基于鞭毛蛋白的新型免疫佐劑化合物及其用途的制作方法

專利名稱：基于鞭毛蛋白的新型免疫佐劑化合物及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及在個人或動物中誘導和/或刺激免疫應答。具體地講，本發明涉及可用于免疫原性組合物和疫苗組合物的新型免疫佐劑化合物。
背景技術：
安全且有效的疫苗的開發仍是全球公共衛生的一個主要目標。具體地講，已出現被稱為“粘膜疫苗”的疫苗，作為可注射疫苗的吸引人的潛在替代品。粘膜給藥具有許多潛在地合乎需要的特征。開發粘膜疫苗遞送技術的最迫切的理由也許是，通過在許多侵入性病原體的粘膜進入部位產生局部免疫來形成免疫防御的第一道防線。此外，一些研究者已報道存在著普通粘膜免疫系統，憑借該系統，在一個部位誘導的粘膜免疫能導致在遠端粘膜部位的免疫(Mciihee，J.R.等人.The mucosal immune system from fundamental concepts tovaccine development (粘膜免疫系統從基石出概念到疫苗開發)· Vaccinel992,10 :75-88)。另外，通過粘膜部位遞送抗原具有還能產生全身免疫應答的潛力。這表明，通過以非侵入性方式(例如鼻內途徑或其他粘膜途徑)遞送疫苗，以引發針對可能在不同粘膜部位進入的各種各樣的病原體的免疫，可獲得極大的益處。現今的疫苗(粘膜疫苗或其他疫苗)大部分是由以下兩個主要組分組成的(i) 具有治療意義的靶標抗原和(ii)能刺激和/或誘導針對所述抗原的免疫原性的免疫佐劑化合物。已知的各種免疫佐劑在性質上相差甚大，但具體地講包含礦物油、細菌提取物、活的和減毒的生物體以及氫氧化鋁金屬的懸浮液。即使佐劑能提供增強的免疫應答，但它們的使用也會引起不良副作用，這主要取決于它們的給予途徑。因此，得到批準且在人類中有效的佐劑的數目仍相對有限。先天性免疫領域的進展已使人們更好地了解支配著宿主免疫應答的調節的細胞機制和分子機制。這一對免疫系統的更好的認識，已讓人們能研究和開發新的潛在有用的免疫佐劑。具體地講，toll樣受體(TLR)有助于哺乳動物體內的先天性免疫和適應性免疫的協同誘導。由于TLR是由多種多樣的細胞類型表達的，因此它們能夠在全身引發免疫。發生病原微生物感染后，TLR可識別被稱為微生物相關分子模式(MAMP)的保守模體。TLR的結合可誘導專事于對病原微生物的先天性清除和獲得性免疫的基因表達程序。 例如，TLR可誘導趨化因子的產生，趨化因子進而特異性吸引直接參與先天性微生物清除的多形核嗜中性粒細胞(PMN)。此外，TLR能促進多效性免疫介質(如TNFq)的分泌和專事于將抗原呈遞到淋巴細胞的樹突細胞(DC)的功能性成熟。
因此，TLR激動劑不僅能刺激“廣泛特異性的”促炎免疫應答，而且能增強對限定的抗原的適應性免疫應答，因此被認為是免疫佐劑。盡管這些潛在有利的作用，但由于MAMP有全身毒性，這促使了人們努力開發能使 MAMP活性偏向于佐劑作用的衍生物。的確，將分子工程改造成具有獨特的性質，這是操縱免疫應答中的一個重大挑戰。細菌鞭毛蛋白(許多細菌病原體中的主要鞭毛成分)是用于TLR5活化的特異性、 獨特激動劑。來自鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella enterica Serovar Typhimurium, (S. Typhimurium))的FliC鞭毛蛋白是有關鞭毛結構-功能、免疫性和TLR5信號轉導的研究的典范。它是具有兩個獨特結構域的含494個氨基酸的蛋白質。氨基和羧基末端“保守”區域形成對于TLR5活化必不可少的結構域。鞭毛蛋白FliC的中間結構域包含對于TLR5信號轉導非必須的氨基酸。它被稱為 “超可變”區，因為一級序列在組成和大小上隨細菌種類的不同而大大不同。與此相對，已知超可變區為鞭毛蛋白抗原性所必需。已證實靜脈內(i. V.)注射鞭毛蛋白能促進全身應答，全身應答由促炎介質(如 TNF α或IL-6)的產生和DC活化來表征。此外，鞭毛蛋白還能引發粘膜特異性的先天性和適應性防御機制。例如，上皮細胞系和肺粘膜能上調趨化因子樣CXCL8(IL-8)和CCL20的產生，CXCL8 (IL-8)和CCL20進而分別募集粘膜PMN和DC。不同的作者還報道了鞭毛蛋白是強效的全身和粘膜免疫佐劑，其能引起(i)血清和/或分泌性抗體應答和(ii)對鞭毛蛋白本身和共給予的抗原的Thl和Th2細胞應答。由于鞭毛蛋白的強效的全身和粘膜免疫佐劑活性，它們對于疫苗尤其是粘膜疫苗類型的開發來說可特別值得關注。但是，大多數的所述鞭毛蛋白型佐劑不完全適合于這種疫苗應用，特別是適合于所述粘膜疫苗策略。的確，已知的鞭毛蛋白佐劑呈現重大的副作用，具體而言是當體內給予時，呈現固有的抗原活性和全身促炎性質。此外，大多數的已知的鞭毛蛋白型免疫佐劑需要與靶標抗原物理連接，以便當體內給予時能引起強效的免疫應答。這個要求迫使需要額外的復雜操作以便獲得合適的鞭毛蛋白抗原連接和最終的有用的免疫原性物質。因此，需要這樣的新的化合物，它們可用作免疫佐劑，特別是用于誘導和/或增強對抗原的粘膜免疫應答，引人注目的是又不會引起任何重大的全身炎癥副作用。有利地，這些新的化合物還應能夠簡單地與靶標抗原混合就能引發免疫應答。本發明于是提出能滿足這個需要且尤其可用于生產免疫原性組合物和疫苗(特別是粘膜型疫苗)的新的免疫佐劑化合物。發明_既述根據本發明，已發現了衍自來源于SEQ ID N° 1類型的鼠傷寒沙門氏菌的鞭毛蛋白的新型肽化合物呈現出體內免疫佐劑活性，這在本文的實施例中進行說明。
根據本發明，還證實這些新型佐劑化合物尤其呈現出粘膜佐劑性質，而又不會造成顯著的全身促炎作用。本發明的所述新的衍自鞭毛蛋白的化合物因此尤其可用作免疫佐劑物質，有利地用以誘導和/或增強粘膜免疫應答。本發明因此涉及這樣的免疫佐劑化合物，其包含a)與起始于位于SEQ ID N0 1的位置1的氨基酸殘基、終止于選自位于SEQ ID N0 1的位置99至173的氨基酸殘基中的任何一個的氨基酸殘基的氨基酸序列具有至少 90%氨基酸同一性的N末端肽；和b)與起始于選自位于SEQ ID N。1的位置401至406的氨基酸殘基中的任何一個的氨基酸殘基、終止于SEQ ID N0 1的位置494的氨基酸殘基的氨基酸序列具有至少90% 氨基酸同一性的C末端肽，其中-所述N末端肽和C末端肽直接互相連接，或者-所述N末端肽和C末端肽通過間隔鏈間接互相連接。本發明的免疫佐劑化合物的優選實施方案在下文的描述中進行詳細說明。本發明還涉及包含上文中(或者下文的描述中)所定義的免疫佐劑化合物以及一種或多種藥物可接受的賦形劑的藥物組合物。根據本發明的藥物組合物包含上文中所定義的免疫佐劑化合物以及一種或多種抗原。所述藥物組合物因此有利地為免疫原性組合物(即旨在引起針對抗原的免疫應答以(例如)產生抗體的組合物)或者疫苗組合物(即旨在在受試者或動物中引起免疫應答以治療或預防疾病的組合物)。根據本發明的一個優選實施方案，所述免疫原性組合物或所述疫苗有利地包含不與所述一種或多種抗原共價連接的本發明所述免疫佐劑化合物。本發明還涉及供用作藥物的上文中所定義的免疫佐劑化合物(特別是用以誘導和/或增強粘膜佐劑活性)。本發明還涉及本發明的免疫佐劑化合物用于制造這樣的藥物組合物的用途，該藥物組合物尤其用于引起和/或增強針對鞭毛蛋白之外的一種或多種的抗原的免疫應答(尤其是在通過粘膜途徑給予后在粘膜區室中引起和/或增強)。本發明還涉及⑴編碼以上所公開的免疫佐劑肽化合物的核酸，(ii)包含插入其中的所述核酸的重組載體，(iii)轉染或轉化有所述核酸或所述重組載體的宿主細胞。附圖簡述

圖1.缺失超可變區的鞭毛蛋白的特性和交叉反應性。(A)重組鞭毛蛋白的示意性三維視圖。野生型鞭毛蛋白FliC的結構用Pymol (http://www. pymol. org)在左側小圖中示出。在單體中，末端區域(1-170和400-494)緊密折疊成α -螺旋，形成參與鞭毛功能的結構域。模體89-96(黑色)對于TLR5信號轉導是必不可少的。FliC “超可變”結構域主要由β結構和β轉角組成。使用Swiss 模型(http://www.expasy.org/spdbv/)預測了 FliCA 204^292 和FliC.174_400的總體結構，FliC.204_292和FliCM74_4(1(1分別表示超可變區的部分缺失和完全缺失。對于Fl iCΔ 191_352，表示該缺失的氨基酸的位置在左側小圖示出。Fl iCΔ 174_400和 FliCM91_352分別在缺失交匯處含有GAAG接頭和LELE接頭。(B, OFliC特異性血清的交叉反應性。超免疫血清是在皮下給予用CFA配制的鞭毛蛋白進行初次免疫、隨后進行IFA加強免疫之后獲得的。在 ELISA 中滴定血清的 FliC、FliC,2Q4_292、FliCM91_352 和 FliCM74_4(1(1。 結果代表2個實驗。(B)抗FliC血清的交叉反應性。(C)抗FliCM74_4(1(1&清的交叉反應性。統計學顯著性(Mann-Whitney試驗中ρ > 0. 05)由星號表示。圖2.缺失超可變區的鞭毛蛋白的上皮和粘膜促炎活性。(Α，B)重組鞭毛蛋白對上皮細胞的活化。人上皮細胞用鞭毛蛋白FliC、FliC
Δ 204-292 Λ Fl iCA 191_352^ Fl lCA 174_4oo SC
FIiCa!74-400/89-96*以指定的濃度進行活化。將含有報道融合體CCL20_luc的Cac0-Rumb0細胞活化6小時，并將螢光素酶活性歸一化到用飽和FliC水平測量的最大活性(A)。將BEAS-2B 支氣管上皮細胞刺激16小時，然后測量上清液中的IL-8水平。結果代表2個獨立實驗中的一個⑶。(C-D)缺失的鞭毛蛋白對粘膜先天性應答的刺激。將重組鞭毛蛋白或胰蛋白酶處理的制品(Iyg當量)i.n.給予麻醉的小鼠(η = 3-5)。2小時后，用實時qRT-PCR測定全肺中的CCL20特異性mRNA水平(C)。滴注后六小時，對BAL (黑色柱)和肺(空心柱)取樣測量CCL20濃度(D)。在Mann-Whitney試驗中確定統計學顯著性(ρ > 0. 05)。圖3.具有超可變區缺失的鞭毛蛋白的佐劑作用。在第1天和第21天用卵清蛋白(OVA) 士鞭毛蛋白或霍亂毒素(CT) i. η.免疫小鼠 (n = 8)。在第35天，在血清(A)和BAL⑶中測量OVA特異性IgG滴度。測定BAL中的OVA特異性IgA的濃度(C)。結果代表2個獨立實驗中的1個。在Marm-Whitney試驗中確定統計學顯著性(ρ > 0. 05)。圖4.缺乏超可變區的鞭毛蛋白的固有抗原性質。在第1天和第21天用卵清蛋白(OVA) 士鞭毛蛋白或霍亂毒素(CT)或LPSi. η.免疫小鼠(n = 8)。在第35天，在血清㈧和BAL(B)中測量FliC特異性IgG滴度。結果代表2個獨立實驗中的1個。在Mann-Whitney試驗中確定統計學顯著性(ρ > 0. 05)。圖5.鞭毛蛋白特異性抗體對TLR5信號轉導的中和作用。在第1周用1 μ g鞭毛蛋白FliC和CFA皮下免疫NMRI小鼠，然后在第3、5、7周用 FliC和IFA加強免疫。在模擬條件下，類似地用卵清蛋白和佐劑或者單獨用佐劑對動物進行處理。實驗在第9周進行。
(A)鞭毛蛋白特異性免疫血清的體外TLR5中和活性。用與50% v/v FliC超免疫血清(空心圓圈)或模擬血清(黑色圓圈)溫育的鞭毛蛋白FliC，將含有報道構建物CCL20-luc的Caco-Rumbo上皮細胞活化6小時。測定螢光素酶活性，并歸一化到用lOOng/mlFliC獲得的活性。結果代表3個獨立實驗中的1個。(B, C)鞭毛蛋白特異性免疫血清的體內TLR5中和活性。給經免疫的動物(n = 3)靜脈內注射PBS (黑色柱)或者0. 1 μ g (灰色柱)或1 μ g 的鞭毛蛋白FliC(空心柱)。2小時后收集血清，通過ELISA測定CCL20 (B)和CXCL2 (C)的濃度。(D)免疫血清的中和活性。給動物(每個劑量η =幻靜脈內被動轉移不同數量的鞭毛蛋白特異性血清或模擬血清，1小時后用所指示的重組鞭毛蛋白靜脈內處理。通過ELISA測量攻擊后2小時血清中的趨化因子產生量。用Mann-Whitney試驗確定統計學顯著性(ρ > 0. 05)。圖6.鞭毛蛋白FliC和FliCA174_4QQ的鼻內劑量響應活性。給小鼠(n = 3-5) i. η.滴注不同數量的鞭毛蛋白FliC(黑色方框)或 FliCA174_4QQ(空心方框)。6小時后，用ELISA測定BAL中的CCL20 (A)和CXCL2 (B)的濃度。在Mann-Whitney U試驗中確定統計學顯著性(ρ > 0. 05)。圖7.缺失超可變區的鞭毛蛋白FliCA174_4QQ的全身活化能力的改變。靜脈內給予不同數量的鞭毛蛋白FliC(黑色方框)或FliCM74_4QQ (空心方框)。2 小時后，用ELISA測定血清中的CCL20 (A)和CXCL2 (B)的濃度。在Mann-Whitney試驗中測定統計學顯著性(ρ > 0. 05)。圖8.各種重組的缺失超可變區的鞭毛蛋白的SDS PAGE分析。圖8 是重組產生的 FliCA174_4QQ、FliC, 161_4Q5、FliC, 138_4Q5 和 FliC, 1Q(1_4(15 用考馬斯藍染色后的SDS PAGE電泳的照片。圖9.各種重組的缺失超可變區的鞭毛蛋白的免疫印跡分析。圖9 是重組產生的 FliCA174_4Q(1、FliCA161_4(15、FliCA138_4(15 和 FliCA1(1(1_4(15 在用抗 FliC 抗體染色后的蛋白質印跡電泳的照片。圖10.各種重組的缺失超可變區的鞭毛蛋白對CCL20趨化因子的生成的誘導。經缺失的鞭毛蛋白對全身先天性應答的刺激。將重組鞭毛蛋白或經胰蛋白酶處理的制品(IOyg當量)腹膜內給予小鼠(n = 2)。注射后兩小時，采集血清樣本測量CCL20濃度。圖11.各種重組的缺失超可變區的鞭毛蛋白對CXCL2趨化因子的生成的誘導。經缺失的鞭毛蛋白對全身先天性應答的刺激。將重組鞭毛蛋白或經胰蛋白酶處理的制品(IOyg當量)腹膜內給予小鼠(n = 2)。注射后兩小時，采集血清樣本測量CXCL2濃度。圖12.重組FliC,174_■對于針對來自HIV病毒的gpl40抗原的免疫的佐劑作用。在第1天和第21天用gpl40 (5 μ g) 士鞭毛蛋白(1 μ g) i. η免疫小鼠(n = 6)。在第35天，測量血清(實心符號)和BAL (空心符號)中的gpP140特異性IgG滴度。結果代表2個獨立實驗中的1個。
