用于識別生物材料的方法和裝置的制作方法

專利名稱：用于識別生物材料的方法和裝置的制作方法
技術領域：
本發明涉及對液體中的生物材料的識別。
背景技術：
已經知道可使用質譜分析法來識別生物材料，比如微生物(如細菌、病毒)、細胞、
多肽等。
例如，MALDI-MS (基質輔助激光解吸-電離質譜分析)涉及包含微生物的試樣材料的激光電離和電離顆粒的質譜分析。在MALDI-MS中，通過在靶板上提供微生物和基質材料的混合物來準備用于電離的微生物。當混合物干燥時，基質材料會粘附在微生物上，這導致了具有較低能量的軟電離，其可保存較大的分子碎片以用于分析微生物的組成。朝向靶板上的選定目標位置進行激光轟擊，以便從這些目標位置中電離出材料。對每個目標位置， 對產物進行質譜分析。
已發現MALDI-MS非常適合實驗室分析，但是仍存在一些問題。對于不同類微生物的混合物試樣來說，用單一激光轟擊來從不同種類微生物的混合物中電離出材料會導致各個物種的識別復雜化，這是很危險的。即使在靶板上可發現孤立的單一微生物，也不可能在由激光轟擊所電離的所有材料的噪聲中檢測到它。在MALDI-MS中，當例如取自患者體內的原始試樣包含不同類微生物的混合物時，通過使用初始培育步驟可克服這些問題。培育可用于保證在單一激光轟擊中產生主要為一種的大量微生物。然而，培育可能要占用一天的時間。結果，如果在采集體內試樣和提供分析結果之間需要短的周轉時間，實際上MALDI-MS 就不適用了。這限制了其應用。
例如在一個例子中，在將入住病人轉移到MRSA細菌會造成傷害的環境中之前，希望從病人處獲得試樣，并且在存在于試樣中的眾多微生物中識別出MRSA細菌。為了能實際使用，優選應當在最多幾個小時內就獲得此檢測的結果。培育微生物的需要阻止了傳統 MALDI-MS用于此目的的實際使用。
從A.L.van Wui jckhuijse 等撰寫并發表于期刊《Journal of Aerosol Science)) 第 36 卷第 677-697 頁(ΕΡ0 參考 XP004936536)的題為《Matrix-assisted laser deporption/ionization aerosol time of flicght mass spectroscopy for the analysis of bioaerosols -development of a fast detector for airborne biological pathogens))的文章中得知了采用MALDI-MS來進行微生物識別。該文獻描述了使用噴霧器來噴灑通過稀釋單一培養的細菌試樣到預定值而產生的溶液。在該文獻中所提及的霧化無法保證液滴具有相同的尺寸。結果，每個液滴中的細菌數量是變化的，然而由于僅使用一個種類的細菌，因此這并不重要。此外，該文獻中的霧化方法需要使用較大的試樣量，即使在少量液滴上分配時也是如此。
從W002052246中得知了一種用于檢測并識別生物氣溶膠顆粒的裝置。該裝置收集包含生物氣溶膠顆粒的空氣，并通過噴嘴將帶有顆粒的空氣送入分析室中。在分析室中檢測帶有微生物的顆粒，并且電離所檢測的顆粒。由于在從大氣壓到質譜儀所用的高真空的轉換過程中很多顆粒會丟失，因此該裝置需要相對大量的顆粒。所測試的顆粒相比于所捕捉的顆粒的效率可低至百分之一。
從美國專利申請2005/0230615得知了一種MALDI-IM(離子遷移率)測量技術，其中液滴通過震蕩孔板氣溶膠發生器來形成。然而它并未公布關于液滴中的微生物的信息。 如果液滴包含有微生物，那么使用MALDI-IM將導致識別這些微生物即使不是不可能也是很困難的。
從Hookeun Lee 等撰寫并發表在期刊《Anal. Chem.》2003，75，2746-2752 的題為((Analysis of Whole Bacterial Cells by Flow-Field Flow Fractionation and Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectroscopy)) 的文章中得知了使用流體場流分離儀(FFFF)來制備用于MALDI-MS的靶板。該文獻顯示了當使用靶板時可采用FFFF來分散完整的細菌細胞，以提高用于MALDI-MS的細胞密度。

發明內容
本發明的目的之一是提供一種識別生物材料的方法和裝置，其可基于帶有不同類型微生物如細菌、真菌和病毒的混合物的液體試樣來快速提供結果。
本發明提供了一種識別試樣中的包含有微生物的生物材料的方法，該方法包括 -準備包含試樣和MALDI基質材料的液體； -產生液體的連續流束； -將流束分散成流束的接連的部分，以形成飛行的液滴； _根據微生物的測量密度來將液體稀釋到與微生物的密度C相一致的稀釋水平， 其中C滿足關系式C*V < 1，V是每個所分散部分的體積； _從飛行中的液滴中電離材料； -測量所電離材料的質譜。
這里，通過將包含來自試樣的生物材料和MALDI基質材料(例如晶體形成基質材料)的液體的流束分散成流束的接連部分來形成液體的飛行液滴。例如，可使用帶有壓電元件的有源液滴形成器。對飛行中的液滴進行電離和質譜分析。通過這種方法，可以不需要靶板并消除其缺點，同時可實現高效率。液滴在飛行中會變干，使得在電離時變干的液滴成為干燥顆粒。這里所用的用語“液滴”包括通過干燥液滴而形成的干燥顆粒。優選地，測定每個來自各液滴的材料的質譜。
