串聯質譜法的靶向分析的制作方法

串聯質譜法的靶向分析的制作方法
【專利摘要】描述了一種串聯質譜儀和方法。在一個離子源（10）中產生前體離子并且一個離子注入器（21，23）經由一個單或多反射TOF裝置（30）向一個下游離子導向器（50，60）注入離子，該單或多反射TOF裝置該將離子根據它們的m/z分離為多個包。控制在離子注入器（21，23）與離子導向器（50，60）之間的前體離子的路徑中的一個單通離子門（40），以使得只允許含有感興趣的前體離子的前體離子包的一個子集繼續傳輸至離子導向器（50，60）。提供一個高分辨率質譜儀（70）用于分析被允許穿過離子門（40）的那些離子，或者它們的碎片。該技術允許從寬質量范圍的前體中選擇多個m/z范圍，任選地對這些所選擇的離子種類中的一個或多個進行碎裂。
【專利說明】串聯質譜法的靶向分析
發明領域
[0001]本發明涉及用于使用串聯質譜法的離子靶向分析的一種方法和一種設備。
發明背景
[0002]三重四極桿質譜法是用于復雜混合物的靶向分析的一種充分發展的分析技術。在一個三重四極桿質譜儀中，從一個離子源中產生離子并且注入到一個第一四級桿分析器中。此處，選擇一個窄的質量范圍(m/z)并且該窄的質量范圍進入包括一個氣體填充的碰撞單元的一個第二級中。通過與氣體碰撞產生的碎片離子進入一個第二四級桿分析器中，其中選擇一種特定碎片用于檢測。
[0003]在用于分析的靶標是已知的但與其他分析物相比以非常低的水平存在的情況下，該三重四級桿技術允許分離前體以及相對應的感興趣的碎片離子，由此提供一種用于靶標分析的穩健的定量方法。
[0004]該分析方法的一個缺點是只有窄窗口的m/z在該第一級中被分離，其中所有其他m/z在這些四級桿上損失。這種浪費性的運行妨礙了快速定量分析，其中多個靶標化合物需要在有限時間內進行分析。在每種情況下，需要將這些四級桿設置為接受不同范圍的m/z，并且有效的工作周期是相當低的(可能0.1%_10%，取決于靶標的數量)。
[0005]傳統三重四級桿質譜儀的一個替代方案包括在一個高分辨率、高質量準確度譜中從所有前體中同時采集所有碎片。一旦已經獲得那個單一譜，可以對它進行搜索以嘗試識別一個靶標m/z的離子。具有足夠分辨率和質量準確度以允許實施該效果的分析器包括軌道阱? (Orbitrap?)靜電阱分析器和飛行時間(T0F)分析器。然而，甚至使用此類儀器(分辨能力>50，000至100，000并且質量準確度低于2ppm或甚至更好)，在現代靶向分析實驗中極大的濃度范圍意味著現存的所謂“全質量”分析器就線性度、動態范圍和感興趣的一個特定m/z的檢測限而言不能與該三重四級桿裝置競爭。對于T0F分析器，這些限制由低傳輸和檢測電子約束造成。對于該軌道阱?，困難主要是任何外部俘獲裝置的有限電荷容量。
[0006]改進質量分析的通過量的一個方式是進行MS/MS，其中將離子束分為多個包(根據這些包的m/z)。然后將一個第一包碎裂,而不損失另一個包,或與另一個包并行。將該離子束的分裂為多個包可以通過使用存儲廣泛質量范圍離子的一個掃描裝置來實現。用于實施該掃描的合適裝置是一個3D離子阱，如例如在W0-A-2003/103，010中所披露的；一個具有徑向噴射的線性阱，如在US-A-7，157,698中所述的；一個脈沖離子遷移率譜儀(參見，例如，TO-A-00/70335 或 US-A-2003/0213900);—個減速的線性阱(參見 TO-A-2004/085，992)或一個多反射飛行時間質譜儀如在W0-A-2004/008，481中所述的。
[0007]在每種情況下，質量分析的第一級之后是在一個碰撞單元中例如(優選，一個具有軸向梯度的碰撞單元)、或通過一個脈沖激光器的快速碎裂。使用，例如，另一個T0F質譜儀，但在比該掃描持續時間快得多的時間標度上分析這些所得到的碎片(被稱為“嵌套時間”)。然而，該性能仍是受到損害的，因為只有非常有限的時間被分配給每個掃描(典型地，10 μ S-20 μ s)。[0008]這些所謂的“二維MS”方法似乎提供通過量而不損害靈敏度，不像更傳統的多通道MS/MS安排，其中大量的并行質量分析器(典型地離子阱)用于各自選擇一種前體并且然后從該前體中掃描出這些碎片至一個單獨的檢測器如US-A-5，206，506中所披露的離子阱陣列或US-A-2003/089，846中所披露的多個阱。
[0009]然而，所有已知的二維MS技術遭受相對低的前體選擇分辨率(不比單元分辨率更好)以及相對低的碎片分析的分辨能力(不大于幾千)影響。而且，這些已知的2維MS技術是基于俘獲裝置的使用以提供高工作周期，并且該周期時間是由最慢的分析器的周期時間來定義的。現代離子源可以產生數百皮安量級的離子電流，也就是說，每秒超過IO9個元電荷。因此，如果掃描穿過感興趣的整個質量范圍的全周期是5毫秒，那么此類俘獲裝置原則上應該能夠積累高達5百萬個元電荷并且仍允許有效的前體選擇。