圖13. FliC在固定化有抗FliCM74_■小鼠單克隆抗體的免疫親和基材上的純化循環的^Onm色譜圖。圖14.在FliC在固定化有抗FliCM74_■小鼠單克隆抗體的免疫親和基材上的純化循環過程中收集的各種色譜流份的電泳分析。圖14是收集的流份(如圖13中所示)在用考馬斯藍染色后的SDSPAGE電泳的照片。發明詳述根據本發明，已證實新型化合物能誘導體內粘膜免疫佐劑活性，使得當將所述新型化合物與靶標抗原一起給予時，可以誘導針對該合適的相應的抗原的免疫應答。引人注目的是，本文已證實本發明的新型佐劑化合物在鼻內給予小鼠后也能發揮其免疫佐劑性質。本發明的所述免疫佐劑化合物因此能夠加強全身和粘膜免疫應答。還已證明本發明的所述鞭毛蛋白衍生的免疫佐劑化合物具有TLR5介導的粘膜佐劑性質，其雖有體內粘膜促炎作用，但在全身注射后不顯示任何顯著的全身促炎副作用。此外，本文實施例中所含的結果顯示，所述鞭毛蛋白衍生的免疫佐劑化合物不顯示顯著的固有抗原作用，即，當通過鼻內途徑給予時目的分子能防止或減弱引發鞭毛蛋白特異性抗體顯著地進入血清或支氣管肺泡灌洗液(BAL)的能力。以上結果表明，本發明的所述鞭毛蛋白衍生的免疫佐劑化合物可用作免疫應答的有效佐劑，尤其是用于誘導粘膜免疫應答。因此，引人注目的是，所述肽化合物當它包含在(i)粘膜疫苗組合物中時可用于通過誘導受試生物體體內的粘膜免疫應答而防止或治療疾病，或者當它包含在(ii)免疫原性組合物中時可用于增強或引發針對所期望的抗原的免疫應答。具體地講，如本文的實施例中所示，本發明人已發現出乎意料的是，TLR5信號轉導是區室化的，因為新的特別的FliCM74__鞭毛蛋白(即來自鼠傷寒沙門氏菌ATCC14(^8鞭毛蛋白FliC的肽序列SEQ IDN0 1從位置174至位置400發生缺失所得的鞭毛衍生肽)能刺激粘膜中的免疫性，但毫無任何顯著的全身促炎作用。本發明人還確定，FliCM74_■鞭毛蛋白由于產生中和性fliC特異性抗體的能力差，因此具有突出的有利性質。另外，本發明已發現，與野生型鞭毛蛋白相比，FliC,174_■鞭毛蛋白的全身信號轉導作用被大大削弱，而粘膜活性不受影響。本文還已證實，其他的缺失超可變區的鞭毛蛋白(包括FliCM61_4Q5和FliCM38_4Q5 在內)也被賦予免疫佐劑性質。本發明的免疫佐劑肽這些發現使本發明人得以設計出應具有與FliCM74_4(1(1、FliCM61_4(15和FliCM38_4。5 鞭毛蛋白相同的性質和優點的肽家族。所述肽家族從本文實施例中研究的FliCM74_4Q(1、FliCM61_4Q5和FliCM38_4Q5鞭毛蛋白出發并基于鞭毛蛋白肽序列SEQ ID N0 1和基于該肽的晶體結構進行定義，以預測可能具有剩余的TLR5刺激活性的截短形式。本發明因此有利地涉及這樣的免疫佐劑化合物，其包含a)具有起始于位于SEQ ID N0 1的位置1的氨基酸殘基、終止于選自位于SEQ IDN0 1的位置99至173的氨基酸殘基中的任何一個的氨基酸殘基的氨基酸序列的N末端肽； 和b)具有起始于選自位于SEQ ID N。1的位置401至406的氨基酸殘基中的任何一個的氨基酸殘基、終止于SEQ ID N0 1的位置494的氨基酸殘基的氨基酸序列的C末端肽，其中-所述C末端肽直接連接到N末端肽，或者-所述N末端肽和C末端肽通過中間間隔鏈間接互相連接。詞語“包含”及其語法變體當在本說明書中使用時，應理解為指示規定的特征、整數、步驟或組分或者它們的群組的存在，但并不排除一種或多種其他的特征、整數、步驟或組分或者它們的群組的存在或添加。本發明的化合物在本文中可以可互換地稱為“免疫佐劑化合物”或“鞭毛蛋白衍生肽”。所謂“免疫佐劑化合物”是理解為本發明的鞭毛蛋白衍生肽當給予受試者或動物時可誘導和/或增強針對抗原的免疫應答。它還意在表示通常有助于加速、延長或增強對特定抗原的特異性免疫應答的質量的物質。如本文中所描述，所述免疫佐劑化合物可與一種或多種抗原和藥物可接受的賦形劑一起用于疫苗組合物或免疫原性組合物。上述的SEQ ID N° 1的肽序列來源于鼠傷寒沙門氏菌ATCC14(^8鞭毛蛋白 FliC(登錄號 AAL20871)。多肽編號起始于最終N末端甲硫氨酸(SEQ ID N0 1中未顯示)之后的第一個氨基酸，該甲硫氨酸通常被細菌宿主細胞中的甲硫氨酸氨基肽酶切除，這在下文中提到。有利地，本發明的鞭毛蛋白衍生肽的N末端肽和C末端肽與SEQID N0 1的相應的氨基酸序列部分具有至少90%甚至更高的氨基酸同一性。同一性的描述及如何確定同一性是本領域技術人員公知的。本文意圖，給定的目的氨基酸序列當與參考氨基酸序列具有至少90 %、91%、 92%、93%、94%、95%、69%、97%、98%、99%或99. 5 %氨基酸同一性時，則所述目的氨基酸序列與所述參考氨基酸序列具有90 %或更高的同一性。為確定兩個氨基酸序列之間的同一性百分數，出于最佳比較的目的將序列進行比對。例如，出于比較目的，可在第一和第二氨基酸序列中的一個序列中或者同時在兩個序列中引入空隙以便最佳比對，且可忽視非同源的序列。出于最佳比較的目的，可使用CLUSTAL W(版本1.8 用以下參數獲知兩個氨基酸序列的同一性百分數(I)CPU MODE = Clustalffmp ； (2) ALIGNMENT = ((full)) ； (3) OUTPUT FORMAT = ((alnw/numbers)) ； (4)OUTPUT ORDER =《aligned》；(5)C0L0RALIGNMENT =《no》； (6) KTUP (word size)=《default》；(7) WINDOW LENGTH = ((default)) ； (8) SCORE TYPE = ((percent))； (9)T0PDIAG = ((default))； (lO)PAIRGAP = ((default))； (ll)PHYLOGENETIC TREE/ TREE TYPE = ((none))； (12)MATRIX = ((default))； (13) GAP OPEN = ((default))； (14) END GAPS =((default)) ； (15) GAP EXTENSION = ((default)) ； (16) GAPDI STANCES = ((default)) ； (17)TREE TYPE =《cladogram》和(18)TREE GRAP DISTANCES =《hide》。具體地講，應理解，可在不破壞本發明的鞭毛蛋白衍生肽的優點和活性的情況下， 作出微小的修飾。這種修飾包括在本發明的術語“免疫佐劑化合物”或“鞭毛蛋白衍生肽”的含義內， 只要特定的免疫活性得到保持，特別是TLR5介導的粘膜佐劑性質，而又沒有任何顯著的全身促炎副作用。此外，可將各種分子共價或非共價連接到本發明的鞭毛蛋白衍生肽，包括例如其他的多肽、碳水化合物、核酸或脂質。這些連接的分子最終存在于需求針對其的免疫應答的抗原中。這種修飾包括在本發明的定義內。微小的修飾還可例如涉及天然氨基酸的保守置換，以及摻入非天然氨基酸、氨基酸類似物和功能模擬物的結構變更。例如，賴氨酸殘基被認為是精氨酸殘基的保守置換。因此本文意圖，與參考的第二多肽具有至少90%氨基酸同一性的第一多肽涵蓋這樣的第一多肽，其與該參考的第二多肽相比包含一個或多個氨基酸差異，且其中所述氨基酸差異選自(i) 一個或多個氨基酸置換，( ) 一個或多個氨基酸缺失以及(iii) 一個或多個氨基酸添加，或者(i)、(ii)和(iii)的任何組合。一般來講，本發明因此涵蓋這樣的變體多肽，其與參考的多肽相比具有一個或多個氨基酸置換、缺失或添加，優選地與參考的多肽相比具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個氨基酸置換，和/或1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個氨基酸缺失和/或1、2、3、4、5、6、7、8、9或10
個氨基酸添加。本領域技術人員知道或能確定什么結構會構成功能上相當的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。如上所述，本發明鞭毛蛋白衍生肽的C末端肽和N末端肽可直接連接，有利地通過肽鍵共價連接。在一個另選的實施方案中，本發明鞭毛蛋白衍生肽的所述N末端肽和C末端肽通過間隔鏈間接地相互連接。應將間隔鏈選擇成不會干擾最終化合物的生物活性，且不會使最終化合物的免疫原性顯著增加。間隔鏈優選地由通過肽鍵連接在一起的氨基酸構成，且在本發明鞭毛蛋白衍生肽的N末端序列和C末端序列之間共價連接。因此，在優選的實施方案中，間隔鏈包含1至 20個通過肽鍵連接的氨基酸，其中氨基酸選自20個天然氨基酸。在一個更優選的實施方案中，該1至20個氨基酸選自Gly、Ala、ftx)、Asn、Gln、CyS、LyS。甚至更優選地，間隔鏈由 NH2-Gly-Ala-Ala-Gly-C00H 序列構成。也可能是非肽的接頭，例如烷基接頭。這些烷基接頭還可被任何非立體阻礙性基團、低級酰基、鹵素、CN、NH2、苯基等取代。另一種類型的非肽接頭是聚乙二醇基團。本領域技術人員熟知這些間隔鏈，且可選擇合適的間隔鏈，尤其是根據他要連接在一起的N末端肽和C末端肽來選擇。此外，位于SEQ ID N0 1的氨基酸位置488的C末端序列的天冬酰胺殘基有利地被絲氨酸殘基取代。
已引入了這個置換來特異性標記本發明的鞭毛蛋白衍生肽。這種置換天然出現于其他細菌種類如嗜肺軍團桿菌(Legiormelapneumophila)的鞭毛蛋白中，而不改變TLR5刺激活性。可在不會改變佐劑TLR5刺激活性的位置中引入其他的置換，以進一步標記本發明的鞭毛蛋白衍生肽。本發明的鞭毛蛋白衍生肽的優選實施方案根據優選的實施方案，考慮到鞭毛蛋白肽序列SEQ ID N0 1和考慮到晶體結構， 本發明的免疫佐劑化合物的N末端肽有利地選自SEQID N0 1的氨基酸序列1-99、1-137、 1-160 和 1-173。具體地講，鞭毛蛋白FliC的三維結構顯示，N末端結構域被編組在3個α螺旋中， 這些α螺旋被β轉角接著是β片層和β轉角隔開。保持這些二級結構的(一些)部分在N末端處可足以保持TLR5刺激活性(具體而言是粘膜TLR5刺激活性)JPSEQ ID N0 1 的氨基酸序列1-99含有前2個α螺旋，SEQ ID N。1的氨基酸序列1_137含有前3個α 螺旋，而SEQ ID N。1的氨基酸序列1-173含有FliCM74__鞭毛蛋白中存在的N末端結構。在更優選的實施方案中，免疫佐劑化合物的所述C末端肽選自SEQ ID N0 1的氨基酸序列401-494和406-494。具體地講，鞭毛蛋白FliC的三維結構顯示，C末端結構域被編組在2個被β轉角隔開的α螺旋中。保持這些二級結構的(一些)部分在N末端處可足以保持TLR5刺激活性(具體而言是粘膜TLR5刺激活性)=SEQ ID N0 1的氨基酸序列401-494是FliC綱_400 鞭毛蛋白中存在的序列，而SEQ ID N0 1的氨基酸序列406-494僅含有兩個C末端二級α 螺旋。在某些優選的實施方案中，本發明免疫佐劑化合物的N末端肽由這樣的氨基酸序列組成，該氨基酸序列起始于位于SEQ ID N0 1的位置1的丙氨酸殘基，終止于位于SEQ ID N0 1的選自以下的位置的氨基酸殘基位置137、138、139、140、141、142、143、144、145、 146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、 165、166、167、168、169、170、171、172 和 173。