試樣或液體被稀釋到與其中微生物的密度C滿足關系式C*V < 1的濃度相一致的稀釋水平，這里V是液體的所述部分的體積。因此，平均在單個液滴的液滴體積中將會有少于一個微生物或細胞。因此，可以保證能獲得數量可觀的每個液滴含有一個微生物或細胞的液滴的測定結果。結果，可以獲得單個微生物和/或細胞的質譜。
在一個實施方案中，稀釋水平可與試樣中的細胞和/或微生物的濃度相適應。可采用密度檢測器來測定濃度，例如通過對所檢測微生物計數，并且采用所測定的濃度來控制稀釋。密度檢測器可包含(流式)細胞儀，其定位成例如通過對流束或前體流束中的微生物進行計數來檢測流束中的密度，其中前體流束在將MALDI基質加入到前體流束中時注入到流束中。
在一個實施方案中，在產生了帶有試樣和基質材料的流束的位置之后，流束流向液滴形成器而無任何重大的軸向重排列。即，一旦已加入了基質材料或至少在稀釋之后，液體被分散成的那些部分對應于流束的接連部分。這樣便降低了液滴帶有多個微生物的可能性。這可通過使用細胞儀來測量該流束中的密度并基于該測量來控制稀釋來改進。在一個實施方案中，可通過在流束產生處的下游將載液混合到流束中來進行稀釋。這也降低了液滴帶有多個微生物的可能性。
在一個實施方案中，用于識別試樣中的生物材料的裝置包括 -流束產生器，其配置為可提供其中已經混合有試樣和MALDI基質材料的液體的連續流束； -混合單元，其包括混合器和用于測量微生物密度的檢測器，根據微生物的測量密度來控制混合器的稀釋水平，使之到與滿足關系式C*v < 1的微生物濃度C相一致的稀釋水平，其中V是每個分散部分的體積； -液體部分分散器，其配置為將流束分散成流束的接連部分，并提供由沿飛行路徑在飛行中的所述部分形成的液滴； -輻射源，其指向飛行路徑，并且配置為提供用于電離來自液滴的材料的輻射； -質譜儀，其配置為獲得來自單個液滴的所電離材料的質譜圖。液體部分分散器可為液滴形成器，其例如包括壓電諧振器。
在另一實施方案中，裝置的液體部分分散器包括氣體流束供給出口和用于將液體流束供給到配置為形成氣體動力噴嘴的出口的導管。
在另一實施方案中，該裝置包含稀釋單元，其配置為將稀釋劑添加到試樣或液體中，以達到與平均在單個液滴的液滴體積中少于一個微生物的濃度相一致的稀釋水平。作為替代，可使用其中大多數液滴包含最多一個來自試樣的微生物的濃度。在另一實施方案中，稀釋單元包括密度檢測器，其配置為檢測試樣或帶有試樣的液體的密度，并且根據所檢測的密度來控制稀釋到所述的水平。
在一個實施方案中，液體部分分散器可配置為直接將液滴發射到進行電離的真空空間中。
在另一實施方案中，該裝置包括控制單元，其配置為使液滴形成和源自輻射源的脈沖產生同步。


通過對示例性實施方案的描述可以清楚這些和其它的目的以及有利的方面。
圖1顯示了用于識別微生物的裝置； 圖2顯示了帶有熒光屏的識別裝置； 圖3顯示了帶有超聲分散器的識別裝置； 圖4顯示了另一識別裝置； 圖4a_c顯示了液體流束分散器的例子； 圖5-7顯示了識別裝置的實施方案。
具體實施例方式圖1示意性地顯示了用于識別生物材料的裝置。盡管就該裝置而言將描述其在微生物識別中的應用，然而應當理解，該裝置僅是能夠對飛行液滴進行MADLDI質譜分析的裝置的一種實施方案。應理解的是，除了微生物以外也可使用其它生物材料，比如細胞(如血細胞、多肽等)。
裝置包括試樣接收器10、導管11、第一混合單元12、第二混合單元14、小室15、壓電諧振器16、控制回路17、脈沖激光器18和質譜分析儀19。壓電諧振器16可為用在噴墨打印機中以形成墨滴的那種類型。導管11將試樣接收器10、第一混合單元12、第二混合單元14和壓電諧振器16串聯式相連。控制回路17與壓電諧振器16和脈沖激光器18相耦合。
壓電諧振器16位于小室15中。導管11從第二混合單元14通入到穿過壓電諧振器16的開口。脈沖激光器18指向從該開口發射出的穿過小室15的液滴的飛行路徑。質譜分析儀19與小室15相連，并且定位成接收由在飛行路徑中的液滴吸收來自脈沖激光器 18的輻射而造成的電離碎片。
在操作中，將包含來自試樣接收器10的試樣材料、來自第一混合單元12的稀釋劑和來自第二混合單元14的基質材料的液體流束分散成多個部分，其中每個部分均形成發射為穿過小室15飛行的小液滴。在穿過小室15的飛行期間，當液滴在飛行中變干時液滴中的基質材料會在微生物的周圍結晶，形成干燥的顆粒。隨后，脈沖激光器18對干燥的顆粒發射激光脈沖。這導致干燥顆粒中的材料的電離。在質譜儀19中分析所電離的材料。
例如可使用直徑在1-100微米范圍中的液滴。優選使用具有處于該范圍中的幾乎完全相同尺寸的液滴，這可通過在規則的間距處打斷液體流束、例如通過在平均流速恒定的流束上施加適當頻率的周期性干擾來實現。
由于此小尺寸的液滴，在飛行期間僅需很少的時間來使液滴為電離做好準備。由于該準備發生在飛行中，可形成帶有包圍在微生物所有側面的基質材料的微生物。就像在傳統的MALDI-MS情況中一樣，在液滴和靶板之間的界面處沒有晶核產生。優選地，稀釋速率與液滴尺寸的組合選擇成使得大多數帶有微生物的液滴包含不超過一個微生物。例如， 可使用與平均在液滴體積中最多一個微生物的濃度相一致的稀釋水平。
