還是拮抗劑。本發明可以有效識別有機物的擬/抗雌激素作用，方法成本低廉簡便，能夠節省大量的人力物力財力，為大規模開展毒害化學品環境安全性評價(REACH)進行提供相應的基礎工具與快捷途徑。
文檔編號C40B30/02GK101381894SQ20081012372
公開日2009年3月11日 申請日期2008年5月30日 優先權日2008年5月30日
發明者磊 劉, 張愛茜, 彭素芬, 遠 藺, 韓朔睽, 高常安 申請人:南京大學