在某些優選的實施方案中，本發明免疫佐劑化合物的C末端肽由這樣的氨基酸序列組成，該氨基酸序列起始于位于SEQ ID N0 1的選自位置401、402、403、404、405和406 的位置的氨基酸殘基，終止于位于SEQ ID N0 1的位置494的精氨酸殘基。在這些優選實施方案的一個具體方面，本發明免疫佐劑化合物的所述N末端肽和所述C末端肽有利地通過上述的NH2-Gly-Ala-Ala-Gly-C00H間隔鏈互相連接(即置換缺失的序列174-400)；而且位于SEQ ID N0 1的位置488的天冬酰胺殘基有利地被絲氨酸殘基置換。上述這種免疫佐劑化合物的示例性實施方案涵蓋本文實施例中所示且在下文中更詳細描述的FliQ174-徹、FliCM61_4Q5和FliC·奢在又一個實施方案中，目的免疫佐劑化合物的所述N末端肽和C末端肽分別由SEQ ID N0 1的氨基酸序列1-173和401-494組成。在再一個實施方案中，目的免疫佐劑化合物的所述N末端肽和C末端肽分別由SEQ ID N0 1的氨基酸序列1-160和406-494組成。在又一個實施方案中，目的免疫佐劑化合物的所述N末端肽和C末端肽分別由SEQID N0 1的氨基酸序列1-137和406-494組成。在一些實施方案中，本發明的免疫佐劑化合物在其N末端包含額外的甲硫氨酸殘基，尤其是當這些化合物在細菌細胞中作為重組蛋白產生時。在其中目的免疫佐劑化合物的所述N末端肽和C末端肽由SEQID N0 1的氨基酸序列1-173和401-494組成的實施方案中，本發明的鞭毛蛋白衍生肽由缺失了從氨基酸位置174延伸到氨基酸位置400的那部分氨基酸序列的氨基酸序列SEQ ID N° 1組成。此本發明鞭毛蛋白肽序列在本說明書中也稱為“FliCM74_4QQ”或“FliCM74_4QQ鞭毛蛋白”。根據一個優選的實施方案，本發明免疫佐劑化合物的所述N末端肽和所述C末端肽有利地通過上述的NH2-Gly-Ala-Ala-Gly-C00H間隔鏈互相連接(即置換缺失的序列 174-400)；而且位于SEQ ID N0 1的位置488的天冬酰胺殘基有利地被絲氨酸殘基置換。這樣獲得的本發明鞭毛蛋白衍生肽是271個氨基酸的序列，其中該肽序列存在于 SEQ ID N° 2.多肽編號起始于最終N末端甲硫氨酸(SEQ ID N0 2中未顯示)之后的第一個氨基酸，該甲硫氨酸通常被細菌宿主細胞中的甲硫氨酸氨基肽酶切除，這在下文中提到。在其中目的免疫佐劑化合物的所述N末端肽和C末端肽由SEQID N0 1的氨基酸序列1-160和406-494組成的實施方案中，本發明的鞭毛蛋白衍生肽由缺失了從氨基酸位置161延伸到氨基酸位置405的那部分氨基酸序列的氨基酸序列SEQ ID N0 1組成。此本發明鞭毛蛋白肽序列在本說明書中也稱為"FliCm5”或“FliCM61_4Q5鞭毛蛋白”。根據一個優選的實施方案，本發明免疫佐劑化合物的所述N末端肽和所述C末端肽有利地通過上述的NH2-Gly-Ala-Ala-Gly-C00H間隔鏈互相連接(即置換缺失的序列 161-405)；而且位于SEQ ID N0 1的位置488的天冬酰胺殘基有利地被絲氨酸殘基置換。這樣獲得的本發明鞭毛蛋白衍生肽是253個氨基酸的序列，其中該肽序列存在于 SEQ ID N° 25。多肽編號起始于最終N末端甲硫氨酸(SEQ ID N0 25中未顯示)之后的第一個氨基酸，該甲硫氨酸通常被細菌宿主細胞中的甲硫氨酸氨基肽酶切除，這在下文中提到。在其中目的免疫佐劑化合物的所述N末端肽和C末端肽由SEQID N0 1的氨基酸序列1-137和406-494組成的實施方案中，本發明的鞭毛蛋白衍生肽由缺失了從氨基酸位置138延伸到氨基酸位置405的那部分氨基酸序列的氨基酸序列SEQ ID N0 1組成。此本發明鞭毛蛋白肽序列在本說明書中也稱為“FliCM38_4Q5”或“FliCM38_4Q5鞭毛蛋白”。根據一個優選的實施方案，本發明免疫佐劑化合物的所述N末端肽和所述C末端肽有利地通過上述的NH2-Gly-Ala-Ala-Gly-C00H間隔鏈互相連接(即置換缺失的序列 138-405)；而且位于SEQ ID N0 1的位置488的天冬酰胺殘基有利地被絲氨酸殘基置換。這樣獲得的本發明鞭毛蛋白衍生肽是230個氨基酸的序列，其中該肽序列存在于 SEQ ID N° 26。多肽編號起始于最終N末端甲硫氨酸(SEQ ID N0沈中未顯示)之后的第一個氨基酸，該甲硫氨酸通常被細菌宿主細胞中的甲硫氨酸氨基肽酶切除，這在下文中提到。在其中目的免疫佐劑化合物的所述N末端肽和C末端肽由SEQID N0 1的氨基酸序列1-99和406-494組成的實施方案中，本發明的鞭毛蛋白衍生肽由缺失了從氨基酸位置 100延伸到氨基酸位置405的那部分氨基酸序列的氨基酸序列SEQ ID N0 1組成。此本發明鞭毛蛋白肽序列在本說明書中也稱為“FliC__4Q5”或“FliC__4Q5鞭毛蛋白”。根據一個優選的實施方案，本發明免疫佐劑化合物的所述N末端肽和所述C末端肽有利地通過上述的NH2-Gly-Ala-Ala-Gly-C00H間隔鏈互相連接(即置換缺失的序列 100-405)；而且位于SEQ ID N0 1的位置488的天冬酰胺殘基有利地被絲氨酸殘基置換。這樣獲得的本發明鞭毛蛋白衍生肽是192個氨基酸的序列，其中該肽序列存在于 SEQ ID N° 27。多肽編號起始于最終N末端甲硫氨酸(SEQ ID N0 27中未顯示)之后的第一個氨基酸，該甲硫氨酸通常被細菌宿主細胞中的甲硫氨酸氨基肽酶切除，這在下文中提到。本發明的免疫佐劑肽的合成本發明的鞭毛蛋白衍生肽可由通過遺傳工程獲得的重組細胞合成，或者由本領域技術人員公知的化學或酶促肽合成方法中的任何一種合成。1.通過重組細胞合成本發明的鞭毛蛋白衍生肽可通過重組法由重組細胞產生，所述重組細胞已轉染了編碼該肽的氨基酸序列且能讓該肽得以在受轉染的細胞內有效產生的核酸。編碼本發明的鞭毛蛋白衍生肽的核酸序列所述鞭毛蛋白肽序列的修飾可用重組DNA誘變技術來產生。有多種用于構建和修飾DNA序列的方法為本領域技術人員所知，且所述重組方法的選擇也將為本領域技術人員所知。“重組誘變”技術包括例如定點誘變和PCR誘變(具體參見CurrentProtocols in Molecular Biology, 2007, John Wiley and Sons, Inc.,第 8 章禾口第 15 章)。所述聚合酶鏈反應(PCR)尤其可用于多種突變程序和應用。PCR誘變程序使得有可能容易地和有效地對任何靶標DNA進行修飾和工程化改造。這包括例如點突變、缺失或插入的引入。這些技術例如在SEQ ID N0 3的野生型fliC基因上進行，該基因分離自編碼由 SEQ ID N0 1表示的鞭毛蛋白肽的鼠傷寒沙門氏菌ATCC14(^8菌株。在一個優選的實施方案中，通過PCR誘變(具體參見CurrentProtocols in Molecular Biology, 2007, John Wiley and Sons，he.，第 8 章和第 15 章)使上述 f IiC 基因缺失其長度的中間部分，PCR誘變是用根據為本發明的肽搜索的所需N末端序列和C末端序列而選擇的合適引物對來進行。例如，基于含有SEQ ID N。3的所述野生型f IiC基因的pBR322衍生質粒，在其自身的啟動子的控制下，以下引物對可用于PCR誘變技術-SEQ ID N° 4和SEQ ID N° 5，分別用于由SEQ ID N° 1的氨基酸序列1-99和 401-494組成的N末端肽和C末端肽；-SEQ ID N° 4和SEQ ID N° 6，分別用于由SEQ ID N° 1的氨基酸序列1-99和 406-494組成的N末端肽和C末端肽；-SEQ ID N° 7和SEQ ID N° 5，分別用于由SEQ ID N° 1的氨基酸序列1-137和 401-494組成的N末端肽和C末端肽；-SEQ ID N° 7和SEQ ID N° 6，分別用于由SEQ ID N° 1的氨基酸序列1-137和 406-494組成的N末端肽和C末端肽；
-SEQ ID N° 8和SEQ ID N° 5，分別用于由SEQ ID N° 1的氨基酸序列1-160和 401-494組成的N末端肽和C末端肽；-SEQ ID N° 8和SEQ ID N° 6，分別用于由SEQ ID N° 1的氨基酸序列1-160和 406-494組成的N末端肽和C末端肽；-SEQ ID N° 9和SEQ ID N° 5，分別用于由SEQ ID N° 1的氨基酸序列1-173和 401-494組成的N末端肽和C末端肽；-SEQ ID N° 9和SEQ ID N° 6，分別用于由SEQ ID N° 1的氨基酸序列1-173和 406-494組成的N末端肽和C末端肽；為將SEQ ID N。1的位置488的天冬酰胺變成絲氨酸，例如可用以下引物SEQ ID N0 10和SEQ ID N。11進行定點誘變。為在鞭毛蛋白重組肽的1-99、1-137、1-160或1-173與401-494或406-494的交匯處弓丨入NH2-Gly-Ala-Ala-Gly-C00H接頭，可將以下DNA序列GGTGCAGCTGGA添加在引物序列SEQ ID N0 5和SEQID N0 6的5’末端，產生出分別稱為序列SEQ ID N0 12的“F-接頭-401”和序列SEQ ID N0 13的“F-接頭-406”的引物。適合于產生本發明鞭毛蛋白衍生肽FliCM74_■的DNA序列例如為序列SEQ ID 14。適合于產生本發明鞭毛蛋白衍生肽FliCM61_4Q5的核酸例如為序列SEQ ID 28。適合于產生本發明鞭毛蛋白衍生肽FliCM38_4Q5的核酸例如為序列SEQ ID 29。適合于產生本發明鞭毛蛋白衍生肽FliCMQ(1_4Q5的核酸例如為序列SEQ ID 30。可復制載體的選擇和使用可將本文公開的編碼目的鞭毛蛋白衍生肽的核酸序列插入到可復制載體中以進行克隆(DNA的擴增)或用于表達。各種載體是可公開獲得的。載體可例如為質粒、黏粒、病毒顆粒或噬菌體的形式。 可通過多種程序將適當的核酸序列插入到載體中。一般地，用本領域知道的技術將DNA插入到適當的限制性內切核酸酶位點中。載體組分通常包括但不限于信號序列(如果所述序列要分泌的話)、復制起點、一種或多種標記基因、增強子元件、啟動子和轉錄終止序列中的一者或多者。含有這些組分中的一者或多者的合適載體的構建采用到技術人員知道的標準連接技術。目的鞭毛蛋白衍生肽不僅可直接重組產生，而且可作為與異源多肽的融合多肽產生，該異源多肽可為信號肽或其他的在成熟蛋白質或肽的N末端具有特異性切割位點的多肽。一般而言，信號序列可為載體的組分，或者它可為被插入到載體中的、編碼目的多肽的 DNA的一部分。信號序列可為選自例如堿性磷酸酶、青霉素酶、Ipp或熱穩定腸毒素II的前導序列的原核生物信號序列。為了酵母分泌，信號序列可例如是酵母轉化酶前導序列(包括酵母菌屬(Saccharomyces)和克魯維酵母屬(Kluyveromyces)的α因子前導序列，后者在美國專利第5，010，182號中描述)，或者酸性磷酸酶前導序列、白色念珠菌(C. albicans) 葡糖淀粉酶前導序列(EP 362，179，1990年4月4日公布)，或者1990年11月15日公布的WO 90/13646中描述的信號。在哺乳動物細胞表達中，哺乳動物信號序列可用于指導蛋白質如來自相同或相關的物種的分泌多肽的信號序列以及病毒分泌前導序列的分泌。表達載體和克隆載體都含有使該載體能夠在一個或多個選定的宿主細胞中復制的核酸序列。適于多種細菌、酵母和病毒的這類序列是公知的。來自質粒PBR322的復制起點適合于大多數革蘭氏陰性細菌，2. mu.質粒起點適合于酵母，各種病毒起點(SV40、多瘤、 腺病毒、VSV或BPV)可用于在哺乳動物細胞中克隆載體。表達載體和克隆載體通常會含有選擇基因，也稱為可選擇標記。典型的選擇基因編碼具有以下功能的蛋白質(a)賦予對抗生素或其他毒素(例如氨芐青霉素、新霉素、甲氨喋呤或四環素)的抗性，(b)對營養缺陷加以補足，或者(c)供應從復雜培養基不可得到的關鍵營養物，例如對于桿菌而言編碼D-丙氨酸消旋酶的基因。對于哺乳動物細胞而言合適的可選擇標記的例子，是那些使得能夠鑒定有能力吸收編碼目的鞭毛蛋白衍生肽的核酸的細胞的可選擇標記，如DHFR或胸苷激酶。當采用野生型DHFR時，適當的宿主細胞是缺乏DHFR活性的CHO細胞系，其按照tolaub等人.，Proc. Natl. Acad. Sci.USA,77 :4216(1980)所述進行制備和擴增。適用于酵母的選擇基因是酵母質粒 YRp7 中存在的 trp 1 基因。Stinchcomb 等人·，Nature, 282 :39(1979) ；Kingsman 等人·，Gene，7 :141(1979) Jschemper 等人，Gene, 10 :157(1980)。