由于脈沖激光器18每次朝向一個干燥的顆粒發射，所以來自帶有一個微生物的液滴的顆粒的每個測定質譜僅代表一個微生物。而且，液滴的使用意味著被電離試樣的尺寸由液滴的尺寸和液滴中所溶解和分散的材料的量所確定。這與傳統的MALDI-MS相反，在傳統的MALDI-MS中，試樣的尺寸由靶板上的遠大于液滴尺寸的激光斑的尺寸決定，因此有更多的材料電離，這會在質譜中導致增加的“噪聲”水平。另外，不同微生物的混合物也會被電離。
進行了實驗，其顯示出可以區分具有或不具有青霉素抗性的單個金黃色葡萄球菌。在該實驗中使用了包含試樣材料、稀釋劑和基質材料的液體氣溶膠。通過脈沖激光器對單個顆粒(真空干燥的液滴)進行電離，并獲得電離材料的質譜。結果發現，基于其質譜可將帶有具青霉素抗性的金黃色葡萄球菌的顆粒和帶有不具青霉素抗性的金黃色葡萄球菌的顆粒區分開。
第一混合單元12用作稀釋單元。它包括第一混合器120、稀釋劑儲存器122和檢測器124。稀釋劑儲存器122與第一混合器120相連以提供稀釋劑，第一混合器120配置為將稀釋劑與來自試樣接收器10的試樣材料相混合。檢測器124可為光學檢測器，其配置為當微生物流過測量光束、例如在帶有微生物的液體于其中流通的導管中時檢測散射自單個微生物的光。通過在平均每單位時間間隔中檢測到的微生物的計數，便可確定密度。在另一實施方案中，測量來自包含了稀釋劑和來自試樣接收器10的材料的第一混合器120中的液體的光散射強度。
這種類型的檢測器本身是已知的。可使用已知類型的細胞儀或流式細胞儀。如所知的那樣，細胞儀是一種檢測生物材料密度的局部波動的裝置，該波動與相對于鄰近液體為背景的單個微生物中的材料的空間濃度之間的差異相對應。例如，在帶有微生物的液體所流過的位置處可檢測到瞬時波動，或者通過掃描檢測位置可檢測到空間波動。例如可使用這樣的光學檢測，其使用的裝置提供了熒光的檢測，或者聚焦到尺寸小于每微生物的最大液體體積的小區域中的其它光學特性的檢測。可使用一個或多個檢測器，在材料如NADH 發射熒光(其為微生物的特征)的波長下檢測熒光。也可使用其它光學特性，比如散射、衍射等。
顆粒檢測器124顯示為與第一混合器120的控制輸入端相連。控制機構設置為可提高加入到試樣中的稀釋劑的量，直到測量密度已經降低到或低于預定的密度。可采用液體循環回路來沿稀釋劑注入點而循環所稀釋的試樣，直到達到所希望的密度。在操作中，可采用控制計算機(未示出)來接收來自密度檢測器124的測量數據，并且基于此數據產生混合器的控制信號。
在操作中，將包含微生物的液體試樣提供到試樣接收器10中。泵(未示出)將試樣材料經導管11泵送到第一混合單元12中。第一混合器120將稀釋劑加入到試樣材料中。 例如可采用水或乙醇作為稀釋劑。可使用分批式處理，其中可將一批試樣材料提供到第一混合回路12中，其后接著處理該批次而不從試樣接收器10中獲取其它材料，直到該批次已被處理完并已經離開第一混合單元12。例如可使用處于0. 01到10毫升范圍內的批次大 采用反饋回路來提高稀釋速率，直到通過密度檢測器124所觀測到的密度已經降到預定的水平。作為反饋的替代還可使用前饋方法，其中測量初始密度并采用最終水平來將所加入稀釋劑的量控制到預定水平。在一個實施方案中，該預定水平選擇成使得大多數液滴將包含一個微生物或更少。該水平可設置成使得達到平均每個液滴少于一個微生物， 或平均每個液滴中四到四分之一個微生物。應注意的是，液體中的微生物的整體計數得到滿足就可以了，不必指定微生物的類型。因此，可保證僅具有一個任何類型微生物的液滴的合理數量。
結合由液滴形成的參數設定來控制的液滴尺寸，并使用來自檢測器124的測量結果和微生物的濃度之間的關系來選擇實際水平。在一個實施方案中，這個水平在校正步驟期間基于對液滴部分的觀測(其中通過質譜儀觀測液滴中的來自微生物的材料)來試驗性地設置，通過調整該水平直到包含一個微生物的液滴的比率處于例如所產生質譜的十分之一到一半的預定水平為止。在一個例子中，可使用稀釋率為試樣對稀釋劑在一比五之間的稀釋。
應注意的是，第一混合單元14中的反饋用于保證具有不同微生物濃度的試樣不會導致大的效率變化(就未包括微生物的無用液滴的數量而言)，或者不會導致數量可觀的包含多于一個生物體的液滴。如果可預先控制濃度，則可不需要反饋或密度確定。類似的，如果已知濃度不會高得致使在預定的稀釋后留存有數量可觀的帶有多個生物體的液滴的風險，并且一定的效率損失是可接受的話，那么可以省略反饋或密度確定。在此情況下可使用預定的稀釋率，或者可以省略第一混合單元12。
第二混合單元14包括第二混合器140和基質材料儲存器142。基質材料儲存器 142與第二混合器140相連，以向第二混合器140提供基質材料，第二混合器140配置為可將基質材料與來自第一混合單元12的稀釋的試樣材料相混合。
在操作中，液體從第一混合單元12移向第二混合單元14。盡管為了該目的而顯示出了導管11，然而應理解的是，分批操作的液體可以任何方式移向第二混合單元14。在另一實施方案中，第二混合單元14可與第一混合單元14相結合。在第二混合單元14中加入了 MALDI基質材料。MALDI基質材料在現有技術中是已知的。可使用適合于結晶粘附在微生物上并具有適于吸收激光脈沖以電離來自微生物的材料的光吸收波段的基質材料。已知有多種適當的基質材料。不會形成晶體的MALDI基質材料也是已知的。可使用針對特定類型的生物體或特定有機材料的MALDI基質材料，但是作為替代也可使用適用于更寬范圍的生物體和/或有機材料的MALDI基質材料。第二混合單元14可配置為添加足量的MALDI 基質材料，以提供大約為100 1到10000 1的基質與分析物摩爾比。