[0010]W0-A-2008/059246描述了允許多個離子種類的高性能同時分離以便進行隨后的檢測或碎裂的一種安排。在所披露的安排中，將離子注入到一個多反射靜電阱中，該多反射靜電阱將離子沿一個軸線往復反射。通過一個靜電門的適當控制來分離感興趣的種類的離子，該靜電門根據離子在該阱內的振蕩周期將離子進行偏轉，分別沿第一或第二離子路徑。
[0011]針對這個背景，本發明提供，在一個第一方面，根據權利要求1的一種串聯質譜方法。本發明還擴展至根據權利要求21的一種串聯質譜儀。
[0012]本發明基于靶標分析不要求獨立地獲得所有MS/MS譜的認識。該儀器僅僅需要遞送這些感興趣的離子種類的分離的且可檢測的峰。這些分離的前體可以使它們的群體再次混合在一起并且然后在一個單一的高分辨率譜中獲得。這種所謂的并行反應監測(PRM)允許多個低強度分析物的并行定量，因此在大規模靶向實驗中使檢測限大大增加超過三重四級桿。
[0013]在該離子門上所選擇以便用于繼續傳輸至該離子導向器的離子當到達該離子導向器時，并且在該離子導向器的下游當它們在該高分辨率質量分析器中進行分析時，可以保持為未碎裂的狀態。該模式通過使用不同的工作周期來展開存儲具有不同強度的m/z的可能性，大大擴展了以上所述的“全質量分析”技術的能力。以此方式，使用已經被減少了1-3個數量級的強度范圍獲得未碎裂的和碎裂的譜兩者。例如，低強度峰可以在每次注入之后被傳輸至該高分辨率質量分析器，同時高強度峰只可以在所有注入的0.5%-1%的過程中被傳輸。然后可以任選地將所獲得的不同的相對小質量范圍的譜(各自典型地具有它自己的特定衰減方案)縫合在一起(例如，通過使用W0-A-2005/093783中所述的技術)。在最終的譜對于傳輸上的這些差異進行校正之后，此類“譜縫合”允許對分析的動態范圍進行顯著的擴展。
[0014]此外，所使用的技術提供足夠的時間以碎裂離子，并且尤其提供足夠的時間以使用此類最近開發的“慢速”技術如電子轉移解離(ETD)或紅外多光子解離(IRMPD)。
[0015]因此根據本發明的一些優選實施例，被允許穿過該離子門的前體離子的一些或全部可以在其下游進行碎裂。在一個優選的實施例中，該離子導向器包括一個碎裂單元和該碎裂單元的下游的一個離子阱(它可以任選地是一個第二離子阱)。然后通過該離子門選擇感興趣的前體離子，并且傳送到該碎裂單元，其中將這些前體離子的一些或全部碎裂。然后通過該高分辨率質量分析器分析這些碎片離子(以及任何剩余的前體離子)。最優選地，將這些碎片離子存儲在該(第二)離子阱中，以使得，例如，在高分辨率質量分析之前，可以通過該技術的多個周期使特定的低豐度種類在該(第二)離子阱中增強。在額外的或者替代的實施例中，前體離子的增強可以同樣發生，或者相反在該離子積累裝置中，通過使用一個碎裂單元但以一個低能量模式操作它以使得不將離子碎裂，和/或通過繞過該碎裂單元(或完全忽略它)并且使用一個第二離子阱。
[0016]因此，可以從寬質量范圍的前體中選擇多個m/z范圍(而不是1，如在四極濾質器中)。可以將每個所選擇的前體種類進行碎裂-任選地以一個對應的最佳能量-并且然后可以將這些碎片在一個單一的廣譜碎片群體中進行組合。該單一碎片群體然后可以在一個高分辨率質量分析器中如一個T0F、一個軌道靜電阱如軌道阱(?)、或FT-1CR質譜儀中進行分析。因此，提出一種方法和設備，該方法和設備一個方面解決該有限的空間-俘獲分析器的電荷容量，以及另一方面解決TOF的有限動態范圍，這是通過選擇一個有限的然而復數的具有分析興趣的離子種類用于碎裂和隨后的并行分析。例如，可以將10個與100個之間的前體種類在該技術中一起分析。
[0017]本發明可以提供一種串聯質譜方法，包括這些步驟:a)在一個離子源中產生前體離子；b)在一個離子阱中將這些前體離子俘獲；c)將這些前體離子從該離子阱經由一個離子門向一個離子導向器噴射，以使得這些前體離子在它們至所述離子導向器的通路上僅達到所述離子門一次，這些前體離子作為暫時分離的多個離子包到達，每個離子包含有多個不同離子種類中的一個對應種類的離子；d)控制該離子門，以便從到達該離子門的多個離子包中順序選擇從感興趣的前體離子種類的一個子集獲得的多個離子包的一個子集；e)將所選擇的多個離子包的子集在該離子導向器中混合；并且f)在一個高分辨率質量分析器中分析從該混合的所選擇的離子包子集獲得的該所得到的離子群體。
[0018]還可以提供一個串聯質譜儀，該串聯質譜儀包括一個用于產生前體離子的離子源，一個用于從該離子源中俘獲前體離子、被安排在該離子源下游的離子阱；一個單通離子門，被安排在從該離子阱向一個下游離子導向器噴射前體離子的路徑中，這些前體離子作為多個暫時分離的離子包到達所述離子門，每個離子包含有多個不同離子種類中的一個對應種類的離子；一個離子門控制器，被配置為控制該單通離子門，以便允許僅含有多個感興趣的前體離子種類中的一個對應子集的一個離子包子集通過；其中，將該離子導向器被配置為接收被允許通過該單通離子門的前體離子；該串聯質譜儀進一步包括:被安排為分析這些尚子或者它們的碎片的一個聞分辨率質量分析器。
[0019]附圖簡要說明
[0020]本發明可以通過許多方式來進行實踐，現在將僅通過舉例并參考附圖來描述一些實施例，其中:
[0021]圖1示出了用于離子的靶向分析的一個串聯質譜儀的一個第一實施例；
[0022]圖2示出了用于前體離子的靶向分析的一個串聯質譜儀的一個第二實施例；
[0023]圖3a和3b分別示出了用于前體離子的靶向分析的一個串聯質譜儀的一個第三實施例的頂視圖和側視圖，包括一個非俘獲離子加速器；并且
[0024]圖4a和4b分別示出了 DC和RF離子導向器的示意圖，以提供用于離子到圖3a和3b的非俘獲離子加速器的正交加速的一個替代裝置。
[0025]優選實施例的詳細描述
[0026]首先參見圖1，示出了一個串聯質譜儀I。該質譜儀I包括一個離子源10，如一個電噴射離子源或一個MALDI離子源，該離子源產生有待分析的連續的或脈沖的帶電粒子流(前體離子)。將來自該離子源的這些離子引入一個僅rf存儲的第一級(離子阱)20，隨后立即是一個僅rf存儲的第二級(離子阱)21。第一和第二離子阱20、21均由填充有氣體并且由一個狹縫22分開的線性僅rf多極桿形成。該狹縫選通進入的離子流。最優選地，第二離子阱21是一種所謂的彎曲的線性阱或C-阱-例如W0-A-2008/081334中所述的類型的。施用到第一和第二級20、21的多級桿上的rf頻率是優選在約2MHz與5MHz之間。選擇第二離子阱21中的壓力，以便提供在一個短時間段內(優選小于I微秒)的離子冷卻。該時間段對應于超過約3X10_3-10X10_3毫巴的氮氣壓力。優選地，使用來自離子源10的一個窄的氣體射流。
[0027]將狹縫22的電壓降低以允許離子進入第二離子阱21并且然后再次升高以在第一離子阱20中保持(存儲)來自該離子源的剩余的前體離子。
[0028]在不大于I毫秒的冷卻時間后，將第二離子阱21中的離子正交地噴射到第二離子阱21的軸線處。第二離子阱21的軸線是，為了本說明的目的，這些阱桿沿其伸長的軸線。可以通過許多方式實現噴射。
[0029]首先，通過跨過第二離子阱21的rf桿施加一個DC電壓可以將離子正交地噴射，而無需關閉施加到這些桿上的rf電壓。可替代地，可以應用同樣的技術，但還伴隨有這些rf電壓的快速斷開。在其內容通過引用而結合的US-A-7，498，571中描述了該技術。在此情況下，優選的是，第二離子阱21是一個如W0-A-2008/081，334中的C-阱。允許從第二離子阱21的正交噴射的另一種替代方案是將一個雙極激勵施用到伸展的rf桿上，如US-A-5，420，425中所述的。可以掃描雙極激勵的幅值以提供在2X 105amu/秒與10X IOW秒之間的質量掃描速率。用于該正交噴射的變體的串聯質譜儀的優選安排在圖2中示出，并且將與以下附圖相聯系進一步詳細進行描述。用于從阱21正交脈沖噴射出的再另一種安排在US-B-8，030, 613中進行描述。
[0030]盡管本發明的優選實施例使用從第二離子阱21的正交噴射，還可能的是將離子從第二離子阱21中軸向地噴射。然而，該安排典型地允許該噴射脈沖的更低的空間電荷。該第二離子阱的空間電荷極限優選達到IXlO6個與3X106個之間的元電荷。這對應于每秒所允許的I X IO9個與3 X IO9個之間的元電荷的離子流，等價于200皮安與600皮安之間的一個離子電流。這與現代離子源(如以上所述的電噴射和MALDI離子源)的典型亮度匹配。
[0031]在從第二離子阱21的正交噴射之后，將離子引導穿過一個任選的扇形電場25，進入一個單反射或多反射飛行時間(MR-TOF)分析器30，以允許根據它們的質荷比的進行離子的飛行時間分離，同時維持一個相對緊湊的封裝。在替代的實施例中，一個多扇區飛行時間質量分析器(例如，MULTUM)、或一個多反射T0F、或一個軌道飛行時間質量分析器可以用作分析器30。在W0-A-2009/081143或W0-A-2010/136534中描述了合適的裝置。
[0032]一個離子門40位于MR-T0F30下游。在圖1的實施例中，離子門40位于MR-TOF分析器30的焦點處。具有不同質荷比(m/z)的前體在時間上的不同時刻到達門40。門40是在一個控制器100的控制下。該控制器控制門40，以便(在圖1中所示的安排中)允許具有分析興趣的前體離子在一個所希望的軌跡上進入一個碎裂單元50。使用控制器100的控制下施加到離子門40上的電壓脈沖將所有不希望的離子偏轉到一個離子止動器(或靜電計)41上。離子門40本身可以作為一個簡單的偏轉器，或可替代地，作為一個布拉德伯里-尼爾森門(Bradbury-Nielsen gate)來實施(參見物理評論(Phys.Rev.), 1936年,第49卷,第5期，第388頁-第393頁)。最優選地，離子門40是無柵的。任選地，可以使用一個另外的脈沖裝置42來減少能量發散。在其內容通過引用而結合的US-A-7，858，929中描述了該技術。
[0033]可以將離子門40和脈沖裝置42，任選地，整合到一個能量提升裝置中，該能量提升裝置將該電勢(相對于該飛行管)增加至對于在離子門40附近的離子而言足夠轉移至一個下游碰撞單元50的水平。