trpl 基因為缺乏在色氨酸中生長的能力的酵母突變株(例如ATCC No. 44076或PEP4-1)提供選擇標記。Jones， Genetics,85 :12(1977)。表達載體和克隆載體通常含有可操作地連接到編碼鞭毛蛋白衍生肽的核酸序列以指導mRNA合成的啟動子。被各種潛在的宿主細胞識別的啟動子是公知的。適用于原核生物宿主的啟動子包括β -內酰胺酶和乳糖啟動子系統(Chang等人.，Nature, 275 615(1978) ；Goeddel 等人·，Nature，281 :544 (1979))，堿性磷酸酶、色氨酸(trp)啟動子系統(Goeddel, Nucleic Acids Res.，8 :4057(1980) ；EP 36，776)，和雜合啟動子如 tac 啟動子(deBoer 等人.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80 :21-25 (1983)) 用于細菌系統的啟動子還會含有可操作地連接到編碼目的鞭毛蛋白衍生肽的DNA的aiine-Dalgarno (S. D.)序列。適用于酵母宿主的啟動序列的例子包括用于以下酶的啟動子3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman 等人.，J. Biol. Chem.，255 :2073 (1980))或其他糖酵解酶(Hess 等人.， J. Adv. Enzyme Reg. ,7 :149(1968) ；Holland, Biochemistry，17 :4900 (1978))，如煉醇醇、 甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構酶、 3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構酶、磷酸葡萄糖異構酶和葡糖激酶。其他的酵母啟動子——它們屬于具有轉錄受生長條件控制的額外優點的可誘導啟動子——是用于以下酶的啟動子區域醇脫氫酶2、異細胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝相關的降解酶、金屬硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶以及負責麥芽糖和半乳糖的利用的酶。 適用于酵母表達的載體和啟動子在EP 73,657中有進一步描述。目的核酸在哺乳動物宿主細胞中從載體的轉錄例如受到以下啟動子的控制從病毒如多瘤病毒、鳥痘病毒(UK 2，211，504，1989年7月5日公布)、腺病毒(如腺病毒2)、 牛乳頭狀瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細胞病毒、反轉錄病毒、乙型肝炎病毒和猿病毒40 (SV40) 的基因組獲得的啟動子；異源哺乳動物啟動子，例如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子； 和熱激啟動子，前提是這種啟動子與宿主細胞系統相容。通過將增強子序列插入到載體中，可增加更高等的真核生物對編碼目的鞭毛蛋白衍生肽的DNA的轉錄。增強子是DNA的順式作用元件，通常為約10至300bp，其作用于啟動子以增加啟動子的轉錄。現已知許多來自哺乳動物基因(珠蛋白、彈性蛋白酶、清蛋白、
16α-胎蛋白和胰島素)的增強子序列。但是，通常會使用來自真核細胞病毒的增強子。例子包括在復制起點的后側(late side)上的SV40增強子(bpl00_270)、巨細胞病毒早期啟動子增強子、在復制起點的后側上的多瘤增強子和腺病毒增強子。增強子可在相對于編碼目的多肽的序列的5’或3’位置剪接到載體中，但優選位于相對于啟動子的5’位點。用于真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人類或者來自其他多細胞生物的有核細胞)的表達載體還會含有終止轉錄和穩定mRNA所必需的序列。這種序列通常可得自真核生物或者病毒DNA或cDNA的5'非翻譯區和偶爾得自3'非翻譯區。這些區域含有在編碼目的鞭毛蛋白衍生肽的mRNA的非翻譯部分中被轉錄為聚腺苷酸化片段的核苷酸區段。另外其他的適合改編用于在重組脊椎動物細胞培養物中合成目的鞭毛蛋白衍生肽的方法、載體和宿主細胞在Gething等人.，Nature，293 :620-625(1981) ；Mantei等人.， Nature, 281 :40-46(1979) ；EP117, 060 和 EP 117,058 中有描述。宿主細胞的選擇和轉化使宿主細胞轉染或轉化本文對于鞭毛蛋白衍生肽的生成所述的表達載體或克隆載體，并在常規的營養培養基中進行培養，該培養基視所需而定進行修改以便誘導啟動子、 選擇轉化子或者擴增編碼所需的序列的基因。技術人員無需進行過多的實驗就能選擇培養條件，如培養基、溫度、pH等。一般而言，用于使細胞培養物的生產率最大化的原理、方案和實用技術可在Mammalian Cell Biotechnology :A PracticalApproach, Μ. Butler (IRL Press, 1991)中才戈SJ。轉染方法是普通技術人員知道的，例如CaPO4處理和電穿孔。取決于所用的宿主細胞，轉化是用適于這種細胞的標準技術來進行。應用氯化鈣的鈣處理法(如Sambrook等人(出處同上)中所述)或者電穿孔法，通常被用于原核生物細胞或者其他含有很大的細胞壁屏障的細胞。根瘤土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)感染被用于某些植物細胞的轉化，如Shaw等人.，Gene 23 :315 (1983)禾Π 1989年6月29日公布的WO 89/05859 中所述。對于沒有這種細胞壁的哺乳動物細胞，可采用Graham和van der Eb, Virology, 52 :456-457(1978)所述的磷酸鈣沉淀法。哺乳動物細胞宿主系統的轉化的各個一般方面在美國專利No. 4，399，216中已有描述。向酵母中的轉化通常是按Van Solingen等人.， J. Bact.，130 946 (1977)和 Hsiao 等人·，Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)，76 :3829 (1979)所述的方法進行。但是，也可使用其他的將DNA引入到細胞中的方法，如核微注射、電穿孔、細菌原生質體與完整細胞的融合或者聚陽離子(例如聚凝胺(polybrene)或聚鳥氨酸)。有關各種用于轉化哺乳動物細胞的技術，參見Keown等人.，Methods in Enzymology, 185 527-537 (1990)和 Mansour 等人·，Nature, 336 :348-352 (1988)。適用于克隆或表達本文的載體中的DNA的宿主細胞包括原核生物細胞、酵母細胞或更高等的真核生物細胞。合適的原核生物包括但不限于真細菌，如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性細菌，例如腸桿菌科(EntercAacteriaceae)，如大腸桿菌(E. coli)。有各種大腸桿菌菌株可公開獲得，如大腸桿菌K12 MIC94菌株(ATCC31,446)；大腸桿菌X1776 (ATCC 31，537)；大腸桿菌W3110菌株(ATCC27, 325)；和K5772(ATCC 53,635)。其他合適的原核生物宿主細胞包括腸桿菌科如埃希氏菌屬(Escherichia)(例如大腸桿菌)、腸桿菌屬(EntercAacter)、歐文氏菌屬(Erwinia)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、變形菌屬(Proteus)、沙門氏菌屬(Salmonella)(例如鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium))、沙雷氏菌屬 (Serratia)(如粘質沙雷氏菌(Serratia marcescans))和志賀氏菌屬(Shigella)以及桿菌如枯草芽孢桿菌(B. subtilis)和地衣芽孢桿菌(B. licheniformis)(例如1989年4月 12日公布的DD沈6，710中公開的地衣芽孢桿菌41P)、假單胞桿菌屬(I^seudomonas)如銅綠假單胞桿菌(P. aeruginosa)和鏈霉菌屬(Str印tomyces)。這些例子是示例性的而非限制性的。鼠傷寒沙門氏菌的SIN41菌株(fliC fljB)對于生產鞭毛蛋白衍生肽而言特別值得關注，因為這些原核宿主細胞不分泌任何鞭毛蛋白(ftOcNatl Acad Sci USA. 2001 ；98 13722-7)。但是，鞭毛蛋白通過專門的分泌系統分泌所謂的“III型分泌系統”。有趣的是， 菌株SIN41能產生為達到鞭毛蛋白最佳分泌所需的III型分泌系統所有組分。置于fliC 啟動子下的編碼新的鞭毛蛋白肽的克隆序列使得能夠在菌株SIN41中大量分泌目的鞭毛蛋白衍生肽。菌株W3110也是值得關注的，因為它是重組DNA產物發酵的普通宿主菌株。優選地，該宿主細胞分泌的蛋白水解酶數量極少。例如，可對菌株W3110進行修飾以在編碼該宿主的內源蛋白質的基因中產生遺傳突變，這種宿主的例子包括大腸桿菌W3110菌株1A2， 其具有完整基因型tonA ；大腸桿菌W3110菌株9E4，其具有完整基因型tonA ptr3 ；大腸桿菌 W3110 菌株 27C7(ATCC 55，M4)，其具有完整基因型 tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT kan. sup. r ；大腸桿菌W3110菌株37D6，其具有完整基因型tona ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT rbs7 ilvG kan. sup. r ；大腸桿菌 W3110 菌株 40B4，其為具有非卡那霉素抗性degP缺失突變的菌株37D6 ；和具有突變的周質蛋白酶的大腸桿菌菌株，公開于1990年8月7日公布的美國專利第4，946，783號。大腸桿菌菌株MG1655、 MG1655 Δ fimA-H或MKS12、缺失fliD和缺失fimA-H的MG1655菌株也是將重組鞭毛蛋白作為分泌蛋白生產的值得關注的候選菌株(Nat Biotechnol. 2005 ； (4) :475-81)。或者，體外克隆方法如PCR或其他核酸聚合酶反應是適合的。除了原核生物之外，真核微生物如絲狀真菌或酵母也是編碼鞭毛蛋白衍生肽的載體的合適克隆宿主或表達宿主。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是常用的低等真核宿主微生物。其他包括粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe) (Beach 禾口 Nurse, Nature, 290 140 [1981] ； 1985年5月2日公布的EP 139, 383)；克魯維酵母屬(Kluyveromyces)宿主 (美國專禾IJ No. 4，943，529 ；Fleer 等人·，Bio/Technology,9 :968-975 (1991))，如乳酸克魯維酵母(K. lactis) (MW98-8C, CBS683, CBS4574 ；Louvencourt 等人·，J. Bacteriol.， 737 [1983])、脆壁克魯維酵母(K. fragilis) (ATCC 12，424)、保加利亞克魯維酵母 (K. bulgaricus) (ATCC 16，045)、K. wickeramii (ATCC 24，178)、K. waltii (ATCC 56，500)、 K. drosophilarum (ATCC 36,906 ；Van den Berg 等人·，Bio/Technology, 8 :135 (1990))、 K. thermotoIerans 和馬克斯克魯維酵母(K. marxianus)；亞羅酵母屬(yarrowia) (EP 402，226)；巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris) (EP 183，070 ；Sreekrishna 等人·， J. BasicMicrobiol. ,28 :265-278 [1988])；假絲酵母屬(Candida)；里氏木霉(Trichoderma reesia) (EP 244，234)；粗糙脈胞菌(Neurospora crassa) (Case 等人·，Proc. Natl.
