專利名稱：：中藥等天然產物混合物藥物篩選備選庫的制備方法及其應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及藥物篩選備選庫的制備方法及其應用，更具體而言，涉及用于以蛋白質晶體結構為基礎進行藥物篩選的、來源于中藥等的天然產物混合物藥物篩選備選庫的制備方法及其應用。
背景技術：
：天然產物又稱次級代謝產物(SecondaryMetabolites),具有結構的多樣性和生物活性的多樣性。天然產物及其衍生物在以往的疾病治療中發揮了無可限量的作用，也是3今藥物研發過程中最具潛力的資源之一(NewmanDJ,GraggGM,SnaderKM.AtoW印，2000,17(3):215-234;LeeK畫H.■/iVW.2004,67(2):273-283)。但是，在過去10年中，制藥工業對天然產物的研究興趣有所降低，這主要是由于傳統的天然產物粗提物庫與常規的高通量的篩選方法缺乏兼容性(FrankE.andGuyT.JVWwrciev.Z>wgD!'scov.2005，4:206-220)。上個世紀90年代組合化學(Combichem)的出現，使得從天然產物中發現新藥的研究被冷落了多年。組合化學能夠合成數目巨人的化合物(理論上據估計有1018到10，個化合物，通常認為是106()個)，這就為常規的高通量的篩選方法提供了理想的篩選化合物庫，因此，組合化學這一技術的出現，使得大部分制藥公司都轉向了以組合化學庫為基礎的高通量篩選路線上，他們期待采用這種技術手段能夠大大加快活性化合物的發現速度。然而，近年來制藥工業的新藥產出率并沒有像預期的那樣提高，而是持續下跌。造成這種結果的原因很多，一個最主要的原因可能就是由于制藥工業采用組合化學技術之后，對天然產物研發的興趣有所降低(DavidJ.etaL/A^.Pra^2003,66,1022-1037)。組合化學方法是從共同的結構模板出發，選擇具有相同功能的多種組建模塊，通過同種鍵反應實現分子結構多樣性。這樣合成的化合物的結構骨架缺乏多樣性。因此，組合化學作為藥物發現的工具目前仍有其局限性，有待進一步發展和完善。而天然產物在藥物研發中的獨特作用，近年來重新引起人們的關注。美國國立癌癥研究院的調査顯示，1981—2002年上市的877種小分子新化學實體藥物中，來源于天然產物的占61%。其中，6%直接來源于天然產物，27%為天然產物的衍生物，5%來源于天然產物藥效團的合成物，23%是根據天然產物結構進行模擬設計的合成物(DavidJ.etal./2003，66，1022-1037)。現在對中藥等傳統藥物、海洋生物以及微生物代謝過程中的天然產物研究方興未艾，每年都會有大量結構新穎的化合物被發現提供出來，這些新穎化合物是合成方法所無法實現的藥物和藥物先導化合物的重要源泉，在新藥和先導化合物的發現中起著重要作用。目前，用于藥物篩選的天然產物庫共有三種形式，一是天然產物粗提物庫，為混合物庫，一般包含有10—100種組分；二是天然產物提取組分，半純品庫，一般包含有5—10種組分；三是純品庫，單一組分(FrankE.andGuyT.A^wAev/，Z>wgW膨v，2005,4:206-220)。現有的天然產物粗提物庫雖然保留了原藥材所含成分的完整性且簡單易得，但其成分較復雜且其各個成分的濃度并不確定，有可能相差10倍、100倍甚至更多。因此，對于那些濃度低的組分，可能在常規的高通量的活性篩選中被忽略掉，而含量較豐富的組分有可能表現出非特異性的抑制，比如破壞檢測體系的pH值或者其它的物理特性，造成假陽性結果(FrankE.andGuyT.iVWwieWewsDrag^scove^.2005,4:206-220)。天然產物半成品庫雖然部分地去除了干擾因素，也提高了所含受試成分的相對濃度，但是卻喪失了原藥材所含成分的完整性，并且往往在不同的色譜操作中造成對原藥材所含成分的損失。對于天然產物純品庫，命中物(hit)的檢測方法與人工化學合成的純品庫相同，可以用于常規的高通量的篩選方法中。然而，對于每一種天然產物粗提物來說，分離得到其每種成分的純品化合物，需要較長的周期和大量的工作，并帶有明顯的盲目性，獲得有效化合物的準確性非常低。對于天然產物尤其是來源于中藥等的天然產物的研究是很有必要的，因為中藥在我國已有數千年應用的歷史，是一個偉大的寶庫。但是中藥所含的化學成分復雜，有效成分也往往含量低微。對中藥有效成分的闡釋是中藥現代化的重要內容，因為不確定具體何種成分在起作用，就無法為藥材種植、藥材炮制、成藥的質量標準以及相關的藥理、毒理、臨床實驗等提供依據。中藥化學成分的分離、純化和鑒定則需要反復運用各種色譜方法和多種波譜方法去完成，一味中藥的化學成分研究已經是一項周期長、工作量大的工作，這還是僅限那些含量相對較大的成分。在結構清楚的各種成分里面尋找有效成分，又得對其進行各種生物活性測試，現今用于常規的高通量篩選的生物活性測試模型主要是一些簡單的體外測試模型這其實是一種盲目的篩選模式，往往大多數分離得到的純品化合物是無效的，而且這種簡單的生物活性測試模型能說明的問題也是有限的。即使我們能夠確定那些有效成分，那么這些成分是如何對某些疾病起到治療作用的，它們是如何通過與機體的相互作用而對機體進行調節的，也很少有關于這些小分子成分與體內生物大分子相互作用細節的闡述。隨著基因組學、生物信息學等的快速發展，產生了基于分子生物學、結構生物學的藥物篩選方法。人類以及微生物的基因組計劃提供了數量空前的潛在藥物靶標，僅僅在人類基因組的工作草圖完成后不到1年的時間內就發現了1778個疾病基因。這些工作推動了蛋白質表達(蛋白質組學)以及蛋白質結構(結構生物學)的研究，與人類疾病相關基因的識別、鑒定及其所表達的蛋白質的結構與功能的研究為藥物篩選與發現開拓了不可限量的前景，給新藥發現帶來了契機。隨著科學技術的進一步發展，研究者開始使用X射線晶體學等生物物理的技術以蛋白質晶體結構為基礎進行藥物篩選，這類篩選方法主要包括(l)基于蛋白質三維結構的虛擬藥物篩選和設計(計算機輔助的藥物設計)分子生物學和結構生物學的發展，提供了許多耙點蛋白質的三維結構，因此，按照互補性原則，根據蛋白質的三維結構的藥物設計方法已被廣泛使用。它與傳統的藥物化學方法不同，是根據蛋白質的三維結構，在結合位點找到與之相適配的小分子結構。一般可分為兩種途徑一是基于數據庫搜尋的也稱為虛擬篩選，即按照受體結合部位的形狀和結構特征，將有機分子庫的化合物以其三維結構逐一對接到受體結合部位，找出與結合部位相適配的分子。另一種方法稱為全新藥物設計，即按照受體結合部位的形狀和結構特征，由原子、化學基團或片斷拼接成與之互補的配體分子。事實上，前者相當于在許多已有的鑰匙中尋找可開啟鎖的鑰匙，而后者是按照鎖的結構制造新的鑰匙。可是，目前用于虛擬篩選的小分子庫主要是劍橋小分子庫，此庫中新化合物種類較少，而且許多化合物的成藥性較差。全新藥物設計的方法能夠解決上述問題，計算機全新藥物設計可以在耙標蛋白質的活性口袋內放置片斷，然后通過優化靜電、范德華和氫鍵作用"生長"出適合活性口袋的分子。但這種方法又往往產生難于合成的分子，并且其可靠性還得接受實驗的檢驗。(2)基于片斷(fragment-based)的篩選基于片斷篩選中的片斷指的是分子量小于200Da的小分子基團，通常是組成化合物的基本基團，如萘醌、苯環等等。通常，這種小分子片斷對耙標蛋白具有較低的結合力，因此常常不被常規的高通量篩選方法所發現。但是這種方法也存在著本身的局限性首先，分子量較小的基團在低分辨率(低于2.5A的分辨率)的電子密度中不易與結晶溶液中本身存在的小分子(如DMSO等)、離子(如酸根離子等)等區別開，因此對靶標蛋白的晶體質量要求較高，極大的限制了耙蛋白的范圍；其次，能夠穩定存在的、分子量在200Da水平上的小分子基團種類有限，目前使用較多用于結構篩選的備選庫中也只有數百至數千種成分，這就極大的限制了命中的可能性；再次，這種篩選方法將很多不能夠合成、無法分解為基本基團的天然產物排除在藥物篩選的范圍之外，限制了篩選范圍。截至到目前為止，現有技術中沒有描述以蛋白質的晶體結構為基礎，從來源于中藥等的天然產物混合物藥物篩選備選庫中高效、全面地篩選藥物的方法。對于具有結構多樣性和生物活性多樣性的天然產物的研究，仍然以傳統方式進行，即用藥物靶蛋白篩選粗提物，如果發現有活性，就將該提取物分割成若干組分，再分離和鑒定活性化合物。這個過程不僅緩慢、效率低、勞動強度大，而且也不能保證篩選出的化合物在化學上是可行的。因此，有待發展一種全新的天然產物藥物研發模式，并迫切需要建立一種新的、能滿足蛋白質體外活性測定和X射線晶體學技術需要的來源于中藥等的天然產物混合物藥物篩選備選庫，其能夠用于以蛋白質晶體結構為基礎進行藥物篩選的方法，從闡明小分子與大分子相互作用細節的角度入手，進行快速、高效、可靠的藥物篩選。