[0034]可以通過首先獲得一個前體離子的全景譜來推導有待選擇的這些離子種類。該全景譜中的前體離子的相對強度還可以有利地用于提供自動增益控制。具體地，為了調節前體離子和它們的碎片相對于彼此的數量，以便提供類似的相對豐度，可以將這些前體離子種類中的一些在該串聯質譜儀的僅一個單周期過程中傳輸，而可以將其他種類在多個周期中傳輸。這可以通過一個簡單實例來進一步理解。考慮前體離子的一個全景譜，其中一種第一離子種類，種類1，具有的相對豐度為一種第二前體離子種類，種類2的相對豐度的大約40倍。為了最終分析大致類似數量的離子種類I和離子種類2的包，在圖1的安排將只允許離子種類I的離子在四十個周期之一的過程中穿過離子門40。“周期”是指排空第二離子阱21，隨后在離子門40處飛行時間分離并且選通進入碎裂單元50。相反，在譜儀I的四十個周期的每一個中將允許具有的相對豐度為離子種類I的1/40的離子種類2的離子穿過離子門40。當然將理解的是，這些多個周期的相對計時不是關鍵性的:也就是，前提是在譜儀I的多個周期過程中，積累適當數量的前體離子，典型地不重要地是在這些周期的哪個周期的過程中積累了每個單獨的離子種類。
[0035]作為該離子的‘數字’計量的一個替代方案，一種‘模擬’計量也是可能的，其中離子門40提供的不是該離子束的“開/關”轉換，而是通過可變電壓進行的束強度的可控衰減。這種衰減對電壓的依賴性可以使用一種校準混合物進行校準并且然后用于真實分析物。
[0036]在這兩種變體中，在該最終的輸出譜中，優選通過這些衰減因子按比例縮放回所測量的強度，以提供準確的定量表示。可能的是將相鄰的相對窄的質量范圍譜縫合在一起以產生一個更寬質量范圍的(“全景的”)譜。一種用于實現其的合適技術在W0-A-2005/093783進行描述。在最終的譜對于傳輸上的這些差異進行校正之后，此類“譜縫合”允許對分析的動態范圍進行顯著的擴展。
[0037]優選地，在圖1的安排中，對于一個給定分析，取決于正在進行的實驗，選擇10個與100個之間的分離離子種類(不同的m/z)。希望分析物是被選擇為與它們的內部校準物并行的，盡管如以上所解釋的，根據一個前體離子譜中的這些前體離子的強度上的差異，周期的數量可以是不同的。
[0038]碰撞單元50 (—種前體離子種類選擇性地被選通到其中)優選是具有一個DC場的一個氣體填充的多級桿，以在這些離子進行混合的碰撞單元50的端部收集離子。碰撞單元50與一個聞分辨率質量分析器70相接，同時在碰撞單兀50與聞分辨率質量分析器70之間任選使用一個外部離子俘獲裝置60。如果可以將離子的能量發散減少至幾十eV，那么氮氣或IS氣可以用作碰撞單兀50內的一種碰撞氣體。然而，對于幾十eV或以上的能量發散,優選的是使用氦氣作為一種碰撞氣體，由于它允許高得多的碰撞能量。
[0039]在已經將所有的所選擇的前體離子在碰撞單元50中碎裂并且冷卻后，經由任選的外部裝置60，將它們轉移到高分辨率質量分析器70中。“高分辨率分析器”是指具有數萬或數十萬的分辨能力的、能夠提供質量分析的任何裝置，如(但不限于)一個軌道靜電阱，如一個軌道阱(?)分析器，一個任何類型的TOF分析器，如一個具有或不具有離子鏡的正交加速TOF分析器，一個多反射飛行時間質量分析器、一個多扇區飛行時間質量分析器、一個多偏轉飛行時間質量分析器，或者，可替代地，一個傅立葉變換質量分析器，或另外的。分辨能力的最佳設置取決于所得到的混合物的復雜程度，并且甚至對于簡單混合物典型地應該是至少10，000，并且優選至少20，000。對于數十個重疊的MS/MS譜，預期的是，最佳分辨能力將超過50,000。
[0040]其中高分辨率質量分析器70是一個軌道阱(?)質量分析器，任選的外部裝置60是存在的并且優選是一個僅rf存儲阱，如一個c阱，再次如W0-A-2008/081334中所述的。在此情況下，將來自第二離子阱21的多重噴射脈沖在該碎裂單元中進行碎裂，然后將這些碎片在c阱60中積累。在所有碎片在c阱60中的積累之后，將它們作為一個單脈沖噴射到軌道阱分析器70中，以作為一個單一譜來采集。
[0041]可替代地，其中高分辨率質量分析器70是一個TOF質量分析器，然后可以將碰撞單元50中的碎片離子連續地從碰撞單元50中泄漏，通過一個用于連續采集的正交加速器以IkHz與IOOkHz之間的頻率對該離子束連續地進行取樣。對于長飛行長度和/或多反射的T0F，再次一個c阱或其他rf存儲裝置可以用作外部裝置60。在此情況下，沒有必要使這些碎片離子注入到TOF質量分析器70中的操作與從第二離子阱21中的噴射同步。
[0042]作為仍一個另外的選擇，可以無需碎裂而將這些離子轉移到外部裝置60中。也就是說，允許離子穿過碎裂單元50而不進行碎裂，或可替代地可以導致它們繞過碎裂單元
50。這可以通過減少碎裂單元50的這些桿上的rf電壓的幅值,或通過使用具有僅rf運輸多極桿的一個另外的離子路徑(未示出)來實現。這是用于獲得具有前體離子的校正的(未縮放的)強度的一個預掃描的優選模式。