18Acad. Sci. USA, 76 :5259-5263[1979])；許旺酵母屬 Gchwanniomyces)如西方許旺酵母 (Schwanniomyces occidentalis) (1990 年 10 月 31 日公布的 EP 394,538)；和絲狀真菌， 如脈孢菌屬(Neurospora)、青霉菌屬(Penicillium)、彎頸霉屬(Tolypocladium) (1991 年 1月10公布的WO 91/00357)和曲霉菌屬(Aspergillus)宿主如構巢曲霉(A. nidulans) (Ballance 等人.，Biochem. Biophys. Res. Commun.，112 :284-289[1983] ；Tilburn 等人.， Gene, 26 :205-221 [1983] ；Yelton 等人·，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 1470-1474 [1984]) 和黑曲霉(A. niger) (Kelly 和 Hynes, EMBO J.，4 :475-479[1985])。甲基營養型酵母適合于本發明，包括但不限于以下各屬的能夠在甲醇上生長的酵母漢遜酵母屬(Hansenula)、 假絲酵母屬(Candida)、克勒克酵母屬(Kloeckera)、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母菌屬 (Saccharomyces)、球擬酵母屬(Torulopsis)和紅酵母屬(Rhodotorula)。這類酵母的示
C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)
中找到。適用于表達編碼目的鞭毛蛋白衍生肽的核酸的宿主細胞衍自多細胞生物。無脊椎動物細胞的例子包括昆蟲細胞(如果蠅S2和夜蛾Sf9)以及植物細胞。有用的哺乳動物宿主細胞系的例子包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞和COS細胞。更具體的例子包括被SV40轉化的猴腎CVl細胞系(C0S-7，ATCC CRL 1651)；人胚胎腎細胞系093細胞或經亞克隆以在懸浮培養中生長的293細胞，Graham等人.，J. Gen. Virol. ,36 :59(1977))；中國倉鼠卵巢細胞 /-DHFR (CHO, Urlaub 和 Chasin，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 :4216 (1980))；小鼠塞托利細胞(TM4，Mather，Biol. R印rod. ,23 :243-251(1980))；人肺細胞(Wl38,ATCC CCL 75)； 人肝細胞(Hep G2，HB 8065)；和小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562, ATCC CCL51)。適當的宿主細胞的選擇被認定為在本領域的技能范圍內。純化目的鞭毛蛋白衍生肽的一般方法可從培養基或從宿主細胞裂解物回收各種形式的目的鞭毛蛋白衍生肽。如果它與膜結合，則可用合適的去污劑溶液(例如TRIT0N-X. TM. 100)或者通過酶促切割將它從膜釋放下來。應用于表達編碼目的鞭毛蛋白衍生肽的核酸的細胞可通過多種物理或化學手段進行破碎，如冷凍-解凍循環、超聲處理、機械破碎或細胞裂解劑。可能需要從重組細胞蛋白或多肽純化目的多肽。以下程序是合適的純化程序的代表在離子交換柱上進行分部分離；乙醇沉淀；反相HPLC ；在二氧化硅上或陽離子交換樹脂 GBDEAE)上進行層析；層析聚焦；SDS-PAGE ；硫酸銨沉淀；使用例如kphadex G-75進行凝膠過濾；用A蛋白瓊脂糖凝膠柱除去污染物(如IgG)；和用金屬螯合柱結合目的鞭毛蛋白衍生肽的表位標記的形式。可采用各種蛋白質純化方法，這類方法是本領域公知的，在例如Deutscher， Methods in Enzymology,182(1990) ；Scopes, ProteinPurification-Principles and Practice (Springer-Verlag =New York, 1982)中有描述。所選擇的純化步驟將取決于例如所用的生產方法的性質和具體產生的鞭毛蛋白衍生肽。在一個優選的實施方案中，鞭毛蛋白衍生肽從重組鼠傷寒沙門氏菌SIN41(fliC fljB)的上清液純化，這在實施例中公開。具體地講，將沙門氏菌在Luria-Bertani (LB)肉湯中37°C攪拌下生長6_18小時。將上清液過濾，并用60%硫酸銨(Sigma Aldrich，美國)飽和。離心回收沉淀的物質，溶解于20mM Tris/HCl pH7.5，然后透析。通過依次進行羥基磷灰石處理、陰離子交換和尺寸排阻層析(Bio-RadLaboratories，美國；GE Healthcare，瑞典)，對蛋白質進行進一步的純化。最后，用多粘菌素B柱(Pierce，美國)，使蛋白質脫去脂多糖(LPQ。使用鱟測定法 (Associates of Cape Cod Inc.，美國)，測出殘余LPS濃度小于30pg LPS/yg重組鞭毛蛋白。通過免疫親和層析純化目的鞭毛蛋白衍生肽在另外的實施方案中，可通過在免疫親和層析基材上進行分離，來純化根據本發明的鞭毛蛋白衍生肽。所述免疫親和層析基材包含已固定化在其上的抗鞭毛蛋白抗體。本文所謂“抗鞭毛蛋白”抗體是指能結合天然鞭毛蛋白或結合缺失超可變區的鞭毛蛋白(包括本發明涵蓋的那些缺失超可變區的鞭毛蛋白)的抗體。優選地，抗鞭毛蛋白抗體由單克隆抗體組成，包括小鼠抗鞭毛蛋白抗體在內。根據本發明已證實，通過在本說明書別處公開的、包括用缺失超可變區的鞭毛蛋白FliCM74_4QQ免疫小鼠這個步驟的方法來獲得的抗鞭毛蛋白抗體，能識別天然鞭毛蛋白和本文公開的任何一種缺失超可變區的鞭毛蛋白。因此，在免疫親和層析基材的某些優選的實施方案中，所述基材包含抗 FliC.174_400的小鼠單克隆抗體。所述優選的免疫親和層析基材可如下制備-在Econo-Pac A 蛋白柱(#732-2022 Affi-gel ；Bio-Rad)上純化含有抗 FliCM74_400單克隆抗體的小鼠腹水。-將所得的純化的抗FliCM74_■單克隆抗體(也可稱為“B23C5”)通過伯氨基共價偶聯到N-羥基琥珀酰亞胺活化Wkpharose 高性能柱(#17_0716_01 Hitrap NHS活化的HP，GEHealthcare)，產生鞭毛蛋白特異性親和柱。偶聯收率為98%。如本文實施例中所示，上述鞭毛蛋白特異性親和柱使得可以高度特異性地將天然鞭毛蛋白與起始樣本中所含的其他蛋白質組分或非蛋白質組分分離開來，從而也可以將本文所公開的任何一種缺失超可變區的鞭毛蛋白與起始樣本中所含的其他蛋白質組分或非蛋白質組分分離開來。以下描述一種用于純化鞭毛蛋白或本文所公開的任何一種缺失超可變區的鞭毛蛋白的方法-將得自重組鼠傷寒沙門氏菌SIN41或大腸桿菌的培養物的含鞭毛蛋白的上清液離心，濾過0.22 4!11膜，用結合緩沖液(7511111^化-!1(1 pH8) 1 1稀釋，上樣到上述的鞭毛蛋白特異性親和柱。-接著，用15-20CV(柱體積)的結合緩沖液洗滌該鞭毛蛋白特異性親和柱。-然后，用3CV的洗脫緩沖液(IOOmM甘氨酸-HCl，0.5M NaCl,pH2. 7)洗脫蛋白質， 各流份立即用500 μ L Tris 1. 5Μ ρΗ8· 9中和，以避免長時間暴露于酸性ρΗ。-然后，用10CV的結合緩沖液將柱再生，并用0.02%疊氮化鈉在4°C下保藏。典型的層析圖譜在圖13中顯示，該圖示出了(i)在觀此！!!處的吸光度(O.D.)曲線 (帶實心方框的線條)和(ii)電導率曲線。圖13中的箭頭數字對應于從柱流出的液體流份已被成功收集的時間，所謂成功收集是根據對各流份的鞭毛蛋白含量的進一步分析(參見圖14和以下段落)。數字表示的各個收集的流份分別為-1號-上樣前的5 μ L樣本(3 μ g)=輸入總量=900 μ g-2號-柱運行后從上樣的樣本得到的20 μ L-3號-從柱洗滌得到的20 μ L-4號-從柱洗滌得到的20 μ L-5、6和7號-在洗脫緩沖液后的各個流份得到的20 μ L 總量 900 μ g-8號-柱再平衡得到的20 μ L圖14示出了蛋白質印跡的照片，該蛋白質印跡是用圖13所示的流份1至8作為分別的起始材料進行。2.化學分析在某些實施方案中，本發明的肽可通過化學肽合成的常規技術進行合成。例如，可用固相技術，如Stewart 等人.，Solid-Phase PeptideSynthesis (W. H. Freeman Co. :San Francisco, Calif., (1969) ；Merrifield, J.Am.Chem. Soc.,85 2149-2154(1963) ；Fields GB, Noble RL ；1990 ；Int.J.Pept.Protein Res. ；Vol. 35 161-214)所描述的那些固相技術，通過直接肽合成來產生目的鞭毛蛋白衍生肽。可用手工操作或通過自動化來進行體外蛋白質合成。自動合成可例如用Applied Biosystems肽合成儀(Foster City, Calif.)按生產商說明書來完成。目的肽的各個部分可分別進行化學合成，并用化學或酶促方法進行組合以產生全長目的肽。包含本發明鞭毛蛋白衍生肽的組合物本發明的又一個目標是包含本說明書所定義的佐劑化合物以及(特別地)一種或多種藥物可接受的賦形劑的組合物，特別是藥物組合物。本發明還涉及包含本說明書所定義的免疫佐劑化合物以及一種或多種抗原的免疫原性組合物。“免疫原性組合物” 一旦給予受試者或動物，將能引起針對其中所包含的所述一種或多種抗原的保護性免疫應答。本發明還涉及包含本說明書所定義的免疫佐劑化合物以及一種或多種抗原的疫苗組合物。本文所用的疫苗組合物一旦給予受試者或動物，將能引起針對例如微生物的保護性免疫應答，或者能有效地保護受試者或動物免受感染。疫苗組合物可用于防止或改善會對免疫應答調節作出有利響應的病理狀況。免疫佐劑如上所述，術語“免疫佐劑”當針對免疫原性組合物或疫苗使用時，意在指通常起到加速、延長或增強對抗原的特異性免疫應答的質量的作用的物質。有利地，免疫佐劑還可減少進行保護性免疫所需的免疫次數或抗原數量。抗原有多種物質可用作免疫原性類型的或疫苗類型的化合物或制劑中的抗原。例如， 減毒的和滅活的病毒和細菌病原體、純化的大分子、多糖、類毒素、重組抗原、含有來自病原體的外來基因的生物體、合成的肽、聚核酸、抗體和腫瘤細胞可用來制備(i)可用于在個體中引起免疫應答的免疫原性組合物，或(ii)可用于治療病理狀況的疫苗。因此，可將本發明的鞭毛蛋白衍生肽與多種抗原進行組合，以產生可用于在個體中弓I起免疫應答的免疫原性組合物或疫苗。本領域技術人員會能夠選擇適宜于治療具體的病理狀況的抗原，且會知道如何確定粗抗原或分離的抗原在具體的疫苗制劑中是否有利。本領域技術人員還會能夠確定是否優選將本發明的免疫佐劑共價連接或者不共價連接到所述一種或多種抗原。本發明的體內試驗證明，當目的鞭毛蛋白衍生肽和靶標抗原通過粘膜途徑特別是鼻內途徑一起給予時，粘膜佐劑活性并不需要目的鞭毛蛋白衍生肽和靶標抗原之間的任何連接。分離的抗原可用本領域公知的多種方法制備。可使用本領域公知的重組方法，例如在細菌、酵母、昆蟲、爬行動物或哺乳動物細胞中分離和克隆編碼任何免疫原性多肽的基因，所述方法例如描述于 Sambrook 等人·，Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor Laboratory, New York(1992)禾口 Ansubel 等人·，Current Protocolsin Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD (1998)。已成功地克隆、表達了多種編碼來自病毒、細菌和原生動物病原體的表面抗原的基因，并用作疫苗開發用的抗原。 例如，已在各種公知的載體/宿主系統中表達乙型肝炎病毒的主要表面抗原HbsAg、霍亂毒素的P亞單位、大腸桿菌的腸毒素、瘧疾寄生蟲的環子孢子蛋白和Epstein-Barr病毒的糖蛋白膜抗原以及腫瘤細胞抗原，并加以純化和用于疫苗。本發明的鞭毛蛋白衍生肽通過能有益地增強對重組抗原的免疫應答的TLR5介導的粘膜系統引起先天性免疫應答。用于疫苗的病理上異常細胞可獲自任何來源，如一個或多個具有病理狀況的個體或者獲自一個或多個這種個體的離體或體外培養細胞，包括要用所產生的疫苗進行治療的特定個體。免疫調節分子有多種免疫調節分子也可與本發明的鞭毛蛋白衍生肽組合使用，以改變個體中的免疫應答。所需的改變的類型將決定被選擇與本發明的所述鞭毛蛋白衍生肽進行組合的免疫調節分子的類型。例如，為增強先天性免疫應答，可將本發明的鞭毛蛋白衍生肽與另一種能促進先天性免疫應答的免疫調節分子進行組合，所述另一種免疫調節分子例如其他的PAMP或者已知或懷疑能引起先天性免疫應答的保守區域。有多種PAMP已知能刺激受體的toll樣家族的不同成員的活性。可將這類PAMP進行組合以對能誘導有益的細胞因子譜的toll樣受體的特定組合進行刺激。例如，可將這類PAMP進行組合以刺激能誘導Thl或Th2免疫應答的細胞因子譜。可將其他類型的能促進體液或細胞介導的免疫應答的免疫調節分子與本發明的鞭毛蛋白衍生肽進行組合。例如，可給予細胞因子以改變Thl和Th2免疫應答的平衡。本領域技術人員會知道如何為具體的病理狀況確定可用于獲得免疫應答的有益改變的適宜細胞因子。