將來自第二混合單元14的液體作為液體的連續流經導管11泵送到穿過壓電諧振器16開口中。盡管顯示了將第二混合單元14與壓電諧振器直接相連的導管11，然而應了解的是，可通過其它任何方式將一批液體從第二混合單元14輸送到導管11入口處的位置。 在導管11的入口處可使用中間儲存器(未示出)。可采用液體泵(未示出)來將液體流束經導管11泵送到壓電諧振器16，或者可采用泵來給第二混合單元14中的或液體已流入其中的中間儲存器中的液體施加壓力，以便于迫使液體流束經導管11流向壓電諧振器16。 導管11可以較短，使得有效地形成了從第二混合單元14或中間儲存器到穿過壓電諧振器 16的開口的直接連接。
在一個實施方案中，壓電諧振器16包括框架、帶有液體朝向其流動的20微米開口的孔的膜層，以及連接在膜層和框架之間的壓電材料。優選使用至少10微米的開口。壓電材料定位成可使孔在液體流動方向上前后移動。在壓電材料上提供了電極，以驅動該運動。
在操作中，控制回路17給電極施加高頻電激勵。例如可使用IkHz到IMHz范圍中的頻率。高頻電壓導致開口在液體流動方向上作周期性運動，這導致液體流束破碎成部分， 形成液滴。將一系列液滴沿著穿過小室15的飛行路徑發射。優選使用激勵頻率恒定設置的壓電諧振器16，以便于產生相同尺寸的液滴。從噴墨印刷技術中已經知道了用于控制液滴尺寸的技術。
盡管已經描述了采用壓電諧振器16來將液體流束分散成液滴的示例性實施方案，然而應當了解，也可使用其它的液滴形成技術。
在小室15中保持具有低壓的氣氛，例如在千分之一毫巴到幾毫巴的范圍中。該氣氛可包含任何氣體。在一個實施例中使用標準大氣。優選地，從壓電諧振器16到電離位置的飛行路徑的長度至少如此之長，使得在考慮到液滴速度的情況下穿過飛行路徑所需的時間足以例如通過結晶使基質就位。在一個實施方案中，可沿著飛行路徑使用一個或多個中間噴嘴除沫器以降低氣壓，直到達到對于質譜儀合適的水平。在一個實施方案中，質譜儀在接近10_6毫巴或更一般地在低于10_5毫巴的壓力下運行。通過在液滴形成階段使用低啟動壓力，在達到此壓力之前的液滴損失可保持為較低，這提高了裝置的效率。所有液滴都沿著相同的飛行路徑形成的事實也提高了效率。優選地，將液滴直接注入到真空中，但是有利的是添加一個高壓階段，以提高液滴形成的穩定性。
就幾微米(例如在1到10微米之間的范圍內)尺寸的液滴而言，液滴在幾毫秒或甚至幾微秒內就可充分地干燥以實現基質的形成(如結晶)。就20m/s的速度而言，這不會對飛行路徑的長度施加嚴格的約束。可以使用甚至更高的在100-300m/s范圍中的速度。
可在壓電諧振器16的附近提供氣流源(未示出)，以產生沿著飛行路徑的氣體射流。此射流可有助于降低連續液滴凝聚的幾率。
控制回路17控制脈沖激光器18，以產生以相對的相位與壓電諧振器16的振動同步的脈沖，使得來自脈沖激光器18的脈沖將會在來自壓電諧振器16的液滴穿過激光束的時間點到達飛行路徑。這會導致來自液滴的顆粒的電離。質譜儀19分析射出顆粒的質譜。
通過同步激光脈沖與壓電諧振器16的激勵信號，可實現激光脈沖與壓電諧振器 16的振動的同步。作為替代，可采用液滴檢測器(未示出)來檢測在小室15中沿飛行路徑的液滴，并且可通過來自此檢測器的信號來觸發脈沖激光器18。該檢測器也可配置為測量液滴的速度，以預測每個液滴的到達時間。作為替代，可采用由實驗來確定的預定速度。
可將質譜收集到控制回路17或測量計算機中，并且與對照譜或部分對照譜或已知微生物的生物標志清單進行比較，以識別各個液滴中的微生物的類型。在簡單的篩選實施方案中，與少量的對照譜進行對比就足夠了。可計算所識別微生物的計數，以通過將該計數與液滴的全部計數或與包括對照類型的微生物或細胞的液滴的計數進行比較來確定所識別的微生物的濃度。在一個更具探索性的實施方案中，可進行與更大數量的對照譜的比較，以識別試樣中的微生物類型或細胞類型的范圍。
圖2顯示了使用液滴預篩選的實施方案。這里增加了其它激光器20和熒光檢測器22。該其它激光器20具有選定成可激勵液滴中的微生物的熒光的波長。例如可使用 266nm的波長。該其它激光器20指向液滴在到達電離點之前其飛行路徑24的一部分處。 可使用連續波激光器，或與液滴形成同步的脈沖激光器。類似地，熒光檢測器22指向飛行路徑24，以捕捉來自由其它激光器20輻射后的飛行液滴的熒光。熒光檢測器22與控制回路17相連，其配置為可導致脈沖激光器有條件地、僅在其中已檢測到表示微生物存在的熒光的液滴處發射。此外，可采用其它激光器20來觸發發射，即選擇發射的時間點。在另一個實施方案中，采用一個或多個激光器來觸發發射，使用通過所述一個或多個激光器檢測到的時間點和/或液滴速度。這可以不依賴于是否使用了其它激光器20來完成。
在另一實施方案中，在壓電諧振器16處液體分散成液滴之前在導管11中檢測熒光。在此情況下，其它激光器和熒光檢測器指向導管11，并且控制回路17從檢測時間、朝向壓電諧振器16的流速和壓電諧振器16的激勵信號中確定其中微生物將被隔離出來的液滴。在導管11中的熒光檢測可有助于阻止基質結晶妨礙對來自微生物的熒光檢測。