[0043]作為以上所述的技術的結果，由高分辨率質量分析器70獲得的每個譜代表來自10個與100個之間的前體離子種類的碎片譜的并行(即，同時的)采集，其中通過使用所述的自動增益控制(AGC)技術，每種前體具有大致類似數量的離子。這進而導致通過一個因子G增加質量選擇的工作周期，其中G類似于對于并行采集和分析所選擇的前體離子種類的數量。此類工作周期上的增加代表在分析時間和靈敏度上的顯著增益。
[0044]圖2示出了用于前體離子的高通量靶向分析的串聯質譜儀的一種替代安排。對于圖1和2共同的部件用同樣的參考號進行標記。在圖2中，由一個離子源10再次產生離子并且引入到一個僅rf離子存儲的第一級(離子阱)20中。一個狹縫22將第一離子阱20與一個僅rf多級桿的第二級(第二離子阱)21分離。
[0045]如使用圖1的實施例，通過降低狹縫22上的電壓允許離子從該第一個和第二離子阱穿過，然后一旦將第二離子阱21填充滿了，就再次升高該電壓。
[0046]在圖2的實施例中，然后，將離子正交地從第二離子阱21直接噴射到碎裂單元50中，而無需使用如圖1的實施例中所使用的MR-T0F30。這可以通過將一個雙極激勵施加到阱21的伸展的rf桿上(如US-A-5，420，425中所述的)來實現。可以掃描雙極激勵的幅值以提供2X105amu/秒與10X 105amu/秒之間的質量掃描速率。當然，在第二離子阱21與碎裂單元50之間提供一個離子門40，連同，任選地，一個脈沖裝置41和一個離子止動器42以接收由離子門40偏轉的離子，當它們不具有分析興趣并且不需要被注入到碰撞單元50中時。
[0047]與圖1的安排相比，在圖2的安排中將離子門40安排在第二離子阱21的直接下游(在圖2的安排中不存在MR-TOF分析器來提供焦點)。然而，在圖2的安排中具有不同質荷比(不同種類)的離子在不同的時間時刻到達門40，以便僅允許具有分析興趣的離子進入碎裂單元50中。典型地，可以按此方式選通低至幾amu (例如，I至4)的質量窗口。
[0048]在這些前體離子的碎片進入該碎裂單元之后，將它們注入到一個外部裝置60中。從這里，將它們進而注入到一個高分辨率質量分析器70中，以產生具有所有碎片種類一起的一個復合質譜。
[0049]在圖2的實施例中，進一步可能的是將感興趣的前體離子轉移(通過由控制器100控制離子門40將不感興趣的離子偏轉)到外部裝置60中，而無需碎裂。無需碎裂而轉移到外部裝置60中可以在減少的RF幅值下，或者，任選地，沿通過僅rf運輸多級桿的一個另外的離子路徑(未在圖2中示出)來進行。
[0050]如果一些另外的強離子峰的去除可以在第二離子阱21中亦或在之前的離子級中進行，可以放松第二離子阱21的高通過量的要求。例如，可以使用在離子源10、第一離子阱
20、或第二離子阱21中的低質量截止的rf光學器件來進行粗糙的質量過濾。可替代地，可以在離子源10、第一離子阱20、和/或第二離子阱21中使用某些質荷比的諧振激勵。作為一個另外的替代方案，可以將一個小DC電壓施加到一個四級桿上以提供再次在離子源10、第一離子阱20、或第二 離子阱21中的低和高兩者的質量截止。在任何此類預過濾的發生中的主要要求是，對于每個感興趣的離子種類，在至碎裂單元50的入口處的處于一個脈沖中的平均離子數N應該在質譜儀I的之前的級中經歷小的累積損失。數學上，這可以被表示為Iin>e.z.N.f?Iin/G0在此，e是元電荷(1.602X 10_19庫侖)，z是具有特定m/z的一種離子種類的電荷狀態，f是從第二離子阱21的噴射頻率，并且Iin是在從離子源10的出口上的離子電流。在將高頻率RF電壓(例如，在2MHz與5MHz之間)、適當的寬槽縫以及校正的同步應用到第一和第二離子阱20、21上之后，到達一個離子電流U=e.z.N.f=(0.2…0.5)Iin是可行的。換句話說，雖然只選擇有限數量的前體，本發明的實施例提供優于三重四級桿的益處。
[0051]以上所述的方法還與相對慢的碎裂方法，如電子轉移解離(FTD)、OzID (臭氧誘導解離)、IRMPD、UV解離等等相兼容，并且大大增強用于靶向分析的這些“慢速”碎裂方法的實用性。目前，由于長的活化時間是必需的，在靶向分析中存在對于此類技術的非常有限的用途。為了對不同前體提供類似碎裂效率，每個ETD實驗可以對于所有離子的相同荷電狀態進行，例如，在一個第一實驗中將選擇僅具有電荷+3的離子以引入到碎裂單元50中，在一個第二實驗中使用+4，等等。對于IRMPD和UV解離，靶向前體應該優選具有類似的解離常數(也就是說，橫截面)等等。還可能的是，在該高分辨率分析器的每個譜中具有該類型的幾個不同實驗。
[0052]以上所述的這些方法的應用是廣泛的。例如，它們可以用于肽定量，臨床、食品、環境和法醫應用中復雜混合物的分析。在使用中，將前體和碎片的質荷比的清單，優選與液相色譜儀(LC)中的相對應的保留時間和它們的變化范圍一起上傳到一臺電腦(未示出)中，該電腦直接或間接地控制控制器100。然后，一個無碎裂的MS全譜用于獲得一個概覽譜和峰強度的估算。在此之后，進行使用以上所述的這些技術的一個或多個周期，取決于所討論的AGC考慮因素。對于生物聚合物如肽的混合物，將必需產生至該高分辨率分析器中的每次注入的清單，以此方式，使得所選擇的前體具有它們的碎片上的最小重疊，即，對于每個前體，應該存在至少一種獨特的碎片，該獨特的碎片可以辨別它的身份，連同該前體的準確質量一起。