發明內容本發明的目的在于提供一種高效、快捷、準確、可靠、實用的適用于以蛋白質晶體結構為基礎進行藥物篩選的天然產物混合物藥物篩選備選庫的制備方法及該藥物篩選備選庫在以蛋白質晶體結構為基礎進行藥物篩選中的應用。具體而言，本發明的天然產物混合物藥物篩選備選庫的制備方法，是從一種新的角度去研究中藥現代化和生物學。由于天然產物粗提物所含的成分是相當復雜的，因此必須對天然產物的粗提物進行優化，目的是去除干擾因素如蛋白、多糖等，保留成藥性較好的小分子并使之盡量集中，提高相對濃度，以制備適用于以蛋白質晶體結構為基礎進行藥物篩選的藥物篩選備選庫。本發明為實現這一目的，采用如下所述的技術方案制備藥物篩選備選庫，其基本原理為對初級原料提取后，提取物先使用不同極性的溶劑如乙酸乙酯進行萃取、萃取后的水相再用大孔樹脂分離的方法進行處理，這樣既能保證去除蛋白、多糖等干擾因素，又能利用兩種不同分離機制的差別，使小分子集中到極性不同的段位，由此得到含有適中分子量的并能夠用于以蛋白質晶體結構為基礎進行藥物篩選的天然產物混合物藥物篩選備選庫。本發明的來源于中藥等的天然產物混合物藥物篩選備選庫的制備方法包括如下步驟(a)、制備提取物(粗提物)浸膏取初級原料，回流提取，合并提取液，濃縮得浸膏；(b)、制得有機溶劑萃取部分稱取所得浸膏，雙蒸水懸浮，用有機溶劑萃取，分離有機溶劑相和水相；合并水相，備用；合并有機溶劑萃取物，蒸除有機溶劑，得到干膏狀有機溶劑相成分，備用；(c)、制得水相大孔樹脂50%乙醇和95%乙醇洗脫部分蒸除步驟(b)得到的水相中的有機溶劑，用大孔樹脂柱層析分離，用水為流動相洗脫，棄去水洗部分；再用乙醇溶液洗脫；將乙醇溶液洗脫部分蒸除溶劑，得干膏狀樣品備用；(d)、制得天然產物混合物藥物篩選備選庫上述步驟(b)中制得的干膏狀有機溶劑相部分、步驟(C)中制得的干膏狀樣品分別為制得的天然產物混合物備選樣品，所有初級原料制得的天然產物混合物備選樣品即組成天然產物混合物藥物篩選備選庫。本發明天然產物混合物備選庫的制備方法優選方案為(a)制備提取物(粗提物)浸膏當所選用的初級原料為除微生物外的任一種物質時取一定量的初級原料，其中所用乙醇與原料的質量比為6:1-12:1。用實驗用乙醇回流提取，最好回流提取2-4次，每次l-3小時，合并提取液，濃縮得浸膏。其中所述的實驗用乙醇濃度最好為70%-95%乙醇，最優選95%乙醇；回流提取次數最優選為3次，每次優選2小時。對于中藥處方的提取物浸膏的制備，則按照處方中規定的藥材種類和1-6倍按照處方中規定的用量組成初級原料，分別用70%-95%乙醇按上述同樣的方法制得浸膏一；另外，同樣則按照處方中規定的藥材種類和1-6倍用量組成初級原料，最好用雙蒸水煎煮3次，每次1-3小時，煎煮液合并，濃縮得浸膏二。浸膏一和浸膏二都作為中藥處方的提取物浸膏進行下一步的處理。對于微生物的提取物制備，則是將含有適量微生物的培養液過濾，得到固體微生物菌絲體和培養液濾液，菌絲體再超聲破碎，最好用80%丙酮超聲破碎20-60分鐘，過濾，濾液濃縮得浸膏，此浸膏與培養液濾液都作為微生物的提取物進行下一步的處理。(b)制得有機溶劑萃取部分萃取用有機溶劑最好為乙酸乙酯或氯仿；浸膏與雙蒸水的質量比最好為1:5-1:15，優選1:10;萃取用有機溶劑的體積與懸浮用水的體積比最好為6:1-10:1，優選8:1。當初級原料為微生物外的任何一種物質時，可將步驟(a)中的浸膏，用雙蒸水懸浮，傾入分液漏斗中(分液漏斗選用適宜的分液漏斗，例如，如果加入100ml水，則選用1000ml的分液漏斗)，用乙酸乙酯或氯仿萃取4-6次，萃取時需充分振搖，靜置5-8小時分層后，分離有機溶劑相和水相；合并每次有機溶劑相萃取物，用旋轉蒸發儀蒸除有機溶劑，得到干膏狀有機溶劑相成分，備用。對于微生物提取物的培養液濾液部分直接用有機溶劑萃取，最好萃取4-6次，合并每次有機溶劑萃取物，蒸除有機溶劑，得到干膏狀有機溶劑相成分，備用。(c)制得水相大孔樹脂50%乙醇和95%乙醇洗脫部分將步驟(b)中萃取后的水相部分蒸除水中溶解的少量有機溶劑，用大孔樹脂柱層析分離，依次用水、50%乙醇、95%乙醇為流動相洗脫，水洗脫6-10次，優選7次，每次洗脫用水為2-4倍體積量的步驟2中懸浮用水量，棄去水洗部分;50%乙醇和95%乙醇各洗脫4-6次，優選5次，每次洗脫用乙醇量為2-4倍體積量的步驟2中懸浮用水量。將50%乙醇和95%乙醇洗脫部分分別使用旋轉蒸發儀蒸除溶劑，得干膏狀樣品備用。其中，所述的旋轉蒸發儀優選EYELAN1001型旋轉蒸發儀；所述的洗脫用懸浮用水量和洗脫用乙醇量優選為3倍體積量的步驟2中懸浮用雙蒸水；所述的大孔樹脂優選HP-20型，優選地，大孔樹脂用180毫升，玻璃柱規格30X300咖。(d)制得天然產物混合物藥物篩選備選庫上述步驟(b)中制得的有機溶劑相部分的干膏狀樣品、歩驟(c)中制得的水相50%乙醇洗脫部分的干膏狀樣品以及水相95%乙醇洗脫部分的干膏狀樣品，構成本發明的天然產物混合物藥物篩選備選庫的源自一份初級原料的三種備選樣品(每一種備選樣品都是由許多天然產物小分子組成的混合物，也稱為天然產物混合物備選樣品)；當初級原料為中藥處方或微生物時，按上述方法，每一份初級原料可得到六種備選樣品；所有初級原料提供的每種備選樣品即組成了本天然產物混合物藥物篩選備選庫。上述天然產物混合物藥物篩選備選庫的組成示于圖1天然產物混合物藥物篩選備選庫初級原料的選取范圍很廣泛，本發明可選取傳統中藥作為天然產物混合物藥物篩選備選庫的初級原料，因為傳統中藥在我國已有幾千年的應用，至今還用于各種疾病的治療。本發明也可選取藏藥等少數民族藥材及潛在的藥用動植物作為本發明的天然產物混合物藥物篩選備選庫的初級原料。本發明也可選取傳統經方、驗方等中藥處方作為本發明的天然產物混合物藥物篩選備選庫的初級原料。本發明也可選取海藻、海綿等海洋生物作為本發明的天然產物混合物藥物篩選備選庫的初級原料，因為海洋生物能提供新穎結構分子巨大的生物資源，由于生態環境與陸地截然不同，導致體內生物合成過程不同，使得海洋生物與陸地生物相比，具有更豐富的生物分子多樣性。本發明也可選取微生物作為本發明的天然產物混合物藥物篩選備選庫的初級原料，因為其具有特有的生理過程和生長環境，也含有極其豐富的特有天然產物。總之，本發明提供的制備方法中，所用的初級原料可選自以下述的任一種或幾種傳統藥材、按中藥處方規定的藥材種類和用量組成的混合藥材、還未進行藥用開發的動植物品種、海洋生物、微生物。比如，<<中藥藥典》、<<中華本草>>、《中國植物志》收錄的中藥材品種、藏藥。本發明提供的天然產物混合物藥物篩選備選庫，具有廣泛的應用。本發明提供了以蛋白質晶體結構為基礎，從該備選庫中進行藥物篩選的方法。本發明提供的方法，包括以蛋白質晶體結構為基礎從該備選庫中獲取靶分子與靶蛋白復合體精細三維結構。本發明提供的以靶蛋白質晶體結構為基礎，從該備選庫中獲取靶分子與靶蛋白復合體精細三維結構的方法可包括如下步驟將靶標蛋白晶體與天然產物混合物備選樣品接觸，分析將靶標蛋白的晶體與天然產物混合物備選樣品接觸后的晶體的X射線衍射數據，獲得與靶標蛋白結合的靶分子的電子密度，鑒定靶分子，進而獲得靶分子與靶蛋白復合體的精細三維結構。對于得到的靶分子，可以進一步優化和進行生物學實驗。本發明提供了以蛋白質晶體結構為基礎，從該備選庫中進行抗SARS藥物篩選；或從該備選庫中進行抗HCV感染的藥物篩選。