圖3顯示了一個實施方案，其中裝置包含指向試樣接收器10或處于試樣接收器10 和第一混合單元12之間的導管11的超聲波源30，其配置為將微生物群簇分散成單個的微生物。此外，超聲波源30可用于從已經收集了微生物的試樣載體如棉簽或濾紙中分離微生物。
用于微生物群簇的超聲分離技術是已知的。群簇的分離可用于降低在其中一次存在多于一個微生物的液滴的數量。盡管已經顯示了一個其中超聲波源30指向試樣接收器 10的實施例，然而應了解的是，也可設置一個或多個超聲波源30指向處在試樣接收器10和壓電諧振器16之間的任何位置以用于分離群簇。在第一混合單元12之前分離群簇具有的優點是，可獲得更可靠的密度確定和更均勻的稀釋。
作為使用超聲方法分散群簇的替代，也可使用其它分散技術，比如渦流方法，其為已知的且涉及到例如通過振動液體來在液體中產生旋渦。不進行群簇分散所存在的風險是，一些液滴中可能包括微生物群簇。在一些情況、例如當群簇為同質的時，或者當不需要在群簇中的不同類型生物之間進行區分時，這可能不是個問題。
圖4a示例性地顯示了帶有壓電諧振器16的分散器的更多細節。導管11終止于穿過周期性地縮窄以發射液滴的壓電諧振器16的開口。盡管已描述了采用壓電諧振器16 將液體流束分散成液滴的實施方案，然而應了解的是也可使用其它的液滴形成技術。例如可使用已知的氣體動力噴嘴，其中導管11通向一氣體流，當將流束注入到該氣體流中時或在其后，所述氣體流用于將液體流束分散成小液滴。圖4b顯示了可使用結構的一個例子， 其中導管11的端部通到一更大的提供有氣體流的導管50中。因此，在將液體流束注入到氣體環境中之后可以形成液滴。優選地，氣體和液體的流速以及開口尺寸設定成可獲得窄范圍的液滴尺寸，這提高了效率并簡化了所需要的控制，以保證脈沖激光器18在需要撞擊液滴的時刻發射。
在另一個實施方案中，可使用類似于從水龍頭中滴水的液滴分散機理，其中迫使液體流束經導管到導管的開口，并且液滴從開口中斷開而形成飛行。可利用重力或穿過該開口的氣體流來將液滴從開口中斷開。在該實施方案中，可通過選擇液體流束的流速、開口的直徑和/或形狀以及氣體流速來控制液滴的尺寸。在另一個實施方案中，可采用如圖4c 所示的通入導管11的氣體入口 54來在規則間隔開的距離處將氣泡注入到經過導管11的液體流束中。可利用氣體入口 54中的閥門56來形成氣泡。在流束到達導管11的開口之前，氣泡將流束分散成一些小段，使得當流束從導管11的開口中被壓出來時，每個小段將形成各自的液滴。
如所述，該裝置提供用于微生物的識別過程，其中液體流束包含微生物和基質材料。將液體流束打斷成液滴，優選地形成單分散的液滴。以沿飛行路徑飛行的方式提供液滴。這些液滴在飛行時在真空中變干。所得的干燥顆粒被電離以獲得質譜圖。在飛行中對這些顆粒進行分析。在所示實施方案中，將液體稀釋到大多數帶有微生物的液滴僅包含一個微生物的稀釋水平。
盡管已經顯示了該裝置的一個特定實施方案，然而應了解的是，該過程可通過該裝置的改進實施方案來完成。例如，作為使用導管11的替代，也可使用可輸送的試樣承載器，其被可輸送到稀釋劑混合單元、基質材料混合單元和液滴形成站。如圖4所示，通過使用用于同時地或在不同的時間間隔中混合試樣、稀釋劑和基質材料的混合級42，便可在一個混合單元40中進行稀釋劑的混合和基質材料的混合。一部分輸送可在導管中進行，另一部分可使用輸送單元來進行。可改變稀釋和基質材料添加的順序，或者可將任何混合步驟分成多個混合步驟。
盡管借助于例子描述了對微生物的應用，然而應當了解，該技術可用于識別其它類型的生物材料，比如細胞，例如血細胞或特定類型的此種細胞。試樣可包括各種材料的混合物，并且通過結合從不同液滴的質譜中獲得的結果，可從試樣中識別出多種類型的材料。
在住院許可篩選應用中，生物材料的試樣可取自病人，例如取自唾液或取自任何黏膜或血樣或尿樣或其結合，并且如所述地來處理試樣。可采用從其質譜圖中得到的液滴中微生物的合成識別，或包含帶有質譜圖的微生物的液滴計數來決定是否接受病人進行一般治療，其中該質譜圖與有害微生物、比如具有特定抗生素抗力的金黃色葡萄球菌的對照圖譜相匹配。可對帶有有害微生物的病人再次檢查，以用于特別治療。
類似地，通過從多個病人中取樣并如所述地處理試樣，可監測帶有有害微生物的傳染病的爆發。在一個實施方案中，例如如果需要在一組人中識別有害微生物，例如在醫院的病房中，可將取自不同病人的試樣混合，而不需要挑選出單個的病人。
在診斷應用中，生物材料試樣可取自病人，并且如所述地處理試樣，以檢測帶有特定微生物的感染。
盡管描述了帶有脈沖激光器的實施方案，其避免了需要連續地提供用于電離的足夠能量，然而應了解的是，液滴的分散本質使得能夠使用連續波激光。作為激光的替代，也可使用其它類型的光源以提供用于電離至少部分液滴的光。例如可使用紫外光或紅外光。 除了光，可考慮用于電離的其它方法，例如離子轟擊或甚至超聲照射。