[0053]還可以廣泛地應用該方法而無需碎裂，因此然后通過確定分析物的準確質量，并且通過最小化假陽性的風險(因為分析在該高分辨能力上進行)來提供可靠的識別。一個實例包括一個具有非常高的動態范圍的偽全景質譜，其中將該整個質譜范圍分為數千個子范圍，每個子范圍被分配相似數量的電荷。在根據這些分配的電荷選通這些離子之后，通過該高分辨率分析器獲得一個全景譜，其中在該原始全景譜中這些最大強度峰與這些最小強度峰相比接收更低(得多)的數量的注入。然后根據注入數量上的差異對所采集的譜進行校正，由此恢復離子的相對強度，但還允許這些最小強度峰使用高得多的信噪比進行測量(如果它們落在強峰附近之外)。
[0054]圖1和2的實施例均示出串聯質譜儀，其中將來自離子源10的離子在一個第一離子阱20中俘獲并且然后傳輸到一個第二離子阱21中，從該第二離子阱，將這些離子正交地噴射至MR-T0F30 (圖1)或直接至一個碰撞單元50 (圖2)。然而，在根據本發明的實施例的可替代實施例中，不使來自該離子源的離子經受初始俘獲級，反而直接注入到一個正交加速器中。圖3a和3b示出了用于高通過量靶向分析的一種此類安排的頂視圖和側視圖，該安排使用一個用于前體分離的TOF分析器，而在該離子源下游使用一個非俘獲正交噴射裝置。在圖4a和4b中分別示出了 DC和RF正交噴射裝置的替代的安排，這些安排再次避免來自該離子源的離子的初始俘獲。
[0055]然后參見圖3a和3b，更詳細地，示出了根據本發明的一個第三實施例的一個串聯質譜儀。對于圖1、2和3的實施例共同的部件用同樣的參考號進行標記。
[0056]如之前所述的，在離子源10中產生離子。從該離子源，將它們噴射到一個正交加速器23中。在圖3a的實施例中，正交加速器23作為一對平行板24、25來實施。平行板24用作一個提取板，該提取板具有一個柵格或最優選地一個用于提取束流的縫隙，如例如在TO-A-01/11660中所述的。當跨過加速器23沒有施加DC電壓時，離子進入其中。在足夠長度的離子束已經進入加速器23之后，跨過該加速器施加一個脈沖電壓，并且將離子經由透鏡27提取到一個TOF分析器30中。取決于所要求的分離的品質，TOF分析器30可以是一個多反射T0F、一個多偏轉TOF或一個單反射T0F。示出一個單反射T0F。
[0057]由于存在非常高的離子電流，高度希望的是，在T0F30內在該離子路徑上不存在柵格，以便在從源至檢測器的離子路徑中，避免離子可以在其上沉積的金屬表面的出現。圖3b是使用一個單反射T0F30的實例、根據該第三實施例的串聯質譜儀的側視圖。如可以在圖3b中看出，離子在單反射T0F30中、在一個無柵鏡32中遵循一個Y形狀的軌跡。在W0-A-2009/081143中給出了如具體在圖3b中所示的T0F30的示例性安排的進一步細節。
[0058]在從鏡32的返回路徑上，通過一個離子門40來選通離子，其中允許感興趣的離子進入一個碎裂單元50并且將不希望的離子偏轉至一個離子止動器41。優選地，離子門40是無柵的并且含有一個由狹縫包圍的脈沖電極42，這些狹縫限制了來自脈沖電極42的場穿透。任選地，這些縫隙可以使時間相關的電壓施加到它們上，以便補償來自脈沖電極42的場穿透。
[0059]在基于它們的到達時間的選擇之后，離子進入一個減速透鏡43，其中使它們的能量減少至所希望的值。盡管未顯示，在圖1和2中示出的實施例中這些離子還可以在進入碎裂單元50之前經歷減速。典型地，用于碎裂的所希望的最終能量可以被估算為在30eV/kDa與50eV/kDa之間，其中使用氮氣或空氣作為一種碰撞氣體。然而，該估算的最終能量與氣體質量成反比縮放，所以將如果氦氣用作一種碰撞氣體，該最終能量可能超過IOOeV/kDa_200eV/kDa。類似地，對于極小的或無碎裂而言，該所希望的最終能量當該碰撞氣體是氮氣或空氣時為〈10eV/kDa，并且當氦氣用作一種碰撞氣體時為〈30eV/kDa_50eV/kDa。為了允許減速至此類低能量，優選的是，首先不將離子過度加速，優選通過不大于300V-500V。
[0060]在P.0’ Connor 等人，美國化學學會期刊質譜(J.Amer.Soc.Mass Spectrom.),1991，2，322-335中呈現了一種合適的減速透鏡的典型實例。對于在T0F30中的I米飛行路徑，期望500-1000的選擇分辨率，這被認為對于大多數應用是足夠的。由于該離子軌跡的Y形狀，離子到達正交加速器23上方的一個平面中，以使得獨立于該加速能量而選擇它們的初始能量。這不同于常規的正交加速T0F，并且允許離子的工作周期和傳輸上的改進。典型地，T0F30在約IOkHz的重復頻率下運行，以使得每個脈沖噴射高達IO5個-1O6個元電荷。