本發明提供的以蛋白質晶體結構為基礎，從本發明的藥物篩選備選庫中獲取靶分子與靶蛋白復合體精細三維結構的方法可包括如下步驟-(1)選取耙標蛋白質用X射線晶體學的方法解析出其三維結構的蛋白質都可以成為本實施方案的靶標蛋白質，優先選取與人類重要疾病或重要病毒相關的蛋白質；在確定了靶標蛋白之后，可以采用從公司購買、由合作者提供或從cDNA文庫中克隆的方法，參照已經發表的關于該靶標蛋白的克隆、表達、純化文獻中的方法，得到正確的構建(construct),并參照已發表文獻中報道的方法進行該靶標蛋白質的表達和純化；(2)制備靶標蛋白質的晶體；使用上述經過純化的靶標蛋白，參照已報道的該靶標蛋白的結晶條件或經過自己優化的該靶標蛋白的結晶條件(優化靶標蛋白的結晶條件包括改變耙標蛋白的結晶濃度，改變靶標蛋白的結晶池液的組成等)，生長大量、衍射能力強的晶體，備用。(3)制備天然產物混合物藥物篩選備選庫(上文已述)；(4)天然產物備選樣品對靶標蛋白體外抑制活性的測定步驟(1)中所選取的靶標蛋白若已報道其具有成熟的體外活性測定方法，在迸行靶標蛋白晶體與天然產物混合物藥物篩選備選庫中的樣品(稱為天然產物混合物備選樣品)的浸泡實驗之前，最好將天然產物混合物備選樣品對靶標蛋白進行體外活性的測定(耙標蛋白活性測定方法參照相關文獻(如SARS冠狀病毒主蛋白酶，參見YangH，XieW等人.2005PloSBiol3(10):e324))，從不同的天然產物混合物備選樣品中選取出對耙標蛋白具有抑制活性的樣品(命名為"有抑制活性"的樣品)，進行下一步的晶體浸泡或共結晶工作，這樣可以針對性的選取出對特定靶標蛋白有抑制活性的天然產物混合物備選樣品，減少下面步驟5中晶體浸泡或共結晶的次數，從而有效減少工作量，并提高命中率。對于其他的、試圖通過本實施方案的方法進行功能探索的靶標蛋白(如SARS非結構蛋白nsplO)，可不考慮此步驟，直接實施步驟(5)，以確定是否在革巴標蛋白上結合有靶分子，用來研究該靶標蛋白的功能。(5)靶標蛋白質的晶體與天然產物混合物備選樣品接觸；對于已報道具有體外活性測定方法的靶蛋白，在步驟4中得到"有抑制活性"的樣品(可能是一種，也可能是多種，設為N1種)之后，使用步驟2中制備的靶標蛋白的晶體與"有抑制活性"的樣品的浸泡實驗或者使用步驟1得到的經過純化后的靶標蛋白與"有抑制活性"的樣品進行共結晶實驗。主要目的是獲得靶標蛋白與靶分子(該靶分子為"有抑制活性"的樣品中可能存在的靶標蛋白的配體分子)復合體的能夠穩定存在，并具有可供X射線衍射實驗的衍射能力的晶體。使用的方法主要包括晶體浸泡和共結晶，優選晶體浸泡的方法，采用如下步驟(1)將步驟4中得到的Nl種"有抑制活性"的樣品溶解于靶標蛋白的結晶池液(結晶池液是靶蛋白晶體生長的溶液，通常由沉淀劑和緩沖溶液組成)(例如SARS主蛋白酶的結晶緩沖液組成為1.812%的PEG6000，3%二甲基亞砜(DMSO)，lmMDTT，100mMMES緩沖液(pH5.0PH6.0)中，制得晶體浸泡液。(2)利用尼龍晶體環等工具，將晶體從結晶池液中取出，分別加入至上述(l)中所述的晶體浸泡液中浸泡2小時至48小時不等。(6)晶體X射線衍射數據的收集和分析；在步驟4、5的基礎之上，使用具備較好衍射能力(通常指的是最高分辨率不低于3人)的靶標蛋白質的晶體與天然產物混合物備選樣品接觸后的晶體，進行X射線衍射數據的收集和分析。數據收集時，首先使用HamptonResearch公司的尼龍晶體環，從晶體浸泡液中獲取浸泡一定時間(2小時至48小時)的晶體；并迅速使用Rigaku公司的冷卻系統或OxfordCyrosystem公司的冷卻系統，將晶體在以上所述的兩種冷凍系統產生的低溫氮氣流中冷凍至-15(rC—-18(TC;使X射線通過晶體，使用旋進法收集x射線衍射數據。在收集到將靶標蛋白質的晶體與天然產物混合物備選樣品接觸后的晶體的X射線衍射數據后，按照下述步驟進行相應的數據處理首先，使用HKL2000等(包括Mosflm、D*trek等)衍射數據處理程序包等本領域已知的常用的數據處理的方法，對上一步驟中收集得到的衍射數據進行處理，獲得完整的數據文件；其次，使用CNS或者CCP4程序包中的Phaser、Molrep等各種分子置換(MolecularReplacement)程序等本領域已知的常用的數據處理方法，利用分子置換(MolecularReplacement)的方法，以靶標蛋白的母體晶體結構為初始模型，得到候選的靶標蛋白與靶分子的復合體的精細三維結構；再次，使用程序O、COOT、XtalView等可視化程序包等本領域已知的常用的數據處理的方法，觀測可能的靶標蛋白與抑制劑或者配體小分子復合體的電子密度。如果此時發現，在耙標蛋白相應的活性位點，有不屬于蛋白質分子本身的、不屬于溶劑分子的、不屬于結晶溶液中存在的分子的未知電子密度存在，并且該電子密度與靶標蛋白的活性位點的氨基酸有包括氫鍵作用、共價作用等在內合理的化學環境，則可以確認此天然產物混合物備選樣品中，有抑制劑小分子等配體分子與靶標蛋白結合。(7)鑒定靶分子，獲得靶分子與靶蛋白復合體的精細三維結構。一旦在步驟6中發現結合在靶標蛋白質分子上的未知電子密度，一般來說可按照下面兩種方法進行進一步工作，以確定結合小分子的具體成分等(1)對于分辨率較高的復合體的晶體結構，通常指分辨率超過2.5人，可以通過直接觀察分析電子密度，分析結合小分子與靶標蛋白質分子的化學作用，并結合該天然產物混合物備選樣品研究，對結合小分子的成分和結構進行合理的推測(可能是一種、也可能是多種)，然后通過購買、合成等途徑獲取可能的小分子，并進行對照實驗，以確定小分子的最終成分。(2)對于分辨率較低的復合體的晶體結構，通常指分辨率低于2.5人。首先，利用質譜的方法，對蛋白質和天然產物混合物備選樣品進行分析，確定結合小分子的分子量。其次，通過査閱相關文獻等手段，對該備選樣品的已有的成分進行具體分析，統計在上述用質譜方法確定的分子量左右(通常指分子量土io以內)可能存在的化合物(可能是一種，也可能是多種)。然后，通過合成、購買等手段獲取該種或者這些化合物，并進行對照實驗，以確定小分子的最終成分。(8)耙分子的優化和進一步的生物學實驗。一旦按照步驟l一步驟7的方法，從某種天然產物混合物備選樣品中獲得了耙標蛋白質分子與靶分子結合的復合體的結構，并確定靶分子的具體成分和結構式之后，可以根據獲得的復合體結構對靶分子進行結構上的設計和優化。以期得到能夠設計并合成出與靶標蛋白質分子活性位點更加匹配、結合能力更高的小分子化合物，稱為優化的靶分子。在得到優化的靶分子之后，可以對靶分子、優化的靶分子進行進一步的生物學實驗，包括體外活性測定、細胞學實驗、動物實驗等生物學實驗，進一步測定它們的生物學參數(如結合常數、酶動力學參數、細胞毒性等等)，以及對活體動物的療效，以便為進一步的臨床實驗做好準備，進而進行潛在的藥物開發。同現有的天然產物粗提物庫、半成品庫以及純品庫(FrankE.andGuyT.A^we/eWe柳Dn/gcfocm^y.2005，4:206-220)相比較，本發明的藥物篩選備選庫具有明顯的優點。現有的天然產物粗提物庫雖然保留了原藥材所含成分的完整性，但其中也含有如蛋白質、多糖等許多對篩選造成干擾的成分，它們會造成假陽性或假陰性結果；同時，由于藥材內所含成分之間含量差別大，受取樣等因素的限制，那些活性好、含量低的成分往往達不到檢測限需要的相對濃度。天然產物半成品庫雖然部分地去除了干擾因素，也提高了所含成分的相對濃度，但是卻喪失了原藥材所含成分的完整性，并且往往在不同的色譜操作中造成對原藥材所含成分的損失；而天然產物純品庫雖然最大限度地提高了測試的準確性，但卻需要周期較長的分離、純化以及結構鑒定過程，并且受人力、技術的限制，能提供的化合物數量也是有限的；而本發明的藥物篩選備選庫經過對原藥材的適當優化，比如優選95%乙醇作為提取溶劑，可以提取出更多的親脂性化合物；提取物先用有機溶劑萃取，水相再用大孔樹脂分離的方法，則充分利用兩種不同的分離機制，使極性不同的化合物集中到不同的部位中去，提高了它們的相對濃度并充分避免了交叉；水相大孔樹脂水洗部分因主要含有蛋白質、多糖等親水性成分，棄去不用則避免了它們對篩選造成的干擾，而原藥材的其它成分得到了完整的保留。本發明藥物篩選備選庫與現有的其它幾種藥物篩選備選庫的比較見表l。