本發明的鞭毛蛋白衍生肽的給予本發明的鞭毛蛋白衍生肽將以“免疫原性量”與一種或多種分子如抗原或其他免疫調節分子一起給予，所述免疫原性量意在指引發免疫應答所需的量。單獨的或與一種或多種分子組合在一起的本發明鞭毛蛋白衍生肽的劑量將取決于例如所要治療的病理狀況、個體的體重和狀況以及之前進行的或同時進行的治療。本領域技術人員可確定被認為對于該方法的具體應用而言是免疫原性劑量的適當量。本領域技術人員會理解，在治療過程中需要對患者的狀況進行監測，且可根據患者對治療的反應調整所給予的組合物的量。作為疫苗免疫佐劑，本發明的鞭毛蛋白衍生肽可通過增強較弱的抗原(如高度純化的或重組的抗原)的免疫原性、減少免疫應答所需的抗原的量、減少提供保護性免疫所需的免疫頻率來提高疫苗的有效性，可改進疫苗在免疫應答減低或弱化的個體(如新生兒、老年人和免疫受損的個體)中的功效，和可增強在靶標組織中的免疫性(如粘膜免疫性)，或者通過引發特定的細胞因子譜來促進細胞介導的免疫或體液免疫。本發明的鞭毛蛋白衍生肽通過活化TLR5系統來引起先天性免疫應答，這里具體而言當通過粘膜途徑給予時引起TLR5介導的粘膜應答。具體地講，體內試驗表明，本發明的鞭毛蛋白衍生肽顯示出粘膜佐劑活性，這種活性能夠加強對靶標抗原的全身應答和粘膜應答。先天性免疫應答通過刺激適應性免疫應答來增加對抗原的免疫應答。因此，本發明鞭毛蛋白衍生肽與一種或多種抗原的組合可提供用于在個體中誘導免疫應答的有效免疫原性組合物或疫苗。抗原和/或免疫調節分子與本發明鞭毛蛋白衍生肽的組合，可在本領域公知的多種臨床前毒理學和安全性研究中進行試驗。例如，可在這樣的動物模型中評價這種組合該抗原已被發現在該動物模型中具有免疫原性，且該動物模型可通過與提議用于人臨床試驗的途徑相同的途徑可再現地進行免疫。抗原和/或免疫調節分子與本發明鞭毛蛋白衍生肽的組合，可例如通過由美國食品與藥物管理局生物制品評價與研究中心與美國國家過敏癥與傳染病研究所 (Goldenthal，KL 等人.AID Res HumRetroviruses，9 :S45_9 (1993))提出的方案進行試驗。本領域技術人員會知道如何為抗原和/或免疫調節分子與本發明鞭毛蛋白衍生肽的具體組合確定適當的抗原負荷、免疫途徑、劑量、抗原純度和可用于在特定動物物種中治療特定病理狀況的接種方案。用于誘導免疫應答的本發明免疫原性組合物或疫苗，可與藥物可接受的介質一起作為溶液或懸浮液給予。這種藥物可接受的介質可為例如水、磷酸緩沖鹽水、生理鹽水或其他生理緩沖鹽水、或者其他溶劑或介質，如二元醇、甘油和油(如橄欖油)或可注射有機酯。藥物可接受的介質還可含有脂質體或膠束，且可含有通過將多肽或肽抗原與去污劑和糖苷(如Quil A) 混合在一起制備的免疫刺激復合物。下文將針對能誘導TLR5介導的粘膜應答的化合物，給出更多的用于在藥物可接受的介質中制備和給予本發明的鞭毛蛋白衍生肽的方法。
本發明的免疫原性組合物或疫苗可通過多種途徑給予以刺激免疫應答。例如，這些免疫調節分子可通過皮下、真皮內、淋巴內、肌肉內、腫瘤內、膀胱內、腹膜內和腦內途徑遞送。本領域技術人員會知道如何選擇用于本發明鞭毛蛋白衍生肽的具體制劑的適當遞送途徑。在本發明的一個優選實施方案中，用于在哺乳動物中治療或預防感染的接種方法包括使用本發明的疫苗，該疫苗具體而言將通過粘膜(例如眼、鼻內、口腔、胃、肺、腸、直腸、引導或尿道)表面給予。鼻遞送途徑可用于同時誘導粘膜免疫應答和全身免疫應答。有多種裝置可以便利且有效地遞送制劑到鼻腔和肺組織。鼻遞送途徑在此可特別值得關注，因為本發明的鞭毛蛋白衍生肽在粘膜區室中顯示顯著的佐劑活性，卻沒有任何顯著的全身促炎副作用。在接種方案中，可有利地通過粘膜途徑給予疫苗，疫苗可作為單獨劑量給予，或者優選地根據初次免疫/加強免疫模式每周或每月給予數次，例如兩次、三次或四次。適當的劑量根據各種參數而定。接種方案可為嚴格的粘膜方案，或者為混合方案，其中疫苗的初次免疫劑量通過粘膜途徑(例如鼻內途徑)給予，而加強免疫劑量通過胃腸外途徑給予，反之亦可。制劑制備藥物制劑或組合物的方法包括使活性成分與載體及任選的一種或多種輔助成分結合在一起的步驟。一般而言如下制備制劑將活性成分與液體載體或粉碎的固體載體或兩者均勻地和緊密的結合在一起，然后有必要的話將產品成形。用于口服給予活性成分的液體劑型包括藥物可接受的乳劑、微乳劑、溶液劑、混懸劑、糖漿劑和酏劑。除了活性成分之外，液體劑型還可含有本領域常用的惰性稀釋劑，例如水或其他溶劑、增溶劑和乳化劑，如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、芐醇、苯甲酸芐酯、 丙二醇、1，3_ 丁二醇、油(具體而言為棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氫糠醇、聚乙二醇、脫水山梨糖醇的脂肪酸酯，以及它們的混合物。 除了惰性稀釋劑之外，口服組合物還可包含佐劑如濕潤劑、乳化劑和懸浮劑、甜味劑、矯味劑、著色劑、香味劑和防腐劑。混懸劑制劑除了含有活性成分之外還可含有懸浮劑，例如乙氧基化異十八醇、聚氧乙烯山梨醇和脫水山梨糖醇酯、微晶纖維素、偏氫氧化鋁、膨潤土、瓊脂和黃蓍膠以及它們的混合物。供直腸或陰道給予的本發明藥物組合物的制劑可作為栓劑提供，其可通過將活性成分與一種或多種合適的非刺激性賦形劑或載體(包括例如可可脂、聚乙二醇、栓劑用蠟或水楊酸鹽)混合來制備，且在室溫下為固體而在體溫下為液體，從而在直腸或陰道中會熔化而釋放出活性成分。本發明的適合于陰道給予的制劑還包括含有本領域已知適用的載體的陰道栓劑、棉塞、乳膏劑、凝膠劑、糊劑、泡沫劑或噴霧劑。適合于胃腸外給予的本發明藥物組合物包含活性成分和與其相組合的一種或多種藥物可接受的無菌等滲含水或非水載體，包括溶液劑、分散劑、混懸劑或乳劑或者可在臨用前重構成無菌可注射溶液劑或分散劑的無菌散劑，其可含有抗氧化劑、緩沖劑、使制劑與預定接受者的血液等滲的溶質或者懸浮劑或增稠劑。可應用于本發明藥物組合物的合適的含水和非水載體的例子包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)和它們的合適混合物、植物油如橄欖油、以及可注射的有機酯如油酸乙酯。可例如通過使用包衣材料如卵磷脂，通過維持所需的顆粒大小(在分散劑的情況中)，和通過使用表面活性劑，來維持適當的流動性。這些組合物還可含有佐劑如濕潤劑、乳化劑和分散劑。還可能需要在組合物中包含等滲劑，如糖類、氯化鈉等。另外，可通過摻入能延遲吸收的物質如單硬脂酸鋁和明膠，實現可注射藥物形式的延長吸收。可通過形成活性成分于生物可降解聚合物(如聚丙交酯-聚乙醇酸交酯)中的微囊基質，制備出可注射的長效制劑形式。根據活性成分與聚合物的比例和具體采用的聚合物的性質，可控制活性成分的釋放速度。其他生物可降解聚合物的例子包括聚(原酸酯) 和聚(酸酐)。長效可注射制劑也可通過將活性成分包埋在與身體組織相容的脂質體或微乳中來制備。可注射材料可例如通過用細菌保留濾器過濾來進行除菌。制劑可以單劑量提供，或者以多劑量密封容器(例如安瓿和小瓶)提供，且可在凍干條件下保存，在臨用前僅需要加入無菌液體載體如注射用水。可從上述類型的無菌粉末、 顆粒和片劑即時制備注射溶液和混懸劑。抗原和免疫佐劑化合物在本發明疫苗組合物中的量及所給予的劑量，通過制藥領域技術人員公知的技術來確定，其中要考慮到諸如以下的因素具體的抗原，具體的動物或患者的年齡、性別、體重、物種和狀況，以及給予途徑。在一個優選的實施方案中，本發明的疫苗組合物還包含一種或多種選自以下的組分表面活性劑、吸收促進劑、吸水聚合物、抑制酶促降解的物質、醇、有機溶劑、油、pH控制劑、防腐劑、滲透壓控制劑、拋射劑、水以及它們的混合物。本發明的疫苗組合物還可包含藥物可接受載體。載體的量將取決于其他成分所選定的量、抗原的所需濃度、給予途徑的選擇(口服還是胃腸外途徑)等。載體可在任何方便的時間加到疫苗。在凍干的疫苗的情況中，可例如在臨給予前加入載體。或者，最終產品可制造成帶有載體。適當的載體的例子包括但不限于無菌水、鹽水、緩沖液、磷酸緩沖鹽水、緩沖氯化鈉、植物油、極限必需培養基(MEM)、帶HEPES的MEM，等等。任選地，本發明的疫苗組合物可含有不同數量的常規次要佐劑，數量取決于該佐劑和所需的結果。通常的數量在約0.02% (重量)至約20% (重量)的范圍內，取決于其他成分和所需的效果。合適的次要佐劑的例子包括但不限于穩定劑；乳化劑；氫氧化鋁；磷酸鋁；pH調節齊U，如氫氧化鈉、鹽酸等；表面活性劑，如Tween. RTM. 80(聚山梨醇酯80，可從Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo.)市售獲得)；脂質體；iscom佐劑；合成的糖肽，如胞壁酰二肽；增量劑，如右旋糖苷或者右旋糖苷與例如磷酸鋁的組合；聚羧乙烯；細菌細胞壁，如分枝桿菌細胞壁提取物；它們的衍生物，如短小棒狀桿菌(Corynebacterium parvum)；痤瘡丙酸桿菌(Propionibacterium acne)；牛分支桿菌(Mycobacterium bovis),例如卡介菌 (Bovine Calmette Guerin，BCG)；牛痘或動物痘病毒蛋白；亞病毒顆粒佐劑，如環狀病毒；霍亂毒素；N，N-雙十八烷基-N'，N'-雙O-羥乙基)_丙二胺(吡啶)；單磷酰脂質A; 二甲基雙十八烷基溴化銨(DDA，可從Kodak公司(Rochester，N. Y.))市售獲得；它們的合成物和混合物。理想地，將氫氧化鋁與其他的次要佐劑或免疫佐劑如Quil A混合在一起。合適的穩定劑的例子包括但不限于蔗糖、明膠、蛋白胨、消化的蛋白質提取物如 NZ-胺或NZ-胺AS。乳化劑的例子包括但不限于礦物油、植物油、花生油和其他可用于注射劑或鼻內疫苗組合物的標準、可代謝、無毒的油。出于本發明的目的，這些佐劑在本文指稱為“次要”僅僅是為了與上述的免疫佐劑化合物形成對比，該免疫佐劑化合物由Mio GTP酶激活劑組成，因為其與抗原物質相組合以顯著提高針對該抗原物質的體液免疫應答的作用而作為疫苗組合物中的必要成分。次要佐劑主要是作為加工助劑包括在疫苗制劑中，盡管某些佐劑的確具有一定程度的免疫增強性質從而具有雙重目的。常規的防腐劑可以以約0.0001% (重量)至約0. 1% (重量)的有效量加到疫苗組合物。取決于制劑中所采用的防腐劑，這個范圍以下或以上的數量也可使用。典型的防腐劑包括例如山梨酸鉀、焦亞硫酸鈉、苯酚、羥苯甲酯、羥苯丙酯、硫柳汞等。失活的、修飾的或其他類型的疫苗組合物的選擇以及本發明的改進的疫苗組合物制劑的制備方法，是本領域普通技術人員知道的或者容易確定的。藥理學上有效量的本發明免疫佐劑化合物可例如口服給予、胃腸外給予或以其他方式給予，且優先通過粘膜途徑給予，在給予抗原物質的同時給予、相續給予或不久以后給予，以增強、加速或延長抗原的免疫原性。雖然疫苗組合物的劑量顯著取決于抗原、已接種的或要接種的宿主的物種等，但藥理學上有效量的疫苗組合物的劑量通常將為每劑約0. 01 μ g至約500 μ g(具體而言 50 μ g至約500 μ g)的本發明免疫佐劑化合物(主要基于圖6所示的結果)。組合中的具體抗原物質的量會影響為改進免疫應答所需的本發明免疫佐劑化合物的量，不過設想到業內人士可容易地通過常規試驗調整免疫佐劑化合物的有效劑量以符合具體的情況。一般而言，本發明的疫苗組合物便利地通過口服、胃腸外(皮下、肌肉內、靜脈內、 真皮內或腹膜內)、口腔內、鼻內或透皮途徑給予。本發明所設想的給予途徑將取決于抗原物質和輔助劑(co-formulant)。例如，如果疫苗組合物含有皂苷類，雖然它們口服或鼻內給予時是無毒的，但必須小心不要將皂苷元糖苷注射到血流中，因為它們起到強溶血劑的作用。還有，許多抗原如果口服的話將不會有效。優選地，疫苗組合物通過皮下、肌肉內或鼻內途徑給予。疫苗組合物的劑量將顯著取決于所選擇的抗原、給予途徑、物種和其他標準因素。 設想到，本領域普通技術人員可很容易地滴定出用于針對每種抗原的免疫應答的適當劑量，以獲知有效的免疫量和給予方法。本說明書中別處已經指明的是，本發明的又一個目標是供給予粘膜表面的本發明疫苗組合物。這種給予方式具有重大意義。的確，粘膜含有眾多樹突細胞和朗格漢斯細胞，它們是極好的抗原檢測和抗原呈遞細胞。粘膜還與被稱為粘膜相關淋巴組織的淋巴器官連接， 這些器官能夠將免疫應答傳遞到其他粘膜區域。這種上皮的例子是鼻上皮膜，其實際上由單層的上皮細胞組成(假復層上皮)，而上呼吸道中的粘膜與兩個淋巴組織即淋巴腺和扁桃體連接。鼻粘膜下的一大片毛細血管網絡具有高密度的B細胞和T細胞，這些細胞特別適合于提供對抗原的快速識別和提供快速的免疫應答。優選地，粘膜表面選自鼻、肺、口、眼、耳、胃腸道、生殖道、陰道、直腸和皮膚的粘膜表面。