圖5顯示了識別裝置，其包括試樣儲存器50、第一載液儲存器520、泵522、第一混合級524、流體場流分離儀54、尺寸檢測器540、三通閥542、基質儲存器550、第二混合級 552、第二載液儲存器560、第三混合級562、流式細胞儀57和液滴形成器58。泵522、第一混合級524、流體場流分離儀54、三通閥542、第二混合級552、第三混合級562以及液滴形成器58沿著液體流動通道串聯連接在一起。第一載液儲存器520給泵522的輸入端提供進料。試樣儲存器50給第一混合級524的輸入端提供進料。尺寸檢測器540與液體流動通道中的處在流體場流分離儀54的下游和三通閥542的上游的部分相連。基質儲存器550 給第二混合級552的輸入端提供進料。第二載液儲存器560給第三混合級562的輸入端提供進料。流式細胞儀57與液體流動通道中的處在第三混合級562的下游和液滴形成器58 的上游的部分相連。
盡管未示出，在沿著液體流動通道的一個或多個位置、例如在三通閥542和第二混合級552之間，該裝置可包括用于存儲不同量液體的緩沖器。緩沖器可用于降低流速的變化。
在操作中，泵522將載液從第一載液儲存器520泵送經過流動通道。例如可采用帶有乙酸銨添加劑的水作為載液。在脈沖時間間隔中，第一混合級524將脈沖量的試樣液體混合到載液流束中。流體場流分離儀54根據顆粒的尺寸將流束分成暫時的接連的部分。尺寸檢測器540檢測作為時間的函數的顆粒尺寸，并且根據所檢測的尺寸來控制三通閥542，以使液體流到第二混合級552或廢料出口。第二混合級552將來自基質儲存器560 的MALDI基質材料混合到流束中。可使用連續混合。第三混合級562將額外的載液混合到流束中。流式細胞儀57測定流束中微生物的密度。根據所測定的密度來控制第三混合級 562的混合速率。液滴形成器58將流束分散成流束的接連部分，并且發射由各個部分所形成的液滴。
流動通道優選地設計成使得流束從第二混合級552流到液滴形成器58而無任何明顯的軸向重排。即，在液體通道中避免了液體可在其中積累并混合的較大儲存器。結果，液體形成器58將液體所分散的部分與流束的在第二混合級552或至少在第三混合級562 之后的接連部分相一致。第三混合級562處的稀釋通過將載液混合到流束中來進行。
可采用反饋回路來控制第三混合級562，該反饋回路設計為可根據測量密度“C” 是否在預設目標值之上或之下而向上或向下地改變混合率。可使用滿足關系式C0*v = A 的預設目標值C0，這里V是其中液滴形成器58將流束分散成的部分的體積，A是小于2、優選小于1的數值；例如可使用值A = 0. 2。當密度降到低得使其保持低于預設目標值時(即使未加入載液或加入預定的最小量載液)，第三混合級562的控制可不再依賴于密度。
作為流體場流分離儀54的替代，也可使用任何其它的分離裝置，其將帶有脈沖試樣液體的流束分離成帶有逐漸變化的顆粒尺寸的流束。其優點是降低了來自試樣的相對小尺寸的材料的量，當這種小尺寸材料存在于液滴中時，其會妨礙微生物的識別。此外，其具有的優點是，可及時調整第三混合級562中的混合速率，以提供在不同部分的微生物之間的微生物密度的差異。因此對于每個部分來說，可以更容易地實現帶有單個微生物的液滴。 當密度差異甚大的部分同時存在時，這會是困難的。
可使用傳統的流體場流分離儀54。例如，在之前引用的Hookeim Lee等撰寫的文章中描述了此欄目。簡略地說，此裝置使用了薄帶狀開口通道，其中帶有試樣材料的載液流束從中流過。作為通道中與流動方向垂直的位置的函數，出現不同的流動速度。通過外場， 對顆粒的不同部分可實現不同的橫向密度分布。可使用比如電場、所施加的溫度梯度、重力場等的外場。密度分布起因于在場效應和抵消密度梯度的擴散之間的平衡。結果，在流體場流分離儀54的出口處將出現按時間分散的不同部分，留下完整的微生物。
尺寸檢測器540用于檢測出現部分的顆粒的尺寸。當使用嚴格控制的流體場流分離方法時，可以省略尺寸檢測器540。在此情況下，例如可由計時器來控制三通閥542，該計時器限定了用于在試樣材料脈沖后的預定延遲處使液體流向第二混合級552的時間間隔。 尺寸檢測器540可配置為測量作為尺寸測定的光散射，然而也可使用其它技術，比如導電性測量或熒光檢測。
流式細胞儀57可包括熒光檢測器，其配置為可檢測流經液體中的歸因于微生物的熒光暫時峰。例如可使用波長與NADN相一致的熒光。可采用每時間單位內此峰的計數作為控制第三混合級562的密度信號。在一個實施方案中，采用來自流式細胞儀57的單個微生物的檢測來促使脈沖激光器(未示出)的激光發射，當流式細胞儀57在形成液滴的液體流束部分中未檢測到微生物時，不在該液滴處進行發射。當微生物液滴的密度低于第三混合級562根據微生物密度而混合載液的水平時，可采用發射控制來保持質譜儀的效率。
圖6顯示了帶有處于流式細胞儀57和液滴形成器58之間的附加三通閥60以及與流式細胞儀57相連的控制輸入端的裝置。在操作中，采用單個微生物的檢測來控制該附加三通閥60，當檢測到微生物時使液體流到液滴形成器58，否則則流到廢料出口。這樣便可將無用液滴的數量減至最小。當微生物液滴的數量低于第三混合級562根據微生物密度來混合載液的水平時，可采用對廢料出口的控制來保持質譜儀的效率。在一個實施方案中使用對液滴形成器58的“按需”控制，以在未將液體送到廢料出口時觸發液滴形成。圖7顯示了其中流式細胞儀57位于第三混合級562上游的裝置。因此，根據所檢測的微生物的密度和混合速率之間的預定關系，可以實現前饋控制。可使用下面的關系式 Fadd = N。rg*Vdrop/A-Fin 這里，Fadd是來自第二載液儲存器560的混合流速，Norg是每單位時間所檢測微生物的進入密度，Vdrop是形成液滴的液體部分的體積，A是期望密度，A優選小于1，例如A = 0.2。在圖5和6的反饋方法中，通過反饋來實現該關系。通過計數檢測到的微生物或從連續檢測之間的時間距離中可確定密度。在一個實施方案中，可根據每個微生物的檢測來控制圖7所示實施方案中的第三混合級562，根據在生物體的連續檢測之間的時間距離來控制混合速率，當該時間距離減小時增加所加入的載液的量。