表1本藥物篩選備選庫與現有的其它幾種藥物篩選備選庫的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>本發明人發明的來源于中藥等的天然產物混合物藥物篩選備選庫，充分考慮到在以蛋白質晶體結構為基礎進行藥物篩選過程中的蛋白質體外活性測定實驗和x射線晶體學技術的要求，經過對原藥材的適當優化，不僅保持了受篩對象所含成分的完整性，保證了最大受篩量，而且去除了對篩選體系造成干擾的組分，提高了受試成分的相對濃度。另外，本藥物篩選備選庫的制備方法步驟簡化，成本低，操作快速簡便，且符合x射線晶體學篩選的要求，能快速、高效、準確地進行藥物篩選。顯然，使用本發明的天然產物混合物藥物篩選備選庫中的混合物樣品以x射線晶體學技術的篩選方法進行篩選，能夠高效、準確的尋找與耙蛋白特異性結合的包括抑制劑小分子在內的配體小分子，提高了篩選的效率和準確性。在木發明中，如果沒有特定的說明，其中的方法、裝置或物質等為本領域常規的，或者本領域技術人員根據本申請說明書的描述按照本領域常規技術可選用的。本文將在本發明中所引用的出版物、發明、文獻等以其全部內容引入作為參考。圖1本發明的來源于中藥等的天然產物混合物藥物篩選備選庫的組成示意圖。圖2-圖3本發明的魚腥草，野菊花，大青葉，蘆根，金銀花，連翹，黃芩，知母，四季青，穿心蓮，鴨跖草，梔子，射干，山豆根，馬勃，玄參，地骨皮的水相50%乙醇洗脫樣品對SARS主蛋白酶的抑制活性曲線圖。樣品濃度100jxg/mL圖4-圖5本發明的魚腥草，野菊花，大青葉，蘆根，金銀花，連翹，黃零，知母，四季青，穿心蓮，鴨跖草，梔子，射干，山豆根，馬勃，玄參，地骨皮的乙酸乙酯萃取樣品對SARS主蛋白酶的抑制活性曲線圖。樣品濃度100pg/mL圖6本發明的魚腥草、山豆根、梔子、知母、黃芩的乙酸乙酯萃取樣品對SARS主蛋白酶的抑制活性曲線圖。樣品濃度10pg/mL圖7本發明的川藏香茶菜乙酸乙酯萃取樣品、水相50X乙醇洗脫樣品對SARS主蛋白酶的抑制活性曲線圖。樣品濃度100jig/mL圖8本發明的川藏香茶菜乙酸乙酯萃取樣品、水相50%乙醇洗脫樣品對SARS主蛋白酶的抑制活性曲線圖。樣品濃度10pg/mL圖9本發明的SARS主蛋白酶活性位點附近電子密度對比圖。圖IO本發明的川藏香茶菜乙酸乙酯萃取物樣品中的存在的小分子的電子密度與SARS主蛋白酶活性位點Cysl45殘基電子密度形成共價鍵的顯示圖圖11本發明的SARS主蛋白酶與川藏香茶菜提取物乙酸乙酯萃取樣品作用前后的質譜圖。圖1220pM的川藏香茶菜丙素對SARS主蛋白酶的抑制活性曲線圖圖132pM的川藏香茶菜丙素對SARS主蛋白酶的抑制活性曲線圖圖14紫草、板藍根、香附、荔枝核、山藥、地骨皮、石韋、天花粉、百部、辛夷、荔枝、虎帳12種藥材的乙酸乙酯萃取樣品對HCVNS5B蛋白的抑制活性曲線圖圖15HCVNS5B蛋白His502活性位點附近電子密度對比圖圖16乙酰紫草素與未知電子密度的吻合具體實施例方式下述實施具體實施例僅僅用于天然產物混合物藥物篩選備選庫的制備方法及其應用，其不應當理解為以任何方式限制本發明的范圍。本領域技術人員根據本發明的描述，在不背離本發明的精神和主旨的情況下，可對本發明做出各種改變和變型。實施例l天然產物混合物藥物篩選備選庫中的樣品的制備(初級原料為傳統藥材或未進行藥用開發的藥材的天然產物)源自川藏香茶菜(/.//wn'cw^ra/^Mwrato)的天然產物混合物備選樣品的制備1制備提取物浸膏取500克干燥粉碎的川藏香茶菜藥材，用4500毫升95%乙醇回流提取，提取3次，每次2小時，合并提取液，濃縮得浸膏；2制得乙酸乙酯部分稱取此浸膏10.5克，用85毫升雙蒸水懸浮，傾入IOOO毫升分液漏斗中，用乙酸乙酯萃取。每次萃取用乙酸乙酯850毫升，充分振搖，靜置6小時分層。共萃取6次，合并各次乙酸乙酯萃取物。萃取后得到乙酸乙酯相和水相。乙酸乙酯萃取物用EYELAN1001型旋轉蒸發儀蒸除溶劑，得干膏狀樣品備用；3制得大孔樹脂50%乙醇和95%乙醇洗脫部分萃取后的水相部分用EYELAN1001型旋轉蒸發儀蒸除水中溶解的少量乙酸乙酯，用HP-20型大孔樹脂柱層析分離(大孔樹脂用170毫升，玻璃柱規格30X300mm)，依次用水、50%乙醇、95%乙醇為流動相洗脫。水洗脫8次，每次洗脫250毫升，棄去水洗部分。50%乙醇和95%乙醇各洗脫5次，每次洗脫300毫升。每部分均使用EYELAN1001型旋轉蒸發儀蒸除溶劑，得干膏狀樣品備用；4得到川藏香茶菜提供的天然產物混合物備選樣品上述步驟(2)制得的乙酸乙酯相部分、步驟(3)制得的50%乙醇洗脫部分和95%乙醇洗脫部分等3部分即組成了初級原料川藏香茶菜提供的3份混合物備選樣品。源自其它傳統藥材或未進行藥用開發的藥材的天然產物混合物備選樣品的制備按照源自川藏香茶菜的天然產物混合物備選樣品的制備方法制備。實施例2以中藥處方為初級原料制備天然產物混合物藥物篩選備選庫中的樣品源自屮藥方劑"五味消毒飲"(清朝吳謙著《醫宗金鑒》中處方)的天然產物混合物備選樣品的制備l.制備提取物浸膏按照"五味消毒飲"處方中規定藥材種類和3倍用量金銀花60g，野菊花45g，蒲公英45g，紫花地丁45g，紫背天葵子45g組成初級原料，用2000毫升95%乙醇回流提取，提取3次，每次2小時，合并提取液，濃縮得浸膏一；另按照處方中規定藥材種類和用量組成初級原料，用2000毫升雙蒸水煎煮3次，每次1-3小時，煎煮液合并，濃縮得浸膏二。浸膏一和浸膏二都分別作為屮藥處方的提取物浸膏進行下一步的處理。2制得乙酸乙酯部分稱取浸膏一10.0克，用100毫升雙蒸水懸浮，傾入1000毫升分液漏斗中，用乙酸乙酯萃取。每次萃取用乙酸乙酯800毫升，充分振搖，靜置5小時分層。共萃取6次，合并各次乙酸乙酯萃取物。萃取后得到乙酸乙酯相一和水相一；稱取浸膏二10.0克，用同樣的方法得到乙酸乙酯相二和水相二。乙酸乙酯相一和二均使用EYELAN1001型旋轉蒸發儀蒸除溶劑，得干膏狀樣品備用；3制得大孔樹脂50%乙醇和95%乙醇洗脫部分萃取后的水相一部分用EYELAN1001型旋轉蒸發儀蒸除水中溶解的少量乙酸乙酯，用HP-20型大孔樹脂柱層析分離(大孔樹脂用180毫升，玻璃柱規格30X300mm)，依次用水、50%乙醇、95%乙醇為流動相洗脫。水洗脫7次，每次洗脫300毫升，棄去水洗部分。50%乙醇和95%乙醇各洗脫5次，每次洗脫300毫升，得到50%乙醇洗脫部分一和95%乙醇洗脫部分一。萃取后的水相二部分用同樣的方法得到50%乙醇洗脫部分二和95%乙醇洗脫部分二。每部分均使用EYELAN1001型旋轉蒸發儀蒸除溶劑，得干膏狀樣品備用；4制得"五味消毒飲"提供的天然產物備選樣品步驟(2)中制得的乙酸乙酯相一和二部分、步驟(3)中制得的50%乙醇洗脫一和二部分和95%乙醇洗脫一和二部分等6部分是初級原料"五味消毒飲"提供的天然產物混合物備選樣品。源自其它中藥處方的天然產物混合物備選樣品的制備按照源自中藥方劑"五味消毒飲"的天然產物混合物備選樣品的制備方法制備。實施例3源自海洋生物的天然產物混合物藥物篩選備選庫中的樣品的制備源自松節藻的天然產物混合物備選樣品的制備l.制備提取物浸膏取600克干燥粉碎的海藻-松節藻，用4800毫升95%乙醇回流提取，提取3次，每次2小時，合并提取液，濃縮得浸膏；2制得乙酸乙酯部分稱取此浸膏10.0克，用100毫升雙蒸水懸浮，傾入1000毫升分液漏斗中，用乙酸乙酯萃取。每次萃取用乙酸乙酯800毫升，充分振搖，靜置5小時分層。共萃取6次，合并各次乙酸乙酯萃取物。萃取后得到乙酸乙酯相和水相；乙酸乙酯相部分使用EYELAN1001型旋轉蒸發儀蒸除溶劑，得干膏狀樣品備用；3制得大孔樹脂50%乙醇和95%乙醇洗脫部分萃取后的水相部分用EYELAN1001型旋轉蒸發儀蒸除水中溶解的少量乙酸乙酯，用HP-20型大孔樹脂柱層析分離(大孔樹脂用180毫升，玻璃柱規格30X300ram)，依次用水、50%乙醇、95%乙醇為流動相洗脫。水洗脫7次，每次洗脫300毫升，棄去水洗部分。50%乙醇和95%乙醇各洗脫5次，每次洗脫300毫升。