實施例種· ι齡頓■側材料和方法重組鞭毛蛋白的產牛來源于鼠傷寒沙門氏菌ATCC14(^8鞭毛蛋白FliC(登錄號AAL20871)的重組鞭毛蛋白。鞭毛蛋白FliC 和 FliCA2Q5_293 如之前所描述 Woshioka 等人，1995. Flagellar filament structure and cell motility of Salmonella typhimurium mutants lacking part of the outer domain of f lagellin (缺乏鞭毛蛋白的一部分外結構域的鼠傷寒沙門氏菌的鞭毛絲結構和細胞運動性)· J. Bacteriol. 177 1090-1093 ；Didierlaurent 等 Α 2004. Flagellin Promotes Myeloid Differentiation Factor 88-Dependent Development of Th2-TypeResponse (鞭毛蛋白能促進Th2型應答的髓樣分化因子88依賴性發展).J. Immunol. 172 :6922-6930 ;Sierro 等人，2001，Flagellin stimulation of intestinal epithelial cells triggers CCL20-mediated migration of dendritic cells (鞭毛蛋白對腸上皮細胞的刺激能引發CCL20介導的樹突細胞遷移).Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 :13722-13727)從鼠傷寒沙門氏菌菌株SIN22 (fl jB)和SJW46分離得到， 或者購自 Alexis Biochemicals (瑞士 )。編碼FliCM74_■和FliCM91_352 &構建物，是在pBR322衍生的具有野生型fliC基因 SEQ ID N0 3的質粒上，在該質粒自身的啟動子控制下，使用以下引物對通過PCR產生的 AGCACC attcagcgtatccagacc (SEQ ID N。 15)/ (^(77^(777 gctacBBCcaccgBBBBC (SEQ
ID N ° 16)，和 rCGWG atatcctgtaacagttgcagcc (SEQ ID N ° Π) / ACTCGAG gacggtacatccaaaactgcac (SEQ ID N° 18)(編碼接頭的堿基以斜體表示)。還在具有FliC, 174_4QQ的質粒上進行定點誘變，以使參與TLR5檢測的殘基 89-96 (QRVRELAV)被來自非信號轉導鞭毛蛋白(DTVKVKAT)的相應序列替代；所得的蛋白質 Hift^J Fl174—400/89—96*0在FliCM74_4QQ、FliCA191_352 和 FliC,174_4Q(1/89_9W 中，離末端 6 個殘基處的天冬酰胺被換成絲氨酸。如下所述從重組鼠傷寒沙門氏菌SIN41(fliC fljB)的上清液純化截短的鞭毛蛋白。將沙門氏菌在Luria-Bertani (LB)肉湯中37 °C攪拌下生長18小時。將上清液過濾，并用60%硫酸銨(Sigma Aldrich，美國)飽和。離心回收沉淀的物質，溶解于20mM Tris/HCl pH7.5，然后透析。通過依次進行羥基磷灰石處理和陰離子交換層析(Bio-RadLaboratories，美國)，對蛋白質進行進一步的純化。最后，用多粘菌素B柱(Pierce，美國)，使蛋白質脫去脂多糖(LPS)。使用鱟測定法(Associates of Cape Cod Inc.，美國)，測出殘余LPS濃度小于30pgLPS/ μ g重組鞭毛蛋白。當指明時，將鞭毛蛋白用0.017%胰蛋白酶-EDTAdnvitrogen，美國)在37°C 下處理1小時以完全水解蛋白質，然后在70°C下加熱1小時以滅活胰蛋白酶。用標準的 SDS-PAGE分析蛋白質，并用FliC特異性多克隆抗體進行免疫印跡分析。動物實騎雌性NMRI 小鼠(6-8 周齡)購自 Charles River Laboratories 實驗室(法國)， 并在經認可的機構(#A59107;法國里爾巴斯德研究所)中維持在特殊的無病原體的設施中。所有實驗均符合現行的國家法規和機構法規以及倫理規則。為進行超免疫，在第1天給動物皮下注射在200 μ 1的完全弗氏佐劑(CFA)/PBS中乳化的鞭毛蛋白Flica μ g每次注射)，并在第21、35和49天皮下注射在200 μ 1的不完全弗氏佐劑(IFA)/PBS中乳化的鞭毛蛋白FliC(ly g每次注射)。在第63天，靜脈內給予小鼠200 μ 1鞭毛蛋白/PBS，兩小時后通過腹膜內注射5mg戊巴比妥鈉(CEVA SanteAnimale, 法國)將小鼠處死以進行血清和組織采樣和分析。為表征粘膜先天性應答和佐劑性質，將20μ 1的PBS士蛋白質鼻內給予經麻醉的小鼠，麻醉是通過每25g動物經腹膜內給予1.5mg氯胺酮(Merial，法國)和0. 3mg賽拉嗪 (Bayer，德國)進行。為研究促炎應答，小鼠在2小時進行采樣(以進行RNA和基因表達測定)或在6 小時進行采樣(以測試細胞因子的生成)。為進行免疫測定，在第1天和第21天對小鼠i. η.給予PBS士去除LPS的卵清蛋白(OVA) (20 μ g，Sigma, VII等級，美國)士鞭毛蛋白(1 μ g)。在第35天采集支氣管肺泡灌洗液(BAL)和血清。為評估中和作用，將免疫血清和模擬血清在56°C下加熱30分鐘以使補體失活。在用鞭毛蛋白進行全身活化前1小時，通過靜脈內途徑將系列血清稀釋液(于200 μ 1的PBS 中)被動轉移到動物。在一些實驗中，將血清與稀釋于PBS中的鞭毛蛋白混合，并i. η.給予以測試粘膜中和作用。在氣管內注射Iml含完全蛋白酶抑制劑混合物(cocktail) (Roche，瑞士)的PBS 后收集BAL，并離心澄清。收集血液樣本，在室溫下凝固，然后離心分離血清。通過用2ml補加有蛋白酶抑制劑的T-PER組織蛋白提取試劑(Pierce，美國)均化肺組織，制備肺蛋白提取物。所有樣本在分析前保存于-80°C下。抗原特異件抗體應答的分析用ELISA評估血清和BAL樣本中的OVA特異性或鞭毛蛋白特異性抗體的含量。簡而言之，將OVA (20 μ g/孔，于磷酸鹽緩沖液0.2M pH 6.5中)和鞭毛蛋白 FliCdOOng/孔，于PBS中)在MaxiSorp微量培養板(NalgeNunc Int.，美國)上4°C包被過夜。所有的微量培養板均用PBS/Tween20 0. 05%洗滌，然后用PBS/乳粉在室溫下封閉1小時。將樣本的系列稀釋液在室溫下溫育1小時，然后顯色。生物素酰化的抗小鼠IgG 或 IgA 抗體(Southern Biotechnology Associates，美國)、HRP 綴合的鏈霉親和素(GEHealthcare，美國)和 3，3' ,5,5'四甲基聯苯胺(Becton Dickinson Bioscience，美國) 用作顯色試劑。通過加入H2SO4終止反應，然后于450nm處測定0D。IgG滴度的定義，對于0VA，為產生0. 15 OD的吸光值的最高樣本稀釋度的倒數，對于FliC，為產生0. 5 OD的吸光值的最高樣本稀釋度的倒數，并將IgG滴度與參考血清進行系統地比較。滴度以得自各個小鼠的滴度的幾何平均值表示。測量BAL中的總I gA水平和OVA特異性I gA水平，并用由市售小鼠I gA (Si gma)得到的校準曲線進行歸一化。確定每個小鼠的特異性IgA比例(以OVA特異性IgA的ng數 / μ g總IgA表示)。細胞因子特異件ELISA和基因表汰用市售的ELISA試劑盒(R&D Systems，美國)，測量血清、BAL、總肺和/或細胞培養物上清液中的小鼠CXCL2和CCL20和人IL_8(CXCL8)水平。用Nucleospin RNA II試劑盒(Macherey Nagel，德國)從小鼠肺提取總RNA，并用 High-Capacity cDNA Archive 試劑盒(AppliedBiosystems，美國)進行反轉錄。所得的 cDNA 用基于 SYBR Green 的實時 PCR(Applied Biosystems)進行擴增。特異性弓丨物為CGTCATCCATGGCGAACTG (SEQ ID N ° 19)/ GCTTCTTTGCAGCTCCTTCGT (SEQ ID N ° 20) (ACTB，編碼 β-肌動蛋白)、 TTTTGGGATGGAATTGGACAC(SEQ ID N。 21)/TGCAGGTGAAGCCTTCAACC(SEQ ID N。 2 (CCL20) 和 CCCTCAACGGAAGAACCAAA(SEQ ID N ° 23)/CACATCAGGTACGATCCAGGC(SEQ ID N ° 24) (CXCL2)。如之前所描述(Sierro 等人，2001，Flagellin stimulation of intestinal epithelial cells triggers CCL20-mediated migration of dendritic cells (If更毛蛋白對腸上皮細胞的刺激能引發CCL20介導的樹突細胞遷移).Natl. Acad. Sci. USA 98 13722-13727)，通過比較(a)目的基因和ACTB的PCR循環閾值(Ct) (ACt)和(b)處理組和對照組的Δ Ct值(Δ Δ Ct)，確定相對mRNA水平Δ")。基于細胞的測定用具有在人CCL20啟動子控制下的螢光素酶基因的質粒穩定轉染Caco-2人結腸腺癌細胞系(Rumbo 等人，2004，Lymphotoxin betareceptor signaling induces the chemokine CCL20 in intestinal印ithelium(淋巴毒素β受體信號轉導能誘導腸上皮中的細胞因子 CCL20). Gastroenterol. 127 :213-223)，產生 Caco-Rumbo 細胞系。將這些腸上皮細胞在Dulbecco改進的fegle培養基中生長，該培養基補加有10% 胎牛血清、IOmM HEPES、非必需氨基酸IX、青霉素(100U/ml)和鏈霉素(100U/ml)及(為了轉基因選擇)0. 7mg/mL G418 (Invitrogen)。將人支氣管上皮細胞系BEAS-2B在Kaigh F12營養培養基中進行培養，該培養基如Caco-Rumbo培養基一樣補加，還補加ImM丙酮酸鈉和胰島素-轉鐵蛋白_硒混合物 (Invitrogen)。將細胞用重組鞭毛蛋白刺激6小時以進行螢光素酶測定，或者刺激16小時然后收獲上清液進行ELISA。用Bright Glo螢光素酶測定法(ftOmega，美國)測量細胞提取物中的螢光素酶活性。對于用重組鞭毛蛋白進行的活化試驗，相對發光(RLU)歸一化為野生型鞭毛蛋白的最大活性的百分數。對于體外中和作用試驗，RLU歸一化為每種蛋白質的最大活性的百分數[(RLU 處理 /RLU 未處理)/ (RLU /RLU 未處理)]X 100。統計學分析用Marm-Whitney試驗分析統計學差異，ρ值< 0. 05時認為差異顯著。結果以算術平均值士標準偏差表示，除非另有指明。結果可奪區的缺失會肖！丨弱杭jgj牛，伯不會改奪TLR5刺激活十牛通過內部缺失構建了兩種新型鞭毛蛋白分子爾1比，191_352和FliCA174,，分別由 336個和271個氨基酸組成)(圖1A)。作為對照，我們使用了之前表征的變體FliC,2(l4_292，其在抗原結構域中具有部分缺失(Yoshioka 等人，1995，Flagellar filament structureand cell motility of Salmonella typhimurium mutants lacking part of theouter domain of flagellin(缺乏鞭毛蛋白的一部分外結構域的鼠傷寒沙門氏菌的鞭毛絲結構和細胞運動性)· J. Bacteriol. 177 1090-1093) (Fig. 1A)。作為體外和體內實驗的陰性對照，將能削弱TLR5信號轉導的突變引入到
Fl174-400 中，廣生重組蛋白 Fl174—400/89—96*。各個鞭毛蛋白的預測結構表明，模體89-96和保守區域的總體結構沒有改變(圖 1A)。除了 FliC,2(l4_2i32以外，各變體不能夠補足鞭毛蛋白缺陷型細菌的運動性，且被分泌到培養上清液中。其次，我們評估了重組鞭毛蛋白的內在抗原性。為此，將飽和濃度的鞭毛蛋白包被到微量培養板上，并用對FliC或FliCM74_4(l(l具有特異性的超免疫血清通過ELISA進行探測。如圖IB中所示，我們觀察到抗FliC血清對FliC變體滴定與對野生型FliC滴定相比，抗體滴度低3至10倍。相比之下，無論是什么目標鞭毛蛋白，對FliCM74_■具有特異性的超免疫血清的反應性都相似(圖1C)。這些結果提示，中部超可變區是抗鞭毛蛋白抗體的主要靶標。最后，我們試圖確定重組分子是否保持任何TLR5刺激活性。用Caco-Rumbo報道細胞和肺上皮細胞系BEAS-2B進行了劑量響應分析。通過測量Caco-Rumbo細胞中的螢光素酶活性和BEAS-2B細胞的IL-8分泌量，評估激活情況(基于細胞因子CCL20(也稱“肝臟活化的和調節的細胞因子(或LARC) ”和IL-8的表達，人腸上皮細胞系是鞭毛蛋白/TLR5刺激活性的獨特報道細胞)。如圖2A-B 所示，FliC,2Q4_292、FliC,191_352 和 FliCA174_4(1(1 都是強效的細胞激活劑。 各個鞭毛蛋白各自的EC50值隨細胞類型稍有變化，但落入之前描述的ng/mL范圍之內 (Smith 等人，2003, Toll-like receptor 5recognizes a conserved site on flagellin protofilament formation antibacterial motility (Toll 樣受體5 能識別鞭毛蛋白原絲形成和細菌運動性上的保守位點).Nat. Immunol. 4 :1247-1253)。發現重組鞭毛蛋白的活性完全依賴于TLR5，因為FliCM74_4(1(1/89_9W不能夠激活上皮細胞。