圖7的前饋方法的優點是，其使得能對更小的試樣提供檢測。前饋控制方法可與使用附加三通閥60 (未示出)或促使發射相結合。在此情況下，控制是統計意義上的，當僅有低百分比的液滴包含微生物時，則阻止發射。盡管顯示了其中流式細胞儀57位于第二混合級552和第三混合級562之間的實施方案，然而應當了解的是，流式細胞儀57也可位于第二混合級552的上游。在此情況下，在加入MALDI基質材料之前測量密度。當第二混合級552設計為以已知速率添加MALDI基質材料時，可將在第二混合級552之前的流束中的微生物密度轉換為在此級之后的密度。為了更好地控制，流式細胞儀57優選位于第二混合級552之后。
來自圖7的細胞儀57的密度測量可用于控制激光發射和/或附加三通閥(未示出)。該附加三通閥可安裝在與圖6中的三通閥60類似的位置，或在流式細胞儀57和第三混合級562之間。在一個實施方案中，可用細胞儀代替尺寸檢測器54，在檢測到微生物的至少密度閾值時，其可控制三通閥542以使液體流到第二混合級552。在此情況下，通過第三混合級562，此細胞儀也可用于控制稀釋。盡管所示的單個細胞儀兼有多個用途，但是應了解的是，作為替代可使用多個細胞儀，每個用于執行這些用途中的各自的一個或一組。
在一個實施方案中，可采用液滴形成器58上游的流式細胞儀來控制脈沖激光器 18的發射，甚至不用控制稀釋。例如當已知微生物的密度不會過高時，這是可使用的。在另一個實施方案中，當檢測到微生物或檢測到微生物的密度超過閾值時，可采用液滴形成器58上游的流式細胞儀來控制三通閥，以便有選擇地向液滴形成器58提供液體。這甚至可在不控制稀釋的情況下完成。可以使用激光發射與三通閥控制的結合。
因此，提供了一種用于識別試樣中的生物材料的裝置，該裝置包括 -流束發生器，其配置為提供液體的連續流，其中已經將試樣和晶體形成基質材料相混合； -液體部分分散器，其配置為將流束分散為流束的接連部分，并且提供由所述部分形成的沿飛行路徑飛行中的液滴； -輻射源，其指向飛行路徑，并且配置為提供輻射以用于電離來自液滴的材料； _質譜分析儀，其配置為獲得來自單個液滴的電離材料的質譜圖；和 -細胞儀，其位于流束發生器和液體部分分散器之間并配置為檢測流束中的微生物，細胞儀與輻射源和/或流動路徑選擇器相連，使得可根據微生物的檢測導致輻射源和/ 或控制選擇將流束引向液體部分分散器或其它地方。這樣，裝置可以更高的效率處理微生物的小試樣。
盡管已經描述了三通閥的使用以實現流動路徑選擇器，以在用于進一步處理的流經液體和廢料液體之間進行切換，然而應了解的是，為此可使用其它類型的閥門，比如歧管。
可以平行的方式使用帶有流體場流分離儀54的多個分支，以便處理不同的試樣。 每個分支可包含與上面相一致的部件，并且例如包括三通閥542。可采用液體歧管來將這些分支與第二混合級552的輸入端依次連接。因此，即使流體場流分離儀需要較多的時間，也可有效地使用該裝置。
提供了一種識別試樣中的生物材料的方法，該方法包括準備包含試樣和MALDI 基質材料的液體；形成液體的連續流束；將流束分散成接連的部分以形成飛行的液滴；電離來自飛行中液滴的材料；以及測量所電離材料的質譜。
生物材料包括微生物。該方法可包括將試樣或液體稀釋到與平均在單個部分的體積中少于一個微生物的濃度相一致的稀釋水平。可測量稀釋水平并控制稀釋，以繼續進行直到將液體稀釋到所述濃度。在分離步驟前可對試樣或液體實施群簇分離步驟，以將微生物群簇分散成單個的微生物。
可將液體分散成體積大體相等的部分，例如通過在所述流束中在規則的間隔處分散連續部分。在將其從流束中分散出來的期間或其后，可將液體的接連部分發射到飛行中。 作為替代，可將流束發射到飛行中，并且當流束在飛行中時將流束分散成連續部分。在電離步驟之前，液滴會在飛行中變干，至少到在飛行中形成了基質材料晶體的干燥水平。可沿著飛行中的液滴軌跡的至少一部分施加氣體射流。在所述電離之前基于熒光來檢測液滴，并且僅電離帶有已檢測到產生了至少預定熒光強度的液體部分的液滴。
提供了用于識別試樣中的生物材料的裝置，該裝置包括配置為準備液體的混合器，其中將試樣和晶體形成基質材料相混合；配置為提供液體的連續流束的流束發生器； 配置為將流束分散成部分并且提供形成自沿飛行路徑在飛行中的所述部分的液滴的液體部分分散器；指向飛行路徑并配置為提供用于電離來自液滴的材料的輻射線的輻射源；以及配置為獲得來自單個液滴的電離材料的質譜圖的質譜分析儀。
權利要求
1.一種識別試樣中包含微生物的生物材料的方法，該方法包括-準備包含試樣和MALDI基質材料的液體；-產生液體的連續流束；-將所述流束分散成流束的接連的部分，以形成飛行液滴；-根據所述微生物的測量密度來將液體稀釋到與微生物的密度C相一致的稀釋水平， 其中C滿足關系式C*V < 1，V是每個所分散部分的體積；-從飛行中的液滴中電離材料；-測量所電離材料的質譜。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，包括使用細胞儀來測量流束中的微生物的密度，并且根據細胞儀的輸出結果來控制所述稀釋。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，在所述稀釋的上游對所述流束或前體流束進行使用所述細胞儀的在流束中的測量，其中所述前體流束在將MALDI基質加入到所述前體流束中時流入到所述流束中。