每部分均使用EYELAN1001型旋轉蒸發儀蒸除溶劑，得干膏狀樣品備用；4制得備選樣品步驟(2)中制得的上述乙酸乙酯相部分、步驟(3)中制得的50%乙醇洗脫部分和95%乙醇洗脫部分等3部分是松節藻提供的天然產物混合物備選樣品。源自其它海洋生物的天然產物混合物備選樣品的制備按照源自松節藻的天然產物混合物備選樣品的制備方法制備。實施例4以SARS冠狀病毒主蛋白酶晶體結構為基礎，使用按照本發明的天然產物混合物藥物篩選備選庫中的樣品的制備方法制備的天然產物混合物備選樣品進行抗SARS藥物篩選1.靶標蛋白質的選取SARS冠狀病毒主蛋白酶2003年，全球大范圍爆發了SARS疫情，而引起SARS的病原體最終被確認為一種未知的冠狀病毒一SARS冠狀病毒(Drosten，C.，Gunther，S.,Preiser,W.等人.NEnglJMed.2003，348:1967-76)。進一步的研究發現，SARS冠狀病毒的基因組編碼了兩個大的復制酶多蛋白(replicasepolyproteins)pp1a(486kDa)和pplab(790kDa)，這兩個蛋白被水解后產生病毒復制復合體的很多功能亞基。在水解過程中，SARS冠狀病毒的主蛋白酶起到了非常關鍵的作用。在主蛋白酶的作用下，復制酶多蛋白ppla和pplab被水解成十多個功能肽段，從而進一步發揮作用。如果能夠抑制SARS冠狀病毒主蛋白酶的水解作用，那么將會有效地抵御SARS冠狀病毒對人體的侵染。因此，SARS冠狀病毒的主蛋白酶是抗SARS藥物篩選的一個主要靶標蛋白。SARS冠狀病毒主蛋白酶(氨基酸序列見序列表部分l)在大腸桿菌菌株BL21(DE3)中表達后進行進一步分離純化(參見YangHetal.2003.TheCrystalStructuresofSARSVirusMainProteaseMproandItsComplexwithanInhibitor.PNAS，100(23):131卯-13195)。2SARS冠狀病毒主蛋白酶的晶體生長SARS病毒的主蛋白酶的結晶參見YangHetal.2003.TheCrystalStructuresofSARSVimsMainProteaseMproandItsComplexwithanInhibitor.PNAS,100(23):131卯-13195。我們在1.8—12%的PEG6000，3D/0二甲基亞砜(DMSO)，lmMDTT，lOOmMMES緩沖液(pH5,0-6.0)以及蛋白濃度為9一12mg/ml的情況下獲得了適合衍射的SARS冠狀病毒主蛋白酶的晶體。3天然產物混合物備選樣品的制備按照與制備源自川藏香茶菜的天然產物混合物備選樣品的制備方法制備源自其它17種(魚腥草，野菊花，大青葉，蘆根，金銀花，連翹，黃芩，知母，四季青，穿心蓮，鴨跖草，梔子，射干，山豆根，馬勃，玄參，地骨皮)的天然產物混合物備選樣品。4.天然產物混合物備選樣品對SARS主蛋白酶抑制活性的測定SARS主蛋白酶的活性測定是使用熒光底物MCA-AVLQSGFR-Lys(Dnp)-Lys-NH2(純度大于95%，上海吉爾生化有限公司)來完成的。用于熒光強度測定的儀器為FluoraskanAscent熒光儀(ThermoLabsystems,Helsinki,Finland),激發光和發射光的波長分別為320nm禾口405nm。將實施例l一3中得到的干膏狀天然產物混合物備選樣品溶于二甲基亞砜(DMSO)中使其終濃度為50mg/mL在緩沖溶液(50mMTris-HCl(pH7.3)，lmMEDTA(含或不含DTT))中加入SARS主蛋白酶(終濃度0.5pM)，天然產物混合物備選樣品的DMSO溶解物(如川藏香茶菜乙酸乙酯萃取物樣品的DMSO溶解物)使其終濃度為100|ag/mL，底物濃度為20iiM，298K放置10分鐘后，迅速加入熒光標記底物(MCA-AVLQISGFRL(DNP)L-NH2，終濃度20jtiM)。激發波長和發射波長分別為330nM和395nm，溫度保持298K，每2秒鐘記錄一次熒光讀數。對照不加入備選樣品，其余條件相同。結果示于圖2—圖8中。圖2—圖5以及圖7為18種中藥制得的天然產物混合物備選樣品對SARS主蛋白酶抑制活性的測定結果，其中每種備選樣品的濃度為100嗎/mL。由以上圖2—圖8可以看出，其中大部分備選樣品均對SARS主蛋白酶有抑制活性，其中抑制活性較好的有6種，分別是黃芩、魚腥草、山豆根、梔子、知母、川藏香茶菜的乙酸乙酯萃取物樣品。圖6和圖8是以上6種抑制活性較好的黃芩、魚腥草、山豆根、梔子、知母、川藏香茶菜的乙酸乙酯萃取物樣品的濃度稀釋至10pg/mL時的對SARS主蛋白酶抑制活性測定結果，可以發現，將黃芩、魚腥草、山豆根、梔子、知母、川藏香茶菜的乙酸乙酯萃取物濃度為1(^g/mL時，對SARS主蛋白酶仍有較強的抑制活性。這就說明在這5種中藥的乙酸乙酯萃取樣品中可能含有某種成分能夠有效的抑制SARS主蛋白酶的活性，也說明這5種中藥有可能成為治療SARS冠狀病毒的有效藥物。為了了解它們對SARS主蛋白酶抑制作用確切的分子機理，我們可以選擇這5種中藥的乙酸乙酯萃取樣品進行SARS主蛋白酶的晶體浸泡或共結晶實驗。5.SARS主蛋白酶晶體浸泡川藏香茶菜乙酸乙酯萃取樣品以川藏香茶菜乙酸乙酯萃取樣品為例，采用晶體浸泡的方法用來獲得SARS主蛋白酶與川藏香茶菜乙酸乙酯萃取物樣品接觸之后的晶體。采用如下方法制備晶體浸泡液將川藏香茶菜乙酸乙酯萃取物DMSO的溶解物10倍稀釋至晶體生長池液(1.812%的PEG6000，3%二甲基亞砜(DMSO)，lmMDTT，100mMMES緩沖液(pH5.0PH6.0))中，13000一15000rpm高速離心，之后取上清液，得浸泡液，備用。浸泡時，利用尼龍晶體環等工具，將已生長好的SARS主蛋白酶的晶體從結晶池液中取出，加入浸泡液中，浸泡4一6小時后，制得SARS主蛋白酶與川藏香茶菜乙酸乙酯萃取物接觸后的晶體。6.晶體衍射數據的收集和分析使用HamptonResearch公司的尼龍晶體環，從浸泡液中獲取浸泡一定(通常為2—48小時)的晶體；并迅速使用Rigaku公司的冷卻系統將晶體凍系統產生的低溫氮氣流中冷凍至-150。C一-180。C;使X射線通過晶體，間冷用時t使旋進法收集X射線衍射數據。選擇衍射質量好的晶體(分辨率最好大于2.6A)進行數據收集、處理，檢測是否有小分子的結合。通過觀察相同角度的SARS主蛋白酶母體和復合體活性位點電子密度圖(圖9)(藍色是蛋白質本身的電子密度)，可以發現，在復合體的活性位點能夠觀察到清晰的非蛋白質本身的電子密度(青色表示)，提示可能有小分子結合在蛋白質分子上。圖9a中顯示的是SARS主蛋白酶母體結構的活性位點附近的電子密度，圖9b為SARS主蛋白酶與川藏香茶菜乙酸乙酯萃取物樣品浸泡后晶體活性位點附近的電子密度。仔細觀察該處的電子密度(如圖9所示)，我們可以發現存在于川藏香茶菜乙酸乙酯萃取物樣品中的未知小分子的電子密度與SARS主蛋白酶活性位點處Cysl45的電子密度緊密結合在一起，提示我們這應該是小分子與Cys145的Y硫原子形成了共價鍵，從而抑制了SARS主蛋白酶的活性(如圖10所示)。7.結合小分子的分析與鑒定我們將SARS主蛋白酶(濃度為12mg/ml的SARS主蛋白酶水溶液)與川藏香茶菜乙酸乙酯萃取物樣品按照質量濃度比1:1-1:4的比例混合，并在4。C一16。C下作用6—18小時。將作用后的樣品，13,000—15，000rpm高速離心，棄去沉淀后，采用MALDI(matrix-assistedlaser-desorptionionization)譜對樣品進行分析，結果參見圖ll。從質譜的結果我們可以發現，在加入川藏香茶菜乙酸乙酯萃取物樣品后，分子量出現了明顯的偏移，這主要是因為蛋白質分子與川藏香茶菜乙酸乙酯萃取物樣品中的小分子結合的原因。通過質譜結果可以計算(用較高的質譜峰值減去較低的質譜峰)發現，結合的小分子分子量約為390Da。