用衍自TLR5缺陷型小鼠的骨髓巨噬細胞進一步證實了對TLR5信號轉導的需求； 細胞在用重組鞭毛蛋白刺激時并沒有合成任何IL-12p40 (數據未顯示)。^mf^m^mmm tlrs依賴t牛粘臘先天t牛應答然后通過粘膜途徑體內研究了重組鞭毛蛋白對TLR5的刺激。為此，采用qRT-PCR，對經鞭毛蛋白i. η.處理的小鼠的肺中的CCL20和CXCL2表達進行了定量(圖2C)。在2小時內，用野生型鞭毛蛋白或重組鞭毛蛋白處理的動物與模擬處理的動物相比，肺部CCL20 mRNA水平約30倍高。此外，在滴注后6小時，在肺均漿和BAL中都檢測到CCL20細胞因子的產生(圖 2D)。在對照實驗中，FliCM74_4QQ/89_9W和胰蛋白酶消化的鞭毛蛋白沒有誘導這種類型的作用。對于CXCL2也觀察到類似的發現(數據未顯示)。這些結果證實了體內促炎應答僅由重組鞭毛蛋白所致。總之，在超可變區中具有缺失的鞭毛蛋白顯示出與野生型FliC對等物相當的粘膜促炎性質。重組鞭毛蛋白顯示出粘膜佐劑活件為了表征我們的重組分子的佐劑性質，在進行i. η.免疫后研究了在血清和分泌物中的抗體應答。卵清蛋白(OVA)用作模型抗原，將其與或不與各種鞭毛蛋白進行配制或者與霍亂毒素(CT)進行配制，作為金標準粘膜佐劑。與單獨用OVA免疫的動物相比，FliC與OVA共給予顯著提高了 OVA特異性IgG響應(在血清和BAL中均如此，分別提高300倍和100倍)(圖3Α-Β)。此外，在BAL中OVA特異性IgA應答得到增強，由此提示FliC能促進粘膜佐劑的原型分泌抗體應答(圖3C)。有趣的是，FliC的作用與CT的作用類似。與FliC —樣，重組鞭毛蛋白 FliC,2Q4_292、FliC.191_352 和 FliCM74_4(1(1 也因此能夠加強全身應答和粘膜應答。相比之下，FliCM74_4Q__9W和胰蛋白酶處理的鞭毛蛋白缺乏功效(圖3和表1)。因此，鞭毛蛋白的超可變區的缺失沒有顯著影響TLR5介導的粘膜佐劑性質。我們的數據還顯示，各個重組分子各自對先天性和適應性免疫的作用是相關連的。超可^^的缺失·弓飯抗_豐潘白抗體的能力抗原結構域的缺失預期會降低鞭毛蛋白特異性免疫應答，從而降低對TLR5介導的免疫性的任何中和作用，特別是在反復進行給予的情況下。我們因此決定評估i. η.免疫對于FliC特異性抗體的誘導的功效。如所示，FliC在血清和BAL中引發了強烈的IgG應答(表1和圖4)。相比之下， FliCA2Q4_2i32在這兩種流體中引發的抗體水平比FliC引發的低10倍，在用FliCM91_352和 FliCM74_400免疫后觀察到更明顯的作用。總之，鞭毛蛋白的抗原結構域和免疫刺激結構域在功能上是分開的。因此， FliCM91_352 *FliC,174_4( 是用于防止或削弱具有中和活性的鞭毛蛋白特異性抗體的生成的值得關注的分子。寺異+牛抗體能Φ禾Π TLR5介導的{言號轉導
細菌鞭毛蛋白已知能引發主要針對超可變區的強烈的抗體應答。我們猜測，抗鞭毛蛋白抗體會中和鞭毛蛋白的TLR5刺激活性。因此，用鞭毛蛋白FliC或模擬制品(單獨PBS或者在CFA中配制的非相關抗原卵清蛋白(OVA))對小鼠進行皮下免疫，然后用IFA進行加強免疫。ELISA分析揭示，抗FliC 血清顯示出特異性IgG滴度> 106，而模擬血清滴度低于該測定法的檢測閾(102)。如上所述，基于細胞因子CCL20(也稱“肝臟活化的和調節的細胞因子”，LARC)，人腸上皮細胞系是鞭毛蛋白/TLR5刺激活性的獨特報道細胞。因此在此使用具有在CCL20啟動子控制下的螢光素酶基因的Caco-Rumbo細胞，證明抗FliC血清能夠完全中和FliC的TLR5激動活性(圖5A)。然后直接在經免疫的動物中評估FliC特異性抗體對TLR5信號轉導的中和作用。 為此，給小鼠靜脈內注射FliC，然后研究小鼠中的全身促炎應答(CCL20和CXCL2細胞因子的生成)(圖5B-C)。在模擬免疫的動物中，相比于PBS攻擊，FliC攻擊引發了 CCL20和CXCL2的血清水平的顯著提高。相比之下，在FliC免疫的動物中，任何一種攻擊都沒有增強細胞因子的生成。在未經免疫的動物中使用被動血清轉移，發現了注射的抗體量與全身先天性應答之間的緊密相關性，如圖5D所示。總之，預先存在的對鞭毛蛋白的免疫性在體外和體內都能中和后者的TLR5刺激活性。但對于FliCA174_4QQ并非如此，其促進鞭毛蛋白特異性抗體(包括中和性抗體在內)的生成的能力被大大削弱，如前面根據圖4所公開的。確定了通過i.n.途徑引發TLR5介導的先天性應答所需的有效劑量。FliC和 FliCM74_400顯示出類似的劑量-響應曲線，選擇0. 1 μ g劑量用于后續的中和測定(圖6)。為此，用FliC對動物進行i.n.超免疫以引發強烈的FliC特異性粘膜IgG應答 (平均滴度約45，000)，然后用0. Iyg FliC或FliC Δ174_■鞭毛蛋白進行攻擊。監測了 BAL 中的促炎細胞因子的生成。如在未經免疫的動物中觀察到，用FliC或FliCM74_4(1(1攻擊導致了 CCL20生成 (在模擬免疫的小鼠和Fl iC免疫的小鼠中分別為4.觀士 1. 98對1. 08 士 0. 54ng/ml和 2. 48 士 1. 22 對 0. 93 士0. 48ng/ml)。米占fl莫禾ΠΦ身TLR5依IM牛應答在不同禾glti耳又決白超可變區我們還想研究鞭毛蛋白特異性抗體對靜脈內注射重組鞭毛蛋白后誘導的TLR5依賴性應答的中和作用。為分析先天性免疫的全身激活，通過ELISA測量了血清中的循環促炎細胞因子 CCL20和CXCL2的生成(圖7)。我們出乎意料地觀察到，與野生型FliC相比，FliCM74_4QQ引發全身促炎作用的能力被削弱大約100倍。而10μ g FliCA174,卻稍微刺激了細胞因子的生成，在TLR5模體FliCA174_4Q__9W 中發生突變的變體缺乏活性(對于CCL20而言，0. 85士0. 27對0. 02士0. 00ng/ml)。這與FliCA2Q4_292和FliCM91_M2形成了對比，后兩者如同FliC —樣都是強效激活劑。因此，超可變區上的某些分子決定簇(或者取決于超可變區的某些分子決定簇) 為全身TLR5刺激所必需，但不是粘膜TLR5刺激所必需。總而言之，我們的結果表明，粘膜區室和全身區室當中的TLR5活化是由不同的機制控制的。實施例2 詵自FliCA174_4w、FliCA161_4clf和FliCA138_4clf的缺失超可變區的鞭毛蛋白的牛物活件通過進行以上實施例1公開的同一方法，重組產生各種缺失超可變區的鞭毛蛋白，艮口 FliCAm—400、FliCAι61—405、FliCA 138_405 禾口 FliCA 100—405。圖8和9示出了所述重組產生的蛋白質的分析。圖8顯示了在重組蛋白上進行的SDS PAGE電泳的結果，所述蛋白從得自相應的重組鼠傷寒沙門氏菌SIN41細菌細胞的培養上清液收集，在用TCA進行蛋白質沉淀的步驟后進行SDS PAGE電泳。圖9顯示了用抗FliC多克隆抗體在得自相應的重組鼠傷寒沙門氏菌SIN41細菌細胞的培養上清液上進行的蛋白質印跡測定的結果，蛋白質印跡測定是在用TCA進行蛋白質沉淀的步驟后進行。缺失超可變區的鞭毛蛋白FliCA174_w、FliCA161_4clf和FliCA138_4clf的牛物活件通過進行實施例1中所述的細胞因子特異性ELISA測定，測試了 FliCM74_4。。、 FliC.161_405 和 FliC,138_4Q5 對 CCL20 和 CXCL2 的誘導的作用。簡而言之，給C3H/HeJ(TLR4缺陷型)腹膜內注射10 μ g的缺失了位置174-400、 161-405和138-405的不同重組鞭毛蛋白。2小時后，采集血清樣本并處理以便進行細胞因子特異性ELISA (CCL20和CXCL2)。鞭毛蛋白制品衍自之前用硫酸銨沉淀并進行透析的重組沙門氏菌的上清液(圖8 和9)。由于這些粗制品可能被內毒素污染，我們使用了 TR4信號轉導缺陷型小鼠，因為LPS 可能是這些粗制品中的主要污染物。另外，我們使用了胰蛋白酶處理來證明生物活性存在于粗制品的蛋白質級份中。結果在圖10 (CCL20的誘導)和11 (C)(CL2的誘導)中示出。圖10和11的結果提示，如對FliCM74_4Q(1所述，重組鞭毛蛋白FliC,161_4(15和 FliCA138_4Q5有能力進行體內信號轉導。這些結果提示，FliCM61_4Q5和FliCM38_4Q5是有效的TLR5激動劑，因此可代表有效的佐劑化合物。實施例3 :FliCA174_4clcl對于針對來自HIVl病毒的CT140抗原的免疫應答的佐劑活性免疫方案和抗原特異性抗體應答的分析與實施例1中所述相同，例外之處在于以下說明的具體特征。簡而言之，如下分析天然鞭毛蛋白FliC和重組FliC,174_4(1(1對HIVl抗原gpl40的佐劑活性NMRI小鼠(n = 8)在第1天和第21天用20 μ 1的含有gpl40 (5 μ g/只小鼠)、 不含或含有FliC或FliCA174_4Q(1(l μ g/只小鼠)的PBS進行鼻內免疫。在第35天采集血清和支氣管肺泡灌洗液(BAL)樣本，通過gpl40特異性ELISA測定抗體滴度。結果在圖12中示出，其中每個符號表示小鼠個體，條棒代表幾何平均數。各符號表示的進行鼻內給予的小鼠分別如下(i)圓圈單獨給予HIVl gpl40 ； (ii)菱形給予 HIVl gpl40+FliC.174_400 ； (iii)三角形給予 gpl40+FliC。血清樣本的抗體滴度在圖12左邊部分以填充符號(實心符號)表示。支氣管肺泡灌洗樣本的抗體滴度在圖12的右邊部分以空心符號表示。結果顯示，本說明書中定義的各種缺失超可變區的鞭毛蛋白由有效的免疫佐劑化合物組成。表1 重組鞭毛蛋白誘導的蛋白酶敏感性免疫應答*
權利要求
1.一種免疫佐劑化合物，所述免疫佐劑化合物包含a)與起始于位于SEQID N0 1的位置1的氨基酸殘基、終止于選自位于SEQ ID N0 1 的位置99至173的氨基酸殘基中的任何一個的氨基酸殘基的氨基酸序列具有至少90%氨基酸同一性的N末端肽；和b)與起始于選自位于SEQID N0 1的位置401至406的氨基酸殘基中的任何一個的氨基酸殘基、終止于SEQ ID N0 1的位置494的氨基酸殘基的氨基酸序列具有至少90%氨基酸同一性的C末端肽，其中-所述N末端肽直接連接到所述C末端肽，或者-所述N末端肽和所述C末端肽通過間隔鏈間接互相連接。
2.權利要求1的免疫佐劑化合物，其中所述N末端肽選自SEQIDN0 1的氨基酸序列 1-99、1-137、1-160 和 1-173。
3.權利要求1或2中任一項的免疫佐劑化合物，其中所述C末端肽選自SEQID N0 1 的氨基酸序列401-494和406-494。
4.權利要求1至3中任一項的免疫佐劑化合物，其中所述N末端肽和C末端肽分別由 SEQ ID N0 1的氨基酸序列1-173和401-494組成。
5.權利要求1至3中任一項的免疫佐劑化合物，其中所述N末端肽和C末端肽分別由 SEQ ID N0 1的氨基酸序列1-160和406-494組成。
6.權利要求1至3中任一項的免疫佐劑化合物，其中所述N末端肽和C末端肽分別由 SEQ ID N0 1的氨基酸序列1-137和406-494組成。
7.權利要求1至6中任一項的免疫佐劑化合物，其中所述N末端肽和所述C末端肽通過由NH2-Gly-Ala-Ala-Gly-C00H肽序列組成的中間間隔鏈間接互相連接。
8.權利要求1至7中任一項的免疫佐劑化合物，其中所述位于SEQID N0 1的位置 488處的天冬酰胺殘基被絲氨酸置換。
9.權利要求1至7中任一項的免疫佐劑化合物，其中所述化合物在N末端包含額外的甲硫氨酸殘基。
10.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含權利要求1至9中任一項的免疫佐劑化合物以及一種或多種藥物可接受的賦形劑。
11.一種免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含權利要求1至9中任一項的免疫佐劑化合物以及一種或多種抗原。
12.—種疫苗組合物，所述疫苗組合物包含權利要求1至9中任一項的免疫佐劑化合物以及一種或多種抗原。
13.權利要求11的免疫原性組合物或者權利要求12的疫苗組合物，其中所述免疫佐劑化合物不與所述一種或多種抗原共價連接。
14.權利要求1至9中任一項的免疫佐劑化合物，所述化合物供用作藥物。
15.權利要求1至9中任一項的免疫佐劑化合物用于制造藥物組合物的用途。
16.一種核酸，所述核酸編碼權利要求1至9中任一項的免疫佐劑化合物。
17.—種重組載體，所述載體中包含插入其中的權利要求16的核酸。
18.一種宿主細胞，所述細胞轉染或轉化有權利要求16的核酸或者轉染或轉化有權利要求17的載體。
全文摘要
本發明涉及衍自來源于腸道沙門氏菌(Salmonelle enterica)的鞭毛蛋白、顯示體內免疫佐劑活性的新型肽化合物。
文檔編號C07K14/255GK102203252SQ200980134149
公開日2011年9月28日 申請日期2009年6月23日 優先權日2008年6月25日
發明者J-C·西拉 申請人:法國國家健康和醫學研究所, 里爾巴斯德研究所