[0061]因為這些離子包典型地作為長形線到達碎裂單元50，應該考慮碎裂單元50的設計以使得它可以接收此類包。在目前優選的實施例中，這是通過實施作為一個具有差動泵送的長形碰撞單元(類似于W0-A-04/083，805和US-B-7，342，224中所述的碰撞單元)的碎裂單元50來實現的。
[0062]在碎裂單元50中的碎裂之后，將離子混合在一起并且通過噴射到一個任選的外部離子俘獲裝置60中，然后從此處正交噴射到一個高分辨率質量分析器70中，以與關于圖1和2的安排以上所述的相同方式進行分析。
[0063]圖4a和4b示出非俘獲正交離子加速器23的第一和第二安排，其中的任一個可以用作圖3a和3b的非俘獲正交加速器的替代物。圖4a的非俘獲離子加速器是一個DC離子導向器，而圖4b的那個是一個RF離子導向器。
[0064]在圖4a中，離子從該離子源以方向“y”到達。將這些電極25和24 (其中的后者具有一個中心槽縫)保持在同樣的DC電壓下，直到施加提取電壓脈沖，這導致將離子在與該輸入方向“y”正交的方向“z”以脈沖噴射穿過電極24中的槽縫。
[0065]圖4b示出另一種替代安排，其中，再次，離子從該離子源以方向“y”到達并且其中將這些電極25、24上的RF電勢保持為同樣的，直到施加提取脈沖。具體地，在圖4b中，除了這些背面板和前部提取電極25、24之外，加速器23進一步包括頂部和底部電極24’和24’ ’，該頂部和底部電極利用與電極24和25上的RF相位相反的相位。US-B-8，030, 613披露了用于將可切換的RF施加到一個離子阱中的一種技術。然而，可以將該公開中所述的技術同樣地施加到圖4b的非俘獲僅RF離子導向器中，以使得該RF根據那個文獻中所述的原則是可切斷的，并且將脈沖施加到電極25和/或24上以提取穿過電極24中的槽縫的離子。
[0066]在一個優選的實施例中，圖4b的加速器23尤其可以具備有一種阻尼氣體氣體以減少離子的能量發散。
[0067] 雖然已經描述了一些具體實施例，本領域的普通技術人員將容易認識到可以考慮到不同的修改或添加。例如，不僅單反射和多反射鏡可以用于圖1的安排中，而且可以使用多扇區和軌道系統以及離子遷移率分離器。為了額外的功能，可以安裝另外的檢測器和分析器。在圖3a、3b、4a和4b的實施例中，可以任選地將質量選擇的另外的級包括在離子源10和正交加速器23之間。
【權利要求】
1.一種串聯質譜方法，包括以下步驟: a)在一個離子源中產生前體離子； b)將這些前體離子引導到一個離子注入器中； c)將這些前體離子經由一個離子門從該離子注入器向一個離子導向器噴射，以使得這些前體離子在它們至所述離子導向器的通路上僅到達所述離子門一次，這些前體離子作為暫時分離的多個離子包到達，每個離子包含有多個不同離子種類中的一個對應種類的離子; d)控制該離子門以使得從到達該離子門的該多個離子包中順序選擇從感興趣的前體離子種類的一個子集獲得的多個離子包的一個子集； e)將所選擇的多個離子包的子集在該離子導向器中混合；并且 f)在一個高分辨率質量分析器中分析由該混合的所選擇的離子包的子集獲得的所得到的離子群體。
2.如權利要求1所述的方法，進一步包括，在通過控制該離子門來選擇該離子包的子集之后，將這些所選擇的前體離子中的至少一些碎裂。
3.如權利要求2所述的方法，其中，將這些所選擇的前體離子中的至少一些碎裂的步驟包括使用不同的對應的碎裂能量，在不同時間將這些不同離子種類中的至少一些碎裂。
4.如權利要求2所述的方法，其中，將這些所選擇的前體離子中的至少一些碎裂的步驟包括使用不同的對應的優化的碎裂能量，在不同時間將每個不同離子前體離子種類的這些離子碎裂。
5.如權利要求2、3或4中任一項所述的方法，其中，該將這些離子碎裂的步驟包括選自以下清單的技術中的一項或多項，該清單包括:電子移轉解離(ETD)、紅外多光子解離(IRMPD)、臭氧誘導解離(OzID)、紫外線燈和紫外線解離。
6.如前述權利要求中任何一項所述的方法，其中，該步驟c)進一步包括將這些前體離子噴射到一個飛行時間質譜儀中，以在到達該離子門之前將這些前體離子暫時分離成離子包。
7.如權利要求6所述的方法，其中，該將這些前體離子噴射到一個飛行時間質譜儀中的步驟包括將這些離子噴射到一個單反射飛行時間(TOF)質量分析器、一個多反射飛行時間(TOF)質量分析器、一個多扇區反射飛行時間(TOF)質量分析器、以及一個軌道飛行時間裝置中的一個或多個中。
8.如前述權利要求中任一項所述的方法，其中，該離子導向器包括一個離子積累裝置并且該步驟e)包括在該離子積累裝置中存儲所選擇的多個離子包的子集。
9.如權利要求1所述的方法，進一步包括在該離子導向器中并且在這些方法步驟a)至e)的多個周期內，對于多個感興趣的前體離子種類積累所希望數目的離子，該步驟f)進一步包括并行地分析這些積累的所選擇的離子。
10.如權利要求2、權利要求3或權利要求4，或者當從屬于權利要求2、權利要求3或權利要求4時權利要求5或權利要求6或權利要求7所述的方法，進一步包括在該離子導向器中、并且在這些方法步驟(a)至(e)的多個周期內，對于多個感興趣的前體離子種類積累所希望數目的離子的碎片，該步驟f)進一步包括并行地分析這些積累的碎片離子。