通過分析已有的川藏香茶菜成分，我們發現，在該分子量水平上，主要存在如下所示的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage28</formula>我們可以發現在川藏香茶菜的主要成分中，在該分子量范圍內，主要成分以二萜類化合物為主，包括川藏香茶菜甲、乙、丙、丁、戊、己素(分別對應上面PseurataA、PseurataB、PseurataC、PseurataD、PseurataE、PseurataF)，Isodomedin和Dihydropseurata)等。又由于結合在SARS主蛋白酶活性口袋處的小分子，和Cysl45的Y硫原子形成了共價鍵，推知該小分子為Michael受體類小分子，具有a，(3共軛不飽和雙鍵。基于分子量和化學環境的分析，得出結論結合的小分子為川藏香茶菜丙素或者Isodomedin。為了進一步驗證，我們從中國科學院云南昆明植物所獲得了川藏香茶菜丙素及Isodomedin的純化合物，按照以上所述的方法制備川藏香茶菜丙素以及Isodomedin與SARS主蛋白酶復合體的晶體，并進行了數據收集及分析。通過觀察電子密度，我們只在川藏香茶菜丙素浸泡過的SARS主蛋白酶的晶體發現了相似的電子密度，如圖9.c所示。因此可以確定，從川藏香茶菜乙酸乙酯萃取物樣品中發現的與SARS主蛋白酶相結合的抑制劑小分子應為川藏香茶菜丙素。8川藏香茶菜丙素對SARS主蛋白酶抑制活性的測定我們使用純品化合物小分子(川藏香茶菜丙素)，測定了其對SARS主蛋白酶的抑制活性。川藏香茶菜丙素對SARS主蛋白酶抑制活性的測定與步驟4基本相同(結果示于圖12)。然后改變川藏香茶菜丙素的濃度，在2nM測定其對SARS主蛋白酶的抑制活性(結果示于圖13)。從圖12—圖13中可以發現，20^iM的川藏香茶菜丙素對SARS主蛋白酶具有較強的抑制活性，當其濃度為2pM時對SARS主蛋白酶仍然有抑制活性。這就說明中藥川藏香茶菜里面含有的川藏香茶菜丙素能夠有效的抑制SARS主蛋白酶的活性，也說明川藏香茶菜丙素有望成為治療SARS的有效藥物。實施例5按照與實施例1中制備川藏香茶菜乙酸乙酯樣品的制備方法制備紫草、板藍根、香附、荔枝核、山藥、地骨皮、石韋、天花粉、百部、辛夷、荔枝、虎帳12種藥材的乙酸乙酯萃取樣品。實施例6以HCVNS5B晶體結構為基礎，使用按照本發明的天然產物混合物藥物篩選備選庫中的樣品的制備方法制備的天然產物混合物備選樣品進行抗HCV感染的藥物篩選l.耙標蛋白質的選取HCVNS5B蛋白HCV(HepatitisCVirus)屬于黃病毒科(flaviviridae)，是丙型肝炎的病原體。由于缺乏疫苗和有效的治療藥物，HCV感染已經成為一種世界性的流行病。隨著HCV復制過程重要蛋白以及這些蛋白與相關配體或抑制劑的精確三維結構的解析，基于這些蛋白的三維結構設計、篩選治療HCV感染的藥物，成為目前開發治療HCV藥物的重要手段。NS5B是HCV的RNA依賴的RNA聚合酶(RNA-dependentRNApolymerase,RdRp)，在HCV復制過程中起著關鍵的作用，是抗HCV感染的藥物篩選的主要靶標蛋白(Behrens,S.E等人EMBOJ1996:15(1)12-22)。但全長的HCVNS5B蛋白溶解性較差，Ferrari(Ferrari，等人1999)等為提高NS5B的溶解性，在構建NS5B表達載體時切除了C端的21個氨基酸(稱為HCVNS5BA21)，在E.Coil中獲得了保持酶活性的高度可溶的蛋白。雖然在HCV不同的基因型和亞型中，NS5B的蛋白質序列不盡相同，但是相關活性位點卻非常保守，這就為我們從已解析結果的NS5B出發，篩選針對不同基因型的藥物提供了重要的依據。構建在pET-21b載體上的HCVNS5BA21:genotypelb，isolateBK(丙型肝炎病毒基因型lb分離株BK缺失C端21個殘基的NS5B:氨基酸序列見序列表部分2)質粒獲贈于中科院生物物理所高光俠教授實驗室，該質粒在大腸桿菌菌株BL21(DE3)中表達后進行進一步分離純化參見(Ago,等人1999)。2.HCVNS5B蛋白的晶體生長HCVNS5B的晶體生長參見(Ago，等人1999),我們在結晶池液20-25%(w/v)PEG4000，10。/。(v/v)甘油，5mMDTT，50mMMESpH5.06.0和2530mg/ml的蛋白濃度下，能夠得到尺寸較大、衍射能力很強的晶體，為進一步的藥物篩選工作提供了良好的晶體學基礎。3.天然產物混合物備選樣品的制備選用實施例5制備的天然產物混合物備選樣品4.天然產物混合物備選樣品對HCVNS5B抑制活性的測定HCVNS5B的體外活性測定方法參見(RobertA.等人.JournalofVirology,July2003:7575-7581)天然產物混合物備選樣品對HCVNS5B的抑制活性如下測定在緩沖溶液20mMTris-HCl(pH7.5)，5mMMgC12，0.5mMMnC12，ImMDTT，lmg/mlpolyA，1mg/mlOligodT(18T)，lmg/mlUTP，1mg/mlP32國UTP中加入HCVNS5B蛋白(終濃度0.8jig/ml)，天然產物混合物備選樣品的DMSO溶解物(終濃度20ug/ml、10ug/ml)，每5分鐘取樣一次，將到達取樣時間的2-4pl反應后的溶液滴于處理好的DEAE濾紙上以終止反應。當反應完成后，用2XSSC溶液和95X乙醇先后洗滌DEAE濾紙4次，以除去殘余P32-UTP，晾干后，使用Phosphorlmage或者底片曝光，以測定中藥混合物備選樣品對HCVNS5B的抑制活性，結果示于圖14。由圖14可以看出紫草、山藥、虎帳的乙酸乙酯萃取樣品對HCVNS5B蛋白有較好的抑制活性。選定這些樣品進行下一步的晶體浸泡工作。5.HCVNS5B蛋白的晶體浸泡紫草乙酸乙酯萃取樣品采用晶體浸泡的方法使HCVNS5B蛋白的晶體與紫草乙酸乙酯萃取樣品接觸。HCVNS5B蛋白的晶體浸泡液的制備與實施例2中5SARS主蛋白酶的晶體浸泡液的制備方法基本相同。HCVNS5B蛋白的晶體浸泡紫草乙酸乙酯萃取樣品的方法與SARS主蛋白酶的晶體浸泡川藏香茶菜乙酸乙酯萃取樣品的方法基本相同。6、晶體衍射數據的收集和分析HCVNS5B蛋白的晶體與紫草乙酸乙酯萃取樣品接觸后的晶體(簡稱復合體)的數據收集和分析與實施例4步驟6中基本相同。通過觀察相同角度的HCVNS5B蛋白母體的晶體和復合體活性位點電子密度圖(圖15)，可以發現，在復合體的活性位點能夠觀察到清晰的非蛋白質本身的電子密度(紅色部分)，提示可能有小分子結合在蛋白質分子上。7結合小分子的分析與鑒定采用本發明提供的以蛋白質晶體結構為基礎，從本發明的藥物篩選備選庫中獲取靶分子與靶蛋白復合體精細三維結構的方法中步驟(7)提出的另外一種分析結合小分子的方法對結合的小分子進行分析和鑒定。紫草(Sinkiang)屬紫草科藥用多年生草本植物，味甘、性寒，歸心肺經。因其涼血活血、解毒透疹的顯著功效，在各中醫藥典籍中均有詳細記載。在《本草綱目》中以解表涼血、清熱解毒、活血化淤等廣譜療效被列為上品(以根入藥)。在現代醫學研究中，因其具有抗感染、促進傷口愈合、抗腫瘤、抗微生物和抗血栓等眾多功效，被廣泛地用于醫學研究和疾病治療(Papageorgiou等人,1999."TheChemistryandBiologyofAlkannin，Shikonin,andRelatedNaphthazarinNaturalProducts."Angew.Chem.Int.Ed.39:270-300)。到目前為止，已經鑒定出紫草中的多種主要成分，這些主要成分對紫草在治療疾病方面的療效起著關鍵性的作用。而相關研究(Papageorgiou等人，1999.)表明這些成分主要都是紫草素(skikonin/alkannin)母核的衍生物，該母核的結構式為紫草中主要成分的母核的結構式。其中R基團不同代表不同的化合物。目前已知的R基團包括如下面所示的36種。我們首先根據未知電子密度的顯示，去除一些基團過大而不可能放入該處電子密度的化合物。然后準備候選的小分子的PDB數據，讀入COOT后，利用COOT的RealspaceRefinement的功能，將不同的小分子在電子密度中進行修正。結果顯示，乙酰紫草素與未知電子密度的吻合較好，結果如圖16所示。