4.根據上述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，通過在流束產生處的下游將載液混合到流束中來執行所述稀釋。
5.根據上述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，包括將所述測量密度與閾值相比較，并且在密度低于閾值時不進行所述電離。
6.根據上述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，在所述稀釋的下游和將流束分散成部分的上游使用細胞儀來測量密度，該方法包括根據由細胞儀對微生物的檢測來選擇用于所述電離的單個部分。
7.根據上述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，包括將液體分散成連續地包含不同尺寸顆粒的液流、稀釋該液流、在所述分散之后測量微生物的密度，以及根據微生物的測量密度來控制所述稀釋。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述分散包括施加流體場流分離技術。
9.根據上述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，包括將液體分散成體積大體相等的部分。
10.根據上述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，包括在分散步驟之前對試樣或液體施加群簇分散步驟，以將微生物的群簇分散成單個的微生物。
11.根據上述權利要求中任一項所述的方法，其特征在于，包括根據關系式F= N g*Vdrap/A-Fin來控制用于稀釋液體的載液的流速F，其中N g是每單位時間檢測到的微生物的進入密度，Vdrop是用于形成液滴的液體部分的體積，Fin是流束的進入流速，A是小于1 的目標密度。
12.一種用于識別試樣中的生物材料的裝置，該裝置包括-流束產生器，其配置為提供其中已經混合有試樣和MALDI基質材料的液體的連續流束；-混合單元，其包括混合器和用于測量微生物密度的檢測器，根據微生物的測量密度來控制混合器的稀釋水平，使之到與滿足關系式C*v< 1的微生物濃度C相一致的稀釋水平， 其中V是每個分散部分的體積；-液體部分分散器，其配置為將流束分散成流束的接連部分，并提供由沿飛行路徑在飛行中的所述部分形成的液滴；_輻射源，其指向飛行路徑，并且配置為提供用于電離來自液滴的材料的輻射； -質譜儀，其配置為獲得來自單個液滴的所電離材料的質譜。
13.根據權利要求12所述的裝置，其特征在于，所述檢測器包括細胞儀，其配置為測定流束中的或前體流束中的密度，所述前體流束在將MALDI基質加入到前體流束時流入所述流束中。
14.一種檢測具有抗生素抗力的細菌的方法，包括通過由權利要求1的方法獲得的質譜來識別該細菌。
15.一種在醫院中確定是否對病人給予特殊治療的方法，該方法包括 -從病人處采集生物材料的試樣；-準備包含試樣和MALDI基質材料的液體； -產生液體的連續流束；-將流束分散成流束的接連部分，以形成飛行的液滴；-根據微生物的測量密度將試樣或液體稀釋到與滿足關系C*v < 1的微生物的濃度C 相一致的稀釋水平，其中V是每個分散部分的體積； -當液滴在飛行中時從液滴中電離材料； -測量單個液滴的質譜；-當至少一部分液滴的質譜與預定微生物的質譜相匹配時，隔離病人。
16.一種在醫院中監測帶有預定微生物的傳染病暴發的方法，該方法包括 -從至少兩個病人處采集生物材料的試樣；-準備包含來自各個病人的試樣和/或多個試樣以及MALDI基質材料的液體或多個液體；-產生液體或多個液體的連續流束或多個連續流束； _將流束或多個流束分散成接連的部分以形成飛行的液滴；-根據微生物的測量密度將試樣或液體稀釋到與滿足關系式C*V< 1的微生物的濃度 C相一致的稀釋水平，其中V是每個分散部分的體積； -當液滴在飛行中時從液滴中電離材料； -測量單個液滴的質譜；-當至少一部分液滴的質譜與預定的微生物的質譜相匹配時，發出傳染病警報。
全文摘要
使用MALDI-MS(基質輔助激光解吸和電離質譜)技術在試樣中檢測生物材料。準備包含試樣和MALDI基質材料的液體，并將其用于形成液體的連續流束。將該流束分散成接連的部分，以形成發射到飛行中的液滴，或將流束發射到飛行中，然后分散成液滴。可使用從噴墨印刷機中已知的液滴形成技術。對飛行中的液滴電離出材料。測量來自各個液滴的電離材料的質譜。優選地，在液滴形成之前將液體稀釋到大多數液滴均為每個液滴最多含有一個微生物的水平。
文檔編號H01J49/04GK102187426SQ200980141744
公開日2011年9月14日 申請日期2009年8月21日 優先權日2008年8月21日
發明者阿爾揚·勞倫·烏伊杰克胡吉斯, 雷內·帕欽 申請人:荷蘭應用自然科學研究組織Tno