11.如權利要求10所述的方法，其中，該在多個周期內積累的步驟包括，在多個周期的步驟d)的過程中，控制該離子門以便選擇含有該多個前體離子種類的不同子集的離子包，以使得，在N個周期內，N是一個>1的整數，在那些周期的Μ中，Μ是一個< Ν的整數，選擇一個第一離子種類的離子ml/zl以進行碎裂，而在不同的周期數P中，P是一個整數，PSN但P古M，選擇一個第二離子種類的離子m2/z2以進行碎裂。
12.如權利要求11所述的方法，進一步包括根據在由該離子源產生的離子譜中每個此類m/z的強度，對于每個m/z選擇這些方法步驟(a)至(e)的許多周期N，以使得強度更大的離子種類在比強度較小的離子種類更少的周期中進行積累。
13.如前述任何一項權利要求所述的方法，其中，該步驟d)包括選擇由從該離子阱噴射的10個與100個之間的前體離子種類的一個子集獲得的離子包的一個子集。
14.如前述任何一項權利要求所述的方法，其中，該控制該離子門的步驟d)包括允許所述所選擇的離子包的子集穿過該離子門并且直接進入該離子導向器。
15.如權利要求14所述的方法，進一步包括控制該離子門以便將不需要被進一步分析的、來自該離子阱的這些離子包轉移，以使得它們不進入該離子導向器。
16.如前述任何一項權利要求所述的方法，進一步包括進行一個所有前體離子的初步質量分析以識別感興趣的前體離子種類以及它們的相對豐度。
17.如前述任何一項權利要求所述的方法，其中，該分析所得到的離子群體的步驟f)包括將在該離子導向器中的這些離子噴射至飛行時間(TOF)、軌道靜電阱或FT-1CR質量分析器中的一個中。
18.如前述任何一項權利要求所述的方法，進一步包括關于離子包的相對應的多個不同子集，將這些步驟(a)至(f)進行多次；并且將離子包的該多個不同子集通過該高分辨率質量分析器的分析結果進行組合，以便形成一個復合質譜。
19.如前述任何一項權利要求所述的方法，其中，該將這些前體離子引導到一個離子注入器中的步驟(b)包括將這些前體離子在一個離子阱中俘獲，該步驟(c)然后包括將這些離子從該離子阱向該離子導向器噴射。
20.如前述任何一項權利要求所述的方法，其中，該將這些前體離子從離子注入器噴射的步驟(c)包括將這些離子正交地噴射。
21.一種串聯質譜儀，包括: 一個用于產生前體離子的離子源； 一個被安排在該離子源下游的離子注入器，用于將從該離子源接收的前體離子向一個下游離子導向器噴射； 一個單通離子門，該單通離子門被安排在從該離子注入器向該下游離子導向器噴射前體離子的路徑中，這些前體離子作為多個暫時分離的離子包到達所述離子門，每個離子包含有多個不同離子種類中的一個對應種類的離子； 一個離子門控制器，該離子門控制器被配置為控制該單通離子門，以便允許離子包的一個子集通過，該離子包的子集僅含有多個感興趣的前體離子種類中的一個對應子集； 其中，將該離子導向器被配置為接收被允許通過該單通離子門的前體離子；該串聯質譜儀進一步包括: 一個高分辨率質量分析器，該高分辨率質量分析器被安排為分析這些離子或者它們的碎片。
22.如權利要求21所述的質譜儀， 其中，該離子導向器包括或包含一個離子存儲裝置和一個碎裂單元中的一者或兩者。
23.如權利要求22所述的質譜儀，其中，該離子導向器包括或包含一個碎裂單元，該碎裂單元被安排為接收所選擇的通過該單通離子門的離子包的子集，并且進行所述子集的碎裂。
24.如權利要求21至23中任一項所述的質譜儀，進一步包括一個單反射飛行時間(TOF)質量分析器、一個多反射飛行時間(TOF)質量分析器、一個多扇區反射飛行時間(TOF)質量分析器、以及一個軌道飛行時間裝置中的一者或多者，該一者或多者被安排在該離子注入器與該離子門之間，用于在從該離子注入器噴射之后這些離子至該離子門的路上分離離子。
25.如權利要求21至24中任一項所述的質譜儀，其中，該離子注入器是一個離子阱，該離子阱用于俘獲從該離子源接收的離子并且將它們噴射向該下游離子導向器。
26.如權利要求21至24中任一項所述的質譜儀，其中，該離子注入器包括第一和第二平行板，其中之一形成一個提取板。
27.如權利要求26所述的質譜儀，其中，該提取板由一個柵格或縫隙形成、或者包括一個柵格或縫隙。
28.如權利要求26或權利要求27所述的質譜儀，其中，將該離子注入器被安排為以一個指向器來噴射離子，該指向器與從該離子源輸入前體離子的方向基本上是正交的。
29.如權利要求21-24中任一項所述的質譜儀，其中，該離子注入器是一種非俘獲性的僅DC或RF的離子導向器。
【文檔編號】H01J49/00GK103650099SQ201280030981
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2012年6月19日 優先權日:2011年6月23日
【發明者】A·馬卡洛夫 申請人:塞莫費雪科學（不來梅）有限公司