8、結合小分子—乙酰紫草素抑制HCVNS5B的抑制機理Qin.W等人的石if究(Qin.w等人2002.01igomericinteractionofhepatitisCvirusNS5BiscriticalforcatalyticactivityofRNA-dependentRNApolymerase.J.Biol.Chem.277'.2132-2137)顯示NS5B存在一個重要的二體化位點(由Glul8和His502構成)。當NS5B要行使其聚合酶活性的時候，一個單體NS5B上的Glul8需要和另外一個單體NS5B上的His502位氨基酸結合，形成二體化的NS5B活性單位。在這一過程中，一旦有其他小分子預先和Glul8或者His502結合，將會阻礙NS5B形成二體化的活性單位，使其失去酶活性。由圖16可以看出，乙酰紫草素與HCVNS5BHis502咪唑環上的N原子形成了氫鍵，因而阻止了NS5B二體化活性單位的形成，從而抑制了NS5B的聚合酶活性。這就說明中藥紫草里面含有的乙酰紫草素能夠有效的抑制NS5B的活性，也說明乙酰紫草素有望成為治療HCV感染的有效藥物。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage33</formula>補充說明圖2-圖3:天然產物水相50%乙醇洗脫樣品對SARS主蛋白酶活性的抑制曲線。天然產物樣品濃度100ng/mL。圖4-圖5:天然產物乙酸乙酯萃取樣品對SARS主蛋白酶活性的抑制曲線。天然產物樣品濃度100(ag/mL。圖6:天然產物乙酸乙酯萃取樣品對SARS主蛋白酶活性的抑制曲線。天然產物樣品濃度10pg/mL。圖9:SARS主蛋白酶活性位點電子密度圖對比。a為SARS主蛋白酶母體晶體活性位點的電子密度顯示;b為SARS主蛋白酶與川藏香茶菜乙酸乙酯萃取物浸泡后晶體活性位點的電子密度顯示;c為SARS主蛋白酶與川藏香茶菜丙素浸泡后晶體活性位點的電子密度顯示。圖中顯示的電子密度，藍色為2/o/c電子密度，為l.Osigma，青色和綠色為//b/c差值電子密度，為2.5sigma。圖IO:未知小分子的電子密度與SARS主蛋白酶活性位點Cysl45殘基電子密度形成共價鍵。蛋白質分子用白色飄帶圖表示，活性位點的Cysl45殘基用球棍模型表示，藍色電子密度表示Cysl45的電子密度，紅色電子密度表示未知小分子的電子密度。圖ll:藍色表示SARS主蛋白酶本身的質譜峰;紅色表示SARS主蛋白酶與川藏香茶菜乙酸乙酯萃取物作用后的質譜峰。圖15:HCVNS5B蛋白His502活性位點附近電子密度對比。a為母體活性位點的電子密度；b為浸泡過紫草乙酸乙酯萃取物之后該處的電子密度，c為b旋轉90°后的顯示。圖中電子密度為l.Ocr，差值電子密度為2.3a。序列表<110>清華大學、南開大學、中國科學院生物物理研究所〈120〉從中藥等天然產物混合體系中高效、快速獲取靶分子與靶蛋白復合體精細三維結構的新方法〈160〉2〈210>1〈211>306〈212>prt〈213〉SARS冠狀病毒(SARSCoronavirus)<400〉1SerGlyPheArgLys1MetValAspAspMetLeu50SerPhe65SerMetLysThrSerValAlaMet130CysGly145TyrMetLeuGluAlaAlaTyrAla210ThrThrGinThr35AsnLeuGinProLeu115ArgSerHisGlyGly195AlaLeuVal20ValProValAsnI^ys100AlaProValHisLys180ThrValAsn5ThrTyrAsnGinCys85TyrCysAsnGlyMet165PheAsplieAspMetCysCysTyrAla70LeuLysTyrHisPhe150GluTyrThrAsnPheAlaGlyProGlu55GlyLeuPheAsnThr135AsnLeuGlyThrGly215AsnPheThrArg40AspAsnArgValGly120lielieProProlie200AspLeuProThr25HisLeuValLeuArg105SerLysAspThrPhe185ThrArgValSer10ThrValLeuGinLys90lieProGlyTyrGly170ValLeuTrpGlyLeulielieLeu75ValGinSerSerAsp155ValAspAsnPhe225230AlaMet235LysAsnCysArg60ArgAspProGlyPhe140CysHisArgValLeu220LysValGlyThr45LysValThrGlyVal125LeuValAlaGinLeu205AsnTyrGluLeu30AlaSerlieSerGin110TyrAsnSerGlyThr190AlaArgAsnGly15TrpGluAsnGlyAsn95ThrGinGlyPheThr175AlaTrpPheCysLeuAspHisHis80ProPheCysSerCys160AspGinLeuThrTyrGlu240ProLeuThrGinAspHisValAsplieLeuGlyProLeuSerAlaGin245250255ThrGlylieAlaValLeuAspMetCysAlaAlaLeuLysGluLeuLeu260265270GinAsnGlyMetAsnGlyArgThrlieLeuGlySerThrlieLeuGlu275280285AspGluPheThrProPheAspValValArgGinCysSerGlyValThr290295300PheGin305〈210〉<211><212>〈213〉BK)2566PRT丙型肝炎病毒基因型lb分離株BK(H印atitis〈400〉2SerMetSer1GluGluHisHisGinLys50ArgAsp65LysLeuAlaArgSerLysAspThr130PheCys145ValPheAspValThrAsn35LysValLeuSerAla115GluValProValPheGinTyr195TyrLys20LeuValLeuSerLys100ValThrGinAspSer180SerThr5LeuValThrLysVal85PheAsnProProLeu165ThrProTrpProTyrPheGlu70GluGlyHislieGlu150GlyLeuGlyThrlieAlaAsp55MetGluTyrlieAsp135LysValProGinGlyAsnThr40ArgLysAlaGlyArg120ThrGlyArgGinArg200AlaAla25ThrLeuAlaCysAla105SerThrGlyValAla185ValLeu10LeuSerGinLysLys90LysVallieArgCys170ValGlulieSerArgValAla75LeuAspTrpMetLys155GluMetPheThrAsnSerLeu60SerThrValLysAla140ProLysGlyLeuCVirusHCV，genotypelb，isolateProSerAla45AspThrProArgAsp125LysAlaMetSerVal205CysAla15LeuLeu30SerLeuAspHisValLysProHis95AsnLeu110LeuLeuAsnGluArgLeuAlaLeu175SerTyr190AsnAlaAlaArgArgTyrAla80SerSerGluVallie160TyrGlyTrpLysAlaLysLysCysProMetGlyPheAlaTyrAspThrArgCysPhe210215220AspSerThrValThrGluAsnAsplieArgValGluGluSerlieTyr225230235240GinCysCysAspLeuAlaProGluAlaArgGinAlalieArgSerLeu245250255ThrGluArgLeuTyrlieGlyGlyProLeuThrAsnSerLysGlyGin260265270AsnCysGlyTyrArgArgCysArgAlaSerGlyValLeuThrThrSer275280285CysGlyAsnThrLeuThrCysTyrLeuLysAlaAlaAlaAlaCysArg290295300AlaAlaLysLeuGinAspCysThrMetLeuValCysGlyAspAspLeu305310315320ValVallieCysGluSerAlaGlyThrGinGluAspGluAlaSerLeu325330335ArgAlaPheThrGluAlaMetThrArgTyrSerAlaProProGlyAsp340345350ProProLysProGluTyrAspLeuGluLeulieThrSerCysSerSer355360365AsnValSerValAlaHisAspAlaSerGlyLysArgValTyrTyrLeu370375380ThrArgAspProThrThrProLeuAlaArgAlaAlaTrpGluThrAla385390395400ArgHisThrProValAsnSerTrpLeuGlyAsnlielieMetTyr.Ala405410415ProThrLeuTrpAlaArgMetlieLeuMetThrHisPhePheSerlie420425430LeuLeuAlaGinGluGinLeuGluLysAlaLeuAspCysGin435440445GlyAlaCysTyrSerlieGluProLeuAspLeuProGinlie450455460ArgLeuHisGlyLeuSerAlaPheSerLeuHisSerTyrSer465470475GlulieAsnArgValAlaSerCysLeuArgLysLeuGlyVal485490LeuArgValTrpArgHisArgAlaArgSer500505SerGinGlyGlyArgAlaAlaThrCysGly515520AlaValArgThrLysLeuLysLeuThrPro530535LeuAspLeuSerSerTrpPheValAlaGlylieTyrlieGinProGly480ProPro495ValArgAlaArgLeuLeu510LysTyrLeuPheAsnTrp525lieProAlaAlaSerGin540TyrSerGlyGlyAsplie545550TyrHisSerLeuSerArg565555560權利要求1.天然產物混合物藥物篩選備選庫的制備方法，其特征在于包括如下步驟(a)、取初級原料，回流提取，合并提取液，濃縮得提取物浸膏；(b)、稱取所得浸膏，雙蒸水懸浮，用有機溶劑萃取，分離有機溶劑相和水相；合并水相，備用；合并有機溶劑萃取物，蒸除有機溶劑，得到干膏狀有機溶劑相成分，備用；(c)、蒸除步驟(b)得到的水相中的有機溶劑，用大孔樹脂柱層析分離，用水為流動相洗脫，棄去水洗部分；再用乙醇溶液洗脫；將乙醇溶液洗脫部分蒸除溶劑，得干膏狀樣品備用；(d)、上述步驟(b)中制得的干膏狀有機溶劑相部分、步驟(c)中制得的干膏狀樣品分別為制得的天然產物混合物備選庫的備選樣品，所有初級原料制得的每種備選樣品即組成天然產物混合物藥物篩選備選庫。2、根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(a)中用乙醇溶液回流提取，所用乙醇溶液與初級原料的質量比為6:1-12:1;對于初級原料為中藥處方的提取物浸膏的制備，則按照處方中規定的藥材種類和卜6倍按照處方中規定的用量組成初級原料，分別用70%-95%乙醇按上述同樣的方法制得浸膏一；另外，同樣則按照處方中規定的藥材種類和1-6倍用量組成初級原料，用水煎煮，煎煮液合并，濃縮得浸膏二；浸膏一和浸膏二都作為中藥處方的提取物浸膏進行下一步的處理；對于初級原料為微生物的提取物制備，將含有適量微生物的培養液過濾，得到固體微生物菌絲體和培養液濾液，培養液濾液保留；菌絲體超聲破碎，過濾，濾液濃縮得浸膏，此浸膏與培養液濾液都作為微生物的提取物進行下一步的處理；步驟(b)中萃取用有機溶劑為乙酸乙酯或氯仿；對于微生物提取物的培養液濾液部分直接用有機溶劑萃取，合并每次有機溶劑萃取物，蒸除有機溶劑，得到干膏狀有機溶劑相成分，備用；步驟(C)中:依次用水、50%乙醇、95%乙醇為流動相洗脫。3、根據權利要求2所述的方法，其特征在于步驟(a)中-用70%-95%乙醇回流提取2-4次，每次1-3小時；對于微生物的提取物制備中，是將菌絲體用60-90%丙酮超聲破碎；步驟(b)屮:浸膏與懸浮用雙蒸水的質量比為1:5-1:15;萃取用有機溶劑的體積與懸浮用水的體積比為6:1-10:1;步驟(C)中:水洗脫6-10次，50Q%乙醇和95%乙醇各洗脫4-6次；洗脫用水為2-4倍體積量的步驟(b)中懸浮用水量，洗脫用50%乙醇和95%乙醇量分別為2-4倍體積量的步驟(b)中懸浮用雙蒸水量。4、根據權利要求3所述的方法，其特征在于步驟(a)中用乙醇濃度為95%乙醇，回流提取次數3次，每次2小時；對于中藥處方的提取物浸膏二的制備中，是用雙蒸水煎煮3次，每次l-3小時，煎煮液合并，濃縮得浸膏二；對于微生物的提取物制備，是菌絲體用80%丙酮超聲破碎20-60分鐘；步驟(b)中浸膏與懸浮用雙蒸水的質量比l:10;萃取用有機溶劑的體積與懸浮用雙蒸水的體積比為8:1;萃取用有機溶劑為乙酸乙酯，萃取4-6次，萃取時需充分振搖，靜置5-8小時分層；對于微生物提取物的培養液濾液部分則直接用適宜量有機溶劑萃取4-6次，合并每次有機溶劑萃取物，蒸除有機溶劑，得到干膏狀有機溶劑相成分，備用；步驟(c)中所述的洗脫用水、50%乙醇、95%乙醇量分別為3倍體積量的歩驟(b)中懸浮用雙蒸水量；步驟(d)中上述步驟(b)中制得的干膏狀有機溶劑相部分、步驟(C)中制得的水相大孔樹脂50%乙醇洗脫部分和水相大孔樹脂95%乙醇洗脫部分得到的干膏分別組成天然產物混合物備選樣品。5、根據權利要求1-4中任一項所述的制備方法，其中所述的初級原料選自以下述的任一種或幾種傳統藥材、按中藥處方規定的藥材種類和用量組成的混合藥材、還未進行藥用開發的動植物品種、海洋生物、微生物。6、根據權利要求5所述的制備方法，其中所述的傳統藥材包括《中藥藥典》、"中華本草》、《中國植物志》收錄的中藥材品種、藏藥。7、根據權利要求1-6中任一項所述的制備方法制備得到的天然產物混合物藥物篩選備選庫。8、根據權利要求7所述的天然產物混合物藥物篩選備選庫的應用，其特征在于以蛋白質晶體結構為基礎，從該備選庫中進行藥物篩選。9、根據權利要求8所述的天然產物混合物藥物篩選備選庫的應用，其特征在于包括如下歩驟以靶標蛋白的晶體結構為基礎，從該備選庫中獲取靶分子與耙蛋白復合體精細三維結構。10、根據權利要求9所述的天然產物混合物藥物篩選備選庫的應用，其特征在于包括將靶標蛋白的晶體與天然產物混合物備選樣品接觸，分析將靶標蛋白的晶體與天然產物混合物備選樣品接觸后的晶體的X射線衍射數據，獲得與靶標蛋白結合的靶分子的電子密度，鑒定靶分子，進而獲得靶分子與靶蛋白復合體的精細三維結構。11、根據權利要求10所述的天然產物混合物藥物篩選備選庫的應用，其特征在于包括對得到的耙分子的優化和進一步的生物學實驗。12、根據權利要求8-11中任一項權利要求所述的天然產物混合物藥物篩選備選庫的應用，其特征在于是以蛋白質晶體結構為基礎，從該備選庫中進行抗SARS藥物篩選；或從該備選庫中進行抗HCV感染的藥物篩選。全文摘要本發明提供了適用于以蛋白質晶體結構為基礎進行藥物篩選的天然產物混合物藥物篩選備選庫的制備方法及該藥物篩選備選庫在以蛋白質晶體結構為基礎進行藥物篩選中的應用。本發明的制備方法高效、快捷、準確、可靠、實用。通過對原藥材的優化，避免了干擾成份，而又使原藥材的其它成分得到完整的保留。本發明的藥物篩選備選庫，可方便的獲取靶分子與靶蛋白復合體精細三維結構。文檔編號C40B50/00GK101104955SQ200710064730公開日2008年1月16日申請日期2007年3月23日優先權日2007年3月23日發明者婁智勇,孫玉娜,饒子和,明馬申請人:南開大學;清華大學;中國科學院生物物理研究所